KR100221117B1 - 미생물의 검출 방법 및 장치 - Google Patents

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제임스 에드워드 쥬니어 튜너
트루만 클레이 소어페
제임스 로렌스 쥬니어 디구이세피
마이클 존 캘랜드라
리챠드 코르넬리우스 드리스콜
카르멜라 슈 모디
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에프.쥐.엠.헤르만스
악조 엔.브이.
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Abstract

피검물내의 미생물 존재를 검출하기 위한 봉함 가능 용기 및 기기로서, 상기 용기는 그안에 지시제 매체를 함유한 센서 수단과 통하는 액체 배지를 함유한다. 배지중의 pH 변화 또는 CO2농도 변화로 인한 지시제 매체의 변화는 용기 밖에서 검출한다.

Description

미생물의 검출 방법 및 장치
임상용 피검물내의 미생물 오염 물질 존재는 영양 배지중에서 피검물을 배양하고 일정 시간 후 피검물이나 피검물을 방치한 대기중의 변화를 통해 미생물 활성을 검출함으로써 통상적으로 측정된다. 예를 들면, 안넬 등에 의한 미국 특허 제4,182,656호에서는 C13표지된 발효성 기질을 함유한 배양 배지를 가진 용기에 샘플을 넣는다. 용기를 봉하고 생물학적 활성을 유도하는 조건에서 피검물을 처리한 후, 피검물 주위의 기체 대기중에 있는 C12에 대한 C13의 비율을 측정하고 초기 비율과 비교한다. 미국 특허 제4,152,213호에서는 용기내의 기체의 압력을 모니터함으로써 피검물 주위 대기중의 산소 양 감소를 검출하여 봉함 용기내에서 피검물내의 산소 소모성 박테리아 존재를 측정했다. 미국 특허 제4,073,691호는 일정시간 후 피검물 주위 대기의 특성 변화를 측정함으로써 배지를 포함하는 봉함 용기중의 생물학적 활성 물질(세균 포함)의 존재를 측정하는 방법을 제공하고 있다.
대기중의 CO2변화량의 비-침투성 검출 방법은 서프만 등에 의한 유럽 특허 출원 제83108468.6호(공개 일자, 1984.4.4)에 기술되어 있다. 상기 특허와 기타 간행물에 기재된 방법 및 기기는 모두 배양 이후 대기중의 변화량을 측정하기 위해 봉함 용기의 침투 또는 방사능 측정 방법이 요구되며 또는 적외선이 통과되는 특수한 물질이 요구된다.
피검물, 특히 혈액 배양물의 미생물 오염을 측정하는 기타 공지된 방법은 온도, pH, 혼탁도, 색, 생물발광 및 임피던스의 미소한 변화를 측정하는 것을 포함한다. 일반적으로 상기 방법들은 박테리아 대사성 부산물을 검출함으로써 미생물 오염도를 측정한다. 미생물 오염도는 2차 배양 및/또는 염색으로 측정한다. 상기 방법중, 임피던스, 방사능 측정 및 적외선 광학 분석법만이 임상 피검물의 자동 처리화 가능성을 제공한다. 임피던스와 적외선 측정을 제외하고, 상기의 방법들은 또한 액체 피검물이나 피검물 주위의 기체를 측정하기 위해 용기에 투입하는 것이 요구된다.
매번 측정시의 오염 가능성 및 피검물 주위의 대기 성분의 변화 가능성에 더하여, 상기 방법들은 연속적으로 측정할 수 없으며 또한 장시간에 걸쳐 단시간 간격으로 용이하게 측정할 수가 없다. 이것은 원 샘플중의 유기체의 수 및 유기체 자체에 따라 유기체 오염 물질의 증식 속도가 상이하고, 따라서 대기나 유체 샘플중의 측정 가능한 변화가 오염된 피검물에 의해 나타나는 때를 예측할 수 없기 때문에 큰 단점이 된다.
그와 관련된 문제로서, 액체 샘플중의 pH 변화에 의해 오염도를 측정하는 경우, 각종의 대사 생성물은 각기 상이하게 샘플의 pH에 영향을 준다. 예를 들면, 암모니아의 생성은 pH를 상승시키는 반면, CO2의 생성은 pH를 낮춘다. 상이한 유기체 오염 물질의 상이한 증식 속도는 어떤 때에는 pH를 증식시키며 또 어떤 때에는 감소시킬 수 있다. 이러한 증가-감소의 변동성은 pH를 오랜 간격으로 측정한다면 측정되지 않을 것이다.
전혈 샘플에서 pH 측정에 의해 변화를 측정하는 경우, 특히, 지시제 염료가 pH 측정 수단인 경우 오차의 원인은 염료의 색이 혈액 세포 존재에 의해 영향을 받거나 불명확하게 될 가능성이 있는 것이다. 측색 지시제는 피검물의 특성에 의해 야기되는 오차가 염료에 영향을 주지 않도록 방지할 수 있는 경우만 효과적으로 사용할 수 있다.
본건은 1988년 3월 15일에 출원된 출원 일련 번호 제07/168,291호의 CIP건인 1989년 4월 13일에 출원된 출원 번호 제07/322,874호의 CIP건이다.
본 발명은 샘플을 준비하고 용기를 봉한 후에 용기내로 삽입하는 것없이, 봉함 용기와 증식 배지를 사용하여 피검물내의 pH 또는 CO2변화를 연속적으로 모니터하는 장치 및 기기를 제공한다.
또 다른 장점으로서, 본 발명은 피검물 내의 성분이 측색 요인에 영향을 미치지 않도록 하며 또한 피검물내의 pH 또는 CO2농도를 거의 연속적으로 모니터하기 위한 장치를 제공한다.
제1도는 혈액 배양 기구를 나타낸 단면도이다.
제2도는 센서의 반사율과 샘플의 pH 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.
제3도는 박테리아 증식에 따 라 pH와 CO2의 변화를 나타낸 그래프이다.
제4도는 각종의 미생물의 반사율을 나타낸 그래프이다.
제5도는 센서 장치를 나타낸 단면도이다.
제6도는 또 다른 센서 장치를 나타낸 단면도이다.
제7도는 압전기 센서 장치를 나타낸 단면도이다.
본 발명은 투명한 봉함 멸균 용기에서 멸균된 증식 배지로 피검물을 배양함으로써 혈액이나 기타 체액과 같은 임상용 피검물 및 비임상 피검물중의 미생물 존재를 검출하기 위한 기기 및 장치에 관한 것이다. 미생물의 존재 및 확인은 피검물의 pH의 변화 또는 용기 내면이나 용기를 봉하는데 사용된 봉함 장치에 부착된 일회용 센서를 사용한 피검물내의 CO2생성을 측정 또는 검출하여 결정된다. 본 발명에 의하면, 미생물은 비-방사능 측정 및 비-침투성 장치를 통해서, 고농도의 적혈구 세포와 같은 간섭 물질의 존재하에서도 측정될 수 있다.
도면은 다음과 같이 구성된다:
제1도는 혈액 배양 기기를 나타낸 것으로서, 용기(1), 센서(2), 배양 배지(3), 광원(4), 측광계(5) 및 전원(6), 전류-전압 변환기(7) 및 저속 필터(8)를 포함하는 부수 기기를 갖춘 검출기 어셈블리의 기능부의 전체 외양을 나타내고 있다.
각 검출기 어셈블리는 카운터 싱크 구멍내의 광 다이오드와 표면에 빛이 비치지만 직접 검출기에 닿지 않도록 배열된 하나 이상의 LED's로 구성되는 것이 바람직하다. 이 구체예에 있어서 전자 회로는 검출기로부터의 신호를 조절하는 증폭기 및 필터, 신호중에서 이용할 수 있는 것을 선별하는 다중 교환 장치 및 발광기에 대한 일정한 전원을 포함한다.
작동시 전 장치를 37℃ 항온기내에서 진탕기 위에 올려 놓아서 미생물 증식에 적당한 환경을 제공하고 측광계로부터 실내의 빛을 배제한다.
제2도는 pH 민감성을 나타낸 것으로서, 각종의 착색병을 이용하여 시험하는 점외에, pH 민감성 멤브레인 병을 이용하여 시험하였다. 이 도면은 pH 범위 5.8 내지 8.2의 각종 완충액으로 센서를 평형시킨 이후 7개의 상이한 검출기의 평균 전압 출력을 나타내고 있다. 상세한 연구를 통해 본 시스템이 pH 6.0 내지 7.5 범위에 대해 0.1 pH 단위 변화를 신뢰성있게 구별할 수 있음을 알았다.
제3도는 미생물 증식에 따른 pH 및 CO2변화를 나타낸 것으로서, pH 변화 및 CO2생성에 의해 미생물 증식을 검출하기 위해 이 기기를 사용했다. 이 도면은 박테리아(이. 콜리)의 증식으로 인한 pH와 CO2변화를 나타내고 있다.
제4도는 각종의 미생물 검출을 나타내고 있다. 근본적으로 모든 유기체는 그것의 대사 과정중 CO2를 방출할 것이다. 따라서, 이 시스템은 광범위한 범위의 미생물 증식을 검출하는데 사용할 수 있다. 이 도면은 E. coli, 그람 음성 박테리아; S. pyogenes, 그람 양성 박테리아; P. aeruginosa, 그람 음성 비-발효성 박테리아; B. fragilis, 혐기성 박테리아; 및 C. albicans, 효모의 증식 과정에서 생성되는 CO2검출을 나타내고 있다. 이 단위는 분석 초기의 CO2농도를 기준으로 배지중의 상대적인 CO2농도를 나타낸다. 샘플 용기 및 배지가 실온(약 20℃)에 있고, 분석중에는 37℃에서 항온 처리하기 때문에, CO2는 처음 2 내지 4시간 동안 액체 샘플 및 배지위의 공간으로 방출되며 그 이유는 온도가 상승함에 따라 액체중의 CO2용해도가 감소하기 때문이다. 샘플을 주입하여 기기내에 배치하기 이전에 용기 및 배지를 더 고온에서 유지하지 않으면, 보통 처음 2 내지 4시간 이내인, 최소CO2농도가 통과한 후까지는 미생물 존재에 대한 신뢰할 만한 지시가 측정될 수 없다.
제5도는 센서 장치에 대한 것으로서, 마개(3)를 통해 배양기 용기(4)내에 삽입된 캐뉼러 천공 장치(2)를 가진 센서(1)를 나타내고 있다.
제6도는 샘플 및 가스가 지시제와 더 많이 접촉하도록, 마개(4)를 통해 배양기(5)내로 삽입된 2개의 캐뉼러 천공 장치(3)를 연결하는 통로(2)를 가진 센서(1)의 단면도이다.
제7도는 압전기 센서 장치로서, 봉함 장치의 일부로서 압전기 스트림(2)을 갖는, 용기(3) 내부에 압력 변화가 발생했을 때 신호를 방출하는 센서 장치(1)의 단면도이다.
본 발명의 기기와 장치는 미생물에 의해 생성된 대사성 생성물의 증가량을 측정함으로써 혈액 샘플이나 기타 체액과 같은 임상용 피검물 및 비-임상용 피검물중의 미생물 존재를 검출하기 위한 비-침투성 장치를 제공한다. 어떤 미생물의 대사 생성물의 생성을 촉진시키는 특이적으로 제조한 배지에 피검물을 첨가하며, 이 생성물은 배양기의 바닥 또는 용기의 봉함 장치내에 배치된 독특한 일회용 센서에 의해 검출된다. 이 센서는 그 내부에 또는 그 위에 고정된 지시제 매체를 가진, 부착물이나 지지체 매체로 규정하는 고형 조성물 또는 멤브레인을 포함한다. 센서는 용기를 밀봉하기 위한 봉함 수단내에 또는 봉함 수단에 부착되어 용기의 내면에 대해 정면에 위치하여 지시제 매체를 외부에서 볼 수 있도록 한다. 센서와 용기 표면 사이에 세포, 단백질, 기타 고체 또는 기타 불투명하거나 유색의 성분이 들어오는 것을 방지하기 위해 센서를 용기에 고정시킬 수도 있다.
일부 구체예에서는 센서가, 기체 분자는 통과하지만 이온은 통과하지 못하는 막 또는 고형층에 의해 피검물 및 그것의 증식 배지로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 투명하거나 투명한 부분을 가진 캡이나 마개 같은 봉함 장치를 포함한다. 상기 센서는 투명한 캡이나 캡의 일부분에 가까이 놓이거나 캡의 일부로 제조된다. 용기를 봉하기 위해 캡을 사용하는 경우 지시제의 변화는 투명한 봉함 장치를 통해 읽는다. 이 구체예에서 얻을 수 있는 장점은 용기를 대량 생산하는 가장 경제적인 방법일 수 있다는 것이다.
더 바람직하게는 봉함 장치를 중합체와 같은 물질로 제조하며, 이것은 캡슐화된 지시제 미포를 포함한다. 용기 또는 봉함 장치의 투명한 부위는, 상기 물질이 미생물의 대사 산물에 대해 투과성이고 지시제의 변화가 봉함 장치 표면에서 가시적인 한, 필요치 않다.
본 발명의 다른 구체예는 제5도에서 나타낸 바와 같이, 캐뉼러같은, 적어도 하나의 천공 장치에 부착시킨 센서이다. 센서내의 지시제 매체는 캐뉼러의 구멍 중앙으로 이동 가능하다. 상기 용기는 고무 마개와 같은 통상의 마개로 봉한다. 센서 장치는 마개에 위치되며 캐뉼러는 고무 마개의 격막을 거쳐서 용기로 들어간다. 접종된 배지, 미생물의 기체 대사 생성물 또는 배지 자체에서 방출되는 기체는 캐뉼러를 통과하여 센서내의 지시제 색을 변화시키고, 따라서 판독이 가능하다. 본 구체예에 있어서 개선점은 하나의 캐뉼러, 바람직하게는 제6도에서 나타낸 바와같이, 적어도 2개의 캐뉼러를 사용하는데, 각각의 지시제가 왕래하는 센서의 한 말단과, 바람직하게는 각 캐뉼러의 한 말단에 연결된 개방구를 갖는다. 상기 센서는 고형 중합체 유제 또는 센서를 가진 캐스트 플라스틱부 또는 센서나 기타 상기 부품이 결합된 다른 유형의 장치일 수 있다. 각 경우에 있어서, 상기 센서는 연결 통로에 연속적이다. 상기한 바와 같이, 2개의 캐뉼러는 용기상의 마개 격막을 통과하여 용기로 삽입된다. 용기를 진탕할 때 용기 내부의 액체 및/또는 기체류는 한 캐뉼러로 흘러 들어가서 다른 캐뉼러로 나옴으로써 센서와 피검물이 직접 접촉하도록 한다.
1 ml당 1유기체 정도를 포함하는 체액(예, 혈액)의 피검물중의 미생물은 본 발명을 사용하여 검출할 수 있다. 상기의 피검물은 유기체의 빈도가 대사성 산물을 측정할 정도로 증가한 임계 레벨에 도달하기까지 7일정도 걸릴 수도 있다. 일부 유형의 유기체에 대해 106CFU/ml 농도가 pH 또는 CO2의 측정 가능한 변화를 제공함을 알았다. 모든 유기체는 107내지 108CFU/ml의 농도에서 측정 가능한 결과를 보여주었다.
용기내로 삽입되지 않고, 배양기병 내부에서 일어나는 변화를 측정하도록 하는 기타 유형의 센서는 제7도에서 나타낸 바와 같이 캡(즉, 덮개나 봉함 장치)에 부착된 압전 기기(예, 압전기 스트립)을 포함하는 구체예이다. 상기 기기로부터 방출되는 시그날은 용기와 그것의 함유물이 배양 온도에 도달할 때 자동적으로 0이 된다. 상기 덮개가 미생물에 의해 생성된 대사 산물의 압력으로부터 연장됨에 따라 이 장치는 일그러진다. 그로 인한 전기적인 신호를 측정하여 용기내의 생물학적 활성을 모니터한다. 다른 구체예는 용기와 분리되어, 용기의 봉함 장치를 통해 부착된 장치이다. 예를 들면, 상기 구체예는 압전기 스트립 기재에 텅빈 부분을 포함하는 고형 고무의 구형일 수 있다. 스트립 밑에서 캐뉼러를 고무 구형을 통해 삽입한다. 캐뉼러의 노출 말단을 용기의 봉함 장치를 통해 용기내로 삽입한다. 미생물의 기체 호흡 생성물이 캐뉼러에 축적됨에 따라, 그들에 의한 압력이 캐뉼러의 말단과 압전기 스트립 사이의 고무를 일그러뜨리며 스트립을 텅빈 부분으로 밀어넣는다. 그 때 압전기 스트립의 일그러짐에 의해 나타나는 전기적인 신호를 측정한다.
상기 장치의 또 다른 구체예는 둘 이상의 캐뉼러를 사용함으로써 고무 장치내로 들어가는 가스의 양을 증가시킨다. 2개의 캐뉼러를 사용하여, 병이 경사진 경우처럼 더 용이하게 흐름에 따라 센서로 유입 및 배출이 될 것이다.
복합 미생물 배지를 구성하는 영양분은 미생물에 의해 사용되는 대사경로에 영향을 미친다. 유기산, 염기 및 각종 기체가 이용한 영양분에 따른 비율로 생성된다. 이 생성물은 또한 미생물의 종에 따라 다양하다. 액체 배지중에 상기 생성물의 존재는 그것의 pH를 변화시킨다. 본 발명에서 사용되는 센서의 주위의 pH 변화에 반응하여 측정 가능한 변화를 일으키는 pH 민감성 지시제를 포함한다. pH 센서가 기체 투과성, 이온 불투과성 막으로 덮힌 구체예에서는, 지시제의 pH에 영향을 미치는 기체(예, CO2또는 암모니아)의 존재가 측정된다. 따라서, 미생물 증식은 액체 배지의 pH 변화나 배지에 용해된 기체의 측정에 의해 검출할 수 있으며, 두가지 모두 미생물에 의해 생성된 대사성 기체 산물에 의해 야기된다. 이산화탄소는 모든 유기체에 의해 생성되는 일반적인 대사 산물이며, 따라서 미생물 증식을 검출하기에 바람직한 대사 산물이다.
CO2와 pH센서는 두가지 공통 성분이 있으며, 즉 pH 지시제로서 유용한 분자종과 부착/지지 매체이다. pH 지시제는 지지 매체에 공유 또는 비공유 결합시킬 수 있다. 또한 지시제는 경화 이전에 중합체 매트릭스내에 유화시키는 것과 같이 중합체 매트릭스내에 캡슐화시킬 수 있다. pH 센서로서 기능하기 위하여, 지시제는 액체 배지와 접촉시켜야 한다. CO2센서는 피검물과 증식 배지로부터 지시제 막을 완전히 분리하는 반투과성 물질인 제3성분을 갖는다. 반투과층은 분리막일 수 있으며, 선택적으로, 피검물과 증식 배지 근처의 경화된 중합체는 통합 반투과막을 형성할 수 있다. 이 센서는 적당한 접착제로 투명한 용기 또는 투명한 봉함 장치 내부에 고정시킨다. 이것은 또한 봉함 장치의 일부를 포함하거나 그 자체가 경화되는 중합체 매트릭스 내부에서 유화된 지시제로서 봉함 장치 또는 용기 내부에 고정될 수도 있다. 이것은 또한 미생물의 대사 생성물이나 피검물을 함유한 증식 배지를 센서에 접촉시킬 수 있는 방법이 있는 경우엔 용기의 외부에 배치할 수도 있다.
각종의 상이한 형광체 및 볼 수 있는 pH 지시제를 pH 또는 CO2센서중의 활성 분자류로서 사용할 수 있다. 일반적으로, 지시제 선택의 유일한 제한은 기존의 전면 형광 또는 반사 기법으로 용이하게 측정할 수 있는 허용 가능한 동적 pH범위와 파장 범위를 가져야 한다는 것이다.
본 발명에 의해 배지중의 pH 변화를 검출하기 위한 센서는 약 5.0 내지 8.0 범위에 걸쳐 형광 강도 또는 볼 수 있는 색의 변화를 나타내는 것이 바람직하다.
CO2센서에 대한 지시제는 CO2농도의 변화를 검출하기 위하여 pH 약 13 내지 약 5 범위내에서, 가장 바람직하게는 pH 약 13 내지 약 9 범위내에서 형광 광도 또는 볼 수 있는 색의 변화를 나타내어야 한다.
특정한 pH 지시제 분자만이 지지 매체에 공유 결합하거나 비공유 결합하여 그것의 pH 지시 특성을 보유할 수 있다. 크산텐, 페놀프탈레인 및 페놀설폰프탈레인 그룹에 속한 지시제가 유용하다. 예로는 형광체, 쿠마린, 페놀프탈레인, 티몰프탈레인, 브로모티몰 블루, 티몰블루, 크실레놀블루 및 나프롤 벤제인이 있다.
부착/지지 매체는 셀룰로즈와 같은 물질일 수 있으며, 이것은 유기 반응을 사용하여 pH 지시제가 공유 결합할 수 있다. pH 지시제의 비공유 결합은 음성 및 양성의 제타 전위를 갖는 나일론막과 같은 이온성 지지 물질을 사용하여 수득할 수 있다. 사용 가능한 기타 이온성 지지 물질은 양이온 또는 음이온 수지이며, 예로, 디에틸아미노 에틸(DEAE) 수지 또는 DEAE 셀룰로즈이다. 지시제막이 미생물 증식 배지와 직접 접촉하는 경우 지지 물질을 단백질로 전처리하는 것이 필요하다.
pH 지시제 센서는 미생물 증식 배지의 pH 환경에 의한 변화를 직접 검출한다. 그러나, 이 센서는 이온의 통과를 저해하면서 기체의 확산은 선택적으로 허용할 수 있는 능력을 특징으로 하는 실리콘, 라텍스, 테프론 또는 각종 플라스틱과 같은 선택적 반투과성 조성물 또는 막으로 센서를 덮음으로써 액체 증식 배지중의 기체(예, 이산화탄소 또는 암모니아)와 선택적으로 반응하도록 할 수 있다. 중합체 매트릭스내에 캡슐화된 지시제를 함유하는 센서의 경우, 매트릭스를 형성한 중합체는 가스 투과를 허용하지만 이온 투과는 허용하지 않는 반투과막으로서 작용할 수 있다.
캡슐화된 지시제의 예에서, CO2센서는 4성분을 포함하는데, 제1 성분은 pH 6 내지 10 범위에서 반응하는 가시성 또는 형광성 pH 지시제이다. 이러한 요건을 충족하는 지시제의 예는 브로모티몰 블루, 티몰 블루, 크실레놀 블루, 페놀프탈레인, 쿠마린 및 형광체이다. 제2 성분은 수산화나트륨 또는 그와 동등한 염기로서, 선택된 pH 지시제에 의해 CO2를 검출하기 위한 최적의 pH 환경을 유지한다. 제3 성분은 글리세롤이나 그와 동등한 유화제로서 비경화된 중합체내에서 유제화된 지시제 용액의 소적을 산출할 수 있다. 제4 성분은 비경화 중합체(예, 실리콘)로서 지시제를 위한 적당한 환경을 유지한다. 기체는 투과하지만 이온은 투과하지 않는 한, 경화 요건 또는 그것의 화학적 또는 물리적 특성이 지시제의 화학 작용에 영향을 주지 않으며 멸균 처리시 그 특성이 변화되지 않는 모든 중합체를 사용할 수 있다. 또한, 만족할 만한 기타 실리콘 중합체는 촉매 활성에 의해서, 또는 자외선 경화에 의해서, 고온에 의해 경화될 수 있는 중합체이다.
상기 4 성분으로 유제를 제조하고, 중합체를 경화시켜서 pH 지시제 미포 주변에 반투과성 매트릭스를 형성하며, 이것은 액체 미생물 증식 배지로부터 CO2및 기타 기체를 선택적으로 확산시켜서 그결과 지시제에서 측정 가능한 변화가 일어난다. 센서는 주조되고 경화된 후 적당한 접착제(실리콘 접착제)로 배양병에 부착하는 것처럼 별도로 제조될 수 있다. 또는, 바람직하게는 센서를 병의 바닥에서 형성하여 그대로 경화시킬 수 있다. 경화 이후, 센서가 있는 병을 오토클레이브 등의 처리를 함으로써 멸균시킨다. 용이하게, 증식 배지를 오토클레이브 이전에 병에 유입하고 또한 그 방법으로 멸균시킬 수 있다.
다른 대안은 용기의 내면(예, 미세 적정 플레이트의 바닥)에 센서를 분무하여 얇은 층을 형성하는 것이다. 비멸균된 것일 수도 있는 적당한 배지를 각 웰에 첨가하고 피검물을 접종한다. 상기 플레이트는 보통 4-6시간 배양하면 센서의 색변화를 기록할 수 있다.
다음과 같은 센서의 특정한 예는 본 발명의 여러 가지 용도를 설명하기 위해 제공되며, 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
비-형광체 지시제 pH 센서의 제조
양성 제타 준위를 갖도록 변형시킨 나일론 막(Zeta Probe, BioRad)를 3% 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic Soy Broth) 용액에 넣고 회전 진탕기상에서 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 담구었다. 과량의 트립틱 소이 브로쓰를 탈이온수를 이용하여 나일론 막으로부터 완전히 세척했다. 세척된 막을 0.1 N NaOH 중에 용해된 pH 지시제(브로모티몰 블루)의 0.0001 내지 0.1% 용액중에 넣었다. 서서히 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 상기의 막을 반응시켰다. 과량의 지시제 용액을 탈이온수로 완전히 세척하여 막으로부터 나타나는 지시제가 없을 때까지 세척했다. 지시제 막을 24시간 동안 공기 건조시키고 11/16 인치의 원을 막에 펀치했다.
pH 지시제 막을 실리콘 접착제(GE 2501 실리콘 봉함제, 투명함)로 유리 용기의 바닥에 부착하였다. 상기의 병을 미생물 증식 배지로 채우고 오토클레이브하여 멸균시켰다.
실시예 2
비-형광 지시제 CO2센서의 제조
양성의 제타 준위를 갖도록 변형시킨 나일론 막(Zeta Probe, BioRad)를 0.1 N NaOH 중에 용해된 0.0001 내지 0.1%의 브로모티몰 블루 및 0.001 내지 0.1% 크실레놀 블루를 포함하는 지시제 용액중에 놓았다. 서서히 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 상기 막을 반응시켰다. 지시제 용액과 반응시킨 후, 이 막을 탈이온수로 완전히 세척하여 과량의 지시제를 제거했다. 지시제 막을 24시간 동안 공기 건조하고 11/16 인치 원을 막에 펀치했다. 지시제 막을 실리콘 접착제(GE 2501 실리콘 봉함제 II, 투명함)로 투명한 유리벽에 바닥 내면에 부착시키고 실리콘 접착제의 제2층을 지시제 막의 상단에 올려 놓아 나일론 지시제 막을 완전히 봉했다.
상기의 병에 미생물 증식 배지를 채우고 오토클레이브로 멸균시켰다.
실시예 3
A. 캡슐화 지시제 센서의 제조
원액은 25-75% 글리세롤을 함유한 0.0005 내지 0.5 N NaOH 중의 0.1 내지 1.0%의 페놀프탈레인, 크실레놀 블루, 또는 브로모티몰 블루로 제조했다. 0.1 내지 0.5 ml의 원액 지시제-NaOH-글리세롤을 1.0g의 비경화된 RTV 백색 실리콘(SE 실리콘 II, 백색)에 첨가하고 미세한 유제가 제조될 때까지 혼합했다. 실리콘-지시제 유제를 주사기에 넣고 유리병 바닥에 0.1-0.2 ml를 주입하여 유제가 균일하게 분포되도록 했다. 지시제-실리콘 유제 센서를 50% 이하의 상대 습도를 갖는 대기중의 상온에서 최소 24시간 동안 경화시켰다. 경화 이후, CO2센서가 장치된 병을 미생물 증식 배지로 채우고 오토클레이브로 멸균시켰다.
B. 미생물 오염 물질의 자동 검출 장치
미생물 증식으로 인한 pH 변화 및 CO2생성량 둘다를 1989년 5월 15일에 출원된 공계류중인 미국 특허 출원 번호 제07/322,874호, 제07/168,291호 및 제07/351,476호에 기술되어 있는 기기를 사용하여 검출 및 측정할 수 있다.
상기의 기기로 모니터되는 센서는 미생물의 증식이나 대사가 존재할 때 색이 변화하는 지시제를 포함한다. 색변이 눈으로도 명백하게 볼 수 있을지라도 기기를 사용하는 것이 측정의 객관성, 민감도 및 지속성에 유리하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 기기는 필수적으로 센서의 색변화를 모니터하는 가시광선 반사 측정계이다. 모든 샘플을 지속적으로 모니터하기 위하여, 샘플마다 검출계가 있는 것이 바람직하다. 또 다른 대안은 본 기술에 숙련된 자들에게 명백한 것으로서 하나 이상의 고정 검출계를 피검물 용기가 통과하도록 하는 통상적인 장치를 사용하거나 고정된 피검물을 하나 이상의 검출계가 이동하도록 하는 것 등이다.
바람직한 구체예에서는 고체상 발광계와 검출계를 사용한다. 백열등 및 arc 램프 광원을 거울, 렌즈, 광학 섬유 및 센서에 빛을 배양하기 위한 기타 장치와 병행하여 사용할 수도 있다.
C. 배지 제제
상기 실시예 3 B.에 기술된 기기의 pH 변화로 미생물 검출에 사용하기 위한 배지는 3% 트립틱 소이 브로쓰(DIFCO), 0.5% 프로테오즈 펩톤(DIFCO) #3, 1.25% D-글루코즈, 1% L-아르기닌, 0.01% L-시스테인 및 항응고제, 0.05% SPS 소듐 폴리설포네이트를 함유한다. 상기 배지는 pH에 영향을 주는 모든 대사 생성물이 쉽게 배지의 pH를 변화시킬 수 있도록 낮은 완충성을 갖는다. 글루코즈는 발효 가능한 탄수화물로서 미생물에 의해 대사되어 pH를 감소시키는 유기산을 생성한다. 정상적으로 글루코즈를 대사시키지 못하는 비-발효성 미생물(즉, 슈도모나스 에루기노사)을 위한 기질로 아르기닌을 첨가한다. 아르기닌 첨가에 의해 배지의 pH을 증가시킬 수 있는 염기성 대사 물질이 방출된다. 슈도모나스 에루기노사에 의한 CO2생성이 측정된다면, 아르기닌은 포함시키지 않는다. 다른 탄수화물류 또는 아미노산을 배지에 혼합하여 다른 종의 미생물에 의해 대사되는 경우 pH 변화를 유도할 수 있다.
D. 접종된 배양물을 사용한 시험
상기 실시예 3 A.에 기술된 병을 상기 실시예 3 B.의 배지 30 ml로 채우고 오토클레이브로 멸균시켰다. 각 병을 표 1a 및 표 1b에 제시한 유기체중의 하나로 접종하고 상기한 바와 같이 기기에 넣은 후 35℃에서 24 내지 48시간 동안 배양했다. 센서의 변화가 나타나면, 미생물을 함유한 것으로서 기록했다.
표 1a 및 표 1b에 기술된 미생물을 전술한 발명을 사용하여 검출했다.
접종 배양물내에서 검출된 유기체
장내 박테리아류이. 콜리엔테로박터 클로아세 시트로박터 프로인디클렙실라 뉴모니아 프로비덴시아 레트게리프로테우스 미러빌리스 살로넬라 그룹 B세라티아 마르세선스예르시니아 엔데로콜리티카 비발효성 균주슈도모나스 에루기노사슈도모나스 푸트리퍼시언스크산토모나스 메이토필리아아시네로박터 SP.에이케넬라 코로덴스모라셀라 SP.아크로모박터 그룹 VD
스타필로코커스 SPP.응고효소-음성의스타필로코커스S. 오이로우스 혐기성 균주박테로이즈프레길리스박테로이즈 멜라니노제니커스박테로이즈 어사카로리티커스클로스티리디움 퍼프리겐스퓨소박테리움 네크로포럼
스트렙토코커스 SPP.S. 뉴모니아A 그룹B 그룹C 그룹D 그룹-비 엔테로코커스엔테로코커스비리던스 그룹 스트렙토코커스영양변이주 스트렙토코커스 혐기성 균주베일로넬라 파벌라펩토스트렙토코커스 언에어로비어스펩토코커스 메그너스펩토코커스 어사카로리티커스박테로이즈 오바터스유박테리움 리모섬유박테리움 어락토리티컴
효모칸디다 알비칸스 크립토코커스 네오포먼스로도토룰러 루브라토룰롭시스 글라브라타 기타 미생물헤모필러스 인플루엔자헤모필러스 파라인플루엔자네이세리아 메닝지티디스비브리오 파라헤모리티커스네이세리아 고노르헤브란헤멜라 카타르헬리스에어로모나스 히드로필리아리스테리아 모노시토게네스가드네렐라 버지넬리스캠필로박터 제주니
이러한 결과는 동일한 유형의 다른 유기체 또는 액체 배지의 pH에 영향을 주거나 측정 가능한 가스류를 생성하는 모든 유체를 본 발명을 사용하여 검출할 수 있음을 나타낸다.
순수 배양물을 포함하는 피검물이 시험하기에 가장 바람직한 샘플일지라도, 단일의 우세한 유기체(예, 감염된 체액)을 함유하는 기타 피검물, 유동성 고체, 고체의 세척물 또는 식품 가공 공장, 제조처, 육류 포장 공장 또는 호수 및 강에서 발견되는 것과 같은 기타 탁한 액체도 접종 재료로서 사용할 수 있다. 특히, 혈액 배양 병에서 빼낸 혈액을 제조된 미세적정 웰에 직접 접종하여 4 내지 6시간 이내에 보통 그 결과를 읽을 수 있으며, 단 몇가지 미생물은 센서에 변색을 나타낼려면 24시간이 걸리기도 한다. 따라서 적당하게 제조된 미세 적정 웰에 양성의 배양물(예, 혈액 배양병에서 얼음)과 함께 직접 주입하고 특징적인 성장 패턴이 나타날 때까지 배양함으로써 양성의 피검물중 유기체를 동정할 수 있다.
실시예 4
비-형광성 유제 지시제 센서의 제조
이 센서는 이스트만 코닥'스 유니버설 지시제 용액을 포함하며, pH 4 내지 10에서 색이 변화한다.
A. 유니버설 지시제의 제조
이소프로판올(뉴욕주, 로체스터에 위치한 이스트만 코닥 컴패니사)중의 유니버설 지시제 용액 50 ml을 회전 증발기내의 감압하에 40℃에서 가열함으로써 증발 건조시켰다. 4 ml의 HPLC용 이소프로판올중에 상기 용액을 재용해시켰다. 10 ㎕의 10 N NaOH를 2 ml의 농축된 유니버설 지시제에 첨가했다.
B. 실리콘 유제의 제조
10 g의 GE 실리콘 RTV 615 성분 A(뉴욕주, 워터포드주, 제네럴 일렉트릭 컴패니사)을 유리 바이알에 분주했다. 2 ml의 유니버설 지시제/NaOH 용액, 1 g의 글리세롤 및 0.3 g의 백색 실리콘 안료를 실리콘 A 성분에 첨가했다. 4 성분을 테프론 봉으로 서서히 교반하면서 수동 혼합했다. 완전히 혼합한 후, 1 g의 GE 실리콘 RTV 615 성분 B를 유제에 첨가하고 이전처럼 손으로 교반하면서 서서히 혼합했다. 약 5분 동안 진공 건조기내에서 탈가스시켰다. 그 후 유제를 "에어 브러쉬" 분무기에 장치된 압축 실린지 분주기에 옮겨 담는다. 실리콘 유제 센서를 GE 실리콘 프라이머 SS 4120으로 미리 피복된 96 웰의 폴리스티렌 미세 적정 플레이트에 분무했다.
지시제로서 실시예 4에서는 유니버설 지시제를 사용했지만, 표 2a 및 표 2b에 기술된 기타 지시제 및 다우슨 등 Datafor Biochemical Research, 2편, 623페이지, Claredon Press, Oxford, 1969의 지시제 등을 사용할 수 있다.
산-염기 지시제
지시제(일반명) 제제(0.1 g/250 ml) 산색깔 염기색깔 pH범위
크레졸 레드(산범위) 2.62 ml 0.1 N-NaOH을 함유한 물 붉은색 노랑색 0.2-1.8
m-크레졸 퍼플(산범위) 2.72 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 붉은색 노랑색 1.0-2.6
티몰 블루(산범위) 2.15 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 붉은색 노랑색 1.2-2.8
트로페올린 00 물 붉은색 노랑색 1.3-3.0
메틸 옐로우 90% EtOH 붉은색 노랑색 2.9-4.0
브로모페놀 블루 1.49 ml 0.1 N-NaOH을 함유한 물 노랑색 자주색 3.0-4.6
테트라브로모페놀 블루 1.0 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 푸른색 3.0-4.6
콩고 레드 물 또는 80% EtOH 보라색 붉은-오렌지색 3.0-5.0
메틸 오렌지 유리산:물 Na 염: 0.1N-HCl 3 ml를 함유한 물 붉은색 노란-오렌지색 3.1-4.4
브로모크레졸 그린(블루) 1.43 ml 0.1 N-NaOH을 함유한 물 노랑색 푸른색 3.6-5.2
메틸 레드 Na 염:물유리산:60% EtOH 붉은색 노랑색 4.2-6.3
클로로페놀 레드 2.36 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 붉은-보라색 4.8-6.4
브로모크레졸 퍼플 1.85 ml 0.1 N-NaOH을 함유한 물 노랑색 보라색 5.2-6.8
아조리트민(리트머스) 물 붉은색 푸른색 5.0-8.0
브로모티몰 블루 1.6 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 푸른색 6.0-7.6
페놀 레드 2.82 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 붉은색 6.8-8.4
뉴트랄 레드 70% EtOH 붉은색 갈색-오렌지색 6.8-8.0
크레졸 레드(염기성 범위) 2.62 ml 0.1 N-NaOH을 함유한 물 노랑색 붉은색 7.2-8.8
m-크레졸 퍼플(염기성 범위) 2.62 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 자주색 7.6-9.2
티몰 블루(염기성 범위) 2.15 ml 0.1N-NaOH을 함유한 물 노랑색 푸른색 8.0-9.6
페놀프탈레인 70% EtOH(60% 셀룰로즈) 무색 핑크색 8.3-10.0
티몰프탈레인 90% EtOH 무색 푸른색 9.3-10.5
알리자린 옐로우 EtOH 노랑색 붉은색 10.1-12.0
트로페올린 0 물 노랑색 오렌지색 11.1-12.7
pH 지시제를 포함하는 센서를 사용하여 검출되는 CO2와 NH3이외에, 기타 기체 대사 생성물을 이것에 특이성이 있는 지시제를 사용하여 모니터할 수 있다. 예를 들면, 지시제로서 소듐 니트로푸르시드를 함유하는 본 발명의 센서를 사용하여 황화 수소를 검출할 수 있다.
실시예 5
CO2생성의 검출에 의한 미생물의 확인법
실시예 4에서 제조된 3개의 유제 센서 박층을 비멸균 미세 적정 플레이트 상에 분무했다. 각 층을 건조시킨 후 다음 층을 도포했다. 센서의 마지막층이 건조된 후, 200 ㎕의 배지를 미세 적정 플레이트의 각 웰에 넣는다. 각 샘플과 음성 대조군에 사용된 배지는, 23개의 미세 적정 웰 각각에 상이한 탄소원을 함유하는, 규정된 영양분 제한 배지이다. 음성 대조군 웰은 탄소원을 포함하지 않는다. 양성 대조군 웰은 비규정된 영양분이 풍부한 배지를 포함한다. 그후 각 웰에 피검물을 약 106유기체/웰로 접종한다. 상기 미세 적정 플레이트를 각 웰이 서로 분리되도록 봉하고 최고 6시간 동안 35℃에서 배양했다. 미세 적정 플레이트를 배양 이후 1시간 째부터 시간당 색변화를 체크한다. 음성 대조군과 양성 대조군간의 약 40%의 차이가 나타나면, 이 플레이트는 판독할 수 있다. 각 웰에 나타난 색변화는 전체적으로 특이한 탄소원 사용 양상을 나타내며, 이것으로 미생물을 확인할 수 있다.
실시예 6
미세 적정 플레이트내의 탄소원에 따른 미생물의 구별
A. 이산화탄소 센서 플레이트의 제조
50 ml의 코닥 유니버설 지시제를 증발 건조시키고 2 ml의 HPLC용 이소프로판올 중에 재현탁시켰다. 240 mg의 페놀프탈레인, 소듐염을 2 ml의 물중에 용해시켜서 1 ml의 농축된 유니버설 지시제 용액에 첨가했다. 150 ㎕의 CAPS 완충액(3-{시클로헥살아미노}-1-프로판설폰산), pH 10.4, 500 mM을 페놀프탈레인/유니버설 지시제 용액과 혼합했다. 이 용액을 약 15분 동안 탈가스시킨 GE RTV 615 A 실리콘 10 g에 첨가했다. 실리콘과 지시제 유제를 손으로 교반하면서 혼합했다. 0.1 g의 백색 실리콘 안료와 2 g의 GE RTV 615 B를 혼합물에 첨가하여 손으로 혼합하고 약 5분 동안 탈가스시켰다. 상기 유제를 "에어 브러쉬" 분사기에 장착된 압축 실린지 분주기에 넣고 폴리스티렌 24개 웰 플레이트(GE 실리콘 프라이머 SS 4120의 2 피복물로 미리 분무함)에 분무했다. 충분한 양의 지시제/실리콘 유제를 상기 웰에 분무하여 바닥면을 피복하였다. 그후 플레이트를 습윤화된 오븐에 넣고, 50℃에서 하룻밤 동안 경화시켰다. 이러한 분무 공정을 계속 3일 동안 반복하여 각 웰에 3번 피복시켰다.
B. 시험 방법
두 유기체, 이. 콜리(ATCC 제11775호)와 슈도모나스 에루기노사(ATCC 제1014호)를 둘 다 진탕하면서 37℃에서 실시예 3 C.에 기술된 바와 같이 복합체 배지중에서 하룻밤 동안(17시간) 증식시켰다. 배양한 유기체를 20분 동안 4℃에서 11950-X-g에서 회전시켜 수확했다. 상층액을 버리고 유기체를 OD660=5.0으로 0.9% 멸균 식염수 중에 재현탁시켰다.
제조한 미세 적정 플레이트의 각 웰은 하기의 3 배지 중 하나를 1 ml 포함한다:
a) 탄소원을 포함하지 않는 50 mM 헤페스(Hepes) 완충액(pH 7.2)으로 완충된 최소 배지(음성 대조군);
b) 0.5% 브로모숙신산을 포함한 점 이외에는 음성 대조군과 동일한 배지; 및
c) 50 mM 페페스(pH 7.2)로 완충된 비규정된 배지인 트립티케이즈 소이 이스트 추출물 배지(양성 대조군).
20 ㎕의 각각 제조된 유기체를 각 유형 배지의 웰 2개씩에 첨가했다.
각 웰을 코르크 마개로 봉하고 37℃에서 플레이트를 배양했다. 플레이트의 바닥에 있는 센서의 색변화를 6시간 이상 눈으로 모니터했다. 약 4시간 후에 2개의 명확한 패턴을 볼 수 있다. 각 유기체에 대한 음성 대조군은 색이 변하지 않았다(웰은 자주색을 유지함).
이. 콜리에 대한 양성 대조군 웰은 자주색에서 녹색, 노란색 그리고 오렌지색으로 변화했으며, 이것은 센서의 pH가 10에서부터 약 6까지 변화함을 나타낸다. P. 에루기노사에 대하 양성 대조군 웰은 자주색으로 녹색 그리고 노란색(센서의 pH 변화 10 → 약 7)으로 변화했다. 브로모숙신산 배지를 함유하는 웰은 2개의 유기체 사이에 가장 뚜렷한 차이를 나타냈다. 이것은 상기 탄소원을 사용하는 경우 두 유기체의 증식 및 CO2생성 능력에 있어서의 차이와 상관 관계가 있다. 브로모숙신산은 P. 에루기노사의 바람직한 탄소원이지만, 이. 콜리는 이 탄소원을 약간 사용하여 CO2을 생성한다. 4시간 이상 배양하면, 브로모숙신산과 이. 콜리를 함유한 웰에서는 자주색에서 녹색으로 색이 변하며 이것은 센서의 pH 변화가 10에서 8.5로 변화한 것을 나타낸다. 브로모숙신산과 P. 에루기노사를 함유한 웰은 4시간 동안 자주색에서 녹색, 노란색, 그리고 오렌지색으로 변한다. 이러한 색깔 변화는 10에서 약 6으로 pH가 변함을 나타낸다.
따라서 상기 센서는 탄소원으로서 브로모숙신산을 사용하는 그들의 능력에 대하여 이. 콜리와 P. 에루기노사를 구분하게 해준다.
증식 억제 반응을 기준으로 미생물의 확인
전술된 CO2센서를 사용하여 미생물을 확인하는 것은 또한 증식 억제 원리에 근거를 두고 있다. 이 시스템은 전통적인 생화학적 확인 시스템과 구별되며, 즉 억제제(예, 염료, 항생제 및 기타 물질)에 의한 선별적인 증식 억제를 기준으로 한다. 다시말하면, CO2의 생성량이 증식의 척도이다. 상기 억제제의 존재하에 생성된 증식 양상이 시험 미생물의 종을 확인한다. 증식양을 억제제가 포함되지 않은 대조군 증식웰과 비교한다. 일련의 억제제로부터 유도해낸 결과를 근거로 한 2단계 2차 판별 분석법을 사용하여 프로파일이 유도된다.
확인 시스템은 3 내지 6시간 내에 결과가 수득되는 급속한 방법이다. 또한 이 시스템은 통상적인 방법에서처럼 아가 플레이트 상에서 증식한 정제된 미생물 균주를 시험할 수 있으나, 간섭 물질에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 혈액 같은 체액 또는 미생물 빈도가 확장되도록 배양한 체액으로 직접 접종하기도 한다.
실시예 6
실리콘 유제 CO2센서를 사용한 대표적인 미생물의 억제 양상
0.05% 크실레놀 블루 실리콘-유제 센서를 함유하는 미세 적정 플레이트(96 평판 바닥 웰)를 억제제가 없고(증식 대조군 웰) 18개 상이한 염료, 항생제 및 기타 억제 물질을 함유한 미생물 증식 배지 100 ㎕로 채웠다. 억제제의 최종 농도는 대표적인 미생물의 접종물 100 ㎕(최종 접종물 5×107CFU/ml)를 첨가하여 얻었다. 억제제의 농도는 그람 음성 미생물의 종 사이를 구별할 수 있는 양상을 제공하는 증식양(억제)의 차이를 제공하도록 예정되어 있었다.
미세 적정 트레이에 접종한 후, 압감성 플라스틱 플레이트 봉합기로 봉하고 반사율 판독기로 처음 값을 읽는다. 이 플레이트를 37℃ 배양기에 넣었다. 4시간 배양한 후, 플레이트를 제거하고 최종 반사율을 읽는다.
표 3a 및 표 3b의 결과는 18개 억제제에 대한 4개의 시험 유기체의 증식, 미증식 또는 중간 증식의 양상을 나타낸다. 억제 양상은 시험된 미생물 종 각각에 대해 명백히 달라서 그 유기체를 다른 종과 구별할 수 있었다.
실리콘-유제 센서를 사용한 대표적인 미생물의 억제 양상
억제제 이.콜리335821 프로테우스 미라빌리스33583 슈도모나스 에루기노사33584 알칼리겐즈 오도란스33585
아크릴플라빈 30 mcg3 5%2 68% 84% 55%
밝은 녹색 3 mcg 104% 84% 101% 37%
코발트 클로라이드 205 mcg 27% 17% 52% 35%
시클로세린 78 mcg 13% 107% 56% 116%
시클로세린 240 mcg 8% 26% 66% 27%
디브로모살리시클릭산 750 mcg 83% 38% 88% 25%
도데실아민 18.75 mcg 99% 108% 118% 106%
플록스우라딘 36 mcg 55% 35% 79% 75%
말라카이트그린 3 mcg 40% 107% 87% 66%
메틸렌 블루 255 mcg 20% 80% 90% 56%
오마딘 디설파이드 5.5 mcg 10% 71% 94% 36%
소듐 아자이드 75 mcg 6% 35% 47% 47%
탈로우스 아세테이트 150 mcg 40% 68% 34% 47%
카베니실린 40 mcg 54% 69% 89% 77%
세팔로틴 13.5 mcg 53% 26% 108% 66%
콜리스틴 13 mcg 3% 114% 34% -44%
카나마이신 5.4 mcg 66% 44% 105% 95%
노보바이오신 48 mcg 9% 48% 85% 16%
1ATCC 수탁번호2항생제가 없는 증식 대조군과 비교한 항생제 존재하의 증식 백분율. 증식은 이산화탄소 생성양을 측정하는 유제 센서로부터 반사양에 의 해 결정된다.
전술한 바와 같이, 미생물 시험에 대한 기준 기법은 형광원 물질을 사용함으로써 증식량을 결정하거나 시험 유기체의 증식에 의한 현탁도를 가시적 또는 측광에 의해 측정하는 것에 의존한다. 본 발명의 중합체-유제 CO2센서는 시험 유기체에 의해 발생되는 CO2의 양에 의해 증식을 결정한다.
항균 물질 감수성 테스트
본 CO2센서 기법을 3가지 항균 물질 감수성 방법과 함께 사용할 수 있다. 첫 번째 방법은 시험 유기체에 대한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 전통적인 방법이다. 전체적인 치료용 범위를 포괄하는 농도로, 선택된 항생제의 일련의 2배 희석액을 증식 배지와 CO2센서를 함유한 미세 적정 웰내에서 제조한다. 각 웰에 약 105CFU/ml의 시험 미생물을 접종하고 웰을 봉했다. 이 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 배양한다. 그 후 특정한 항생제의 MIC는 가시적으로 또는 반사율 측정할 때 센서에서 아무런 변화가 나타나지 않아 CO2생성양과 유기체 증식이 없음을 나타내는 최고의 희석액을 가진 웰이다.
두 번째 방법은 유용한 전체적인 치료 범위를 포괄하는 항생제의 2개의 예정된 농도와 증식 대조군 웰을 사용하는 신속한 MIC 결정법이다. 이 웰을 약 106내지 107CFU/ml의 시험 유기체로 접종하고 밀봉하고 3 내지 6시간 동안 37℃에서 배양했다. 배양 동안 CO2센서를 연속적, 주기적 또는 초기 및 최종 판독에 의해 반사계를 사용하여 모니터했다. 특정한 미생물에 대한 항생제의 MIC는 비율, 가속 또는 총 CO2생성량으로 결정한 값의 회귀 분석으로부터 결정할 수 있다.
감수성 테스트의 세 번째 방법 또한 3-6시간 배양이 요구되는 급속 방법이다. 그러나, 이 방법은 증식 배지중에 항생제의 한가지 농도만을 사용한다. 증식 대조군을 포함하며 시험 유기체의 약 105내지 107CFU/ml의 접종물이 요구된다. CO2생성량에 대해 센서를 모니터하며 미리 설정된 기준과의 비교가 시험 유기체가 특정한 항생제에 민감한지, 중간 정도인지 또는 내성이 있는지를 나타낸다.
환자의 피검물로부터 표준 미생물학 기법으로 분리해 낸 순수한 미생물 균주를 CO2센서 시스템에 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명에 의해 제공되는 가장 큰 장점은 상기 시스템을 이용한 미생물 증식 검출은 혈액이나 기타 체액중에 존재하는 간섭 물질에 의해 영향을 받지 않기 때문에 유기체를 분리하지 않고도 환자의 혈액 피검물이나 혈액 배양물로 직접 접종하는 것이 가능하다는 것이다. 미생물 모집단을 확대하기 위해 환자의 혈액 피검물이나 기타 체액을 먼저 배양할 수 있다. 피검물을 직접 접종한 후에도 심지어 배양후에도 이용할 수 있다.
실시예 7
실리콘-유제 CO2센서를 사용한 대표적인 미생물의 항균 물질 감염 양상
바닥상에 0.05% 크실레놀 블루 실리콘-유제 센서를 함유한 미세 적정 플레이트(96개의 평평한 바닥을 갖는 웰)을 항생제 없는 배지(증식 대조군 웰)와 9개 상이한 항생제를 포함한 미생물 증식 배제 100 ㎕로 채웠다. 항생제의 최종 농도는 대표 미생물 접종물 100 ㎕를 첨가(최종 접종물 5×107CFU/ml)한 후 수득했다. 사용한 항생제의 농도는 시험 유기체가 특정한 항생제에 대해 민감성, 중간 정도 또는 내성인지를 결정하는데 사용된 농도로 한다.
미세 적정 트레이에 접종한 후, 압감성 플라스틱 플레이트 봉합기로 봉하고 반사율 판독기로 초기 값을 얻었다. 이 플레이트를 37℃ 배양기에 넣고, 4시간 동안 배양한 후, 플레이트를 제거하고 최종 반사값을 읽었다.
표 4의 결과는 9개 항생제를 이용한 4개 시험 유기체의 증식, 미증식 또는 중간 증식 양상을 나타낸다. 이것은 항생제에 대한 유기체의 감수성을 나타낸다. 시험 유기체는 그것의 생리학적 구조의 차이 때문에 감수성의 양상이 상이하다.
실리콘-유제 CO2센서를 사용한 대표 미생물의 항균 물질 감수성 양상
억제제 이.콜리291941 슈도모나스 에루기노사27853 스티필로코커스 아우레우스25923 스트렙토코커스 페칼리스29212
메티실린 5 mcg3 111% 146% 16% 116%
페니실린 G 0.2 유니트 103% 149% 45% 108%
카나마이신 22 mcg 91% 72% 13% 95%
클로람페니콜 4 mcg 14% 88% 45% 19%
테트라사이클린 0.5 mcg 76% 120% 15% 109%
반코마이신 10 mcg 94% 106% 22% 15%
날리딕스산 15 mcg 18% 109% 80% 116%
니트로푸란토인 15 mcg 14% 112% 33% 110%
트리메토프림/설파 18 mcg 88% 86% 86% 80%
1ATCC (미국 모식균 배양 수집소)2항생제가 없는 증식 대조군과 비교한 항생제 존재하의 증식 백분율. 생성된 이산화탄소의 양을 측정하는 유제 센서로부터의 반사양에 의해 증 식을 측정함.3㎍/ml
본 발명은 하기의 몇가지 면에서 특징 및 장점을 갖는다:
(1) 미생물의 대사 생성물은 피검물 주위의 대기중에서 보다 배양병의 액체상에서 측정된다.
(2) 병의 내면 또는 덮개나 봉함 장치에 부착되거나 덮개나 봉함 장치의 외부를 통해 부착된 특정한 일회용 센서는 병의 보존성을 파괴하지 않고 병 또는 봉함 장치의 투명한 벽 밖에서 측정할 수 있다.
(3) 반사율을 측정하는 기기나 육안 관찰에 의해 외부 측정이 가능하다.
(4) 피검물의 불투명하거나 유색의 성분은 측정 가능한 변화값의 변화를 검출 및 지시할 수 있는 센서의 능력을 저해하지 않는다.
(5) 고농도의 지시제 분자는 색의 변화가 쉽게 관찰될 수 있도록, 센서내에 적은 부피로, 즉 중합체 유제내에 또는 막에 유지된다.

Claims (2)

  1. 배양 배지로 피검물을 배양할 수 있는 내부 챔버를 갖는 봉함 가능한 피검물 용기, 및 압전기를 포함하는 변형 가능한 봉함 수단을 함유하며, 이로써 상기 용기내의 유기체의 대사 활성으로 인한 상기 용기 내부의 압력 변화 결과로서 봉함 수단 및 이의 압전기가 변형될 때 측정 가능한 전기적 신호가 산출되는, 피검물 내의 생물학적 활성을 연속적으로 모니터하기 위한 장치.
  2. 하나의 말단이 셍서 수단에 매립되어 있으며 봉함가능한 용기의 봉함수단을 천공시키기 위한 하나 이상의 공동( ) 천공 수단, 및 압전기를 포함한 변형성 부분으로 구성되는 센서수단으로서, 공동 천공 수단내에서의 압력 변화에 의한 상기 센서 수단의 변형성 부분의 변형이 측정가능한 전기적 신호가 압전기에 의해 발생되도록 하는 센서 수단.
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