JP2002500020A

JP2002500020A - 嫌気性細菌の毒性化合物による阻止および殺害を迅速に評価する方法

Info

Publication number: JP2002500020A
Application number: JP2000526667A
Authority: JP
Inventors: シュウィンゲル，ウィリアム，リチャード; ケホー，ヴィクトリア，マーガレット
Original assignee: Nalco Chemical Co
Current assignee: ChampionX LLC
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2002-01-08
Also published as: ID26631A; EP1051510A4; AU1629299A; CA2316806A1; IN185760B; WO1999034013A1; KR20010033726A; NZ505399A; EP1051510A1; CN1284135A

Abstract

(57)【要約】嫌気性生物によって汚染された水系中で使用するための、殺生物剤または殺生物薬剤の最小阻止濃度を迅速に測定する方法を開示する。微生物によって汚染された水流中での嫌気性生物の増殖を制御する、抗微生物剤または殺生物剤の単独または組み合わせでの最小阻止濃度を測定する機会が、本迅速方法によってもたらされる。本試験法では、嫌気性生物による炭化水素代謝の副産物の生成によって生ずる環境変化に応答する、ｐＨ指示染料を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野嫌気性生物によって汚染された水系において使用するための、殺生物剤または
殺生物薬剤の最小阻止濃度を迅速に測定する方法を開示する。この迅速法によっ
て、抗菌剤あるいは殺生物剤を単独であるいは組み合わせて使用したときの、微
生物によって汚染された水流中の嫌気性生物の増殖を制御するための最小量を測
定する機会がもたらされる。この試験法は、嫌気性生物による炭化水素代謝の副
産物の生成によって引き起こされる環境変化に応答するｐＨ指示染料系を使用す
るものである。

【０００２】本技術によって、最長１〜２週間を必要とすることがある従来の試験手順に対
し、約３０分間から約８〜１０時間の時間内に回答が得られる。本試験手順では
、微小滴定プレート上の複数の試料ウエルを有する複数のカラムを使用し、かつ
汚染された水系、栄養素、ｐＨ指示染料、および増分および連続希釈濃度の抗微
生物剤を含む所定のアリコート（等画分）を移送する技術を用いる。

【０００３】発明の背景工業用水用途の分野の多くでは、殺生物剤を使用することによって細菌の増殖
を制御し、細菌性堆積物の微生物的な堆積と、微生物に由来する副産物の堆積と
を回避し、防止し、制御しなければならない。こうした細菌と他の微生物有機体
とが存在していると、これらの種々の工業用水を使用するところで水処理や種々
の生成物の生産に対してしばしば干渉する。工業用水としては、種々の水、例え
ば冷却水装置をいったん通過して循環する水、ブローダウン特性を備えるかある
いは備えていない閉鎖ループ冷却水装置内を再循環する水、工業的処理に水を使
用するのに先立って処理用に使用され、回収された水、所定の水質基準に適合さ
せるための処理の前および後の双方に排水として放出された水、種々の製品、例
えば製紙および服飾製品を生産するのに使用する処理水、および他の処理水、例
えば原油の回収や炭化水素化学物質の処理の際に使用するための処理水が挙げら
れる。

【０００４】工業用水の用途の各々において、微生物、有害細菌および同類の増殖中の生物
の存在を減少させ、防止し、制御するために、殺生物剤がこれまで使用されてき
ており、現在も使用されている。これらの増殖によって汚損が生ずるというだけ
でなく、これらの存在によって、こうした微生物のコロニーが堆積した金属面の
腐食も引き起こされることがある。

【０００５】種々の殺生物剤を使用する際に関与するプロセスには、殺生物剤を、処理され
る工業用水へと、これらの微生物有機体の増殖を制御できるような強度で添加す
ることが含まれる。増殖の制御によって、我々が意味するところは、生物の増殖
の完全な除去および微生物の完全な除去だけでなく、すべての生物を殺害はしな
いけれども、集団の極端な増殖を制御できるように微生物集団を静的に制御する
ことが含まれる。使用すべき殺生物剤の効率および型を試験し、決定する方法に
おいて、しばしば２４〜４８時間にわたって続く手順、ときには１週間から最大
２週間以上にわたって続く手順が、特定の殺生物剤の効率的な使用を決定するた
めに必要であり、特にこれらの生物が発生する特定の工業用水環境中で、処理さ
れる特定の微生物の静的な制御あるいは完全な除去を達成するのに必要なこの殺
生物剤の量を決定するためには必要である。

【０００６】こうした長い試験期間は、時間の無駄であるというだけでなく、資源の浪費で
あり、この試験は、特定の汚染工業源における微生物の制御を維持するための適
切な殺生物剤、その強度および最適使用濃度を決定するという観点から高価であ
る。

【０００７】殺微生物剤は、種々の工業およびレクリエーション用途において水系中に添加
されている。これらの用途の幾つかを挙げると、工業冷却水系、プールやスパの
ようなレクリエーション用水系中の藻類、細菌、菌類および原生動物の増殖を制
御するための殺微生物剤の添加、製紙の際の細菌を制御するための殺微生物剤の
添加、粗糖を処理する間の細菌の増殖を制御するための殺微生物剤の使用等があ
る。また、本発明は、工業用水および公共用水摂取系および工業冷却水系中での
、ゼブラマッスル、ブルーマッスルおよびアジア産クラムを含むがこれらには限
定されない無脊椎動物の制御用に、殺生物剤を適用することにも用途がある。本
発明は水系に対して特に適用可能であるけれども、非水系においても用途がある
。本明細書で使用するとき、「殺微生物剤」および「殺生物剤」という用語は、
互いに交換可能なように使用されており、水系および非水系の双方において、連
邦殺虫剤、殺菌剤および殺鼠剤法（ＦＩＦＲＡ）の下に規定された「有害生物」
を制御するために使用される化学物質を含むものである。

【０００８】流体系中に存在する殺微生物剤の量を測定する現在の方法は、この系中の細菌
の増殖量を時間をかけて測定すること（間接法）であるか、あるいは活性殺微生
物剤に対する試料の湿式化学分析法（直接法）である傾向がある。この間接法で
は、この流体系から採取した試料を培養して細菌の増殖を測定する。もし細菌が
増殖している場合には、培養物において微生物の増殖量が一定になるか、あるい
は現象が見られるまで、一般的にこの系中へと更に殺微生物剤を供給する。湿式
化学分析法は、時間を消費し、労働集約的であり、十分に装備された研究室以外
の現場で実施したときには大きな誤りにさらされる。本発明がなされるまで、ど
れだけの殺生物剤を嫌気性生物に汚染された系が必要としているかを間接法によ
って迅速かつ正確に測定するための、現場での便利な試験方法は存在しなかった
。

【０００９】工業用水系中での腐食およびスケール阻止剤のような処理用化学物質の作用を
監視するために、トレーサー物質を使用することは、周知である。フーツの米国
特許４，７８３，３１４号では、不活性の遷移金属トレーサー物質を使用して、
蛍光測定法によって腐食およびスケール阻止剤の濃度を監視することが開示され
ている。フーツ他の米国特許４，９６６，７１１号および米国特許５，０４１，
３８６号では、不活性の蛍光性添加物を使用し、これを腐食および／またはスケ
ール阻止剤の量に正比例するように添加し、所与の工業用水系中の腐食および／
またはスケール阻止剤の濃度を監視することを開示している。米国特許４，９９
２，３８０号、５，００６，３１１号および５，１３２，０９６号では、工業用
水処理用途に用いる蛍光トレーサーを監視する方法および機器が開示されている
。

【００１０】米国特許５，１２８，４１９号および５，１７１，４５０号では、蛍光部分を
有する水溶性重合体を使用して、工業用水処理用途においてこれらの濃度を監視
することが開示されている。日本国特許５５−００３６６８号（１９８０年）に
は、殺生物剤の濃度を監視するための原子吸光分光測定法が開示されており、リ
チウム塩物質を添加および測定することによって、殺微生物剤の濃度を間接的に
測定している。この方法では、トレーサー物質を別々に添加することが必要であ
り、また結果を得るために原子吸光分光分析の利用が必要である。原子吸光分光
分析は、蛍光測定に比べて比較的に高価であり、更に不利な点は、原子吸光分光
分析は、複雑な機器が関与し、またオープンフレームおよび燃焼可能な気体を供
給するために、現場での使用に適合させることが容易ではないことである。

【００１１】米国特許４，２４２，６０２号では、紫外線分光分析技術を使用して、複数の
水処理成分を監視する。本方法では、高価な分析機器と共に、特別に書かれたソ
フトウエアを備えたコンピューターハードウエアが関与する。更に、機器は、場
所特異性をベースとして較正しなければならず、水の条件が変化した場合には、
再度の較正が必要な場合がある。欧州特許出願４６６３０３号に開示されている
方法では、処理される水に、ある物質を添加し、この物質が殺微生物剤といかに
して反応するかが関与している。殺微生物剤と反応するこの物質を連続的に測定
し、この物質の損失から殺微生物剤の濃度を測定する。本方法は煩雑であり、特
別の機器と二種類の異なる化学物質の供給とを必要とする。

【００１２】殺生物剤と殺微生物剤とを使用して、多数の異なる工業用水媒体における細菌
の増殖を制御あるいは除去する。しばしば、一種類の殺生物剤または殺微生物剤
は、処理される水媒体中におけるすべての細菌の増殖を制御するのには不十分で
ある。細菌または他の微生物有機体が存在すると、処理される工業用水の処理を
阻害し、これらの汚染された水と接触している機器に腐食や他の問題を引き起こ
すことがある。

【００１３】米国特許５，２０６，１５１号の開示を参照し、本明細書に包含するが、この
特許は迅速なスクリーニング技術を使用して、種々の工業用水中における殺生物
剤および殺微生物剤の有効性を迅速に測定する方法を開示しており、このスクリ
ーニング技術では、微生物有機体を含有する汚染された水媒体の複数の試料を採
取し；これに対して指示染料を添加し、好ましくは微生物有機体が生成するデヒ
ドロゲナーゼ酵素と反応する酸化還元指示染料を添加し；次いでこの酸化還元指
示染料を含有する処理された溶液へと栄養促進剤を添加する。こうした処理され
た試料は、連続希釈量の抗微生物剤を含む滴定プレート上に収容し、この滴定プ
レートを、微生物有機体が存在する工業用水系の稼働温度に等しい温度で培養す
る。本方法では、微生物有機体活性の増殖と促進とを引き起こし、これによって
還元性酵素の濃度を上昇させ、還元性酵素が酸化還元指示染料と反応して色の変
化を生じさせる。次いで、この色の変化を記録する。

【００１４】非処理カラムに対して本染料の色の最初の変化を比較することによって、汚染
された水系中に含まれる微生物有機体の増殖を阻止する、抗微生物剤の最小阻止
濃度（Ｍ．Ｉ．Ｃ）を測定することが可能となる。

【００１５】嫌気性細菌を保持するのに必要な還元環境下では、レザズリン染料のような本
酸化還元指示染料は、この還元環境に応答して色が変化するであろう。従って、
色の変化は、嫌気性微生物が存在しているかどうかを指示できるものではない。
なぜなら、本環境によって、偽陽性の結果がもたらされ得るからである。

【００１６】前記’１５１号の参考文献に記載の方法は、嫌気性微生物によって高度に汚染
されておらず、従って予め存在する低い（陰性の）ＯＲＰを有していない水を試
験するために利用できる。ＯＲＰは、ｍＶの単位で測定される、酸化還元電位で
ある。第６欄５２〜５７行目および第６欄６７行目〜第７欄４行目に開示されて
いる方法を利用して、主として条件的集団を評価できる。こうした条件的集団は
、主として試験水中で好気的に呼吸するが、しかも嫌気性条件下では嫌気性呼吸
／発酵を利用する。この理由から、穏やかな嫌気性条件下で条件的細菌を監視す
るために酸化還元染料を有効に利用する試験方法では、嫌気性集団を中程度から
強い嫌気性条件下で監視するべき場合には、正確な結果が得られない。中程度か
ら強い嫌気性条件では、酸化還元染料に作用が及び、誤った示度を与えるからで
ある。対照的に、本明細書に開示する方法は、嫌気性微生物（絶対および条件的
）が優勢な集団である場合、およびレザズリンによって代謝活性の変化を検出す
るためにはＯＲＰが低すぎる場合に、使用されるべきものである。

【００１７】米国特許第５，３７４，５３６号には、汚染された水中での殺生物剤の相乗的
配合物の存在あるいは殺生物剤配合物の存在を迅速に測定するための生成物選択
試験方法が開示されている。この方法では、酸化還元染料系、栄養素の供給、一
種以上の殺生物剤の混合物あるいはその配合物、およびこの染料系に種々の色の
変化をもたらすような培養時間と温度とを利用する。

【００１８】色の変化によってフェルトの微生物による汚損を検出することは、米国特許第
５，４１３，６８０号に開示されている。ここではヨードニトロテトラゾリウム
を指示薬として利用する。

【００１９】迅速なＭＩＣ試験用の自動読み取り機が、「Clinical Microbiology 」１９８
８年１月号、１〜７頁に開示されている。しかしながら、この方法は現場で利用
するのには不便である。なぜなら、これには容易には携帯できないコストのかか
る機器が必要だからである。更に、この上記技術では、増殖用に天然の液体では
なく人工的な培養基を使用している。この培養基は、蛋白質の含量が多く、製紙
工業において最も良く使用されている二種類の殺生物剤、即ちグルタルアルデヒ
ドおよびイソチアゾリンを試験する用途が排除され得る。なぜなら、これらは蛋
白質によって不活性化されるからである。更に、この試験方法は、有機体の純水
な培養物でしか働かない。試験すべき製紙工場や冷却塔液には通常は混合集団が
存在しているので、この技術は本明細書で意図している目的には有用ではないで
あろう。

【００２０】ルミネッセンスを利用して、試験液中の生存微生物の数を係数することが、米
国特許第５，６２７，０４２号に記載されている。

【００２１】国際特許出願ＷＯ９２／１９７６４号では、回収された体液中での微生物の増
殖を検出するために、ｐＨ感受性の吸光に基づいた染料を利用することが記載さ
れている。この参考文献では、微生物の増殖の存在または不在をいかにして検出
可能であるかを説明している。本明細書に開示する本方法では、嫌気性生物に対
する殺生物剤の有効性を測定する。

【００２２】本発明によって、流体系、特に工業用水系中での微生物の増殖を制御するのに
必要な際の殺生物剤の濃度を測定するための、使用し易く、正確で連続的な間接
法を提供することによって、上記した問題点の多くが解決される。

【００２３】従って、本発明の目的は、工業用水を処理する際に、特に製紙プロセスで使用
する工業用水を処理する際に有用な種々のおよび複数の殺生物剤および／または
毒物を迅速にスクリーニングして微生物を制御する方法を提供することである。

【００２４】また、本発明の目的は、微生物の増殖の制御に有用な毒物および殺生物剤をス
クリーニングし、試験するための迅速かつ可視的なスクリーニング手順を提供す
ることであり、工業用水中、特に製紙プロセス中における微生物の増殖を制御あ
るいは除去することである。

【００２５】更に、本発明の目的は、前記可視的な手順において、ある種のｐＨ指示薬（し
ばしばｐＨ指示染料と呼ばれる）を使用し、可視スペクトルにおいて染料の色を
変化させることによって、微生物有機体によって汚染された水系中の特定の抗微
生物剤の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定できるようにすることである。

【００２６】本発明の目的は、実験室内におけるよりも、むしろ現場で工業用水を処理する
のに有用な種々のおよび複数の殺生物剤および／または毒物を迅速にスクリーニ
ングする方法を提供することである。

【００２７】更に、本発明の目的は、複数の試料セル（あるいは試料ウエル）を含む取り扱
いが容易な微小滴定プレートを提供することであり、各セルは、汚染された水系
の所定の容量またはアリコートを保持する能力を有している。次いで、この水系
試料のアリコートに対して、既知のおよび所定量のｐＨ指示染料を添加し、この
染料は、微生物系の代謝速度の上昇によって生成した炭化水素代謝産物に起因す
る環境変化に反応する能力を有する。次いで、代謝速度の上昇によって生成した
炭化水素代謝産物とｐＨ指示染料化合物との間の化学反応によって、この指示染
料の色に変化が生じ、この色の変化が、微小滴定プレートの試料ウエル中に収容
される水アリコートに対して栄養素を添加することで生じた微生物の代謝の増大
の測定指標である。次いで、これらの複数のアリコートの色の変化を試験する（
視覚的に観測する）。また、本発明の目的は、種々の濃度の抗微生物剤を与える
ような制御された一連の希釈割合を利用して、特定の汚染された水系、例えば特
定の製紙完成紙料、あるいは製紙用の水中における、特定の抗微生物剤または殺
生物剤またはこれらの抗菌剤または殺生物剤のあらゆる組み合わせの最小阻止濃
度を測定するように設計された手順を含む。

【００２８】発明の要約嫌気性生物によって汚染された水系中で使用するための、殺生物剤または殺生
物薬剤の最小阻止濃度を迅速に測定する方法を開示する。この迅速法によって、
微生物汚染された水流中の嫌気性生物の増殖を制御するための、抗微生物剤ある
いは殺生物剤の単独または組み合わせでの最小阻止濃度を測定する機会がもたら
される。この試験法では、ｐＨ指示染料系を使用し、これが嫌気性生物による炭
化水素代謝の副産物の生成によって生じた環境変化に応答する。本技術によって
、最長１〜２週間を必要とすることがある通常の試験手順とは反対に、約３０分
間から８〜１０時間の期間に回答が得られる。本試験手順では、微小滴定プレー
ト上の複数の試料ウエルの複数のカラムを使用し、汚染された水系、栄養素、ｐ
Ｈ指示染料、および増分および連続希釈濃度の抗菌剤の所定のアリコートを移送
する技術を使用する。

【００２９】発明の説明本方法は、微生物の増殖を制御するために製紙液において使用するのに、どの
殺生物剤／抗微生物剤が最適であるのかを決定する手段である。制御されない微
生物の増殖によって、見えない堆積物が生成し、これによって紙の破損やホール
が引き起こされ、コストのかかる休止時間に至ることがある。最適の薬剤を求め
て試験するときには、その集団の環境における天然の集団に対して試験すること
が重要であり、その集団が存在する動的な系の実際の液体中で試験することが重
要である。これらの複数の因子は両方とも、殺生物剤／抗微生物剤の効率に対し
て影響する。この抗微生物剤は非常にコストがかかり、選択された領域のみにし
か適用できないために、最適の活性の殺生物剤をある系について選択することが
極度に重要である。この試験は、工場の場所で実施しなければならない。これは
、製紙用液体を試験するために設計されたフルサービスの実験室からは数千マイ
ル離れていることがある。搬送の間に、混合された微生物の集団は時間経過によ
って変質し、あるいは液体それ自身が化学的に変質することがある。これらの複
数の因子は両方とも、試験結果に影響し、殺生物剤の適合性の劣化をもたらす。

【００３０】（殺生物剤）殺生物剤という用語は、生物系中で殺害を生じさせ得るあらゆる型の抗生物剤
として本分野において明らかに定義されている。また、殺生物剤という用語は、
本分野において、抗微生物剤（殺生物剤のセブセット）を指しており、抗微生物
剤は阻止的であり、生物の増殖あるいは生物系の活性の代謝を防止する薬剤であ
る。抗微生物剤は、一種以上の殺生物剤、あるいは一種以上の殺生物剤の配合物
を含有するものとして定義される。抗微生物剤は、殺微生物性または静微生物性
をも指しており、殺微生物性は殺生物性を指すことがあり、殺生物性は生物系に
対して殺害性（ｃｉｄａｌ）であることを意味しており、微生物殺害性は、微生
物系に対して殺害性（ｃｉｄａｌ）であることを意味しており、微生物系は生物
系の下位集合である。これらの用語は、工業界で交換可能に使用されており、本
分野の当業者には互いに交換可能であるものと理解されている。

【００３１】殺生物剤の説明を表１に列記するが、本発明はこれらの列記した殺生物剤のみ
には限定されない。本方法は、あらゆる殺生物剤を用いて作用するはずである。

【００３２】

【表１】

【００３３】（栄養素）規定した栄養素は、単純に食物であり、本分野においてあらゆる栄養になる物
として定義されている。栄養になる物は、更に栄養を与えるものとして定義され
ている。栄養は、更に、有機体が食物を摂取および消化するプロセスとして定義
される。

【００３４】栄養培養基という用語は、例えば米国公衆健康協会によって「水および排水を
評価するための標準的方法」において特定され、ＤＩＦＣＯマニュアルから得ら
れるような、本分野の用語である。栄養培養基（普通ブイヨン）は、栄養の一つ
の例であるが、ＤＩＦＣＯまたはＢＢＬのような業者のいずれかから入手可能で
あり、通常は上記「標準的方法」によって要求されるのと同じ成分組成のもので
ある。この成分組成と仕様とは、公衆健康および医学業界において厳密に制御さ
れており、従って栄養培養基という用語は、一般的な用語ではなく、通常使用さ
れる三部のビーフ抽出物から五部のペプトンをある割合で含有する脱水された粉
末混合物を意味しているものと理解されている。栄養培養基は、微生物有機体の
活性および増殖を促進する食物となる栄養素である。栄養培養基は、特別の型の
栄養素である。

【００３５】また、グルコースと乳ハーフアンドハーフ殺菌済クリーマーも栄養素である。
また、グルコースは、デキストロースとしても知られており、単純な結晶糖であ
る。乳ハーフアンドハーフは、連邦規則コード第２１章セクション１３１．１８
０によれば、１０．５％から１８％の乳脂肪分を含有するミルクとクリームとの
混合食品である。超殺菌は、殺菌ミルク条例コードによって、一回２８０°Ｆの
最低温度で２分間にわたって処理されたミルク液として定義されている。上記し
た栄養素を添加することによって、増殖を可能とし、増殖を促進するように設計
し、これによって炭化水素代謝産物を生成させ、抗微生物剤の添加によってこの
増殖が終結するか、あるいは静止状態となるまで、炭化水素代謝産物が前記染料
と反応する。

【００３６】添加した栄養素の機能は、微生物の代謝を促進することによって、微生物、あ
るいはこの生物によって生成した副産物を、前記ｐＨ染料と反応させることであ
る。この反応は、液体中の色の変化によって指示される。本明細書に記載した方
法におけるこの栄養促進剤の目的は、微生物の代謝を促進することである。

【００３７】ほとんどあらゆる栄養素あるいは食物を、種々の微生物を分離し、計数するた
めの物質を製造するための増殖培地、あるいは寒天−寒天を添加した場合には、
寒天培地と呼ぶことができる。本促進剤中に見られる物質は、（クリームは除い
て）寒天増殖培地中で通常使用されている。ほとんどあらゆる食物源が、増殖培
地中で栄養素として働き得る。これらのうちの幾つかは、Ｖ−８ジュース、コー
ンミールであり、環境微生物寒天において通常使用されている。

【００３８】栄養促進剤で使用されている栄養素の濃度は、増殖培地で使用されている濃度
とは異なっている。再び、本栄養素の目的は異なる。促進剤においては、ある者
は微生物の代謝の促進を試みると共に、同時に市販の液体の条件を大きく変化さ
せない。本促進剤液を設計する際には、蛋白質が寒天に見られる濃度で使用した
ときには、ある種の殺生物剤の活性を阻害する場合があり、殺生物剤を不活性化
させ得ることを考慮に入れる。本促進剤液は、この問題点を最小限とするように
設計されており、この一方未だ微生物の代謝を迅速に促進させるものである。

【００３９】本発明の利点の一つは、無菌化に対する要求がなく、従って無菌化のための前
述した条項がないことである。無菌化は行う必要がなく、従って栄養素の添加の
前後に無菌化のための要求がない。更に、実験室での手順には通常付随する無菌
化手順は、必要ではなく、また無菌化手順を現場で達成することはできない。

【００４０】栄養素、液体、物質等の無菌性／無菌化は、本明細書に記載した方法では必要
ではない。市販の水中の集団は短時間で（１〜８時間）測定するので、本方法で
観測される微生物活性をもたらすであろうものは水中の天然の集団である。この
ように時間が短いことは、標準的な殺生物剤選択技術に対して、本方法が優れて
いる点の一つである。

【００４１】典型的には、商業的な水の試験試料中の集団は、１ｍｌ当たり５００，０００
〜１０，０００，０００のコロニー生成単位（ｃｆｕ）の細菌を含有するであろ
う。この集団が５００，０００ｃｆｕ／ｍｌよりも少ない場合には、この試験ウ
エルの内容物は、本方法の８時間以内では反応せず、更に重要なことには、本試
験によって殺生物剤に対して適切な挑戦がもたらされないであろう。少ない数の
細菌は、ほとんどあらゆる市販の抗微生物剤によって非常に容易に殺害できる。
液体１ｍｌ当たりに何百万もの有機体が存在するときに、この集団を制御するこ
とを試みる際に、こうした挑戦がもたらされる。こうした挑戦は、本明細書に記
載する方法によって解決された。

【００４２】無菌条件下で本試験を実施する必要はないけれども、清浄であって、汚染され
ていない材料を使用することは必要である。汚染の兆候を示すあらゆる材料は、
本試験では使用してはいけない。

【００４３】上記したｐＨ指示染料によって処理したアリコート試料へと添加可能な栄養素
は、水との溶液または懸濁液中のあらゆる栄養素、あるいはあらゆる基礎栄養素
混合物があり、グルコース、ショ糖、フルクトース、ビーフ抽出物、ペプトン、
（ビーフ抽出物とペプトンとの組み合わせはしばしば「普通ブイヨン」と呼ばれ
ている）、トリプトン、ミルク、ハーフアンドハーフクリーム、酵母抽出物、あ
るいは上記のあらゆる混合物が挙げられる。特定の抗微生物剤の最小阻止濃度（
ＭＩＣ）を迅速に決定するための我々の方法を採用する際に好適な特定の栄養素
は、グルコース、普通ブイヨンおよびハーフアンドハーフクリームの約１：８：
１０の容積比率の混合物である。しかしながら、これらの栄養素は、互いにあら
ゆる適当な割合で配合でき、微生物有機体の活性を成功裏に促進でき、これによ
って次に代謝速度および炭化水素代謝産物の生成を促進し、これが続いて本発明
のｐＨ指示染料と反応し得る。微小滴定プレート上の液体へと直接に栄養素を添
加することによって、微生物の活性または微生物の呼吸が促進され、本微生物の
代謝速度または代謝プロセスが促進され、上記の結果をもたらす。従って、これ
らの代謝産物のｐＨ指示染料との相互作用によって、有機体の細胞電子輸送系を
通して細胞生存性を監視する。

【００４４】（微小滴定プレート）使用する微小滴定プレートは、好ましくは透明なプラスチック製の板であり、
これは試料ウエルと呼ばれるくぼみを有する複数のカラムを備えており、各カラ
ム内に複数のウエルがある。最も好ましくは、本微小滴定プレートは、少なくと
も２つのカラムを備えており、各カラム内に少なくとも三つの試料ウエルを備え
ている。好ましくは、微小滴定プレートは、約６から約１２のカラムを備えてお
り、各カラムは、約６から約１２の試料ウエルを備えている。しかしながら、ま
たこれらのプレートは、例えば白色セラミック製の板であってよく、あるいは色
の変化を容易に読み取り、可視化するような適切な背景を持つ、他のあらゆる板
状の構成物であってよい。これらのプレートは、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジのコスターコンポレーションから入手可能である。

【００４５】微小滴定プレートの複数のカラムを横断して走る上側列の複数の試料ウエル中
へと、試験される水系からの等量の複数のアリコートを添加する。これらの同じ
列の試料ウエルに対して、所定濃度のｐＨ指示染料、栄養素および抗微生物剤を
添加する。抗微生物剤は、約０．１ｐｐｍの濃度から最大で約５，０００ｐｐｍ
の濃度の範囲内の濃度で添加する。従って、複数のピペットを使用することによ
って、約０．１ｐｐｍから約５，０００ｐｐｍの範囲内の濃度の抗微生物剤を含
有する、連続希釈量の抗微生物剤が、このカラムの各々の中の試料ウエルの各々
へと添加され、これによって各カラムの試料ウエルの各々の中で、生物的に汚染
された試験水と、連続希釈量の抗微生物剤とを含有する試料ウエルが得られる。
抗微生物剤の前あるいは後のいずれかに、既知の量のｐＨ指示染料を各試料ウエ
ルへと添加し、既知の量の栄養培地もこの試料ウエルへと添加する。これによっ
て、各カラム内において、汚染された水系の各アリコートの連続希釈された配列
を含有する試料ウエルが得られ、これへと更に減少していく複数種の量の抗微生
物剤が添加される。次いで、この配列の順に量が減少する抗微生物剤によって、
栄養素とｐＨ指示染料との存在下に、有機体の細胞電子輸送系の活性の上昇を反
映する生物または代謝活性を測定する。各カラムでは、栄養処理された培地のア
リコート試料中に含有される微生物有機体に対して、異なる殺生物剤を試験する
。

【００４６】この微小滴定プレートは複数の試料ウエルを有する別々のカラムを備えており
、この試料ウエルは次に微生物の等量のアリコートおよび等量の栄養素およびｐ
Ｈ指示染料中に連続的に減少する濃度の抗微生物剤を含有しており、次いで微小
滴定プレートを培養し、この培養温度は、微生物有機体によって汚染された試料
が最初に得られた汚染水系の温度とほぼ等価であってよい。実質的に等価の温度
とは、実際の環境温度プラスまたはマイナス約１０〜１５℃を含む意味である。
この培養温度は少なくとも２０℃であるが、通常は約９０℃を越えない。この培
養は、指示染料と環境変化との反応による指示染料の色の変化を生じさせるのに
十分な時間の間行い、この環境変化は、試験媒地中の栄養素による活性の促進に
よって生成した炭化水素代謝の副産物の生成によって引き起こされる。この試料
プレートは、嫌気的に培養しなければならない。レメル（Remel）から購入可能な三菱瓦斯化学社製の「Anaero Pack System」を、現場で使用するために採用で
きる。

【００４７】この培養時間は、約３０分間もの短さであってよく、８〜１０時間もの長さで
あってもよい。この試験時間、好ましくは約４〜８時間は、抗微生物活性につい
ての従来の試験法に比べて、著しく短時間であり、抗微生物剤の最小阻止濃度の
存在についてはるかに感受性である。約３０分間から８〜１０時間の間の好適な
培養時間の後に、本滴定プレートを除去し、この滴定プレートのカラムの各々の
中の各試料ウエル中で生じた色の変化を視覚的に検査して測定する。どの染料を
使用したのかに依存して、処理していないウエルが適切な色に変化したときにプ
レートを読み取る。各カラム中に収容されている抗微生物剤の最小阻止濃度を、
このカラム中の抗微生物剤の濃度が低い濃度から高い濃度へと向かって見たとき
に最初の色の変化が観測されたところで、その水準の濃度で決定する。もちろん
、各カラムは、別々の抗微生物剤（あるいは殺生物剤）あるいはこれらの別々の
混合物を収容している。

【００４８】実験の繰り返しによって、この抗微生物剤で処理した水培地中の微生物有機体
を制御し、制御を維持する最小阻止濃度を確認するまで、異なる初期濃度の抗微
生物剤を使用して、このプロセスを繰り返すことができる。

【００４９】抗微生物剤の最小阻止濃度を測定する我々の方法は、試験される汚染水系が，
パルプおよび製紙工場中の種々の場所から得られた紙料または完成紙料水である
ときに、特に有用であることを発見した。この栄養素は好ましくは普通ブイヨン
、グルコース、乳ハーフアンドハーフ超殺菌クリーマーおよびこれらの混合物か
ら選択されており、この混合物は他の上記した栄養素を含有していてよい。本微
小滴定プレートは、少なくとも３つ、好ましくは４つのカラムを備えており、カ
ラムは各々少なくとも４つ、好ましくは少なくとも８つの試料ウエルを備えてい
る。本微小滴定プレートは、通常はガラス、セラミックスからなっているが、好
ましくは透明なプラスチックであり、あるいは培養温度および時間経過に耐える
ことができ、色を観測および解釈可能な適切な背景をもたらすような他のあらゆ
る媒体である。この処理された滴定プレートは、通常は嫌気的に約３０℃から約
５０℃の範囲内の温度で、約３０分間から約４〜６時間の範囲内の時間にたって
培養する。

【００５０】更に、この培養は、不活性ガス雰囲気、例えば特に窒素、ヘリウム、アルゴン
および二酸化炭素によって得られる雰囲気中で完結させることができる。この培
養を不活性ガス雰囲気中で実施した場合には、更なる結果が得られ、この結果に
よって、嫌気性条件下で汚染された水系下で殺生物剤に対する有機体の応答につ
いての情報が、オペレーターに与えられる。

【００５１】本発明は、嫌気性生物によって汚染された水系中での抗微生物剤の最小阻止濃
度を測定する方法であり、本方法は、（ａ）前記の汚染された水系の試料を得；（ｂ）ｐＨ指示染料を前記試料へと添加し、ｐＨ指示染料が、前記嫌気性生物の
炭化水素代謝産物によって生じた環境変化と反応し；（ｃ）栄養素を前記試料へと添加して、染料処理された栄養素水系を生成させ；（ｄ）前記染料処理された栄養素水系のアリコートを得、（ｅ）試験すべき抗微生物剤の複数の連続希釈を実施し、前記染料処理栄養素水
系の前記アリコートと、前記連続希釈物の各々との混合物を生成させ；（ｆ）前記混合物を、嫌気的に、前記汚染された水系の温度とほぼ等価の温度で
、炭化水素代謝産物によって生じた前記環境変化と前記染料との反応による染料
の色の変化を生じさせるのに十分な時間にわたって培養し；および（ｇ）色の変化を観測することによって、前記汚染された水系中に含まれる嫌気
性生物を阻止する抗微生物剤の最小阻止濃度を測定する各ステップを備えている。

【００５２】更に、嫌気性生物によって汚染された水系は、パルプおよび紙処理水、製紙工
場完成紙料水、製紙工場白水、褐色原料水、製紙工場排水、開放再循環冷却水、
閉鎖再循環冷却水、ボイラー供給水、製糖工場処理水，化学処理流、発酵流食物
処理水、および石油および精製処理水および排水からなる群より選択できる。

【００５３】更に、栄養素は、ハーフアンドハーフ乳クリーマー、酵母抽出物、グルコース
、ショ糖、フルクトース、グリセリン、ビーフ抽出物、ペプトン、トリプトン、
乳およびこれらの混合物からなる群より選択できる。

【００５４】前記連続希釈を実施するのに、この連続希釈物中の前記抗微生物剤の最終濃度
が、染料処理、栄養素処理された水系の全容量に基づいて、約０．１ｐｐｍから
約１０，０００ｐｐｍの範囲内の濃度となるようにすることができる。

【００５５】ｐＨ指示染料は、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ブ
ロモチモールブルー、クロロフェノールレッド、メチレンブルークロリド、メチ
ルレッドおよびフェノールレッドからなる群より選択できる。

【００５６】前記染料処理された栄養素水系の連続希釈物は、各々少なくとも８つのウエル
を備えた少なくとも４つのカラムを備える微小滴定プレート上で培養することが
でき、この培養は、約２５℃から約６０℃の範囲内の温度で、約６０分間から約
２４時間の範囲内の時間にわたって実施する。

【００５７】更に、培養の間、不活性ガスを優先的に含有する雰囲気を、処理される滴定プ
レート上で維持する。

【００５８】この不活性ガスは、ＣＯ₂およびＮ₂からなる群より選択できる。

【００５９】本発明の実施に際しては、ステップ（ｂ）を３０分間から２０時間遅延させる
。

【００６０】汚染された水系中の抗微生物剤の最小阻止濃度を測定するための我々の方法に
ついて、更に情報を提供するために、次の実施例を示す。

【００６１】

【実施例】

パルプ完成紙料、ティッシュ完成紙料あるいは他の完成紙料のいずれかから、
約１００ｍｌの濾過された製紙用の完成紙料を得た。

【００６２】これらの濾過液は、粗いフィルターを通して、例えばティッシュペーパーを通
して、あるいはほぼＵＳＳｔｄＳｉｅｖｅｓｅｒｉｅｓＮｏ．９０のメ
ッシュ径を有するフィルターを通して濾過されたものであり、次いで約５ｍｌの
栄養素溶液と１ｍｌのｐＨ指示染料液とをこれに対して添加する。この栄養素溶
液は、ＢＢＬまたはＤｉｆｃｏの普通ブイヨンからの０．４の乾燥粉末と、１ｇ
のデキスロースとを１００ｍｌの水中に含有するものである。この栄養素液に対
して、地域の小売店で入手可能な超殺菌ハーフアンドハーフクリーマー０．５ｍ
ｌを添加する。このｐＨ指示染料液は、０．１５ｇの染料を１００ｍｌの０．０
１％水酸化ナトリウム中に含有している。次いで、この処理され、濾過された水
性完成紙料液約１５０マイクロリットルを、微小滴定プレートの試料ウエルの各
々の中へと、マルチチャンネルマイクロピペット、例えば"Flow Laboratories" により"Titertek"（登録商標）として供給されているものを使用して注入し、同
じ数のカラムの中に試験すべき殺生物剤調整物がある。"Titertek"は、"Flow La
boratories"の登録商標である。

【００６３】１ｍｌの殺生物剤の１％溶液を、４ｍｌの栄養素−染料−完成紙料を含有する
試料へと添加し、結果として試料中に２０００ｐｐｍの殺生物剤を含有する液を
生成させた。

【００６４】これらの市販あるいは試験殺生物剤としては、ポリアミン類、イソチアゾリン
類、有機硫黄類、四級アミン類、有機臭素類、カルバミン酸塩類、メチレンビス
チオシアン酸類、あるいはこれらの組み合わせ、あるいは他の付加的な既知の殺
生物剤が挙げられるが、これらに限定される必要はない。

【００６５】この２０００ｐｐｍの液体を生成させた直後に、この処理液のうち１５０マイ
クロリットルを除去し、微小滴定プレートの最初の試験カラムの最初の微小試料
ウエル中に収容する。一つのカラムは、殺生物剤によって処理せずに残す。次い
で、この微小滴定試料ウエル中で生成した液体を、ピペットを使用してその中に
吸い上げ、２回または３回殺生物剤溶液を移送し、同じ試料ウエル中へと戻し、
これによって液体を混合させた。混合後、１５０マイクロリットルの混合物をこ
の最初の試料ウエルから除去し、これと同じカラム中の次のより低い試料ウエル
中へと配分する。再び、この混合手順を行い、この第二の試料ウエル中の液１５
０マイクロリットルの最後の除去を、マイクロピペットを使用して除去する。こ
の列の第二のアリコートを、微小滴定プレート上の（同じカラム中の）第三の試
料ウエル中に収容する。一つのカラム中の試料ウエルのすべてが、これに添加さ
れ、これと混合される連続希釈濃度の抗微生物剤（殺生物剤）を含有するに至る
まで、この手順を繰り返す。カラム中の最後の試料ウエルから採取した最後の１
５０マイクロリットルのアリコートを廃棄する。

【００６６】試験すべきすべての殺生物剤に対して、各カラム中でこの手順を繰り返す。一
つのカラムの試料ウエルを処理せずに残し、ブランクとして働かせる。即ち、試
験液、栄養素、ｐＨ染料を含有しているが、殺生物剤または抗微生物剤をまった
く添加していない試験カラムとして働かせる。

【００６７】次いで、複数の試料ウエルの複数のカラムを備えた微小滴定プレートを培養す
る。この技術の実施のための温度は、好ましくは、試験されるプロセス流で生ず
る温度プラスあるいはマイナス約１０〜１５℃である。これらの温度は、通常は
約２０℃から約８０℃の範囲内であり、通常は約２５℃から約３０℃から約５０
〜６０℃である。この微小滴定プレートは、二酸化炭素環境中で嫌気的に培養さ
れるべきものであるので、即ち、このプレートは、培養前に、例えば三菱瓦斯化
学社から入手可能な「Anaero Pack System」によってもたらされるような嫌気性
環境中に収容される。この市販の装置は、試料上で空気中の酸素の二酸化炭素お
よび水への変換を生じさせ、これによってＣＯ₂雰囲気をもらたす。

【００６８】上記の手順に続いて、濃度勾配、即ち抗微生物剤の連続希釈濃度は、最初の高
濃度の試料ウエルにおける約１０００ｐｐｍから、最も低い濃度の試料ウエルに
おける約８ｐｐｍ（あるいはそれ以下）まで変化する。染料の存在下では、十分
な抗微生物剤を含有していないウエルは、第二の色に変化する。十分な抗微生物
剤を含有するものは、最初の色のままに留まる。対照例のウエル（非処理）のす
べてが染料の終点の色、即ち黄色または透明である場合に、試験結果を読み取る
。連続希釈した試料ウエルにおける濃度を、処理していないウエルの濃度と比較
することによって、各抗微生物剤に対するＭＩＣを、試験した試料中の微生物有
機体の増殖を制御する抗微生物剤の濃度が最も低い試料ウエルで視覚的に測定で
きる。

【００６９】本試験法に対して反応することが発見された細菌、および特に製紙工場、冷却
塔で通常見いだされる細菌としては、クロストリディア（Clostridia）、硫酸塩
還元菌（Sulfate-Reducing Bactreia）およびクレブシエラ（Klebsiella）が含まれることを見いだした。抗微生物剤または殺生物剤の初期濃度を適切に選択す
ることによって、約１０，０００ｐｐｍから、１ｐｐｍまでおよび１ｐｐｍ以下
の濃度を含む範囲内の濃度でこれらの殺生物剤をスクリーニングすることが可能
である。

【００７０】次の実施例は、本発明の好適な実施形態と利用方法とを説明するために示した
ものであり、本明細書に添付する請求の範囲に他に記載しない限り、本発明を制
限することを意図するものではない。

【００７１】実施例１本実験を実施するために、パルプおよび製紙工場から得た濾過白水のｐＨを、
水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用して６．５に調節した。このｐＨ調節後の完
成紙料の１００ｍｌのアリコートを、５ｍｌの水和した"MiniTox"栄養液（登録商標：イリノイ州ネイパーヴィルのナルコケミカル社から入手可能：０．４ｇの
普通ブイヨン、１．０ｇのデキストロース、１００ｍｌの水を含有する）、１ｍ
ｌの０．１５％クロロフェノールレッド、および０．５ｍｌのハーフアンドハー
フクリーマーと共に、"Whirlpak"(登録商標) バッグ中に収容した。色が均一に分散されるまで、この溶液を完全に混合した。この溶液は、以降は、"AnnaTox" 処理完成紙料と呼ぶ。

【００７２】１５０μｌの"AnnaTox"処理した完成紙料を、微小滴定トレイの各ウエルの中に添加した。次いで、４ｍｌの"AnnaTox"処理した完成紙料を、１０ｍｌのビーカー中に収容した（スクリーニングする各殺生物剤に対して、ビーカーを一個）
。次いで、１ｍｌの１％（重量に基づいて）の殺生物剤液を各ビーカー中に添加
し、混合した。直ちに１５０μｌを除去し、このカラムで連続希釈を開始した。
このカラムの末端において、１５０μｌを廃棄した。この手順を、目的とするす
べての殺生物剤に対して繰り返した。一列のウエルは殺生物剤によって処理せず
、対照例として働かせた。

【００７３】次いで、このトレイを透明テープによって封止して蒸発を防止し、３７℃で攪
拌せずに、対照例が黄色に変化するまで嫌気的に培養した。周期的にトレイの赤
から黄色への色の変化を検査した。クロロフェノールレッドは、ｐＨ６．８では
完全な赤色であり、ｐＨ５．１では完全な黄色である。試料中に存在する嫌気性
細菌の集団の発酵性副産物によって、ｐＨの低下が達成される。殺生物剤がない
場合には、試料中の嫌気性集団の型に依存して、色の変化は１〜２４時間以内に
生じ得る。殺生物剤がこうした細菌の阻止または殺害のいずれかにおいて有効で
ある場合には、色の変化は観測されないであろう。いったんすべての対照例のウ
エルが黄色に変化したときに、最小阻止濃度を読み取る。下のウエルが黄色に変
化したときの濃度を、最小阻止濃度として読み取る。これは、この特定の点で、
作用効果を得るのに十分な殺生物剤が添加されていなかったことを示している。
従って、殺生物剤による処理の有効性について、定量的な測定が可能である。

【００７４】この色の変化が実際のｐＨの変化に起因するものであり、他の外部からの影響
によるものではないことを確証するために、"AnnaTox"法を使用して実験を設定した：そして、ＭＩＣを読み取った後にｐＨを測定した。この結果が示すところ
によれば、平均すると、ＭＩＣの示度は、複数の濃度の間のｐＨの顕著な低下に
対応していた。表９および結果に参照される。

【００７５】このｐＨの変化が細菌の増殖に由来するものであり、ＣＯ₂の捕捉や他の影響によるものではないことを決定するために、完成紙料を３０分間１２１℃でアッ
セイの実施に先立ってオートクレーブ加熱した。透明テープを使用してウエルを
蒸発しないように封止する代わりに、数滴のパラフィンワックスを各ウエル内で
使用した。オートクレーブ加熱していない完成紙料について、並行してこの試験
を実施した。また、パラフィンを使用してウエルを封止した。オートクレーブ加
熱していない試料における殺生物剤の有効性に関する限り、ＭＩＣは通常の変動
を示した。無菌化された化について実施したアッセイでは、２１時間の期間にわ
たって色の変化は見られなかった。この時点で試験を終結させた。

【００７６】また、この試験手順を利用して、殺生物剤を添加した後に、どれほどの数の微
生物が生存しているかを定量的に測定できる。アリコートを各試料ウエルから採
取し、標準的な平板培養法を利用して細菌の係数を測定する。

【００７７】本試験を嫌気性条件下に実施することを銘記することが重要である。言及する
細菌増殖には、絶対嫌気菌および条件的嫌気菌が含まれる。絶対嫌気菌は、酸素
を利用できない微生物であり、条件的嫌気菌は、酸素なしで、あるいは酸素を使
用して増殖できる微生物である。

【００７８】本手順は、次のｐＨ指示薬のいずれを使用しても実施できる。

【００７９】

【表２】

【００８０】相異なる指示薬を使用することの利点は、試験される試料のｐＨを大きく調節
する必要がなく、むしろ試験するべき問題の特定系の固有ｐＨの観点から選択で
きることである。

【００８１】上記した実験手順を使用して、サウスイースタンパルプおよび製紙工場から得
た紙料について、表３でＭＩＣを測定した。

【００８２】

【表３】

【００８３】実施例２実施例１に記載した手順を利用して、異なるサウスイースタンパルプおよび製
紙工場から得た紙料を試験することによって、表４の結果を得た。

【００８４】

【表４】

【００８５】実施例３実施例１に記載した手順を利用して、別のサウスイースタンパルプおよび製紙
工場から得た異なる紙料を試験することによって、表５の結果を得た。

【００８６】

【表５】

【００８７】実施例４実施例１に記載した手順を利用して、更に別のサウスイースタンパルプおよび
製紙工場から得た紙料を試験することによって、表６の結果を得た。

【００８８】

【表６】

【００８９】実施例５実施例１に記載した手順を利用して、更に別のサウスイースタンパルプおよび
製紙工場から得た紙料を試験することによって、表７の結果を得た。

【００９０】

【表７】

【００９１】実施例６実施例１に記載した手順を利用して、更に別のサウスイースタンパルプおよび
製紙工場から得た異なる紙料を試験することによって、表８の結果を得た。

【００９２】

【表８】

【００９３】実施例７表９は、殺生物剤を系に対して種々の濃度で添加したときに、ｐＨの変化が生
ずることを示す。各々の場合において、破壊点ｐＨは肉太活字印刷で示す。殺生
物剤を添加していない場合には（Ｈ）、系中で顕著なｐＨ変化は明らかではなか
った。本発明の方法で指示染料が応答するのは、このｐＨの変化である。

【００９４】

【表９】

【００９５】本明細書に記載した本発明方法の組成、操作および装置には、次の請求の範囲
に規定した本発明の思想および範囲を離れることなく、変更を加えることができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ＯｎｅＮａｌｃｏＣｅｎｔｅｒ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ 60563−1198，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａＦターム(参考） 4B063 QA06 QA18 QQ06 QQ18 QQ61 QQ98 QR50 QR66 QR69 QS24 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】嫌気性生物によって汚染された水系中での抗微生物剤の最小
阻止濃度を測定する方法であって、（ａ）前記の汚染された水系の試料を得；（ｂ）ｐＨ指示染料を前記試料へと添加し、ｐＨ指示染料が、前記嫌気性生物の
炭化水素代謝産物によって生じた環境変化と反応し；（ｃ）栄養素を前記試料へと添加して、染料処理された栄養素水系を生成させ；（ｄ）前記染料処理された栄養素水系のアリコートを得、（ｅ）試験すべき抗微生物剤の複数の連続希釈を実施し、前記染料処理栄養素水
系の前記アリコートと、前記連続希釈物の各々との混合物を生成させ；（ｆ）前記混合物を、嫌気的に、前記汚染された水系の温度とほぼ等価の温度で
、炭化水素代謝産物によって生じた前記環境変化と前記染料との反応による染料
の色の変化を生じさせるのに十分な時間にわたって培養し；および（ｇ）色の変化を観測することによって、前記汚染された水系中に含まれる嫌気
性生物を阻止する抗微生物剤の最小阻止濃度を測定する各ステップを含む方法。
【請求項２】前記嫌気性生物によって汚染された水系が、パルプおよび紙
処理水、製紙工場完成紙料水、製紙工場白水、褐色紙料水、製紙工場排水、開放
再循環冷却水、閉鎖再循環冷却水、ボイラー供給水、製糖工場処理水、化学処理
流、発酵流食物処理水、および石油および精製処理水および排水からなる群より
選択されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記栄養素が、ハーフアンドハーフ乳クリーマー、酵母抽出
物、グルコース、ショ糖、フルクトース、グリセリン、ビーフ抽出物、ペプトン
、トリプトン、乳およびこれらの混合物からなる群より選択されている、請求項
１記載の方法。
【請求項４】前記連続希釈を実施するのに、この連続希釈物中の前記抗微
生物剤の最終濃度が、染料処理および栄養素処理された水系の全容量に基づいて
、約０．１ｐｐｍから約１０，０００ｐｐｍの範囲内の濃度となるようにする、
請求項１記載の方法。
【請求項５】前記ｐＨ指示染料が、ブロモクレゾールパープル、ブロモク
レゾールグリーン、ブロモチモールブルー、クロロフェノールレッド、メチレン
ブルークロリド、メチルレッドおよびフェノールレッドからなる群より選択され
ている、請求項１記載の方法。
【請求項６】前記染料処理された栄養素を有する水系の前記連続希釈物を
微小滴定プレート上で培養し、微小滴定プレートが、各々少なくとも８つのウエ
ルを有するカラムを少なくとも４つ備えており、前記培養を、約２５℃から約６
０℃の範囲内の温度で、約６０分間から約２４時間の範囲内の期間にわたって実
施する、請求項１記載の方法。
【請求項７】培養の間、不活性ガスを主として含有する雰囲気を、処理さ
れた滴定プレート上で維持する、請求項６記載の方法。
【請求項８】前記不活性ガスが、ＣＯ₂およびＮ₂からなる群より選択され
ている、請求項７記載の方法。
【請求項９】ステップ（ｂ）を３０分間から２０時間遅延させる、請求項
１記載の方法。