ES2294787T3 - Dispositivo y metodo para detectar microorganismos. - Google Patents

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David E. Trogdon
Thurman C. Thorpe
Christopher S. Ronsick
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Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO Y UN RECIPIENTE SELLABLE ESTERILIZABLE (36) PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN UN ESPECIMEN, CONTENIENDO EL RECIPIENTE UN MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO Y UN SENSOR (37) CON UN MEDIO INDICADOR EN SU INTERIOR. EN UNA PARED DEL RECIPIENTE SE SUMINISTRA UNA MEMBRANA PERMEABLE A GASES (31) CON UN SELLO DESMONTABLE IMPERMEABLE A GASES (32) SOBRE ELLA. SI EL MICROORGANISMO QUE VA A SER DETECTADO ES UN ORGANISMO ANAEROBIO, ENTONCES EL SELLO IMPERMEABLE A GASES (32) SE MANTIENE EN SU SITIO. SI EL MICROORGANISMO QUE VA A SER DETECTADO ES UN ORGANISMO AEROBIO, ENTONCES EL SELLO IMPERMEABLE A GASES (32) SE RETIRA PARA PERMITIR EL PASO DE OXIGENO HACIA EL INTERIOR DEL RECIPIENTE. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, LA MEMBRANA PERMEABLE A GASES (31) PERMITE EL PASO DE OXIGENO HACIA EL INTERIOR DEL RECIPIENTE, MIENTRAS QUE RESTRINGE AL MENOS PARCIALMENTE EL PASO DE DIOXIDO DE CARBONO HACIA EL EXTERIOR DEL RECIPIENTE. LOS CAMBIOS EN EL MEDIO INDICADOR QUE SE PRODUCEN COMO RESULTADO DE UN CAMBIO EN LA PRODUCCION DE GASES (CO SUB,2}, NH SUB,2}, H SUB,2}S, ETC.), LA PRODUCCION DE ACIDOS VOLATILES O LA CONCENTRACION DE PH EN EL MEDIO, SON DETECTADOS DESDE EL EXTERIOR DEL RECIPIENTE.

Description

Dispositivo y método para detectar microorganismos.
La presente invención proporciona un procedimiento y un dispositivo para detectar/vigilar cambios en pH, producción de gases (CO_{2}, NH_{2}, H_{2}S, etc.) o producción de ácidos volátiles de un espécimen usando un medio de crecimiento y un recipiente cerrado sin entrada al recipiente después de que se prepare la muestra y se añada al recipiente. Como ventaja adicional, se proporciona en la pared de la vasija una membrana permeable a los gases con un cierre removible impermeable a los gases en la misma. Si el microorganismo que se ha de detectar es un organismo anaerobio, entonces el cierre impermeable a los gases se deja en su sitio. Si el microorganismo que se ha de detectar es un organismo aerobio, entonces el cierre impermeable a los gases se retira de manera que permite el paso de oxígeno a la vasija. En una realización preferida, la membrana permeable a los gases se construye de manera que resista presión positiva o negativa elevada dentro de la vasija, y/o que permita el paso de oxígeno a la vasija al tiempo que restringe al menos parcialmente el paso de dióxido de carbono al exterior de la vasija. Se proporciona un sensor que cambia como consecuencia de las diferencias en concentraciones de gases, ácido volátil y/o pH dentro de la vasija (por ejemplo, dentro del medio en la vasija).
Antecedentes de la invención
La presencia de microorganismos en especímenes clínicos se determina convencionalmente cultivando los especímenes en presencia de nutrientes y detectando la actividad microbiana a través de cambios en el espécimen o en la atmósfera sobre el espécimen después de un período de tiempo. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. 4.182.656 a Ahnell y col. se coloca la muestra en un recipiente con un medio de cultivo que comprende un substrato fermentable marcado con carbono 13. Después de cerrar el recipiente y de someter al espécimen a condiciones que conducen a actividad biológica, se determina la relación de carbono 13 a carbono 12 en la atmósfera gaseosa sobre el espécimen y se compara con la relación inicial. En la patente de EE.UU. 4.152.213, se reivindica un procedimiento por el que se determina la presencia de bacterias que consumen oxígeno en un espécimen en un recipiente cerrado detectando la reducción en la cantidad de oxígeno en la atmósfera sobre el espécimen a través de la vigilancia de la presión del gas en el recipiente. La patente de EE.UU. 4.073.691 proporciona un procedimiento para determinar la presencia de agentes biológicamente activos, incluso bacterias, en un contenedor cerrado que contiene un medio de cultivo midiendo cambios en las características de la atmósfera gaseosa sobre el espécimen después de un período de tiempo. Un procedimiento para detección no invasiva de cambios de CO_{2} en la atmósfera gaseosa se enseña por Suppman y col., como se describe en el documento EP0104463. Los procedimientos y aparatos que se describen en estas y otras publicaciones requieren todos ellos o un procedimiento radiométrico o la invasión del recipiente cerrado para medir cambios
en la atmósfera gaseosa después del cultivo o requieren materiales especiales que permitan que pase luz infrarroja.
Otros procedimientos conocidos para medir presencia microbiana en especímenes, particularmente cultivos de sangre, incluyen medir cambios mínimos en temperatura, pH, turbidez, color, bioluminiscencia, e impedancia. Generalmente, estos procedimientos determinan la presencia o el crecimiento microbianos detectando subproductos metabólicos bacterianos. La presencia microbiana también se puede evaluar mediante subcultivo y/o tinción. De estos procedimientos, solamente la impedancia, radiometría y espectrometría infrarroja proporcionan la posibilidad de procesamiento automatizado de especímenes clínicos. Y excepto para la impedancia y las mediciones infrarrojas, estos procedimientos también requieren entrar en el recipiente a fin de hacer una medición sobre el espécimen líquido o la atmósfera gaseosa sobre el espécimen.
Además de la probabilidad de contaminación y la creación de la probabilidad de alterar la constitución de la atmósfera sobre el espécimen cada vez que se hace una determinación, estos procedimientos no permiten tomar mediciones continuamente ni repetidamente a intervalos de tiempo cortos durante un período de tiempo prolongado. Esto es un inconveniente significativo puesto que la velocidad de crecimiento de los organismos difiere, dependiendo del organismo y del número de organismos en la muestra original, de manera que no se puede predecir cuando se van a presentar cambios detectables en la atmósfera o muestra fluida. En un problema relacionado, cuando se determina el crecimiento del organismo mediante cambios de pH en la muestra líquida, diversos productos metabólicos afectarán de manera diferente al pH de la muestra. Por ejemplo, la producción de amoníaco subirá el pH mientras que la producción de CO_{2} lo bajará. Diferentes velocidades de crecimiento de diferentes organismos podrían dar como resultado un aumento de pH una vez y una disminución otra vez, que no se detectarían si el pH se mide a intervalos ampliamente espaciados. Otra fuente de error cuando se detectan cambios mediante medición de pH en muestras de sangre entera, particularmente cuando el medio para la determinación de pH es un colorante indicador, es la probabilidad de que el aspecto del colorante pueda ser afectado u oscurecido por la presencia de células sanguíneas. Indicadores colorimétricos solamente se pueden usar eficazmente si se puede prevenir que los errores inducidos por la naturaleza del espécimen influyan en el aspecto del colorante.
Cuando el agente biológicamente activo es un organismo aerobio, se tiene que proporcionar un sistema para garantizar suficiente oxígeno dentro de la vasija de manera que pueda tener lugar actividad biológica. Una manera de proporcionar oxígeno a la vasija es añadiendo oxígeno a la atmósfera dentro de la vasija que contiene el medio de cultivo, en el momento de fabricación de la vasija. Entonces, cuando se añade un espécimen a la vasija por el usuario de la vasija, ya estará presente oxígeno dentro de la vasija. (Sin embargo, un problema con este procedimiento es que la vida en almacenamiento de vasijas de este tipo, que contienen oxígeno y medios de cultivo previamente añadidos, es corta).
Otro procedimiento para proporcionar oxígeno a la vasija cuando el microorganismo es un organismo aerobio, es mediante "adición" a la vasija en el momento de hacer el cultivo del organismo. A menudo, una aguja o una cánula perforan un tapón sobre la vasija de manera que permiten un flujo libre de oxígeno a la vasija durante el cultivo. Sin embargo, un problema con este procedimiento es que requiere una etapa extra, cierta habilidad por parte del usuario para perforar la vasija, y tiene cierto de peligro de contaminación del espécimen o de lesión al usuario por la aguja. Asimismo, si el procedimiento de cultivo incluye batido para oxigenar mejor el medio de cultivo, hay que tener cuidado de que el medio de cultivo líquido no pierda fuera de la vasija a través de la aguja. Asimismo, una vasija perforada no permitiría controlar el paso de dióxido de carbono fuera de la vasija (siendo deseables los cambios en dióxido de carbono dentro de la vasija para indicar la presencia de un microorganismo particular).
El documento US 5372936 describe un procedimiento para detectar actividad biológica en un espécimen. En el procedimiento se introducen el espécimen y el medio de cultivo en un contenedor que se puede cerrar y se exponen a condiciones que posibilitan que tengan lugar procesos metabólicos en presencia del microorganismo en la muestra. Se mide la actividad biológica por medio de optodos que están en contacto directo con el sustrato que se ha de evaluar. En ciertas realizaciones los optodos están separados del medio de cultivo por medio de una membrana.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo y un procedimiento para detectar la presencia de microorganismos en especímenes clínicos, tales como sangre u otros fluidos corporales, cultivando los especímenes con un medio de crecimiento estéril en un recipiente transparente estéril que tiene una membrana permeable a los gases. La presencia de microorganismos se determina detectando o midiendo cambios en el pH del espécimen o la producción de gases (por ejemplo CO_{2}) o ácidos volátiles dentro del recipiente usando un sensor desechable fijado en la superficie interior del recipiente. Según la invención, se pueden detectar microorganismos en presencia de materiales que interfieren, tales como grandes concentraciones glóbulos rojos sanguíneos, por medios no invasivos.
En la presente invención, se puede retirar un cierre impermeable a los gases de la membrana permeable a los gases cuando la vasija se ha de usar para cultivo de de organismos aerobios. En caso contrario, si se deja el cierre en su sitio, la vasija se puede usar para el cultivo de organismos anaerobios. La membrana permeable a los gases permite el paso de oxígeno a la vasija, preferiblemente resiste altas presiones positivas o negativas y restringe en grado suficiente el paso de dióxido de carbono al exterior de la vasija y restringe completamente el paso de medio líquido al exterior de la vasija, incluso durante el tratamiento en autoclave y batido de la vasija.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras consisten en lo siguiente:
Figura 1 Instrumento de cultivo sanguíneo
Este dibujo muestra el aspecto global de la parte funcional del instrumento, el ensamblaje detector, con (1) vasija, (2) sensor, (3) medio de cultivo, (4) fuente de luz, (5) fotodetector, y los componentes electrónicos asociados que incluyen (6) fuente de corriente, (7) convertidor de corriente a tensión y (8) filtro de paso bajo.
En una realización, cada ensamblaje detector consiste en un fotodiodo en un agujero avellanado y uno o más LED ordenados de tal manera que la luz cae sobre la superficie que se ha de visualizar, pero no directamente sobre el propio detector. Los circuitos electrónicos en esta realización incluyen amplificadores y filtros para acondicionar las señales de los detectores, multiplexores para que seleccionen entre las señales disponibles, y fuentes de corriente constante para los iluminadores.
Durante la operación, el dispositivo entero se coloca sobre un agitador dentro de una incubadora, que proporciona un entorno adecuado para crecimiento microbiano y excluye la luz ambiental de los fotodetectores.
Figura 2 Sensibilidad al pH
Además de probar el instrumento subjetivamente con diversas botellas coloreadas, se probó con botellas de membranas sensibles al pH. Esta figura muestra la tensión media de salida de siete detectores diferentes después del equilibrado del sensor con diversos tampones en un intervalo de pH de 5,8 a 8,2. Estudios detallados mostraron que el sistema podía distinguir con fiabilidad cambios de 0,1 unidades de pH en un intervalo de pH de 6,0 a 7,5.
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Figura 3 Cambio de pH y atmósfera con el crecimiento microbiano
Se usó el instrumento para detectar crecimiento microbiano tanto mediante cambio de pH como mediante producción de gas o componente volátil. Esta figura muestra el cambio en pH y en CO_{2} que resulta del crecimiento de la bacteria E. coli.
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Figura 4 Detección de una diversidad de microorganismos
Esencialmente todos los organismos liberarán gases o ácidos volátiles en el curso de su metabolismo. Así, este sistema se puede usar para detectar el crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Esta figura muestra la detección de gases (CO_{2}) y/o ácidos volátiles producidos durante el crecimiento de E. coli, una bacteria Gram negativa; S. piogenes, una bacteria Gram positiva; P. aeruginosa, una bacteria no fermentativa Gram negativa; B. fragilis, una bacteria anaerobia; y C. albicans, una levadura. Las unidades indican la concentración relativa de gas en el medio sobre la base de la concentración de CO_{2} al inicio del análisis. Dado que los recipientes de las muestras y los medios están a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC), y el recipiente y la muestra se incuban a 37ºC durante el análisis, se libera CO_{2} al espacio encima de la muestra líquida y el medio durante las primeras 2 a 4 horas debido a la reducida solubilidad del CO_{2} en el líquido a medida que la temperatura aumenta. A menos que los recipientes y los medios se mantengan a la temperatura más alta antes de la introducción de la muestra y su colocación en el instrumento, no se puede medir una indicación fiable de la presencia de microorganismos hasta que se sobrepase el mínimo de concentración de CO_{2}, típicamente dentro de las primeras 2 a 4 horas.
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Figuras 5A-5D
Las Figuras 5A-5D ilustran una realización de la membrana permeable, en la que se dispone la membrana permeable dentro de una cavidad en un tapón de la botella que tiene el sensor en el mismo.
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Figura 6
La Figura 6 es una vista en sección transversal de un tapón que tiene una membrana permeable particular y rejilla de soporte.
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Figuras 7A y 7B
La Figura 7A es una vista desde arriba de una de las rejillas de soporte para la membrana permeable, y la Figura 7B es una vista despiezada de los soportes de la membrana.
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Figuras 8A-8C
Las Figuras 8A-8C son vistas de rejillas de soportes de membranas para sujetar una membrana moldeada con una junta tórica.
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Figura 9
La Figura 9 es una vista en sección transversal de la botella de cultivo de la presente invención que tiene el sensor y la membrana permeable en la misma.
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Figuras 10A y 10B
La Figura 10A ilustra la botella de cultivo con la abertura de la botella en el centro de la tapa de la botella, y en la Figura 10B, la abertura de acceso de la botella está descentrada.
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Figura 11
La Figura 11 ilustra la botella de cultivo de la presente invención que tiene el sensor en la misma, así como la membrana permeable a los gases y un cierre removible impermeable.
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Figuras 12A-12C
Las Figuras 12A-12C ilustran una realización adicional de la membrana permeable a los gases dentro de la tapa de la botella de cultivo.
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Figuras 13A y 13B
Las Figuras 13A y 13B ilustran una realización de la invención en la que la rejilla y la membrana permeable tienen forma de C.
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Figura 14
La Figura 14 es una vista en sección transversal de características particulares de la tapa de la botella de cultivo y del anillo de retención para la membrana permeable.
Figuras 15A y 15B
Las Figuras 15A y 15B son ilustraciones de secciones transversales de realizaciones adicionales del anillo de retención para la membrana permeable.
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Figura 16
La figura 16 es una ilustración de la botella de cultivo en conjunto.
Descripción de realizaciones preferidas
El aparato y el dispositivo de la invención proporcionan un medio no invasivo para detectar la presencia de microorganismos en especímenes clínicos, tales como muestras de sangre y otros fluidos corporales, y en especímenes no clínicos midiendo el incremento en productos metabólicos producidos por microorganismos. El espécimen se añade a un medio especialmente formulado que realza la producción de ciertos productos metabólicos microbianos, que son detectados por un sensor único desechable situado en el fondo de un recipiente de cultivo o en el medio de cierre del recipiente. El sensor comprende una composición sólida o membrana, a la que se hace referencia como un medio de unión o soporte, con un medio indicador inmovilizado sobre ella o dentro de ella. El sensor se sitúa enrasado con la superficie interna de un recipiente, en el medio de cierre que se usa para cerrar el recipiente o unido al medio de cierre, de manera que el medio indicador sea visible desde el exterior. Se puede fijar al recipiente para prevenir que las células, proteínas, otros sólidos u otros componentes coloreados se pongan entre él y la superficie del recipiente. En ciertas realizaciones el sensor está separado del espécimen y su medio de crecimiento por una membrana o capa sólida que permite el paso de moléculas de gas, pero que previene el paso de iones.
Una realización de esta invención comprende un medio de cierre, tal como una tapa o cubierta, que puede ser transparente o que puede tener una sección transparente. El sensor se puede colocar en las proximidades de la tapa o la sección de la tapa transparente o se puede hacer parte de la tapa. Cuando se usa la tapa para cerrar el recipiente, los cambios en el indicador se leen a través del medio de cierre transparente. Una ventaja que se observa para esta realización es que puede ser ésta la manera más económica para producir los recipientes a gran escala.
El medio de cierre también se puede hacer de un material, tal como un polímero, que contiene micelas de indicador encapsuladas. No se necesita una sección transparente ni en el recipiente ni en el medio de cierre, siempre que el material sea permeable a los productos metabólicos de los microorganismos y los cambios en el indicador sean visibles sobre la superficie del medio de cierre.
Los microorganismos en especímenes de fluidos corporales, tales como sangre, que contienen tan poco como 1 organismo por mililitro, pueden ser detectados usando esta invención. Especímenes de este tipo pueden requerir hasta 7 días de incubación antes de que la población de organismos alcance un nivel crítico cuando se pueda medir un aumento en productos metabólicos. Los autores de la presente invención han encontrado que una concentración de 10^{6} CFU/ml para ciertos tipos de organismos proporcionó cambios medibles en pH y CO_{2}. Todos los organismos mostraron resultados medibles a concentraciones de 10^{7} a 10^{8} CFU/ml.
El sensor es útil porque: 1) los productos metabólicos microbianos se miden en la fase líquida de la botella de cultivo en lugar de en la atmósfera encima del espécimen, 2) dado que el sensor único desechable se fija a la superficie interior de la botella o la junta de estanqueidad o medio de cierre de la botella o se une a través del exterior de la junta de estanqueidad o medio de cierre, se pueden hacer mediciones desde el exterior de la pared transparente de la botella o del medio de cierre sin tener que violar la integridad de la botella, 3) las mediciones externas se pueden hacer mediante inspección visual o con un instrumento que mida mediante reflectancia, 4) componentes opacos o coloreados en el espécimen no interfieren con la capacidad del sensor para detectar cambios ni para la medición de estos cambios, y 5) se mantiene una alta concentración de moléculas de indicador dentro de un pequeño volumen en el sensor, es decir, dentro de la emulsión de polímero o sobre la membrana, de manera que se puede observar fácilmente un cambio de color.
Los componentes nutricionales que integran un medio microbiano complejo influyen en las trayectorias metabólicas usadas por los microorganismos. Se producen ácidos orgánicos, bases y diversos gases en proporciones que dependen de los nutrientes disponibles. Estos productos también varían de unas especies de microorganismos a otras. La presencia estos productos en el medio líquido puede cambiar su pH. Los sensores usados en la invención contienen indicadores sensibles al pH que dan un cambio medible en respuesta a un cambio de pH en el entorno. En la realización en la que el sensor de pH está cubierto por una membrana permeable a los gases, impermeable a los iones, se mide la presencia de gases que afectan al pH del indicador, tal como CO_{2}. Así, se puede detectar el crecimiento microbiano tanto por los cambios en pH del medio de cultivo líquido como por la medición de gases disueltos en el medio, ambas indicaciones están producidas por productos metabólicos gaseosos producidos por microorganismos. El dióxido de carbono es un metabolito común producido por la mayoría de los organismos y, por lo tanto, es el metabolito preferido para detección de crecimiento microbiano.
Los sensores de CO_{2} y pH comparten dos componentes comunes, una especie molecular útil como indicador de pH y un medio de unión/soporte. El indicador de pH puede estar unido al medio de soporte bien de modo covalente o de modo no covalente. Alternativamente, el indicador puede estar encapsulado dentro de una matriz de polímero de manera que esté emulsionado dentro de una matriz de polímero antes del curado. Para que se comporte como un sensor de pH, el indicador tiene que estar en contacto con el medio líquido. El sensor de CO_{2} tiene un tercer componente, una sustancia semipermeable que separa completamente la membrana indicadora del espécimen y el medio de crecimiento. La capa semipermeable puede ser una membrana separada, alternativamente, el polímero curado adyacente al espécimen y al medio de crecimiento puede formar un membrana semipermeable integral. Estos sensores se fijan por dentro de una vasija transparente adecuada o un medio de cierre transparente con un adhesivo apropiado. También pueden comprender una parte integral del medio de cierre o se pueden fijar al medio de cierre o dentro de la vasija como un indicador emulsionado dentro de una matriz de polímero curada in situ. También se pueden colocar fuera del recipiente, siempre que se proporcione un procedimiento que permita que los productos metabólicos de los microorganismos o del medio de crecimiento que contiene el espécimen se pongan en contacto con el sensor.
Se puede usar una diversidad de indicadores de pH fluorescentes y visibles como especies moleculares activas en sensores de pH y CO_{2}. Generalmente, las únicas limitaciones en la selección de indicadores son los requisitos de que tengan intervalos dinámicos de pH aceptables y cambios de longitud de onda que sean fácilmente detectables mediante tecnologías existentes de fluorescencia o reflectancia de superficie frontal.
Sensores para detectar cambios de pH en el medio de cultivo según la invención preferiblemente exhiben un cambio en intensidad de fluorescencia o color visible sobre un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a 8,0.
Indicadores para el sensor de CO_{2} deberían exhibir un cambio en intensidad de fluorescencia o color visible preferiblemente entre aproximadamente pH 13 y aproximadamente 5, y lo más preferiblemente entre aproximadamente pH 13 y aproximadamente 9, a fin de detectar cambios en concentración de CO_{2}.
Solamente ciertas moléculas indicadoras de pH se pueden unir de modo covalente o de modo no covalente a un medio de soporte y conservar sus propiedades indicadoras de pH. Son útiles los indicadores que pertenecen a los grupos xanteno, fenolftaleína y fenolsulfonftaleína. Ejemplos de éstos incluyen fluoresceína, cumarina, fenolftaleína, timolftaleína, azul de bromotimol, azul de timol, azul de xilenol y \alpha-naftol benceína.
El medio de unión/soporte puede ser una sustancia tal como celulosa, a la que se puede unir de modo covalente un indicador de pH usando reacciones orgánicas. Se pueden conseguir uniones no covalentes de indicadores de pH usando materiales de soporte iónicos tales como membranas de nailon que tienen potencial zeta positivo o negativo. Otros materiales de soporte iónicos que se pueden usar son resinas iónicas cargadas positiva o negativamente, tales como resina de dietilaminoetilo (DEAE) o DEAE celulosa. Puede que se requiera tratamiento previo del material de soporte con una proteína si la membrana indicadora ha de estar en contacto directo con el medio de crecimiento microbiano.
Los sensores indicadores de pH detectan directamente cambios de pH debidos al entorno de pH del medio de crecimiento microbiano. Sin embargo, estos sensores se pueden hacer para que reaccionen selectivamente a gases (por ejemplo dióxido de carbono, amoníaco) en el medio de crecimiento líquido cubriéndolos con una composición o membrana selectivamente semipermeable, tal como silicona, látex, teflón, o diversos plásticos caracterizados por la capacidad de permitir selectivamente la difusión de un gas al tiempo que previenen el paso de iones. Para sensores que comprenden indicadores encapsulados dentro de una matriz de polímero, el polímero que forma la matriz puede actuar como la barrera semipermeable que permite el paso de gases pero no iones.
En una realización, el sensor de CO_{2} comprende cuatro componentes. El primer componente es un indicador de pH visual o fluorescente, que es reactivo al intervalo de pH entre 6 y 10. Ejemplos de indicadores que cumplen estos criterios son azul de bromotimol, azul de timol, azul de xilenol, fenolftaleína, cumarina y fluoresceína. El segundo componente es hidróxido sódico o una base equivalente, que mantiene un entorno de pH óptimo para detección de CO_{2} mediante el indicador de pH seleccionado. El tercer componente es glicerol o un emulgente equivalente que puede producir pequeñas gotas de solución de indicador emulsionadas dentro del polímero sin curar. El cuarto componente es el polímero sin curar tal como silicona, que mantiene un entorno apropiado para el indicador. Se puede usar cualquier polímero que no afecte a la actividad química del indicador, tanto respecto a sus propiedades físicas o químicas naturales como a sus requisitos para curado, siempre que sea permeable a gases pero no a iones, y no tenga alteradas estas propiedades cuando se someta a esterilización. Otros polímeros de silicona que también son satisfactorios son los que se curan mediante alta temperatura, mediante actividad catalítica, o mediante vulcanización ultravioleta. Se prepara una emulsión a partir de los cuatro componentes y se cura el polímero para formar una matriz semipermeable alrededor de las pequeñas gotas de indicador de pH, lo que permite la difusión selectiva de CO_{2} y otros gases desde el medio líquido de crecimiento microbiano, dando como resultado un cambio medible en el indicador. El sensor se puede preparar separadamente, tal como en un molde, se cura, y luego se une a la botella de cultivo con un adhesivo apropiado, tal como un adhesivo de silicona. Alternativamente, y preferiblemente, el sensor se forma sobre el fondo de la botella y se cura in situ. Después del curado se esteriliza la botella con el sensor, tal como mediante tratamiento en autoclave. Convenientemente, el medio de crecimiento se puede introducir en la botella antes del tratamiento en autoclave y esterilizar también mediante este proceso.
El cultivo de microorganismos aerobios requiere suministro de oxígeno dentro de la botella de cultivo. Actualmente, las botellas de cultivo automatizadas, semiautomatizadas y algunas manuales se ventilan de modo transitorio de alguna manera, por ejemplo mediante inserción y retirada de un dispositivo de ventilación (un pincho o aguja de ventilación, por ejemplo), aflojamiento y/o cambio de una tapa, o extracción mecánica de gas y retorno forzado del gas a la botella. Algunos sistemas manuales que no se agitan emplean un dispositivo de ventilación continua que permanece en su sitio mientras dura la prueba.
Sin embargo, en la presente invención, se proporciona una barrera selectiva hidrófoba en la botella que permite el paso de atmósfera ambiente a la botella de cultivo al tiempo que previene las fugas de medio y de espécimen fuera de la botella. La barrera permeable de la presente invención preferiblemente previene que entren contaminantes, tales como organismos contaminantes, a la botella, así como evita el paso de dióxido de carbono fuera de la botella. Materiales preferidos para la membrana permeable/barrera hidrófoba incluyen membranas y materiales de silicona, polipropileno, etileno propileno fluorado, polietileno de baja densidad, Porex, politetrafluoroetileno y polimetilpenteno como barreras selectivas (polimetilpenteno que tiene permeabilidad al CO_{2} despreciable y alta permeabilidad al O_{2} - - 270 (cc-m)/seg-cm^{2}-1,33kPa x 10^{-10}). Otras membranas permeables también son viables si son suficientemente permeables al oxígeno, preferiblemente si evitan el paso de dióxido de carbono fuera de la botella, y si el material se puede tratar en autoclave y es resistente a fugas bajo presión. Como se describirá a continuación, los materiales que carecen de la rigidez suficiente, se pueden reforzar formando una estructura de soporte integral con la membrana permeable, o colocando la membrana permeable sobre los medios de soporte o entre ellos.
En algunas realizaciones de la presente invención se pueden usar adhesivos para afianzar la membrana permeable a un material de soporte. Se pueden usar adhesivos tales como Elmers Stix-All para cerrar los racores Porex con seguridad dentro de un tapón. El adhesivo de la marca Adcare, aunque no suficiente para proporcionar un cierre hermético, es permeable al gas y se puede usar para adherir una membrana a un racor Porex en una configuración de tipo emparedado.
A fin de prevenir el paso de oxígeno a la botella de cultivo antes del uso de la botella para cultivo, se proporciona un cierre hermético para cubrir la membrana permeable a los gases. El cierre impermeable cubre y cierra herméticamente la membrana permeable durante la preparación de la botella, gaseado, tratamiento en autoclave y almacenamiento. El cierre se retira en el momento de la inoculación de la botella (si el microorganismo es aerobio) para permitir el intercambio de gases durante la incubación de la botella del medio. Aunque puede depender del material de que se disponga dentro de la membrana permeable, aluminios revestidos de plástico son generalmente adecuados.
Adicionalmente, con respecto a la membrana permeable a los gases, es deseable un tamaño de poro de 0,2 micrómetros o menos para prevenir la contaminación del medio por organismos del ambiente durante la transferencia de gas a través de la membrana. Se necesita un sistema de soporte para afianzar la membrana permeable a los gases en su sitio, y la misma estructura de soporte o una separada debería soportar la membrana permeable a los gases si fuera necesario, frente a la presión interior y los efectos del vacío debidos al tratamiento en autoclave. PTFE con una rejilla interna de soporte de polipropileno es particularmente beneficioso para uso como membrana permeable a los gases.
En las Figuras 5A a 5D se ilustra una realización de la invención. Un tapón 10, tal como se ilustra en la Figura 5A, está provisto de una cavidad interna 12 como se ilustra en la Figura 5B. Dentro de la cavidad del tapón se dispone un filtro 14, con un cierre 16 removible impermeable a los gases que se dispone adyacente al filtro 14 (véase Figura 5C). Como se muestra en la Figura 5D, cuando el cierre 16 removible impermeable se retira, el tapón 10 es permeable a los gases por vía de la membrana 14 permeable a los gases. La membrana 14 permeable a los gases puede ser, por ejemplo, un filtro Porex.
Como se ilustra en la Figura 6, en una realización diferente del tapón de la presente invención, se proporciona un cierre 16 impermeable a los gases por encima de dos soportes 20, 21 que tienen entre ellos una membrana 22 permeable a los gases. Como se puede observar mejor en las Figuras 7A y 7B, se proporciona una rejilla 25 de soporte en el soporte superior 20 y en el soporte inferior 21. Cuando los dos soportes 20, 21 se encajan uno con otro, la membrana 22 permeable a los gases se sujeta firmemente entre ellos. En otra realización de los soportes para la membrana permeable a los gases, como se puede observar en las Figuras 8A a 8C, se puede moldear una membrana 28, sujeta entre los soportes 20 y 21, con un cierre 29 de junta tórica de modo que se mejora la impermeabilidad de la membrana al paso de líquidos fuera de la botella de cultivo. Evidentemente, los soportes y la membrana entre ellos, se proporcionan en un tapón, que se proporciona de modo similar en una botella de cultivo que tiene el sensor de la presente invención.
En otra realización de la presente invención, la membrana permeable a los gases no se proporciona en el tapón, sino más bien adyacente al tapón, en una posición en la parte de arriba de la botella de cultivo. Como se puede observar en la Figura 9, se proporciona una membrana 31 permeable a los gases por debajo de un cierre removible impermeable a los gases, tal como un cierre de hoja 32. Se proporciona un tapón 23 tal como un tapón de 20 mm, así como un cierre metálico 34 y una tapadera de apertura al golpe 35. La botella 36 puede ser una botella de plástico con sensor 37 y membrana 38 dispuestos en el fondo de la misma, como se ha descrito previamente. Como se puede observar en la Figura 10A, el tapón 33, que puede ser un tapón de 12 mm, se dispone en una posición centrada de la tapa 30 de plástico sobre la botella 36. Asimismo, como se puede observar en la Figura 10B, el tapón se puede proporcionar descentrado sobre la tapa.
Como se ilustra en la Figura 11, por encima de la membrana 31 se dispone un cierre 32 de hoja. El cierre 32 puede ser un aluminio revestido de plástico. Evidentemente, se contemplan otros materiales para el cierre removible, siempre que tales materiales tengan suficiente impermeabilidad y facilidad para ser retirados de la botella en el momento del cultivo. Como se puede observar en la Figura 11, se proporciona una lengüeta 39 no adherida a la botella como parte del cierre 32, para facilidad de agarre y retirada del cierre.
En una realización adicional de la presente invención como se ilustra en las Figuras 12A a 12C, se forma una rejilla 40 dentro de la propia tapa de la botella. En una realización, una pluralidad de agujeros 41 se forma a través de la tapa de la botella. Como se puede observar en las Figuras 12B y 12C, las capas 43 de Porex pueden estar dispuestas adyacentes a la membrana 45 permeable a los gases y se pueden sujetar en su sitio mediante anillos de retención 42. Este ensamblaje, como se observa en la Figura 12B, se dispone debajo de la rejilla 40 de la tapa de la botella.
La rejilla puede ser tal como la rejilla 47 que se ilustra en la Figuras 13A y 13B, en las que la pluralidad de agujeros 41 está en forma de C alrededor del tapón central 33. De esta manera, se puede aumentar el área superficial de la membrana 48 permeable a los gases que se dispone debajo de la rejilla.
La botella de cultivo de la presente invención se puede fabricar de cierto número de maneras. En una realización preferida, la botella de cultivo y la tapa de la botella de cultivo se fabrican separadamente, y luego se adhieren entre sí posteriormente, tal como encolando la parte de arriba en la botella. Otro procedimiento de adherir la parte de arriba de la botella y la botella es mediante soldadura por fricción, en la que la parte de arriba y la de abajo de la botella se hacer rotar una con relación a la otra de manera que la fricción generada funde el plástico, que se vuelve a solidificar con lo que la parte de arriba y la botella se sueldan entre sí de esta manera.
Como se puede observar en la Figura 14, se proporciona la tapa 59 de la botella con superficies externas 50, 51 y 52, que tienen cada una un diámetro externo diferente. La superficie 52 es de una dimensión tal que está a nivel de la superficie circunferencial exterior de la botella. La superficie 50, superficie con el diámetro externo más pequeño, ajusta exactamente dentro de la botella, de tal manera que el diámetro interno de la botella y el diámetro externo definido por la superficie 50, son esencialmente iguales. La superficie 51 tiene un diámetro externo mayor que el diámetro interno de la botella. Según esto, durante la soldadura por fricción, la superficie 51 que tiene un diámetro mayor que el diámetro interno de la botella, crea un elevado grado de fricción a medida que la tapa de la botella se hace girar y se hace presionar en la botella. De esta manera, la parte de arriba de la botella y la botella se adhieren firmemente entre sí. Como también se muestra en la Figura 14, la membrana 58 se sujeta en su sitio mediante el anillo 54 de retención que tiene una proyección 56 para mejorar la impermeabilidad al flujo de fluido alrededor del anillo de retención y la membrana.
Otro procedimiento de adherir la tapa de la botella a la botella es mediante soldadura ultrasónica. El anillo de retención para sujetar en su sitio la membrana permeable a los gases, también se puede adherir mediante soldadura ultrasónica. Como se puede observar en las Figuras 15A y 15B, el anillo 54 de retención que se ilustra en sección transversal, está provisto de un pico 60 anular. Cuando se aplica energía ultrasónica al punto 65 directamente debajo del pico 60, el anillo 54 de retención se puede soldar en su sitio. Como se puede observar en la Figura 15B, se puede proporcionar una superficie 66 inclinada interna para disminuir la probabilidad de que el líquido sea atrapado en el anillo de retención durante el batido de la botella.
Como se ilustra en la Figura 16, se dispone un sensor 37 en el fondo de la botella de cultivo, con la membrana 58 que se sujeta en su sitio mediante el anillo 54 de retención. Asimismo se ilustra un rebaje 70 anular para el exceso de plástico fundido que se genere durante la soldadura por fricción de la tapa a la botella debido a la fusión de la superficie 51 (véase Figura 14). Debido al rebaje 70 anular, el plástico fundido no fluye a las superficies exteriores de la tapa de la botella ni de la botella.
Debido a la capacidad de respuesta del sensor al dióxido de carbono o al pH, en una realización de la presente invención es deseable que la membrana sea más permeable al oxígeno (que entra en la botella) que al dióxido de carbono (que sale de la botella). Una membrana al menos parcialmente impermeable al dióxido de carbono permitirá una sensibilidad más alta del sensor. Sin embargo, una membrana más permeable al oxígeno que al dióxido de carbono no es necesaria para la presente invención. Sin embargo, inicialmente se pensó que no sería viable una botella de cultivo que permitiera un flujo libre de dióxido de carbono fuera de la botella así como que requiriera dióxido de carbono dentro de la botella para alterar el sensor en la misma (de modo que indique la presencia, por ejemplo, de un microorganismo). Sorprendentemente, se descubrió que el sensor actúa como un tipo de "pileta" para el dióxido de carbono en la botella de tal manera que el sensor indicará propiamente la presencia de un microorganismo incluso con la membrana permeable a los gases como parte de la botella.
Permeabilidad por cambio de gases sanguíneos (Tabla 1)
Se prepararon botellas y se gasearon con nitrógeno 100%. Se desprecintaron botellas representativas retirando el cierre térmico y se dejaron batir en una batidora rotatoria a temperatura ambiente durante 1 hora. Al final de este período de tiempo, se midió pO_{2} en un instrumento de gases sanguíneos y se compararon las lecturas con una botella de control sin membrana permeable y a una pO_{2} determinada previamente de 2,66-4,00 kPa (que se había encontrado en pruebas previas que representan botellas gaseadas con nitrógeno 100%). Un aumento en la pO_{2} de estas botellas en comparación con el valor de control y referencia indicó permeabilidad del material al oxígeno dentro de 1 hora.
Capacidad de tratamiento en autoclave (Tabla 1)
Se trataron en autoclave materiales de prueba seleccionados a 121ºC, 103 kPa durante 12 minutos en escape rápido. Los materiales se examinaron a continuación respecto a cambios visibles tales como fusión y deformación.
Tolerancia a la presión (Tabla 1)
Se prepararon tapones con materiales de prueba según se han descrito sin cierre térmico que se cierran a continuación por engastado en botellas que contienen agua. Una jeringa de 60 cc se ajustó con una aguja de 16 g, se hizo retroceder el émbolo a la marca de 50 cc y se insertó la aguja en el tapón. A continuación se aplicó presión al émbolo hasta que se produjeron fugas a través del material. Cuando se produjeron fugas, se determinó la cantidad de presión requerida restando la posición del émbolo de 50.
TABLA 1 Prueba física de membranas
1
Permeabilidad por comportamiento de crecimiento (Tabla 2)
Se inocularon botellas representativas. Se prepararon botellas como se ha descrito anteriormente. A continuación se inocularon botellas representativas con C. albicans, P. aeruginosa y M. luteus, 2 botellas por material de prueba usando protocolos estándar de comportamiento de crecimiento. Se prepararon botellas de control negativo con una atmósfera de dióxido de carbono al 5% en nitrógeno. Estas botellas no se ventilaron de modo transitorio y no tenían membrana permeable. Se prepararon botellas de control positivo de la misma manera pero se ventilaron o eran botellas aeróbicas estándar maduras. Las botellas inoculadas se dejaron en BTA durante 3 días y a continuación se representaron gráficamente las lecturas. Mediante comparación de los gráficos, se determinó que M. luteus era el mejor indicador de paso de oxígeno a las botellas a una velocidad que no inhibía el crecimiento. Asimismo, como éste era un organismo que producía poco dióxido de carbono, se podía observar el efecto de difusión de dióxido de carbono.
TABLA 2 Permeabilidad de membranas por comportamiento de crecimiento de M luteus
2
Permeabilidad del cierre térmico (Tabla 3)
Usando un sacabocados, se hicieron agujeros en tapones Tompkins estándar. Materiales de prueba para cierre térmico se colocaron como cierre sobre el agujero. Se llenaron botellas con 40 ml del medio, se taparon con tapones de cierre térmico, se gasearon con nitrógeno al 100% y se trataron en autoclave durante 12 minutos a 121ºC, 103 kPa. Tras equilibrado durante un mínimo de 24 horas, se midió pO_{2} de botellas representativas con un NOVA STAT 3 usando protocolos estándar. Las botellas restantes se mantuvieron a temperatura ambiente durante un período de tiempo para determinar si los cierres térmicos permitían fugas de oxígeno a la botella. La comparación de la pO_{2} inicial frente a la de las botellas de control sin un tapón con núcleo frente a pO_{2} tras el tiempo de mantenimiento determinó si el material era permeable al oxígeno.
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TABLA 3 Prueba de permeabilidad de cierre térmico
3
Aun cuando se podría usar un cierto número de procedimientos para hacer la botella de cultivo de la presente invención, en un procedimiento el material de la membrana permeable a los gases se une a la tapa de la botella mediante cierre térmico. A continuación se une un cierre removible sobre el material permeable, fuera de la botella. Se suelda la tapa en su sitio sobre la botella. En una acometida separada, se añade el sensor y se somete a curado térmico. Posteriormente, se añade el medio a la botella, y se evacua el espacio de cabeza y se sustituye con una mezcla gaseosa apropiada. A continuación se puede aplicar un vacío residual. Se afianza un tapón en su sitio con un cierre, tras lo cual se trata en autoclave la botella ensamblada.
Durante el tratamiento en autoclave, la presión en el interior de la botella puede exceder de 103 kPa. Según esto, según una realización de la presente invención, la estructura de la membrana permeable a los gases, así como el cierre removible impermeable a los gases se construyen de manera que resistan presiones de 34 a más de 206 kPa. Preferiblemente, la estructura de la membrana permeable y el cierre removible son capaces de resistir presiones de al menos 103 kPa. Y, dado que la presión del crecimiento del organismo puede alcanzar hasta 172 kPa, la estructura de la membrana permeable a los gases y el cierre removible se construyen cada uno de manera que resistan presiones de 103 a 172 kPa, y en una realización preferida, la membrana y el cierre se construyen de manera que resistan presiones de 172 kPa o más. Tras el tratamiento en autoclave, las botellas se dejan enfriar, y se pueden etiquetar a continuación para embalaje y expedición.
En un procedimiento para usar la botella, se toma una muestra de sangre de un paciente de manera que se usa una aguja de mariposa con tubo afianzado a un adaptador de recipiente de vacío. Se descontamina la parte de arriba de una acometida provista de tapón y se desliza el adaptador sobre la acometida. A continuación, la botella aspirará la cantidad adecuada de muestra. Una vez inoculada, se identifica la botella y está dispuesta para cultivo. Si la botella se ha de usar para cultivo aerobio, se pela el cierre removible, exponiendo la membrana permeable a los gases y permitiendo así el paso libre del oxígeno a la botella. La botella se puede colocar en un instrumento automático de cultivo tal como el instrumento BacT/Alert de Organon Teknika. La botella se incuba a una temperatura de 35-37ºC.
En un cierto número de procedimientos de cultivo, es deseable batir la botella de cultivo durante el cultivo. La botella de cultivo de la presente invención es particularmente adecuada para ser batida durante el cultivo puesto que la membrana permeable a los gases permite el flujo libre de oxígeno a la botella de cultivo pero al mismo tiempo restringe el flujo de fluido fuera de la botella. De hecho, se ha encontrado que la presente invención es particularmente adecuada para un batido vigoroso, así como para un batido del cultivo entre las posiciones de pié e invertida. Una botella de la técnica anterior a la que se hace una adición tendría fugas y por lo tanto no podría ser batida ni sacudida de esta manera.
Se han descrito los principios, realizaciones preferidas, y modos de operación de la invención en la memoria descriptiva anterior. Sin embargo, la invención que se pretende proteger en este documento no se ha de constreñir como limitada a las formas particulares descritas, pues éstas se han de considerar como ilustrativas más que restrictivas. Por ejemplo, tanto el sensor como la membrana permeable se pueden proporcionar en otras partes de la botella de cultivo, distintas de las descritas. Por ejemplo, la membrana permeable se podría disponer en la pared lateral de la botella, o el sensor se podría disponer dentro de la tapa de la botella. Asimismo, se podrían suministrar una pluralidad de sensores o membranas. Es más, otras ordenaciones para las rejillas de soporte y tamaños y formas de las membranas permeables, también estarían dentro del alcance de la invención. Y, evidentemente, otros materiales para la membrana permeable y el cierre removible impermeable, también estarían dentro del alcance de esta invención.

Claims (38)

1. Un dispositivo para detectar microorganismos que comprende:
un recipiente para contener una muestra que se ha de analizar respecto a la presencia o ausencia de microorganismos;
medio de crecimiento dentro de dicho recipiente para soportar el crecimiento de microorganismos;
un sensor dentro de dicho recipiente separado de dicho medio de crecimiento, siendo dicho sensor capaz de responder a cambios en concentración de un componente gaseoso dentro de dicho recipiente, cambiando la concentración de componente gaseoso por el crecimiento de microorganismos, de modo que dicho sensor es capaz de indicar la presencia o ausencia de microorganismos dentro de la muestra;
una membrana permeable a los gases en una pared de dicho recipiente capaz de permitir el paso de gas entre el interior y el exterior del recipiente al tiempo que restringe el paso de medio líquido al exterior del recipiente durante el uso del dispositivo; y
un cierre removible impermeable a los gases que se dispone adyacente a dicha membrana permeable a los gases.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicho componente gaseoso es un producto metabólico de microorganismos en la muestra.
3. El dispositivo de la reivindicación 2, en el que dicho sensor es capaz de responder a cambios en pH debidos a dichos productos metabólicos gaseosos de microorganismos en la muestra.
4. El dispositivo de la reivindicación 2, en el que el producto metabólico es dióxido de carbono, y dicho sensor es capaz de responder a aumentos en dióxido de carbono.
5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicho sensor se fija en la superficie interior de una porción del recipiente, y en el que dicha porción del recipiente es sustancialmente transparente.
6. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicha membrana permeable a los gases es una barrera hidrófoba para contener la muestra dentro del recipiente.
7. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que dicha membrana permeable a los gases se construye de manera que resiste presiones de 34 a aproximadamente 206 kPa.
8. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que dicha membrana permeable a los gases se construye de manera que resiste presiones de 103 kPa o más.
9. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que dicha membrana permeable a los gases se construye de manera que resiste presiones de 172 kPa o más.
10. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicha membrana permeable a los gases se forma de uno o más materiales que se seleccionan entre silicona, polipropileno, copolímeros acrílicos, etileno propileno fluorado, polietileno de baja densidad, politetrafluoroetileno y polimetilpenteno.
11. El dispositivo de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente un cierre removible hermético impermeable a los gases que cubre dicha membrana permeable a los gases.
12. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que dicho cierre removible comprende un aluminio revestido de plástico.
13. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que dicha membrana permeable a los gases tiene un tamaño de poro de 0,2 micrómetros o menos.
14. El dispositivo de la reivindicación 7, en el que se proporciona un medio de refuerzo dentro o en las proximidades de la membrana permeable a los gases para proporcionar soporte a la membrana permeable a los gases cuando esté bajo presión.
15. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que se proporciona un medio de refuerzo dentro o en las proximidades de la membrana permeable a los gases para proporcionar soporte a la membrana permeable a los gases cuando esté bajo presión.
16. El dispositivo de la reivindicación 14, en el que dicha membrana permeable comprende politetrafluoroetileno y dicho medio de refuerzo es una rejilla de soporte de polipropileno dentro de dicha membrana permeable a los gases.
17. El dispositivo de la reivindicación 15, en el que dicho medio de refuerzo comprende dos rejillas de soporte dispuestas sobre uno u otro de los lados de la membrana permeable a los gases.
18. El dispositivo de la reivindicación 14, que comprende adicionalmente una junta tórica que se dispone adyacente a la circunferencia de la membrana permeable a los gases.
19. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que dicho recipiente es una botella y dicha membrana permeable a los gases y dicho cierre impermeable se disponen dentro de una taba de botella para ajustarse a la botella.
20. El dispositivo de la reivindicación 17, en el que dicho recipiente es una botella, y dichos membrana permeable a los gases y cierre impermeable se disponen dentro de una tapa de botella para ajustarse a la botella, y dicho medio de refuerzo comprende una pluralidad de aberturas en la tapa de la botella adyacentes a donde se dispone dicha membrana permeable a los gases dentro de la tapa de la botella.
21. El dispositivo de la reivindicación 20, en el que dicha membrana permeable a los gases y la ordenación de aberturas en la tapa de la botella tienen forma de C.
22. El dispositivo de la reivindicación 20, en el que dicho sensor se dispone dentro de la tapa de la botella.
23. El dispositivo de la reivindicación 20, en el que dicho sensor se dispone dentro de una porción del fondo de la botella.
24. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicha membrana permeable a los gases es más permeable al oxígeno que al dióxido de carbono.
25. El dispositivo de la reivindicación 24, en el que dicha membrana permeable a los gases comprende polimetilpenteno.
26. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un gas inerte dentro de dicho recipiente.
27. El dispositivo de la reivindicación 26, en el que dicho gas es nitrógeno y/o CO_{2}.
28. Un procedimiento para analizar una muestra respecto a la presencia o ausencia de microorganismos, que comprende:
proporcionar el dispositivo según la reivindicación 1;
retirar del dispositivo el cierre impermeable a los gases;
añadir al dispositivo la muestra que se ha de probar;
incubar el dispositivo a una temperatura previamente determinada;
batir el dispositivo durante la incubación;
en el que la membrana permeable a los gases restringe el paso del medio fluido y de la muestra al exterior del dispositivo y simultáneamente permite el paso de oxígeno al dispositivo; y
detectar cualquier cambio en el sensor en el dispositivo de manera que se determina la presencia o ausencia de microorganismos dentro del dispositivo.
29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que se bate el dispositivo hasta el punto en que el medio fluido y la muestra dentro del dispositivo golpean contra la membrana permeable a los gases sin fugas a través de ella.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que, cuando los microorganismos están presentes en la muestra que se ha de probar, dichos microorganismos utilizan dicho medio fluido para crecer, y en el que dicho crecimiento de microorganismos da como resultado un producto metabólico gaseoso que genera una presión dentro de dicho dispositivo, estando dicha membrana permeable construida de tal manera que resiste dicha presión generada dentro del dispositivo.
31. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que dicha membrana permeable a los gases es capaz de resistir presiones de 34 a 206 kPa.
32. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que dicha membrana permeable a los gases es capaz de resistir presiones de al menos 103 kPa.
33. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que dicha membrana permeable a los gases es capaz de resistir presiones de al menos 172 kPa.
34. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que durante el batido, el dispositivo se sacude hacia atrás y hacia adelante entre una posición de pié e invertida.
35. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicha muestra que se ha de probar es una muestra de sangre, una muestra de fluido corporal estéril, o una muestra de alimento.
36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el microorganismo es C. albicans, P. aeruginosa o M. luteus.
37. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el microorganismo es Mycobacteria.
38. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que durante la incubación y el batido, se permite pasar a dicho dispositivo mayor cantidad de oxígeno a través de dicha membrana permeable a los gases, que dióxido de carbono se permite pasar a través de dicha membrana permeable a los gases fuera de dicho dispositivo.
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