KR0163790B1 - 리간드 골드 결합 - Google Patents

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에프.지.엠.헤르만스, 에이. 지. 제이. 베르미렌
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Abstract

본 발명은, 항체, 항원 또는 리간드와 같은 결합성분을 골드 졸에 연결하기 위해 이용 가능한 졸 상에 알칸티올 및 알칸티올 유도체를 제공하는, 알칸티올 및 알칸티올 유도체로 피복된 골드 졸에 관한 것이다.
또한, 골드 졸에 결합된 디- 및 트리-티올 화합물은 졸에 대한 항체, 항원 또는 리간드의 흡착을 촉진한다. 또한, 본 발명은 피복 방법, 및 피복된 졸을 포함하는 시험 키트에 관한 것이다.

Description

리간드 골드 결합
제1도는 여러 농도 및 pH값에서 항-gp160 항체(GC-143)로 골드 졸(gold sol)을 피복함으로써 제공된 염-유도된 골드 졸 응집(salt-induced gold sol agglomeration)에 대한 상대적인 내성을 나타내는 그래프.
제2도는 여러 농도 및 pH값에서 항-gp160 항체(GC-143)로 TTC 피복된 골드 졸을 피복함으로써 제공된 염-유도된 골드 졸 응집에 대한 상대적인 내성을 나타내는 그래프.
제3도는 여러 농도 및 pH 수준에서 염 첨가가 없는 상태하에 골드 졸의 자발적 응집을 야기시키는 GC-143의 능력을 나타내는 그래프.
제4도는 여러 농도 및 pH 수준에서 염 첨가가 없는 상태하에 TCC 피복된 골드 졸의 자발적 응집을 야기시키는 GC-143의 능력을 나타내는 그래프.
제5도는 SPIA 평가분석에서 골드 졸상에 흡착된 GC-143의 면역학적 활성 및 특이성을 나타내는 그래프.
제6도는 SPIA 평가분석에서 골드 TTC 피복된 골드 졸상에 흡착된 GC-143 의 면역학적 활성 및 특이성을 나타내는 그래프.
제7도는 염-유도된 응집으로부터 졸을 보호할 수 있는, 골드 졸에 흡착된 비유도체화된 모노클로날 항-HIV p24 항체의 능력을 나타내는 그래프.
제8도는 염-유도된 응집으로부터 졸을 보호할 수 있는, 골드 졸에 흡착된 티올화된 모노클로날 항-HIV p24 항체의 능력을 나타내는 그래프.
본 발명은 골드 졸(gold sol)에 항체, 항원 또는 리간드와 같은 결합 성분들을 결합 또는 연결하는데 이용가능한 그룹들을 졸상에 제공하기 위해 알칸티올 및 알칸티올 유도체로 피복시킨 골드 졸에 관한 것이다. 또한, 골드 졸에 결합된 디- 및 트리-티올 화합물의 사용은 상기 결합 성분들의 수동 흡착(passive adsorption)을 촉진시킨다. 본 발명은 또한 관련 리간드에 부착될 수 있는 항원, 항체 또는 담체 분자를 포함한 티올화된 결합 성분으로 피복된 골드 졸에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이와 같은 티올 화합물로 골드 졸을 피복하는 방법, 면역학적 및 면역세포학적 진단 시험시에 상기의 피복된 졸을 사용하는 방법 및 상기의 피복된 골드 졸을 포함하는 시험 키트(testkit)에 관한 것이다.
각종 질병의 진단을 위한 시험 방법은 끊임없이 향상되고 있다. 오늘날, 면역학적 방법은 샘플내 항원 또는 항체의 존재를 검출하기 위해 사용되는 가장 민감한 방법들중의 하나이다. 이러한 평가분석법은 면역진단학 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 면역학적 평가분석법은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 샘플내 항원을 포착하고, 형광성 화합물 또는 효소와 같은 표지체(label)를 함유하는 제2항체를 항원-항체 복합체와 면역 화학적으로 반응시키는 평가 분석법으로 이루어진다. 결과적으로 생성된 표지된 항체-항원-항체 복합체를 검출한다. 시험시에는 단지 하나의 반응성 항체 사용, 경쟁적 억제 방법, 또는 판독가능한 응집 반응이 이루어지도록 하는 표지체로서의 입자의 사용과 같이 상기의 기본 평가분석법을 변형한 것이 보편적으로 사용된다. 또 다른 변형예는 검체 및 제2의 적절히 표지된 결합 파트너(binding partner)와의 복합체 형성후, 양성 반응을 나타내는, 항원 또는 항체로 피복된 미립자(microparticle)를 사용하는 것이다.
골드 졸 미립자는 졸 입자 면역평가분석(SPIA)으로 알려져 있는 평가분석 방법에서 사용된다. 이러한 평가분석법에서는, 항체 또는 항원과 같은 적절한 결합 파트너로 피복된 골드 졸을 함유하는 용액이 샘플과 반응하여 그 결합 파트너에 결합된다. 이러한 방법의 경우, 일반적으로 색상 변화에 의해 검출될 수 있는 복합체가 형성된다.
피복되지 않은 골드 졸 입자 및 기타 콜로이드는 저 농도의 염에 노출시 응집되어 용액으로부터 급속 침전된다. 그러므로, 적절한 결합 파트너로 골드 졸을 피복하는 것은 두가지의 기능을 제공한다. 첫째는 적절한 면역학적 결합 활성을 제공하는 것이고, 둘째는 면역 반응에 최대한으로 활용되도록 고안된 완충제내에서 부득이하게 일어나곤 하는 응집에 대하여 보호 기능을 한다는 것이다. 모든 단백질 또는 중합체가 염-유도된 응집으로부터 골드 졸을 완전히 보호하는 것은 아니기 때문에, 보통은 염-유도된 응집으로부터 골드 졸을 완전히 보호할 수 있는 것으로 알려져 있는 단백질 또는 중합체로 오버코팅(overcoating)하는 단계를 수행한다. 이와 같은 오버코팅 단계는 플라스틱 기재에 항체 및 항원을 흡착하는데 있어서 잘 알려져 있는 실시방법으로, 피복된 물질의 안정성을 증대시키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 오버코팅은 골드 졸과 샘플 성분의 비특이적 상호작용을 감소시키는 역할을 한다. 이러한 비특이적 상호작용은 진단 평가분석에서 항체 피복된 라텍스 입자를 사용하는 때에 중대한 문제가 되며, 그 형태와는 상관 없이 대부분(전부는 아닐지라도)의 면역평가분석에서 비특이적 혈청 간섭(nonspecific serum interference)으로 나타나는 것으로 추정된다. 몇몇 경우에서는, 특이적 시스템에서 혈청 간섭을 최소화하기 위해 오버코팅 단백질 또는 중합체를 변화시키는 것이 가능하다. 구아니딘 히드로클로라이드 또는 우레아와 같은 졸매질에 대한 첨가제가 유용하다. 종종, 비특이적 간섭은 혈청 이호성(heterophile) 활성에 집중될 수 있으며, 이것은 전체 동물 혈청을 첨가함으로써 제거될 수 있다.
골드 콜로이드로의 목적하는 결합 파트너의 수동 흡착에 있어, 심각한 결점은 종종 상기와 같은 직접 피복이 성공적으로 이루어질 수 없다는 것이었다. 일반적으로 콜로이드로의 수동 중합체 흡착의 물리-화학적 매커니즘은 잘 알려진 과정이 아니다. 골드 졸에 대한 항체의 수동 흡착은 염-유도된 응집으로부터 보호가 잘 되지 않고 또 오버코팅에 의한 추가 보호도 불가능한 피복된 졸을 생성시킬 수 있다. 또한 흡착된 항체의 부정확한 배향에 기인한 것으로 추정되는 낮은 면역학적 활성을 갖는 피복된 졸을 생성시키거나, 또는 졸 자체의 항체-유도된 응집을 야기시킬 수 있다. 마지막으로, 선택된 결합 파트너가 골드 졸에 간단히 결합하지 않은 수도 있다. 이러한 문제들의 총체적인 결과로, 진단용의 골드 콜로이드 시약의 제조에는 기타 진단 형태에서 유용한 생물학적 시약을 거의 사용할 수 없다.
당해 기술 분야에서 필요로 하는 것은 불확실한 수동 흡착 특성 또는 수동 흡착시 결합 파트너 및 우수한 코팅 의 담체 접합체의 불가피한 생성이 제거될 수 있도록 골드 졸에 결합 파트너, 단백질, 탄수화물 또는 리간드를 공유 결합적으로 부착하는 방법이다. 특히, 이와 같은 졸은 피복된 결합 파트너 부재시에도 염-유도된 응집에 대하여 굴절성이 있는 경우라면 훨씬 더 유용하다. 동시에, 졸의 물리-화학적 표면 성질을 변화시킬 수 있는 능력은 면역화학적 진단 평가 분석에서의 비특이적 간섭의 원인이 되는 종종 미규명된 샘플-졸 상호 작용 및 면역세포화학적 평가분석에서의 배경 문제들을 최소화시킬 수 있게 한다.
또한 필요로 하는 것은 골드 졸로의 생물학적 중합체의 수동 흡착을 촉진시킬 수 있는 능력이다. 항체 및 중합체의 티올화는 염-유도된 응집에 대한 내성 증가에 의해 입증되는 바와 같이 골드 졸에 결합할 수 있는 이들의 능력을 증가시킬 수 있다. 이와 같은 능력은 골드 졸에 잘 결합하지만 이때 상당량의 이들의 활성을 손실하는 항체에 대해서 뿐만 아니라, 유도체화되지 않은 상태로는 골드 졸에 간단히 결합하지 못하는 항체에 대하여 유용한 것으로 판명될 수 있다. 항체 결합을 촉진시키기 위하여 졸 표면의 물리-화학적 성질을 변화시키기 위한 대안의 방법은 졸을 디-티올 또는 트리-티올 화합물로 피복하는 것이다. 이와 같은 중간 피복은 피복된 졸에 대한 항체의 수동 흡착성을 크게 변화시킬 수 있다.
본 발명은 알칸티올, 알칸티올 유도체, 및 디- 및 트리-티올 화합물로 골드 졸의 미립자를 피복하는 방법을 제공한다. 알칸티올 또는 이들의 유도체로 피복된 골드 졸은 염-유도된 응집에 대하여 내성이 있고, 공유 결합 중합체 또는 리간드 부착을 위한 화학적 성분을 함유한다. 졸 표면의 특별한 소수성-친수성 균형이 얻어지고, 졸과 단백질의 비특이적 상호작용이 일반적으로 최소화된다. 특히, 메틸, 히드록실, 카르복실, 아미노, 술프히드릴 또는 카르보닐과 같이 n-알칸 티올 부분에 대하여 멀리있는 화학적 그룹은 용매 노출시, 공유결합성 부착 부위로서 작용하며, 소수성-친수성 균형 부위가 될 수도 있다.
소분자량의 디- 및 트리-티올 화합물로 골드 졸을 피복하면 염-유도된 응집으로 부터 졸을 보호하지는 못하지만, 피복된 졸 표면의 물리-화학적 성질을 변화시키고 항체 분자의 수동 흡착을 촉진시킨다.
본 발명은 피복된 골드 졸을 포함한다. 또한, 본 발명은 항체 또는 항원과 같은 결합 성분에 부가적으로 결합된 피복된 골드 졸 입자 및 이러한 골드 졸 입자를 함유하는 진단 키트를 포함한다.
본 발명은 결합 성분이 흡착에 의해 부착된 피복 골드 졸 및 결합 성분의 티올화에 의해 흡착이 촉진된 미피복 골드 졸을 포함한다.
다른 기의 부가 결합을 촉진시킬 수 있는 화학적 연결기를 제공하는 골드 졸로 구성되는 미립자의 피복 방법이 본 발명의 기초를 이루고 있다. 본 발명의 미립자는 일반적으로 입경 범위가 약 20nm 내지 약 200nm 이상인 콜로이드상의 골드 졸로서 정의된다. 미립자의 바람직한 입경 범위는 약 60 내지 약 80 nm이다. 가장 바람직한 입경은 약 65 내지 75nm이다. 사용되는 피복 화학물질중 알칸티올 및 그 유도체와 이들의 혼합물과 같은 것들은 골드 졸이 염-유도된 응집이 되지 않도록 하며, 졸 표면의 특정 소수성-친수성 균형을 산출하여 표면과 외부 단백질과의 비특이적 상호작용이 최소화되도록 할 수 있다.
골드 졸은 염화 금(II)산 수용액을 시이드(seed) 골드 입자상으로 히드록실 아민-중개 환원시켜서 제조하였다. 이 방법은 문헌 [Turkevich, J. et al., Discussions of the Faraday Society, No. 11, p.55-74 (1951)]에 개시되어 있다. 일반적으로, 물에 용해된 염화 금(III)산 삼수화물을 탈이온수에 첨가한 후, 히드록실아민 히드로클로라이드를 첨가한다. 시이드 골드 입자를 첨가하고 교반한다. 소량의 아세톤을 첨가한 후, 혼합물을 교반한다. pH가 7.0이 될 때까지 K2CO3를 첨가한다. 골드 졸의 입경은 골드 입자의 첨가량 및 염화 금(III)산의 사용량에 따라 약 20nm 내지 약 150nm 범위이며, 이렇게 제조된 골드 졸은 알칸티올 또는 티올 유도체에 의해 피복할 준비가 된 것이다.
알칸티올, 그 유도체 및 디- 및 트리-티올 화합물이 골드 졸 입자를 피복하고 골드 졸에 공유결합성 중합체 또는 리간드를 부착하거나 또는 친수성/소수성 균형을 변화시키기 위한 화학적 부분 또는 연결기를 제공하는데 사용되는 바람직한 화합물이다. n-알칸티올이 더욱 바람직하나, 식 CH3(CH2)nSH(여기에서, n은 9 내지 23이다)의 알칸티올이 가장 바람직한 화합물이다. 알칸티올의 유도체는 일반적으로 식 RCH2(CH2)nSH(여기에서, R은 OH, COOH, CHO, SH 및 NH2 이고, n은 9 내지 23이다)로 나타낸다. 디- 및 트리-티올 화합물은 일반적으로 저분자량의 화합물이다. 그중 몇가지는 중금속 킬레이트로서 인식되어 왔다. 그중 2가지 일례가 2,3-디메르캅토숙신산과 트리티오시아누르산이다.
졸을 n-알칸티올로 피복하기 위해서는, 알코올, 바람직하게는 메탄올에 용해된 알칸티올 및 1% Tween-20R(ICI Americas 등록 상표, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트)의 0.10 M 용액을 새로 제조한다. 이 혼합물 약 1㎖를 위에서 제조한 골드 졸 약 100㎖에 첨가하고, 교반한다. 생성된 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 방치시킨다. 저 농도의 피복 화합물이 골드 졸을 피복하는 데에는 효과적이지만, 최적 피복 시간은 매번 실험적으로 확인하여야 한다.
졸 혼합물을 약 1mM의 3-[N-모르폴리노]-2-히드록시프로판 설폰산(MOPSO)(pH 7의 완충액)으로 세정하여 실온에서 2000 x g으로 약 15분동안 원심분리하고, 사용할 때까지 4℃에서 보관할 수 있다.
이상은 골드 졸을 n-알칸티올 화합물로 피복하는 방법의 일례이다. 리간드 또는 중합체 화합물의 화학적 접합을 위한 연결기를 함유하는 n-알칸티올 및 n-알칸티올 유도체의 혼합물을 부착시키도록 상기 피복 방법을 변형시킨다. 예를 들면, 피복 혼합물에 히드록시-n-알칸티올을 포함시키면 졸 표면의 친수성이 증가하는 한편, 졸과 혈청 단백질의 비특이성 상호작용이 감소한다. 존재하는 티올 화학물 총량의 10% 수준으로 카르복실-n-알칸티올을 포함시키면 목적하는 밀도의 접합부분을 갖는 졸을 생성하는데 충분하다. 이러한 혼합물에 있어 n-알칸티올의 탄소 연쇄 길이는, 접합부를 더 잘 노출시켜 고분자와 졸 표면과의 반응과 관련된 입체 장애를 감소키시도록 n-알칸티올 유도체의 탄소 연쇄 길이보다 2-4개의 탄소를 적게 할 수 있다.
n-알칸티올, n-알칸티올 유도체 또는 이 두 그룹의 혼합물의 피복용액은 1% Tween-20R과 함께 알코올, 바람직하게는 메탄올중에서 제조한다. 상기 모든 티올 화합물의 전체 농도는 일반적으로 0.10M이하이다. 몇몇 경우에는, 티올 화합물 피복에 대한 최적 pH가 7이 아니다. 예를 들어, 트리티오시아누르산이 피복된 졸의 경우, 이 졸은 특정 티올 화합물의 혼합물에 의해 부여되는 염-유도된 응집에 대한 내성 정도를 최대로 하기 위해 상기 티올 화합물을 첨가하기전에 pH 6으로 조절한다.
상기 졸은 일반적으로 2시간 동안 상기 티올 혼합물의 존재하에 피복이 실시되지만, 최적 항온처리 시간은 매번 실험적으로 결정한다. 이는 분광광도 분석법을 이용하여 항온처리 시간을 달리한 후 염-유도된 응집에 대한 내성에 대해 졸을 시험함으로써 얻을 수 있다. 골드 졸은 특징적인 보라색을 나타내며, 이러한 색은 졸 입자의 직경에 상당히 민감하다. 졸 입자의 응집이 일어났다면, 그 졸의 유효 크기는 크게 증가하게 되고, 특징적인 흡광 최대치가 보라색인 540nm로 부터 고 파장으로 전이되어, 푸른색 내지 무색 졸이 얻어진다.
실제로, 피복된 졸의 1㎖ 분취액을 유리 튜브내에 분재한다. 이 졸의 분취액에 10% NaCL 100㎕를 혼합하면서 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 10분간 방치하고, 540nm에서의 흡광도를 100㎕의 물을 첨가한 동일한 졸 분취액의 흡광도와 비교한다. 대조용 분취액 흡광도의 90% 또는 그 이상을 유지하고 있는 시험 분취액은 염-유도된 응집에 대한 내성이 있는 것으로 간주한다.
시험된 화합물들은 하기 표 1에 제시되어 있다.
* 부가된 염이 없는 대조용 졸 분취액의 540nm에서의 광학 밀도(%)로 표시함.
이 졸은 피복 화합물의 존재하에서 자발적으로 응집되었다.
염-유도된 응집으로부터 졸이 보호는 되었지만, 원심분리로 수거한 후에 이 졸은 더 이상 염을 보호하지 못했다.
피복 혼합물내에 사용된 화합물들의 몰비.
골드 졸을 피복하고 이를 염-유도된 응집으로부터 보호하는데 가장 성공적인 화합물은 n-알칸티올인 것으로 밝혀졌다. 12-메르캅토-1-도데카노산 같은 N-알칸티올 유도체는 그들 자체로는 염-유도된 응집에 대한 내성을 부여하는데 비효과적이지만, n-알칸티올 및 그의 유도체의 혼합물로 피복된 졸은 염-유도된 응집으로부터 완전히 보호되었으며, 전술한 기타 특성도 제공하였다.
화학적으로 접합가능한 그룹을 함유한 피복된 골드 졸을 이후, 단백질, 탄수화물, 항체, 항원, 중합체, 단량체 또는 리간드 같은 결합 성분에 공지된 방법에 따라 카르보디이미드 화학제를 이용하여 결합시킨다. 결합 성분은 상기 피복된 골드 졸에 흡착 또는 공유 부착될 수 있는 임의의 그룹을 포함하고 있다. 몇몇 경우에서는, 상기 결합 파트너를 간접적으로 접합시키기 전에 상기 졸에 6-아미노카프로산 같은 연결 분자를 접합시키기 위해 카르보디이미드 화학제를 사용하기도 하는데, 이는 상기 결합 파트너상의 입체적인 구속력을 완화시키고 그의 상보적 결합 파트너의 그리고 이 파트너에 의한 인지를 용이하게 하기 위한 것이다. 상기 피복된 졸에 결합 파트너 또는 연결 분자를 접합시키기 위해, 상기 졸을 연결하고자 하는 물질, 즉 pH 7.0의 10-25mM 완충액중의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC)와 N-히드록시술포숙신이미드(SNHS)의 존재하에 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 몇몇 경우에서는, 일련의 EDC 분취액들을 접합 반응중에 첨가하여 이 화합물이 수성 매질중에서 가수 분해되는 것을 보충한다.
유용성이 있는 접합 화학물질의 선택은 피복된 졸상에 있는 화학부분 뿐 아니라, 소정의 연결 분자상에 도입된 부분의 유형에 따라 결정된다. 예를 들면 졸-결합된 알칸티올 유도체 또는 졸-부착된 연결 분자상의 아미노기들은 호모- 또는 헤테로- 이작용성 N-히드록시숙신이미드 에스테르 가교결합제를 사용하여 중합체에 접합시킬 수 있다. 마찬가지로, 졸-결합된 알칸티올 유도체 또는 연결 분자상의 술프히드릴기는 호모- 또는 헤테로-이작용성 말레이미드 가교결합제를 사용하여 중합체에 접합시킬 수 있다. 가능한 접합 방법의 범주는 동일하지는 않지만 현재 진단용 면역접합체의 제조시 사용되고 있는 화학적 방법의 범주와 아주 유사하다. 상기 졸상의 부분과 양립성이 있는 전형적인 가교결합제인 알칸티올 유도체 또는 화학적 가교결합제가 상기 졸에 적합한 결합 파트너를 부착시키는데 필요하다.
졸 입자 면역 평가분석법(SPIA)을 이용한 면역평가분석법도 제이.류버링(J. Leuvering)의 미국 특허 제 4,313,734호에 개시된 바와 같이 실시한다. 간단히 설명하면, 결합 성분을 지닌 피복된 골드 졸을 반대 결합 파트너를 함유하고 있는 시험 시료의 존재하에서 항온처리 한다. 반대 결합 파트너가 상기 시료내에 존재하는 경우에는, 상기 피복된 졸이 가교결합될 것이며, 단일 골드 졸 입자의 흡수 최대치에서의 흡광도가 현저히 감소하게 된다. 골드 졸로의 중합체 화합물의 흡착성은 상기 결합 파트너를 티올화함으로써 촉진될 수 있다.
폴리클로날과 모노클로날 항체 둘다를 N-숙신이미딜 S-아세틸티오 아세테이트(SATA)와 반응시킴으로써 티올화하였다. 수득된 보호 술프히드릴기를 히드록실아민 히드로클로라이드와 단백질의 반응에 노출시켰다. 이것은 술프히드릴기를 단백질내로 도입시키는 잘 알려진 화학적 방법이다. 그후 티올화된 단백질을 pH 6, 7, 8 및 9에서 5 ㎕/㎖ 내지 100 ㎕/㎖ 범위의 단백질 농도로 골드 졸에 흡착시켰다. 염-유도된 응집에 대한 내성 정도를 전술한 바와 같이 측정하였다. 이 방법에 의한 항체의 티올화반응은 비-티올화된 항체에 비해 염-유도된 응집으로부터 골드 졸을 보호할 수 있는 능력을 크게 개선시켰다(참고, 제7도 및 제8도, 실시예 12).
골드 졸로의 항체의 흡착을 촉진시키기 위한 대안의 방법은 골드 졸과 결합 파트너 사이에 중간 피복물을 포함시킴으로써 항체의 흡착성이 증가되도록 졸 표면의 물리-화학적 특성을 변화시키는 것이다. 디- 및 트리-티올류가 이러한 목적에 사용된다. 트리티오시아누르산(TTC)이 이러한 화합물의 일례이다. 골드 졸을 n-알칸티올 화합물에 대해 전술한 바와 유사한 방법에 의해 TTC로 피복하는데, 단 TTC와 Tween-20 의 농도는 달리한다. 이 농도는 실험적으로 결정한다. 세척된 졸의 염-유도된 응집에 대한 내성을 제공할 수 있는 항체의 능력은 다양한 pH와 단백질 농도에서 상기 항체와 피복된 졸을 항온 처리한 후, 결정하였다.
본 발명의 피복된 미립자는 항원 또는 항체에 공유 결합될 수 있으며, 면역진단에 사용하기 위한 시험용 키트로 시판된다. 항원 또는 항체는 검출하고자 하는 상대 결합 파트너에 특이적이며 키트의 다른 성분에는 희석제, 완충액, 표지용 시약 및 실험 재료가 포함될 수 있는데, 이 성분들은 실시하고자 하는 특정 시험에 특이적인 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더 자세히 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하지는 않는다. 본 발명의 변형은 당해 기술분야의 당업자라면 명백히 알 수 있을 것이며 이 또한 본 발명의 일부로서 간주된다.
[실시예]
[실시예 1]
[골드 졸의 제조]
최종 골드 졸 제제에 사용되는 시드 졸을 제조하기 위하여, 10㎖의 1% HAuCl트리히드레이트를 900㎖의 물에 첨가하고 잘 교반했다. 10㎖의 1% 소듐 시트레이트를 상기 혼합물에 첨가하고 잘 교반했다. 격렬하게 교반하면서, 10㎖의 0.075% 소듐 보로히드라이드(소듐 시트레이트 용액중에 소듐 보로히드라이드를 용해시켜서 제조함)를 첨가하고, 5분 동안 잘 교반했다. 상기 혼합물을 0.22 마이크론 필터를 통해 여과시켜 4℃에서 보관했다. 사용 이전에 졸을 24시간 이상 동안 숙성시켜야만 한다.
최종의 골드 졸을 제조하기 위하여, 8 ㎖의 2% HAuCl트리히드레이트(수중)를 900㎖의 물에 첨가했다. 계속 교반하면서, 새로 제조한 5% 히드록실아민 히드로클로라이드 4㎖를 첨가했다(수중). 직후에, 22.33㎕의 시드 졸을 첨가하고 30분동안 격렬하게 교반했다. 1 ㎕의 아세톤을 생성된 졸 1 ㎖ 마다 첨가했으며 10분간 계속 교반했다. 원하는 pH가 될 때까지 0.2 M KKCO를 첨가했다.
첨가된 시드 졸의 적당한 부피는 다음과 같이 결정했다 :
원하는 졸 사이즈에 필요한 시드의 부피= 소정의 시드 졸의 양으로부터 산출되는 졸의 직경을 원하는 입자의 직경으로 나눈 값의 세제곱근과 소정 크기의 졸에 필요한 시드의 부피를 곱한 값.
[실시예 2]
[n-알칸티올에 의한 골드 졸의 피복]
실시예 1에 기재된 바대로 골드 졸을 제조했다. 메탄올중의 0.1M 1-도데칸티올과 1% Tween-20 의 용액을 새로 제조했다. 피복하고자 하는 골드 졸 매 100㎖에 대하여, 1㎖의 티올-메탄올 용액을 교반하면서 골드 졸에 적가했다. 상기 혼합물을 2시간 동안 가끔씩 저어 주면서 실온에 방치했다. 피복된 골드 졸을 실온에서 15분 동안 2000 x g로 원심분리하여 회수한 후, 1 mM MOPSO(pH 7.0)중에 재현탁 시켰다. 상기 원심분리와 재현탄 과정을 3회 반복 실시했다. 산출한 졸을 동일한 완충액에 재현탁시키고 사용 이전에 4℃에서 보관했다.
[실시예 3]
[n-알칸티올과 n-알칸티올 유도체의 혼합물로 피복된 골드 졸]
실시예 1에 기재된 바와 같이 골드 졸을 제조했다. 메탄올중의 0.09M 1-도데칸티올, 0.01M 12-메르캅토-1-도데카노산 및 1% Tween-20 의 용액을 새로 제조했다. 피복하고자 하는 골드 졸 매 100㎖에 대하여, 1㎖의 티올 혼합물-메탄올 용액을 교반하면서 골드 졸에 적가했다. 상기 혼합물을 2시간 동안 가끔씩 저어 주면서 실온에 방치했다. 피복된 골드 졸을 전술한 실시예와 동일한 방식으로 회수했다.
[실시예 4 ]
[n-알칸티올 유도체의 골드 졸 피복 및 이후 염-유도된 응집으로 부터의 보호 결핍]
실시예 1에서 제시된 바와 같이 골드 졸을 제조한 후, KCO를 사용하여 pH 7로 조절하였다. 0.10 M의 12-메르캅토-1-도데카노산 및 1% Tween-20 의 메탄올 용액을 새로 제조했다. 피복하고자 하는 골드 졸 매 100㎖에 대하여, 1㎖의 티올-메탄올 용액을 교반하면서 골드 졸에 적가했다. 상기 혼합물을 1시간 동안 가끔씩 저어 주면서 실온에 방치했다. 피복된 졸의 1㎖ 분취액을 2배로 하기 위하여, 100㎕의 물 또는 10% NaCl을 첨가했다. 물을 첨가한 분취액을 대조용으로 사용했다. 10% NaCl을 첨가한 분취액에서는 10분후 광학 밀도의 54%가 소실되었다. 이러한 결과는, 12-메르캅토-1-도데카노산으로 피복시키는 것에 의해서는 염-유도된 응집으로 부터 골드 졸을 보호할 수 없음을 입증하는 것으로 해석된다.
[실시예 5]
[n-알칸티올과 n-알칸티올 유도체의 혼합물로 피복된 골드 졸의 제조]
실시예 1에서 제시된 바와 같이 골드 졸을 제조한 후, KCO를 사용하여 pH 7로 조절했다. 0.004M N-데칸티올, 0.0005M 11-메르캅토-1-운데카놀, 0.0005M 12-메르캅토-1-도데카노산, 0.08M NaCl 및 1% Tween-20 의 메탄올 용액을 새로 제조했다. 피복하고자 하는 골드 졸 매 100㎖에 대하여, 1㎖의 티올-티올 유도체 용액을 교반하면서 적가한후, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 방치했다. 염-유도된 응집으로부터 피복된 졸이 보호되는지의 여부를 실시예 4에서와 같이 평가분석했다.
10% NaCl 첨가후, 피복된 졸은 540 nm에서 100% 광학 밀도를 유지하고 있었다. 이러한 결과는, 피복된 졸이 염-유도된 응집으로부터 완전히 보호됨을 나타내는 것으로 사료된다.
[실시예 6]
[피복된 골드 졸로의 소의 혈청 알부민(BSA)의 접합]
실시예 3에서 제시된, 피복된 골드 졸(540nm에서의 광학 밀도 25.0) 4㎖를 10 mM의 MOPSO (pH 7.0) 4.3 ㎖과 혼합했다. 교반하면서 이 혼합물에, 25㎎/㎖ BSA(0.2㎖), 30 nm SNHS(1.0㎖) 및 0.1 M EDC(0.5 ㎖)를 순차적으로 첨가했다. 상기 BSA, SNHS 및 EDS는 10 mM MOPSO(pH 7.0)내에서 제조된 것이다. 상기 반응물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 이어서 10 mM MOPSO(pH 7.0)에 용해된 1.0M의 에탄올아민(HCl을 사용하여 pH 7.0으로 조절) 1㎖를 첨가한 후, 1시간 동안 더 진탕시켜 반응을 종결시켰다. 동일 부피의 10 mM MOPSO, 0.15 M NaCl, 0.5% Tween-20 및 1.0㎎/㎖ 카세인을 pH 7.0에서 반응 혼합물에 첨가한 후, 상기 혼합물을 1시간 동안 방치했다. 이러한 블로킹 및 오버코팅 단계는 다른 생중합체와의 비특이성 상호작용으로 부터 골드 졸 표면의 미반응된 비피복 부분을 보호하기 위한 것이다. 상기 BSA가 접합된 피복 졸을 실온에서 2000 x g로 15분간 원심분리하여 회수한 후 동일한 완충액중에 재현탁시켰다. 원심분리 및 세척 단계를 3차례 반복했다. 전술한 바와 같이 졸을 원심분리하여 10 mM MOPSO(pH 7.0)내에 재현탁시켰다. 상기 단계를 2회 반복했다. BSA가 접합된 피복 졸은 사용전에 4℃에서 보관하였다.
[실시예 7]
[BSA가 접합된 골드 졸의 SPIA]
실시예5 에서 수득한, BSA가 접합된 골드 졸을 0.1 M MOPSO, 0.15 M NaCl, 1.0%폴리에틸렌 글리콜 8000(pH 7.0)중에 540 nm에서의 광학 밀도가 1.0이 되도록 희석하였다. 폴리클로날 항-BSA 항체 및 정상 토끼 면역글로불린(IgG)의 농도가 12㎕/㎖로 되도록 10mM MOPSO(pH 7.0)중에 희석했다. BSA가 접합된 졸의 각 1㎖ 분취액에 100 ㎕의 희석된 항-BSA 또는 정상 토끼 IgG, 또는 10mM MOPSO 완충액을 혼합하면서 첨가했다. 상기 혼합물을 큐벳에 옮겨 540 nm에서의 광학 밀도를 시간 경과에 따라 모니터하였으며, 이 결과는 표 2에 제시되어 있다.
실시예 2의 결과는, 졸 표면상에 면역적으로 인식가능한 BSA가 존재한다는 사실과 광학 밀도에 있어서의 감소가 졸과 토끼 혈청간의 비특이성 상호작용에 기인한 것이 아님을 입증하는 것이다.
[실시예 8]
[BSA 음성 대조군이 접합된 골드 졸의 SPIA]
EDC를 접합 반응에 첨가하지 않는 것을 제외하고는 실시예 5와 완전히 동일한 방법으로 BSA 음성 대조군이 접합된 피복 졸을 제조했다. 상기 혼합물에는 EDC 대신 동일 부피의 10 mM MOPSO 완충액(pH 7.0)을 포함시켰다. 이러한 졸의 목적은 SPIA 평가분석에 의해, 관찰된 BSA의 활성이 천연적으로 공유결합된 것임을 입증하는 것이다. 표 2 및 3의 결과를 비교해 보면, 이러한 졸상의 BSA 활성의 상당 부분이 수동적으로 흡착될 수 있지만, 동일한 상당 부분은 공유 결합되어 있음을 알 수 있다.
[실시예 9]
[TTC 피복된 골드 졸상의 항체의 피복 특성의 개선]
KCO를 사용하여 pH를 6.0으로 조절하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 골드 졸을 제조했다. 메탄올중의 TTC의 포화 용액을 새로 제조했다. 최종 Tween-20 농도가 2.5%가 될때까지 메탄올중의 10% Tween-20 용액을 첨가했다. 이 용액 4㎖를 교반하면서 상기 졸 200㎖에 첨가하고 그 혼합물을 가끔씩 저어 주면서 2시간 동안 실온에 방치하였다. 피복 졸을 실시예 2에서와 같이 회수했다. 피복 졸의 각 분취액을 2.0의 광학 밀도로 희석시켰으며 동시에 10 mM (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산)(MES), 10 mM MOPSO, 10mM (N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N-[3-프로판술폰산])(EPPS), 및 10 mM (2-[N-시클로헥실아미노]-에탄술폰산)(CHES)으로 각각 pH를 6, 7, 8 및 9로 조절하였다. 병행하여, 골드 졸을 실시예 1에서와 같이 제조하고 각 분취액을 KCO를 사용하여 pH 6, 7, 8 및 9로 조절하였다. 정제된 인체 항- HIV 폴리클로날 항체를 상기 각 완충액을 이용하여 1.0, 0.5, 0.25, 0.10 및 0.05㎎/㎖로 희석시켰다. 병행해서, 상기 각각의 졸과 pH의 1.0 ㎖ 분취액에 혼합하면서 해당 pH에서 항체 용액 100 ㎕를 첨가했다. 혼합물을 30분동안 실온에 방치하였다. 10% 염화 나트륨 100 ㎕를 진탕하면서 각 졸 혼합물에 첨가했다. 10분후, 제1도 내지 제4도에서 제시한 바대로 각 혼합물의 광학 밀도를 540 nm에서 측정했다.
TTC 피복 졸상에 항체를 흡착시킨 결과, 광범위한 pH 범위에서 염-유도된 응집으로부터의 보호가 이루어졌다. 또한, TTC 피복 졸상의 더 낮은 항체 농도에서도 염-유도된 응집으로부터의 보호가 가능했다. NaCl을 첨가하지 않은 경우는, 항체가 비피복 졸의 자발적인 응집 현상을 야기시켰다. 항체-유도된 자발적 응집은 TTC 피복 졸에서 훨씬 적게 나타났다.
종합해보면, 이러한 관찰은 TTC 피복 골드 졸에 대한 상기 항체의 흡착성이 비피복 졸에서 나타나는 것보다 더 큰 것임을 나타낸다.
[실시예 10]
[TTC 피복된 골드 졸에 흡착된 항체의 SPIA 활성의 개선]
100 ㎖의 골드 졸을 실시예 1에서와 같이 제조하고 pH를 9.0으로 조절했다. 10 mM CHES 중의 2㎎/㎖ 인체 항-HIV(GC -143) 2.5 ㎖ (pH 9.0)를 교반하면서 첨가하고, 이 혼합물을 약 2시간 동안 가끔씩 저어주면서 실온에 방치하였다. 5 ㎖의 1 ㎎/㎖ 탈지 분유를 상기 혼합물에 교반하면서 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 더 실온에 방치하였다. 상기 피복 졸을 실온에서 15분 동안 2000 x g로 원심분리하고 10 mM CHES, 0.5% BSA, 300 mM 만니톨, 0.01% 소듐 아자이드(pH 9.0)중에 재현탁시켰다. 상기 원심분리와 재현탁 단계를 3회 반복 실시했다. 이 졸을 동일한 완충액에 최종적으로 재현탁하여 사용이전까지 4℃에서 보관했다. 실시예 9에서 제조된 TTC 피복 졸을 10 mM CHES(pH 9.0)으로 희석하여, 실시예 1에서 제조된 골드 졸의 광학 밀도와 거의 동일한 광학 밀도 2.0의 졸 60 ㎖를 수득했다. 10 mM CHES중에 용해된 0.5 ㎎/㎖ 인체 항-HIV 6㎖(pH 9.0)를 교반하면서 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 실온에 방치한 후, 4℃ 에서 밤새 방치하였다. 6㎖의 1 ㎎/㎖ 탈지 분유를 교반하면서 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 실온에 방치하였다. 피복된 졸을 전술한 바대로 회수하고 동일하게 보관했다.
각 졸의 분취액을 0.1 M MOPSO, 0.15 M NaCl, 1% PEG 8000, 0.25% BSA(pH 7.0)를 사용하여 540 nm에서의 광학밀도가 2.0이 되도록 희석했다. 희석된 각 졸의 분취액을 증량시키기 위하여, a) 100㎕의 완충액, b) 100 ㎕의 10 ㎍/㎖ HIV gp160, 또는 c) 100㎕의 실온에서 90분간 예비-항온처리한 5㎍/㎖ HIV gp60과 5㎍/㎖ 인체 항-HIV의 혼합물을 첨가했다(참고, 제5도 및 제6도).
상기 GC-143 TTC 피복된 졸은 비피복된 상대 졸 보다 더욱 면역적으로 활성이 있으며 SPIA 평가분석에 이를 사용하면 더 민감한 분석이 가능한 것으로 드러났다. 따라서, 작용적인 기준에서도, GC-143 TTC 피복 졸이 비피복된 상대 졸보다 더 우수하다.
[실시예 11]
[N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)를 사용한 모노클로날 항 HIV p24의 티올화]
50 mM NaPO, 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) (pH 7.5) 중의 1.46 ㎎/㎖의 모노클로날 항-HIV p24 1 ㎖를 디메틸술폭사이드(DMSO)중의 5 ㎎/㎖의 SATA 0.02 ㎖과 혼합하고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응한 항체를 동일한 완충액에서 탈염 컬럼을 통하여 겔 여과함으로써 반응 성분으로 부터 분리했다. 0.25 ㎎의 겔 여과 시킨 반응 항체를 동일한 완충액을 사용하여 1 ㎖로 희석시켰으며 100 ㎕의 0.05 M NaPO, 25mM EDTA, 0.5 M NHOH·HCl(pH 7.5)을 혼합하면서 첨가했다. 반응물을 1.5시간 동안 실온에 방치하였다. 탈보호된 항체를 탈염 컬럼을 통해 원 완충액으로 겔 여과 시켜서 미반응 시약을 제거했다.
[실시예 12]
[티올화 모노클로날 항-HIV p24의 피복 특성의 개선]
각 졸 분취액을 KCO를 사용하여 pH 6, 7, 8 및 9로 조절하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 골드 졸을 제조했다. 병행하여, 비유도체화된 및 유도체화된 모노클로날 항-HIV p24의 각 분획(참고, 실시예 11)을 250, 200, 150, 100 및 50 ㎍/㎖로 조절했다. 각각에 대해, 염-유도된 응집으로부터 골드 졸을 보호하기 위한 유도체화된 항체 및 비유도체화된 항체의 상대적인 능력을 실시예 9에 기재된 바와 같이 측정하였다(참고, 제7도 및 제8도).
제7도와 제8도를 통하여, 상기 모노클로날 항테의 티올화는 a) 유도체화된 항체가 자발적으로 졸을 응집시키지 않으며, b) 졸 응집에 대한 항체 보호성의 pH에 대한 의존성 감소, 및 c) 비유도체화된 항체 졸과 비교하여 염의 존재하에서 염-유도된 졸 응집으로부터 보호하는데 필요한 유도체화된 항체의 더 작은 상대적인 양을 특징으로 하는 개선된 피복물을 제공한다는 것을 알 수 있다.

Claims (23)

  1. 알칸티올, 알칸티올 유도체, 디-티올 및 트리-티올 화합물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 화합물로 피복된 골드 졸을 포함하는 미립자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 1종 이상의 알칸티올인 미립자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 1종 이상의 알칸티올과 1종 이상의 알칸티올 유도체의 혼합물인 미립자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알칸티올이 식 CH3(CH2)nSH [식중, n은 9 내지 23의 정수임]의 n-알칸티올인 미립자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알칸티올 유도체가 식 RCH2(CH2)nSH [식중, R은 OH, COOH, CHO, SH 및 NH2로 이루어진 그룹에서 선택되고, n은 9 내지 23의 정수임]의 화합물인 미립자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 디-티올 화합물인 미립자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 트리-티올 화합물인 미립자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 골드 졸이 약 10 nm 내지 약 150 nm의 직경을 갖는 미립자.
  9. 제1항에 있어서, 염-유도된 응집에 대하여 내성을 가짐으로써, 1.0% NaCl의 존재하에서 10분후에 상기 졸의 현탁액의 540 nm에서의 광학 밀도치의 10% 이하가 손실되는 미립자.
  10. 제1항에 있어서, 결합 성분에 공유결합에 의해 연결된 미립자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결합 성분이 단백질, 탄수화물, 항원, 항체, 리간드, 중합체 및 단량체로 이루어진 그룹에서 선택되는 미립자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 화합물에 공유결합에 의해 부착되고 결합 성분이 공유결합에 의해 연결되어 있는 가교 화합물을 추가로 포함하는 미립자.
  13. 제1항에 있어서, 부가적으로 상기 결합 성분이 수동적으로 흡착된 미립자.
  14. 하나 이상의 술프히드릴기를 함유하는 결합 성분에 부착된 골드 졸을 포함하는 미립자.
  15. a) 알칸티올, 알칸티올 유도체, 디-티올 및 트리-티올 화합물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 화합물의 알코올 용액과 골드 졸 미립자를 혼합하여, 피복된 골드 졸 미립자를 제조하는 단계 ; b) 상기 피복된 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; 및 c) 상기 피복된 골드 졸을 완충액중에 현탁하는 단계를 포함하는, 골드 졸 미립자의 피복 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 알코올 용액이 계면 활성제를 추가로 함유하는방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 화합물이 알칸티올과 알칸티올 유도체의 혼합물인 방법.
  18. a) 골드 졸을 제15항에 따라 피복하여 피복된 골드 졸을 제조하는 단계 ;
    b) 상기 피복된 골드 졸과 결합 성분을 항온처리하여 결합 성분이 상기 피복된 졸에 부착되도록 하는 단계 ; c) 상기 단계 b)의 피복된 골드 졸상의 비특이성 부위를 차단하는 단계 ; d) 상기 단계 c)의 피복된 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; 및 e) 상기 단계 d)의 피복된 골드 졸을 완충액중에 재현탁하는 단계를 포함하여, 골드 졸 미립자에 결합 성분을 부착하는 방법.
  19. a) 골드 졸을 제16항의 방법에 따라 피복하는 단계; b) 골드 졸, 적절한 화학적 가교결합제 및 결합 성분의 혼합물을 항온처리하여 결합 성분이 상기 피복된 골드 졸에 부착되도록 하는 단계 ; c) 상기 혼합물을 급냉시키는 단계 ; d) 상기 단계 b)의 피복된 골드 졸상의 비특이성 부위를 차단하는 단계 ; e) 상기 단계 d)의 피복된 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; 및 f) 완충액중에 재현탁하는 단계를 포함하여, 골드 졸 미립자에 결합 성분을 부착하는 방법.
  20. a) 골드 졸 미립자를 제17항의 방법에 따라 피복하는 단계 ; b) 상기 피복된 골드 졸, 적절한 화학적 가교결합제 및 결합 성분의 혼합물을 항온처리하여 결합 성분이 상기 피복된 골드 졸에 부착되도록 하는 단계 ; c) 상기 혼합물을 급냉시키는 단계 ; d) 상기 단계 b)의 상기 골드 졸상의 비특이성 부위를 차단하는 단계 ; e) 상기 단계 d) 의 상기 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; 및 f) 완충액중에 재현탁하는 단계를 포함하여, 결합 성분을 골드 졸 미립자에 부착하는 방법.
  21. a) 골드 졸 미립자를 제16항의 방법에 따라 피복하는 단계 ; b) 상기 피복된 골드 졸을 결합 성분과 함께 항온처리하는 단계 ; c) 상기 단계 b)의 상기 피복된 골드 졸상의 비특이성 부위를 차단하는 단계 ; d) 상기 단계 c)의 상기 피복된 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; 및 e) 상기 단계 d)의 상기 골드 졸을 완충액중에 재현탁하는 단계를 포함하여, 결합 성분을 골드 졸 미립자에 부착하는 방법.
  22. a) 결합 성분을 화학적 티올화에 의해 변형시키는 단계 ; b) 상기 단계 a)의 티올화된 결합 성분을 골드 졸 미립자와 함께 항온처리하는 단계 ; c) 상기 단계 b) 의 골드 졸상의 비특이성 부위를 차단하는 단계 ; d) 상기 단계 c)의 골드 졸을 원심분리하는 단계 ; e) 상기 단계 d) 의 골드 졸을 완충액중에 재현탁하는 단계를 포함하여, 결합 성분을 골드 졸 미립자에 부착하는 방법.
  23. 제1항에 따른 미립자 및 완충액을 포함하는 면역평가분석에 사용하기 위한 진단용 키트.
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