JP2003536074A - Sh基を保有するデキストランまたはアミノデキストランで被覆されたコア−シェル金属粒子、およびその使用 - Google Patents
Sh基を保有するデキストランまたはアミノデキストランで被覆されたコア−シェル金属粒子、およびその使用Info
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Abstract
Description
れたコロイド金属粒子、ならびに免疫学的試験方法におけるかかる粒子の製造お
よび使用に関する。
広範囲に使用されている。特に、免疫学的アッセイの分野において、いずれの型
の生体分子の標識に対するコロイド金属粒子の適用も、非常に成功している。
記載されている。コロイド金粒子は、テトラクロロ金酸溶液の還元により通常得
られ、関連する生体分子は、1つまたはいくつかのさらなるステップにおける吸
着によりこれらの粒子に結合される。コロイド金属粒子のサイズは、種々の反応
パートナーの初期濃度により厳密に調節されうる(G.Frens, Nature Physical Sc
ience, 241, p.20-22(1973))。粒子サイズ変動はまた、EP-B-426 300に記載され
る製造手順の特異的な選択により最適化されうる。
の物理化学特性(例えば、等電点)に強く依存するそれぞれの負荷条件を伴って
主に吸着性である。コロイド金属粒子の被覆の主な所見は、関連技術文献に見出
されうる(例えば、deMey,Immunocytochemistry 、金プローブの調製および使用
、J.M.Polak およびS.v. Noorden, pp.115-145, Wright, Bristol, 1986 または
G.T.Hermanson,コロイド−金属−標識タンパク質の調製、Bioconjugate Technip
ues 、pp. 593-604, Academic Press, 1996 )。
粒子を安定化することが必要であり、かつ有用であることが証明されている。か
かる安定化物質およびブロッキング物質の添加は、おそらく粒子上の不飽和の「
接着」部位がブロックされるという効果を生じる。さらに、これらの物質により
、粒子の凝集が最小化され、関連生体分子の再拡散が低減する。
またはポリエチレングリコール(分子量20,000D)、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルスルフェート、デキストランならびにゼラチン
などの水溶性工業用ポリマーである(例えば、de Mey, 上記; Beesly, J.E.、コ
ロイド金:細胞化学構造のための新しい観点、Microscopy Handbooks、17、Oxfo
rd University Press, 1989,特にpp. 1-14;Behnke, Eur. J. Cell. Biol. 41(19
86). pp.326-338;DE 2420531 C3;Meiselら、J. Phys. Chem. 85(1981), pp.179-
187 を参照)。
つかの重大な不利益を有する。かかる不利益は、例えば、成功した方法が、1つ
の生体分子から第2のものへ容易に移され得ないこと、かかる粒子の安定性に問
題があることが証明されていることである(de Mey, 上記、p.116 およびpp.122
-123を参照)。
ている。特に、いわゆるコア−シェル粒子が、本明細書で言及されている。コア
−シェル粒子は、(通常)金属コアおよび完全に粒子を取り囲むシェルからなる
。かかるシェル物質の重要な例は、例えばEP 258 963およびEP 428 412に記載の
BSA(ウシ血清アルブミン) 、例えばゼラチンなどの変性タンパク質、例えばアミ
ノデキストラン(US 5,248,772 ) などの水溶性ポリマー、または低分子チオール
化合物またはチオール化タンパク質(EP 489 465)から作製されるシェルである。
,248,772) 。かかるシェルは、所望の生体分子が一般に公知の共有結合で結合し
うる官能基を含む。
結合を上回るいくつかの利点を有する。共有結合により、生体分子の流出が避け
られうる。さらに、吸着性負荷手順の間に吸着に利用できない残っているフリー
な表面領域により誘発される非特異的相互作用が停止する。安定剤の添加による
表面の後処理は、コア−シェル粒子に必要でない。十分溶解性のある親水性のシ
ェルの使用により、得られたコア−シェル−タンパク質コンジュゲートの安定性
は、著しく改良されうる。したがって、吸着的に負荷されたコロイド−タンパク
質コンジュゲートで繰り返し観察されるようなコンジュゲートの凝集により生じ
る不安定性が、避けられうる。さらに、コア−シェル粒子へのタンパク質の共有
結合は、タンパク質の物理化学特性からは大いに独立しているので、吸着結合に
適さないタンパク質でさえも使用されうる。
電気的ならびに疎水的相互作用を含む機構を従来完全には理解していない。シェ
ル物質がコロイド金属粒子に結合する際にどの結合型が優勢であるか、シェル物
質の型を決定する。
する。さらなる官能基により、関連する生体分子がこのチオールシェルに結合さ
れうる。
から公知である(US 5,248,772)。アミノデキストランの架橋は、かかる方法で製
造されている粒子に十分な安定性を与えるために必要である。US 5,248,772に記
載される方法のさらなる不利益は、結合に適切なSH- 基を架橋アミノデキストラ
ンのシェルに後で挿入する必要があることである。かかる手順は、いくつかのさ
らなる作業ステップを必要とする。さらに、SH- 基の挿入率は低い正確性でしか
調節されず、挿入効率の解析はほとんど可能でない。
とができ、例えばアミノデキストランシェルの架橋または続く官能基の挿入(例
えば、SHに基づく結合化学のため)などのいずれのさらなる処理ステップも必要
としない、アミノデキストランに基づくコア−シェル粒子は公知でない。
粒子を提供することが目的であった。
される。
いて多くの利点を有する、SH- デキストランまたはSH- アミノデキストランシェ
ルを有するコロイド金属粒子を提供する。本発明は、特に、SH- 基を保有する非
架橋デキストランまたはアミノデキストランからなるものではないシェルを有し
てなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子を取り囲んでなるコア−
シェル金属粒子に関する。
が、金属コアと1つまたは数個の非金属成分からなるシェル/被覆とを有する粒
子を説明するために以下で適用される。
子が考慮されうる。好ましくは、金属は、貴金属、特に金または銀、および特に
好ましくは金に関係する。
〜200 万D 、また好ましくは20000 〜100 万D 、および特に好ましくは30000 〜
100000D を有する分子が使用される。
れる; 本明細書において、アミノデキストランが特に好ましい。SH- 基の挿入は
、例えば、活性化カルボン酸のアミノ基との化学反応である。S-アセチル- チオ
プロピオニル- 酸-N- ヒドロキシスクシニミドエステル(SATP)、N-スクシニミジ
ル-S- アセチルチオアセテート(SATA)またはS-アセチル- メルカプト- 無水コハ
ク酸(SAMBA) 型の試薬が、好適に使用される。デキストランのOH基の活性化は、
例えば、1-シアノ-4-(ジメチルアミノ)-ピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDA
P)により開始され、SH- 基の挿入は、SH保護アミノチオール( 例えば、S-アセチ
ルシステアミン) の続く添加により開始される。
常に大部分が変換されるはずである。SH- 基は、ヒドロキシルアミンの添加によ
り次いで放出される。特に有利なのは、少なくとも70%、特に好ましくは80%お
よび非常に特に好ましくは90%の程度で変換されたアミノ基を有し、SH官能基を
保有するSH- アミノデキストランである。
温度4 ℃または室温および2 〜24時間の間である非常に種々の条件下で行われう
る。室温でpH8.5 で作用させ、約3 時間の間反応を固定するのが特に適切である
ことが証明されている。例えば、ヒドロキシアミンの添加によるSHの放出は、弱
酸pH条件下、特に好ましくはpH6.0 〜6.5 で特に好ましい。
またはSH活性化アミノデキストランが記載される場合、これは、例えば、前記方
法により製造されうるようなSH- アミノデキストランまたはSH- デキストランを
一般に含む。
の提供に対して、単鎖分子、例えば24C-原子の最大鎖長を有するアルキルチオー
ルが使用されるであろうことが明白に記載されている。EP 489 465において、鎖
長の上限が24C-原子に設定されるのには、十分な理由がある。2または3より多
くのSH- 基を有する長鎖分子のこの恐れの理由は明白である。当業者は、例えば
、SH- アミノデキストランなどの長鎖分子は、金属- ゾル粒子を安定化しないが
、凝集を導くと考えたはずである。
、科学技術分野で最大の問題を構成し、不安定性、および非特異的結合により生
じる問題をもたらす。
子の後被覆および安定化に使用される際、非常に有利であることが示されている
。この後処理は、著しく安定な粒子をもたらすので、通常行なわれるようなアミ
ノデキストランモノマーの架橋(US 5,248,772)は、もはや全く必要でない。明ら
かに、SH- 官能性による金属表面への結合はかなり安定であるので、遊離の「接
着」表面成分の飽和のためのさらなる後被覆も、SH- アミノデキストラン分子の
架橋も、再拡散(不安定な分子結合の流出)を避けるために必要でない。それゆ
え、本発明の主題は、コロイド金属粒子の被覆および安定化のためのSH- アミノ
デキストランの使用である。
件下でインキュベートする、SH- アミノデキストランシェルを有するコロイド金
属粒子の製造方法に関する。驚くべきことに、本発明によるコア−シェル粒子は
、調製が容易である。室温で、制御されたpH下に、コロイド金溶液とSH- 修飾ア
ミノデキストラン溶液とを単純に混合することにより、本発明のコア−シェル粒
子の形成を誘発する。このようにして得られた粒子を、洗浄するだけで、架橋に
よる安定化の発生なしにリンカーまたは生体分子への結合に使用しうる。
ましくはpH5.0 〜7.0 の範囲、特に好ましくはpH5.5 〜pH6.5 で行なわれる。反
応温度および反応時間は広く変化しうるが、4 ℃または室温で2 〜24時間が好ま
しい。
を有してなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子を取り囲んでなる
コア−シェル金属粒子に関する。
び銀、非常に特に好ましくは金からなる。
ではない。驚くべきことに、多くのSH- 基は、金属表面との相互作用に関与しな
い。被覆の後もまだ利用できるこれらのSH- 基は、さらなる分子、特に生体分子
に対する最適の結合部位を表わす。
し、他方で特異的に選択された官能基を介して必要とされる生体分子に共有結合
するSH- 反応性ホモ- またはヘテロ二- 官能基リンカーを使用することが非常に
有利であることを証明した。カップリング対象の生体分子上の好ましい官能基は
、例えばNH2-基またはSH- 基である。
属粒子とからなるコンジュゲートの製造方法に関する。
、6.5 〜7.0 の範囲のpHで、マレイミドにより活性化される生体分子は、SH- ア
ミノデキストランを負荷された金粒子に共有結合を介してカップリングされうる
。生体分子のカップリングは、好ましくは、約4℃または室温でありうる臨界で
はない温度で一晩、すなわち、約10〜30時間にわたり行われる。さらなる本発明
の反応性マレイミド基のブロッキングのために、システインのチオグルコース等
の試薬が使用される。SH基は、ヨードアセトアミド、N-メチルマレイミド(NMM
)またはN-エチルマレイミド(NEM )等の試薬を添加することによりブロックさ
れる。
本発明に従って、これらは、好ましくは核酸、ペプチドおよびタンパク質である
。例えば、ハプテン、脂質またはポリサッカリド等の他の生体分子もまた、使用
される場合有益な効果を有する。
トナーを示すタンパク質等のグループに由来する生体分子であり、非常に好まし
くは、本明細書中ではレクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体であ
る。
の抗体断片を含む。これらは、例えば、Fab 、F(ab')2 断片のFab'である。接頭
語「モノクローナル」または「ポリクローナル」を有さない用語、抗体は、両方
のタイプの抗体ならびにキメラ構築物および上記記載の全ての断片を常に含む。
結合した非架橋のSH- アミノデキストランの被覆を有する別の型のコアシェル粒
子に関する。
子、すなわち、好ましくはSH- 基と反応する少なくとも1つの基とのカップリン
グに適した少なくとも2つの基を有する分子を使用することが有利である。本発
明はまた、それゆえ、SH反応性リンカー分子を保有する非架橋SH- アミノデキス
トランの被覆を有するコロイド金属粒子に関する。本発明は、特に、生体分子が
カップリングしたコア- シェル粒子を含む。ここで、生体分子のカップリングが
、SH- アミノデキストランのSH- 官能基に直接行われているかどうか、またはホ
モもしくはヘテロ二官能基リンカーがカップリングに使用されているかどうかは
重要ではない。生体分子にカップリングしたコア- シェル粒子はまたコンジュゲ
ートと呼ばれる。
発明のコロイド金属粒子にカップリングされる。
体とのコンジュゲートは、粒子の従来技術の類似物を上回って有利である。従来
技術に従って金粒子を用いて(図1)、または本発明に従ってコア- シェル- 粒
子を用いて(図2)それぞれ製造された抗体- 金- 粒子コンジュゲートの保存安
定性を比較すると、後者の方が大いに安定であることが明らかである。驚くほど
に良好な安定性の他に、本発明のコンジュゲートは、免疫学的試験システムにお
いてより良好な挙動を示す。図3に示す2つの異なる抗体- 金- 粒子コンジュゲ
ートの免疫学的感度に関する結果は、試験片フォーマットのいわゆるクイック試
験(quick test)に由来する。図3から、当業者は、本発明のコンジュゲートを
用いる場合、前記試験がより感度が高いことを理解しうる。
ためにサンプル流体を提供するのに十分であるような試験片の形態)にしみ込ま
せた単一または全ての反応性試験成分を有する試験システムであると理解すべき
である。サンプル中の分析分子は、しみ込んだ検出試薬と反応し、一方、サンプ
ル流体は試験片を通過する。一般に、試験片は、例えば、分析物- 検出試薬複合
体を集めるために密接に結合した特異的結合パートナーのラインの形態で、検出
ゾーンとしての装置を含む。この検出ゾーンにおけるシグナル強度は、次いで、
肉眼または適切な分析装置により測定されうる。種々のかかるクイック試験の態
様が当業者に公知である(例えば、EP-B-186 799またはEP-A-299 428)。
めにクイック試験に使用されうる。
発明により生産されたコンジュゲートが、吸着的に負荷されたコンジュゲートを
有する他の比較可能な試験片よりも有意に高いシグナルを有することを示した。
比較のために、図3は、両方のコンジュゲートのHIV 陽性サンプルの希釈系列を
示す。より低い軽減は、測定した濃度系列に関してより高い感度と同義である。
試験片の性能に対して、これは顕著な利点である。
マーカーまたは検出試薬としての試験システム中の生体分子、特に抗体とコロイ
ドSH- アミノデキストラン- 金属粒子とからなる本発明のコンジュゲートの使用
は、それゆえ、本発明のさらにとりわけ好ましい態様である。
において可能である。全ての公知の免疫アッセイにおいて、分析物は、1つまた
はいくつかの免疫学的結合パートナーへの結合によりサンプル中で直接または間
接的に特異的に検出される。通常の試験フォーマット、例えば、異種または同種
の試験手順は、当業者に公知であり、本明細書中でさらに説明する必要はない。
ための免疫学的手順であり、ここで本発明のコア- シェル粒子のコンジュゲート
は、マーカーまたは検出試薬として生体分子とともに使用される。
ノデキストランを、200ml のリン酸緩衝液、pH8.5 に溶解させる。1.225gのSATP
を62mlのDMSOに溶解させ、アミノデキストラン溶液に添加した。この混合物を室
温で3時間撹拌し、次いで透析する。SH- 基の放出は、2mlの水に溶解させた69
4mg のヒドロキシルアミンの添加により達成する。pHを6.0 に調整し、その後1
時間リン酸緩衝液pH6.0 に対して透析した。
。続いて、実施例1で作製した400 μg のSH- アミノデキストランを10mMのK-ア
セテート pH5.6に添加し、2時間撹拌する。
MAB<Dig>M-IgG )を1mlのリン酸緩衝液pH7に溶解させる。6.9mg のMHS を690
μl のDMSOに溶解させる。330 μl の抗体溶液と10μl のMHS 溶液とを続いて混
合し、4℃で2時間撹拌する。その後、透析を一晩行う。
テート/Tris 緩衝液pH6.6 に溶解させた720 μg のMH- 修飾抗体を添加し、pHを
7.0 に設定し、混合物を4℃で一晩撹拌する。次に完全に反応しなかった過剰の
SH- 基およびマレイミド基を、チオグルコースおよびヨードアセトアミドを添加
することにより停止する。続いて、400mg のウシ血清アルブミンを添加し、pHを
7.8 に設定する。
、Tris, pH8.0 )。おそらく存在する凝集体を濾過により除去する。金ゾル溶液
のpH値をタンパク質溶液のpHに調整する。抗体溶液(10μg タンパク質/OD 金)
を金ゾル溶液に添加し、2時間インキュベートする。続いて、これを、10%BSA
溶液を添加(約1%のBSA 最終濃度)することにより飽和させる。コンジュゲー
トの精製を透析により達成する。
B<Dig>M-IgG および金ゾル粒子に由来するコンジュゲートを4℃で7ヶ月間保存
した。観察した期間にわたって本発明のコンジュゲートは、そのUV/Visスペクト
ルに関して不変であった。しかし、吸着負荷コンジュゲートは、より大きい粒子
サイズ分布に従って変化したスペクトルを示す(図1および2参照)。
抗体試験において評価し、吸着負荷コンジュゲートと比較した。
V 特異的反応パートナー(脱酸素化した(dioxigenylated))を有する試験片を用
いる乾燥試験として設計する。MAB<Dig>M-IgG-金コンジュゲートを別のキャリア
フリース上で乾燥する。
トナーを再溶解させ、サンプルからの検出対象のHIV 特異的抗体と反応させ、金
コンジュゲートの赤い色により別々の検出フィールドに示す。
。選択された貯蔵条件下(4℃で約7ヶ月)で、UV/Vis 解析は、両方のコンジ
ュゲートバッチの曲線がストレス前後の曲線型において著しい変化を示すことを
示す。これは、約7ヶ月間4℃での貯蔵により、試験したコンジュゲートが非常
に変化していることを意味する。換言すれば、これらのコンジュゲートは、試験
した条件下で安定でない。
UV/Vis 解析である。UV/Vis 解析におけるストレス前後の両方の調製物のほと
んど同一の曲線型は、本発明により製造された両方のバッチが、選択された貯蔵
条件下(4℃で約7ヶ月)で同一の挙動を示し、変化が生じていないことを証明
する。これは、コンジュゲートが試験した条件下で安定であることを意味する。
モノクローナル抗体(MAB )を、本発明により製造したコロイド金粒子に結合さ
せた。さらに、MAB-金コンジュゲートは、従来技術の方法により製造した。両方
のコンジュゲートを、軽減解析により評価した。より低い軽減値は、試験におけ
るコンジュゲートの改良された感度に一致する。
Claims (12)
- 【請求項1】 SH基を保有する非架橋デキストランまたはアミノデキストラ
ンからなるシェルを有してなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子
を取り囲んでなるコア−シェル金属粒子。 - 【請求項2】 粒子が貴金属粒子である請求項1記載のコア−シェル金属粒
子。 - 【請求項3】 さらなる分子がSH- 基を介して金属粒子に結合されている請
求項1または2記載のコア−シェル金属粒子。 - 【請求項4】 さらなる分子がSH- 反応性リンカー分子である請求項3記載
のコア−シェル金属粒子。 - 【請求項5】 生体分子がリンカー分子に結合されている請求項4記載のコ
ア−シェル金属粒子。 - 【請求項6】 生体分子がSH- 官能基に直接結合されている請求項1または
2記載のコア−シェル金属粒子。 - 【請求項7】 生体分子が抗体である請求項5または6記載のコア−シェル
金属粒子。 - 【請求項8】 免疫学的試験手順におけるマーカーまたは検出試薬としての
請求項1〜7いずれか記載のコロイド金属粒子の使用。 - 【請求項9】 クイック試験における検出試薬としての請求項1〜8いずれ
か記載のコロイド粒子の使用。 - 【請求項10】 コロイド金属粒子の被覆にSH- 基が挿入されたアミノデキ
ストランが使用される、活性SH- 官能基を含むシェルを有するコロイド金属粒子
の製造方法。 - 【請求項11】 コロイド金属粒子の後被覆または安定化のためのSH- アミ
ノデキストランの使用。 - 【請求項12】 分析物の検出のために請求項5〜7いずれか記載のコンジ
ュゲートが使用される、サンプルにおける分析物の検出方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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