KR0145908B1 - 핵산 증폭 검출방법 - Google Patents

핵산 증폭 검출방법

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지. 나디우 제임스
테런스 워커 조지
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알. 피. 올뮬러
벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 타겟서열 증폭과 결합되고 타겟서열 증폭을 의미하는 사슬 치환 증폭 반응의 프라이머 증대 생성물을 검출, 고정화 또는 편재화시키는 방법에 관한 것이다. 이 프라이머 증대 생성물은 타겟서열의 SDA로 동시에 생성되는 이차의 타겟-특히 DNA 생성물들이므로 실제시간으로 타겟서열 증폭 검출 및/ 또는 측정에 사용할 수 있다. 일반적으로 이차 증폭 생성물은 증폭될수 없으므로 타겟 서열 증폭을 방해하지 않으면서 형성된 후 SDA 반응물내에 불활성으로 잔존한다. 이 이차 증폭 생성물은 검출, 고정화 또는 편재화를 용이하게 해주는 특수 특색을 함유하도록 고안 또는 변경될 수 있을 것이다.

Description

핵산 증폭 검출방법
제1a도 및 제1b도에서는 본 발명 방법의 단계를 예시하고 있다.
제1a도에서는 두 개의 시그널 프라이머를 사용하여 일본쇄타겟 서열로부터 2차 증폭 생성물을 제조하는 방법을 예시하고 있다.
제1b도에서는 원래의 타겟서열이 이본쇄인 경우 상보적 사슬로부터 발생하는 유사공정을 나타낸다.
제2도에서는 단일 시그널 프라이머를 사용하여 2차 생성물을 제조하는 방법을 예시하고 있다.
본 발명은 핵산 타겟 서열의 증폭 및 측정 방법에 관한다. 인비트로에서의 핵산증폭 기술은 소량의 핵산 검출 및 분석용으로 강력한 수단을 제공해왔다. 이러한 방법은극히 고감도이므로 이를 전염병 및 유전병의 진단, 분석용 유전자의 분리, 및 법의학에서와 같이 특정 핵산 검출용으로 발전시켜보려는 시도가 행해져 왔다. 핵산 증폭 기술은 공정에 요구되는 온도에 따라 분류할 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR로 칭해짐; R.K.Saiki등, 1985,Science 230, 1350-1354),리가제 연쇄 반응(LCR로 칭해짐; D.Y.Wu 등, 1989, Genomics 4, 560-569; K. Barringer등, 1990, Gene 89, 117-122; F. Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193) 및 전사에 의한 증폭 (D.Y.Kwoh. 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 - 1177)에서는 온도 순환이 요구된다. 대조적으로, 사슬치환 증폭(SDA; G.T.Walker 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-296 및 G. T. Walker 등, 1992, Nuc. Acads. Res.20, 1691-1696, 이 두 문헌들은 참고자료로서 본원에 합체되어 있다.), 자기-지속형 서열 복제(3SR ; I. C. Guatelli 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) 및 Qβ리플리카제 시스템(P.M. Lizardi 등, 1988, BioTechnology 6, 1197-1202)과 같은 방법은 등온반응이다. 부가적으로, WO 90/10064호 및 WO 91/03573호에서는 핵산 등온 복제용 박테리오파아지 phi 29 복제기원의 용법에 대하여 기술하고 있다. 핵산 증폭을 검출 및/또는 측정하기 위한 여러 방법들이 또한 발전되어왔다. 대부분, 이러한 방법들은 프라이머에 기초한 것으로서, 즉 타겟서열에 프라이머를 하이브리다이즈시키는 것을 의미하며, 경우에 따라서는 이후에 프라이머를 신장시킨다. PCR에서 증폭시킨 핵산의 프라이머에 기초한 검출방법은 증폭 반응시 프라이머를 증폭된 생성물(앰플리콘)에 첨합시키는 (incorporated)것에 종종 의존한다. 따라서 PCR증폭 프라이머가 지닌 특색들은 증폭 생성물이내에 발현되며 증폭시킨 타겟서열을 검출하거나 다른 수단에 의해 검출을 위해 앰플리콘을 고정화시키는데 이용할 수 있다. 예를 들면, Syvanen 등(1988, Nucleic Acids Res. 16;11327-11338)은 비오틴-함유 증폭 생성물 제조에 사용하는 비오티닐화한 PCR증폭 프라이머의 용법에 대하여 기술하고 있다. 이때 이러한 앰플리콘은 형광염료 또는 기타 리포터 그룹을 함유하는 2차 프로브와 하이브리다이즈시킬 수 있다. 하이브라다이즈시킨 착물은, 비오틴 - 함유착물을 친화성에 기초하여 고정화시켜 반응혼합물의 기타성분들로부터 선택적으로 분리시키고, 리포터그룹을 이용하여 검출시킨다. Laongiaru 등 (1991, 유럽특허출원 제 0420260 호)은 PCR증폭생성물 검출용으로서 이용되는 형광 염료에 컨주게이트된 비오틴-함유 PCR증폭 프라이머의 유사 방법에 대하여 기술하고 있다. 프라이머를 함유한 앰플리콘을 크기에 기준하여 신장된 프라이머로부터 분리시키고, 두 개의 증폭 프라이머 세트상의 상위 형광염료를 사용하여 다중 증폭을 검출하였다. Kemp등(1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2423-2427;1990. PCT특허출원 제WO 90/06374호)은 하나의 수식된(modified) 증폭 프라이머를 첨합시켜 증폭된 DNA를 채취(capturing)하는 방법 및 검출 수단으로서의 2차 수식된 증폭 프라이머의 용도에 대하여 기술하고 있다. Kemp 채취 프라이머는 단백질 GCN4에 결합된 이본쇄 DNA용 인지서열의 일본쇄 형태인 5′말단을 함유한다. Kemp검출프라이머는 자신의 5′말단 상에 비오틴 성분을 포함한다. 증폭된 생성물은 채취 프라이머를 사용한 증폭에 의해 생긴 이본쇄 GCN4 인지서열에 결합함으로써 고정된다. 검출 프라이머에 의해 도입된 비오틴 성분은 아비딘 - 퍼옥시다제 착물과 결합하여 고정된 PCR증폭 생성물을 비색정량 검출할 수 있게 해준다. Wahlberg 등 (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6569-6573)은 하나의 PCR증폭 프라이머는 비오티닐화되고, 나머지 하나는 E. Coli Lac 작동서열을 코드하는 5′말단을 함유하는 유사방법에 대하여 기술하고 있다. 이본쇄 증폭 생성물은 스트렙타비딘에 결합되어 고정되고, 증폭에 의해 생성된 이본쇄 lac 작동유전자에 lac억제인자-β-갈락토시다제 용융 단백질이 결합함으로써 검출된다. Wahlberg 등의 방법은 이본쇄 결합 단백질이 아니라 비오틴 - 스트렙타비딘 간의 상호 작용이 증폭생성물을 고정시키는 것이고 이본쇄 결합 단백질은 비색정량 검출에 사용된다는 점에서 Kemp 등의 방법과 상위하다. 이는 각각 상위한 이본쇄 결합 단백질의 인지서열을 엔코딩하는 5′말단을 지닌 두 개의 증폭 프라이머를 사용함으로써, 상기 두 방법이 결합될 수 있음을 제안한다. 증폭된 생성물은 이후, 하나의 이본쇄 결합 단백질에 결합함으로써 고정화되고, 또다른 단백질에 결합함으로써 검출가능할 것이다. C. A. Vary(1992, Clinical Chemistry 38, 687-694; 1992. PCT 특허출원 제 WO 92/11390)는 다른 이본쇄 앰플리콘에 첨합되는 경우 제3의 올리고누클레오타이드에 대한 하이브리다이즈 부위를 형성하는 5′말단을 함유하는 증폭 프라이머의 용법에 대하여 기술하고 있다. 하나의 말단의 하이브리다이제이션은 증폭된 생성물을 채취하는데 사용되었고, 나머지는 형광염료에 컨주게이트된 프로브와 하이브리다이즈되어 이를 검출하는데 사용되었다. PCR증폭 생성물을 검출하기 위한 상기의 프라이머에 기초한 방법들은 모두 고감도 (즉, 100카피이하의 타겟서열의 검출)를 얻기위하여 두 개의 증폭반응을 필요로 한다. 즉, 타겟서열의 1차 증폭에 연이어서, 채취 및/또는 검출을 위한 바람직한 수식이 첨합된, 네스트된 (nested)프라이머를 사용하는 2차 증폭이 일어난다. 이러한 방식의 두 개의 연속적 증폭은 용인할 수 없을 정도로 높은 레벨의 백그라운드 시그널을 피해야만 하는데. 이는 수식된, 시그널-생성 프라이머에 의해 잘못 복제개시되는 비타겟 DNA의 증폭에 의해 생기는 것이다. 선행 기술 방법의 이러한 특색은 시간 소모적이고 성가시므로, 프라이머에 기초한 검출방법의 이점은 때때로 2차의 연속적 증폭반응의 필요성으로 상쇄된다.
DNA의 비특이적 증폭은, SDA반응에서의 프라이머에 기초한 증폭 생성물의 검출의 특유한 문제들을 보이는 것이 예상되는데, 이는 이러한 증폭이 PCR과 비교할 때 잘못된 복제개시를 증가시킬수 있는 비교적 저온(약 37-40℃)에서 수행되고, 이에 의해 훨씬 높은 레벨의 백그라운드 시그널이 얻어지기 때문이다. 놀랍게도, 타겟서열 증폭과 동시에 검출용 생성물을 생성시키는 단지 하나의 증폭반응을 사용함에도 불구하고, SDA의 프라이머에 기초한 본 발명의 검출 방법으로 낮은 레벨의 백그라운드 시그널을 얻었다. 2차 증폭 생성물 및 증폭된 타겟서열의 동시 생성은 본원에서는 실제시간 (real time)프라이머 신장, 증폭의 실제시간 검출 등으로 불리워지고 있다.
본 발명은 타겟서열의 증폭, 타겟서열의 지시 및 타겟서열의 결부된 SDA반응의 프라이머 신장 생성물의 검출, 고정화(채취)또는 편재화(localizing)방법을 제공한다. 프라이머 신장 생성물은 타겟서열의 SDA동안 생성된 2차 타겟 - 특이적 DNA생성물이므로 타겟서열 증폭의 검출 및/또는 측정하는데 사용가능한다. 그러나 2차 생성물은 타겟서열의 지수적 증폭을 방해하지 않고 형성된 후에, 증폭불가능이고, 또한 SDA반응에 있어서 비활성인 채로 남아있다. 이러한 2차 생성물은 이의 검출, 고정(채취)또는 편재화를 용이하게 해주는 특징을 갖도록 디자인 또는 수식될 수 있다. 본 발명 방법은 또한 원위치에서의 (in situ) SDA후에 고정된 셀 중의 증폭 생성물의 검출, 특히 2차 생성물이, 증폭 생성물의 검출 또는 편재화를 용이하게 하는 5′말단 서열을 함유하는 경우에 유용하다.
본 발명은 실제시간 프라이머 신장에 의한, SDA반응의 증폭생성물의 검출, 모니터링 또는 편재화 방법이다. SDA에 의한 타겟서열의 증폭은 타겟서열의 증폭과 밀접하게 관련하여 생성된 2차 증폭 생성물을 동시에 생성하는 것에 의해 검출, 모니터 또는 편재화된다. 이 이차 증폭생성물은 어떠한 부가적 증폭공정 또는 조작을 필요로 하지 않고, SDA반응의 도중에 생성된다. 일단 생성되면, 2차 증폭 생성물은 반응 혼합물내에서 비활성이며, 목적하는 타겟서열의 정상적인 SDA를 방해하거나 저해하지 않는다. 따라서 본 발명은 SDA의 실제시간 모니터링 및 타겟 서열의 증폭의 검출, 특히 증폭된 서열 검출 자체가 앰플리콘의 더 이상의 반응 또는 신장을 방해하거나 저해하는 상황에 유용하다.
본 발명은 2차 증폭 반응의 필요성을 없앤, 프라이머에 기초한 증폭 검출 방법을 제공한다. 이 방법은 채취 및 검출 프로브와 유사하나 SDA반응에서 증폭 프라이머로 작용하지는 않고 시그널 프라이머를 사용한다. 따라서, 비 타겟 주형상의 상기 시그널 프라이머로부터의 잘못된 신장에 의해 형성된 어떠한 신장 생성물도 그 다음의 증폭에 참여할 수 없다. 잘못된 복제개시 자체는 비교적 드물기 때문에, 그 다음의 공정에 있어서의 잘못 복제개시된 서열의 증폭후에만 검출할 수 있다. 본 발명 방법에서와 같이, 서열의 증폭후에만 검출할 수 있다. 본 발명 방법에서와 같이, 상기의 연속 증폭의 주존재하에서, 시그날 프라이머는, 백그라운드 시그널 레벨의 명백한 증가없이, 증폭 개시 이전에 증폭 반응물에 가해질 수 있다. 이는 검출 절차를 대폭 간이화시키고 SDA반응의 균일한 실제 시간 분석이 가능하게 해준다.
본원에서는 다음과 같이 용어와 문구를 정의하고 있다.;
증폭 프라이머는 프라이머 신장에 의한 타겟서열 증폭용 프라이머이다. SDA용으로, 증폭 프라이머의 3′ 말단 (타겟 결합서열)은 타겟서열의 3′말단에서 하이브리다이즈된다. 증폭 프라이머는 5′ 말단에 인접한 제한 엔도누클레아제에 대한 인지 부위를 포함한다. 이 인지부위는 Walker 등 (1992, PNAS, 상기참조)이 기술한 바와같이, 인지 부위가 반수식된 경우 DNA이중 나선 중 하나의 사슬을 절단할(니킹)제한 엔도누클레아제에 대한 것이다. 반수식된 인지부위는 제한 엔도누클레아제가 인지부위의 양쪽 사슬을 절단하기 보다는 프라이머 사슬에 닉을 도입하도록 최소한 하나가 유도합성된 누클레오타이드를 하나의 사슬에 함유한, 제한 엔도누클레아제에 대한 이본쇄 인지부위이다. 통상, 반수식된 인지부위의 프라이머 사슬은 유도합성된 누클레오타이드를 함유하지 않으며 제한 엔도누클레아제에 의해 니킹된다. 바람직한 반수식된 인지부위는 제한 엔도누클레아제 HincII, HindII, AvaI, NciI 및 Fnu4HI에 대한 헤미포스포로티오에이트된 인지부위이다. 또한 증폭프라이머는 증폭 프라이머의 타겟결합서열이 타겟서열과 하이브리다이즈될 경우 DNA중합효소에 의해 신장가능한 3′-OH 그룹을 포함한다. 대부분의 SDA 반응에 있어서 타겟서열의 지수적 증폭은 증폭 프라이머에 의한 것이다.
신장 생성물은, 프라이머 및 프라이머 결합부위의 하류의 타겟서열에 상보적인 새로 합성된 사슬 및 프라이머를 포함하는 핵산이다. 완충 프라이머는 증폭 프라이머의 상류의 타겟서열에 어닐(anneal)되어 완충 프라이머가 신장됨으로써 하류의 증폭 프라이머 및 이의 신장 생성물로 치환된다. 완충 프라이머의 신장은 증폭 프라이머의 증폭 생성물, 증폭된 생성물 또는 앰플리콘은 증폭 프라이머의 하이브리다이즈 및 신장에 의해 생성되는 타겟 서열의 카피이다. 이 용어는 원래의 타겟 서열의 카피를 포함하는 일본쇄 및 이본쇄 증폭 프라이머 신장 생성물들 양자를 의미하고, 증폭반응의 중간 물질을 포함한다.
2차 증폭 생성물 또는 2차 생성물은 시그널 프라이머의 하이브라다이즈 및 신장에 의해 생성되는 타겟 서열의 카피이다. 이 2차 증폭 생성물은 증폭된 타겟 서열의 내부 단편(segment)를 포함한다. 이 용어는, 시그널 프라이머의 일본쇄 및 이본쇄 신장 생성물들 양자를 의미하며, 또한 최종적으로 이본쇄 형태를 생성시키는 공정에서의 중간물질을 포함한다. 증폭 생성물과는 대조적으로, 몇몇 2차 증폭 생성물은 직선형으로 증폭 가능임에도 불구하고, 이본쇄의 2차 증폭 생성물은 일반적으로는 더 이상이 증폭에는 이용될 수 없다.
본 발명 방법에서, Walker 등 (1993 PNAS 또는 1993 Nac. Acids Res., 상기참조)이 기술한 바와 같이, SDA용 증폭 프라이머는 타겟서열과 하이브리다이즈되어 그 타겟 서열이 증폭된다. 상기한 두 개의 참고 문헌에서 기술한 바와 같이, 타겟서열은 적당한 제한 엔도누클레아제(예를들면 HincII)로 전체 DNA를 제한시키거나 완충 프라이머 및 증폭 프라이머를 사용하여 말단에 적절한 제한 엔도누클레아제 인지부위를 갖는 타겟 단편을 생성시켜 SDA용으로 제조될 것이다. 타겟 서열을 함유한 상기 제조된 단편은 상술한 바와 같이 SDA로 증폭된다. 그러나 본 발명의 SDA 반응은 SDA반응에 의해 생성되는 증폭 생성물의 검출, 모터링 또는 편재화용 2차 증폭 생성물을 동시에 생성되는 최소한 하나의 시그널 프라이머를 추가로 포함한다. 2차 증폭 생성물은 또한 채취 또는 고정화를 용이하게 해주는 특징을 포함하고 있어서 검출, 정량화 또는 추가 복제를 위해 분리될 수 있다. 이 2차 증폭 생성물은 반응 혼합물에 최소한 하나의 시그널 프라이머를 포함시킴으로써 SDA반응에서 생성된다. 특정의 응용물에 사용하기 위하여, 한쌍의 시그널 프라이머를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 시그널 프라이머(들)는 증폭 프라이머의 하이브리다이즈부위의 하류의 타겟 서열에 하이브리다이즈된다. 이들은 증폭 프라이머 신장과 유사한 방식으로 중합 효소에 의해 신장된다. 시그널 프라이머는 타겟 서열 내의 일정 부위에서 하이브리다이즈되어서, 증폭 프라이머가 증폭되므로써 시그널 프라이머의 신장 생성물을 치환한다. 시그널 프라임의 최소한 3′말단은 타겟 서열과 하이브리다이즈하는 서열을 포함한다 시그널 프라이머가 비수식되거나, 예를들어 리포터 그룹, 라벨 또는 친화성 리간드를 가함으로써 검출을 위하여 화학적으로 수식된 경우, 시그널 프라이머 전체가 타겟 서열과 하이브리다이즈될 것이다. 이와는 달리, 시그널 프라이머의 5′말단은 타겟서열과 하이브리다이즈하지 않으나 2차 증폭 생성물의 검출 또는 채취을 용이하게 해주는 특수 누클레오타이드 서열을 포함하는 (때때로 구조적 특징을 포함하여)서열을 포함할 수 있다. 이러한 화학적 수식 및 특수 서열은 시그널 프라이머가 주형상에서 하이브리다이즈되어 신장되는 경우 2차 증폭 생성물에 첨합된다. 화학적 수식의 보기에는 친화성 리간드(예를들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 합텐, 항원 및 항체) 및 리포터 그룹(라벨, 예를들면 검출가능한 반응 생성물을 생성하기 위하여 반응하는 효소, 방사성 동위원소, 형광염료 및 가시 염료)이 포함된다. 특수 누클레오타이드서열의 예에는 (i)라벨시킨 올리고 누클레오타티드 프로브를 이본쇄 2차 증폭 생성물과 하이브리다이즈시켜 삼중 나선를 형성할 서열, 및 (ii)증폭동안 이본쇄가 되게 하는 경우 이본쇄인 DNA결합 단백질을 결합시킬 수 있는, 이본쇄 DNA결합 단백질(예들들어, 억제 유전자, 조절 단백질, 제한 엔도누클레아제, RNA중합효소)에 대한 인지부위가 포함된다.
이본쇄 제한 엔도누클레아제 인지부위를 결과적으로 가져오는 누클레오타이드 서열은 ,시그널 프라이머로서의 바람직한 구조적 특징인데, 이는 그 다음의 제한을 이용하여 독특한 크기에 의해 인지될 수 있는 2차 증폭 생성물을 생성시키기 때문이다.
본 발명의 방법이 제1a도 및 제1b도에 나타낸 바와 같이 이본쇄 타겟 서열의 마주보는쪽 사슬과 하이브리다이즈되는 두 개의 시그널 프라이머를 사용하는 경우, 이 시그널 프라이머들 중 하나는 2차 증폭 생성물의 채취 또는 고정화를 용이하게 해주는 화학적 수식 또는 특수 누클레오타이드 서열을 함유할 것이고, 나머지 하나는 채취된 또는 고정화된 2차 증폭 생성물의 검출용의 라벨 또는 검출가능한 리포터 그룹을 함유할 수 있다. 핵산을 검출하기위해서 리포터 그룹 및 라벨을 사용하고 핵산의 채취 또는 고정화를 위하여 리간드, 화학적 수식 및 핵산 구조적 특징을 사용 하는 것은 업게에 널리 공지된 것이다. 택일적으로, 시그널 프라이머는 비수식될 수 있다. (즉, 2차 증폭 생성물의 검출 또는 채취를 용이하게 해주는 리포터 그룹, 채취 그룹 또는 구조적 특징이 없다.) 2차 증폭 생성물은, 예를들면 겔전기 영동법 및 에티듐 브로마이드 염색법에 의해, 크기에 기준하여 검출될 수 있다. 이러한 모든 방법들은 본 발명에 유용하고 업계의 당업자들은 일상적으로 특정 증폭 검정 시스템에 이용할 적절한 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 주요 특징은 SDA반응에 사용되는 시그널 프라이머가 증폭 프라이머로서 작용하지 않는다는 점이다. 본 발명이 어떤 특정 메카니즘에 의해 한정되는 것은 원치 않으며, 본 출원인은, 상기 특징이, 프라이머에 기초한 기타의 방법들에 의해 얻어지는 높은 레벨의 백그라운드 시그널을 프로모트시키지 않으면서, 시그널 프라이머를 증폭 반응 혼합물에 가해지도록 해준다고 믿는다. 높은 레벨의 백그라운드 시그널은, 프라이머가 증폭 프라이머로 작용할 수 있을 경우, 비특이적 복제개시 및 잘못 복재된 비타겟 DNA의 연속적인 증폭 때문인 것으로 사료되어 진다. 따라서 본 발명은 프라이머에 기초한 검출법의 공정을 굉장히 간편하게 해주는데, 예전의 프라이머에 기초한 검출법은, 고감도 및 특이성을 얻기위해 두 개의 연속적인 증폭 반응에 의존하였고, 2차 반응은 내부적으로 네스트된 시그널-생성 증폭 프라이머로 수행되었다.
상술한 바와 같이, 말단에 적절한 제한 엔도누클레아제 인지 서열 및 타겟서열을 함유하는 핵산 단편은 Walker 등(1992, PNAS상기참조 또는 1992 Nuc. Acids Res., 상기참조)이 기술한 바와 같이 증폭용으로 제조될 수 있다. 간편성을 위해, 제1a도, 제1b도에서의 본 발명 방법의 도면은, 타겟 서열을 함유하는 핵산 서열 단편으로 시작한다. 1992. PNAS(상기참조)에서 기술한 Walker 등의 방법에 따라 제조될 경우 적절한 제한 엔도누클레아제 인지 부위는 상기에서 기술한 타겟 생성도식에 따라 단편에 가해진다. 완층, 증폭 및 시그널 프라이머들은 Walker등(1992 Nuc. Acids Res., 상기참조)의 타겟 생성 도식에서의 타겟서열과 동시에 하이브리다이즈하며 각각의 상류의 프라이머는 신장되어 하류의 프라이머의 신장 생성물을 치환하고 증폭 가능한 타겟단편 및 2차 증폭 생성물이 동시에 생성된다.
제1a도 및 제1b도에서는 한쌍의 시그널 프라이머가 이본쇄타겟 서열의 증폭(5′-A-B-C-D/5′-D′-C′-B′-A′)검출에 이용되는 본 발명 방법을 예시하고 있다. 제1a도에서는 타겟 서열(5′-D′-C′-B′-A′)의 두 개의 1차 상보적 사슬에 대한 본 발명을 예시하고 있다. 제1a,1b 및 제2도에서 예시된 증폭 프라이머의 상승된(raised)된 부분은 니킹가능한 제한 엔도누클레아제 인지 부위를 나타내는데,이는 Walker등 (1992 PNAS 및 Nuc. Acids Res.)이 기술한 바와같다. 긴-상승된 부분은 전-길이의 제한 엔도누클레아제 인지부위를 나타내고, 일반적으로 사슬 니킹 및 치환 후에 생성되는 짧은-상승된 부분은;부분적인 제한 엔도누클레아제 인지부위를 나타낸다. 타겟 서열을 포함하는 핵산 단편은 보다 거대한 핵산의 엔도누클레아제 제한(Walker등 1992 PNAS, 상기참조), 또한 Walker등 (1992 PNAS 및 Nuc. Acids Res.)이 기술한 바와같은, 타겟생성으로 생성될 수 있다. 그러나 도면화 및 단순화를 위해서, 제 1a, 1b 및 2도는, 타겟 서열을 절단하지 않은 제한 누클레아제로 미리 제한시킨 핵산 단편 사에 함유된 타겟 서열로 시작한다.
제1a도에서, 시그널 프라이머 R-B는 SDA반응 혼합물에 포함되고 시그널 프라이머의 B부분을 B′와 하이브리다이즈시켜 1차 증폭 프라이머의 하류의 타겟 서열과 하이브리다이즈시킨다. R-B시그널 프라이머의 R부분은 리포터 그룹 또는 라벨을 포함하거나, 또는 검출 또는 채취를 용이하게 해주는 구조적 특정이다. 상기한 바와같이 R은 하이브리다이즈하거나 하지않을 수 있을 것이나 여기서는 시그널 프라이머의 상위한 기능적 특징을 명확히 하기 위하여 하르브리다이즈하지 않는 것으로 나타내었다. 이를 예시하기 위해서, R은 리포터 그룹을 함유할 것이나, 상기한 바와같은 다른 화학적 수식 또는 구조적 특징을 함유해도 무방할 수 있다. 증폭 프라이머 A 및 시그널 프라이머 R-B양자는 타겟서열을 주형으로 사용하여, DNA중합효소에 의해 신장된다. 이 시그널 프라이머 신장 생성물 R-B-C-D(구조#1)는 증폭 프라이머 A의 신장에 의해 주형으로부터 치환되고, 2차 시그널 프라이머 Q′-C′및 2차 증폭 프라이머 D′의 하이브리다이즈 및 신장을 위한 주형으로 바뀌어서 작용한다. Q′-C′서열의 C′부분은 C와 하이브리다이즈된다. 2차 시그널프라이머의 Q′부분은 R과 유사하며, 이를 예시하기 위해서, Q는 2차 증폭 생성물의 채취를 용이하게 해주는 수식 또는 서열을 함유할 수 있다. Q′-C′신장생성물은 2차 증폭 프라이머의 신장에 의해 치환된다. 이때 상기 치환된 Q′-C′신장 생성물(구조#2)은 R-B의 하이브리다이즈 및 신장용 주형으로 작용하여 시그널 프라이머의 말단 단편 (R 및 Q′) 및 타겟 서열의 내부단편 B′-C′를 포함하는 이본쇄의 타겟-특이적 2차 증폭 생성물(구조#3)이 얻어진다. 2차 증폭 생성물은 니킹가능한 제한 엔도누클레아제 인지부위를 함유하지 않으므로, SDA반응에서 증폭되지 않고 증폭 반응물의 잔류물 중에서 효과면에서 비활성으로 남아있으나, 2차 증폭 생성물의 부가적 카피가 타겟 서열로 부터 생성된다.
2차 증폭 프라이머(D′)가 R′-B′-C′-Q′신장 생성물을 치환함과 더불어, 하이브리다이즈 및 신장하는 것은, 하나의 말단에 R/R′ 서열을갖고, 또다른 말단에 반수식된 제한 엔도뉴클레아제 인지부위를 갖는, 이본쇄 단편 생성시킨다.(구조#4). 이러한 제한 엔도누클레아제 인지부위는 SDA반응물내에 존재하는 제한 엔도누클레아제에 의해 니킹가능하다. SDA반응물 내에 존재하는 DNA중합효소는 닉(nick)에서 중합 및 치환을 개시하여 일부분의 제한 엔도누클레아제 인지부위를 포함하는, 예시된 R′-B-C′-D′생성물을 얻을 수 있다. 이 생성물은 R-B를 하이브리다이즈 및 신장시켜 이본쇄로 만들 수 있다(구조#5). 니킹, 중합 및 치환 사이클을, 순환적으로 반복하여, 직선속도로 상기 단편을 증폭시키지만, 채취를 용이하게 해주는 서열 또는 수식을 함유한 Q/Q′부분이 존재하지 않기 때문에, 일반적으로 일본쇄 생성물도 이본쇄 생성물도 검출할 수 있다. Q/Q′와 R/R′의 작용이 역전될 경우,(즉,Q/Q′리포터 그룹 또는 라벨을 함유하고 R/R′가 채취를 용이하게 해주는 서열 또는 수식을 함유하는 경우), 채취되었음에도 불구하고 이러한 생성물은 리포터 그룹 또는 라벨이 존재하지 않기 때문에 검출될 수 없을 것이다. 그런, 리포터 그룹이 채취와는 독립적으로 검출가능한 경우, 에를들어 리포터 그룹이 이방성 또는 형광 중합에 의하여 검출가능한 형광라벨(WO 92/18650 호; R.Devlin 등; 1993, Clin. Chem. 39, 1939-1943)이거나, 겔 전기영동법 및 방사선 사진에 의해 검출가능한 방사성 동위원소인 경우 구조#5는 검출 가능함을 숙지해야 한다.
제1a도에서는 또한 R-B의 신장 생성물의 치환과 더불어, 어떻게 타겟서열상에서의 1차 증폭 프라이머의 신장이, SDA에 의한 타겟 서열의 증폭용으로 요구되는, 반수식된 니킹가능한 제한 엔도누클레아제 인지부위를 지닌 이본쇄 타겟 서열(구조#6)을 생성시키는지를 보여준다. 상기 반응 생성물은 공지의 SDA반응에 투입되어 증폭된다. 따라서, 2차 증폭 생성물의 형성은 타겟 서열의 증폭과 밀접하게 결부되어 있으며, 그리하여, 타겟 증폭의 측정 뿐아니라, 증폭 발생여부를 모니터하는데 유용하다. 그러나 2차 증폭 생성물의 생성과 증폭 생성물의 생성에 밀접한 관련이 있음에도 불구하고, 타겟 서열의 증폭은 실질적인 반응성분들이 과량으로 존재하기만 한다면 방해받지 않는다. 게다가, 증폭된 타겟 서열은 또한 시그널 프라이머와 결합하여 2차 증폭 생성물의 추가적 카피를 생성시킬 것이다.
제1b도에서는 이본쇄 타겟 서열의 상보적인 2차 사슬(5′-A-B-C-D)로부터의 2차 증폭 생성물의 생성을 나타낸다. 일반적으로, 상보적인 2차 사슬에 대한 반응 단계는 1차 사슬에 대한 것과 유사하다. 그러나, 2차 증폭 프라이머(D′)및 시그널 프라이머C-Q′는 먼저 상보적 사슬과 하이브리다이즈하고 신장된다. 1차 증폭 프라이머(A) 및 시그널 프라이머 R-B는 C′-Q′의 치환된 신장 생성물(A′-B′-C′-Q′,구조 #7)과 하이브리다이즈하고 신장되어 R-B-C-Q(구조#8)를 생성한다. Q′-C′와 R-B-C-Q의 하이브라다이즈 및 신장으로 R′-B′-C′-Q′/R-B-C-Q(구조#9)를 얻는다. 이 2차 증폭 생성물은 구조#9내의 채취 및 라포터 그룹이 둘다 존재하기 때문에 양쪽 특징이 요구되는 시스템 내에서 검출가능하다. 상보적 사슬에 대한 반응은 , 또한 니킹, 중합 및 치환에 의해 직선적으로 증폭 가능한 반응생성물(구조#10)을 생성시킨다. 이러한 직선형 증폭의 치환된 단일 사슬은 Q′-C′의 하이브리다이즈 및 신장에 의해 이본쇄가 된다.(구조#11). 일반적으로, 리포터 그룹 또는 채취 그룹의 부존재로 인하여, 상기 직선형 증폭의 일본쇄생성물도 이본쇄 생성물도 검출불가능이다. 이들은 완전한(intact)제한 엔도누클레아제 인지부위가 없으므로 더 이상 증폭될 수 없다. 그러나, Q가 채취와는 독립적인 리포터그룹(예를들면 상기한 바와 같은 형광라벨 또는 방사성 동위원소)을 포함할 경우, 구조#10 및 #11도 또한 검출가능할 수 있다.
제1a도 및 제1b도에서와 같이 두 개의 시그널 프라이머가 사용될 경우 검출특이성이 일반적으로 개선될 것이나, 단일 시그널 프라이머 또한 사용될 수 있다. 이 방법을 제2도에서 예시하고 있다. 이러한 경우, 시그널 프라이머는 채취그룹 또는 리포터 그룹을 함유하고 타겟 서열 자체 또는 증폭 프라이머는 임의로 2차의 채취 또는 리포터 그룹을 제공할 수 있다. 택일적으로, 채취 및 리포터 그룹 양자가 요구되는 경우, 시그널 프라이머는, 시그널 올리고 누클레오타이드가 이본쇄가 될 경우에만 결합하여 작동하는, 채취 그룹 및 리포터 그룹 양자를 함유할 수 있다. 이러한 구조는, 타겟 서열의 존재가 제2도에 나타낸 바와같은, 복제개시, 신장, 치환 및 재복제개시를 유도하는 경우에만 형성된다. 이러한 2기능 시그널 프라이머는 또한, 형광 이방성 또는 형광에너지 전이와 같은,다양한 균일 검출 방법의 기초를 형성할 수 있다.
제2도에 따라 단일 시그널 프라이머를 사용하여 2차 증폭 생성물을 생성하기 위하여, 1차 증폭 프라이머(A)와 시그널 프라이머 R-B를 일본쇄 타겟 서열 A′-B′-C′-D′과 하이브리다이즈시킨다. 프라이머 둘다신장되고, 1차 증폭 프라이머의 신장이 시그널 프라이머 R-B(R-B-C-D)의 신장 생성물을치환하여, 구조#1을 생성한다. 2차 시그널 프라이머가 없기 때문에, 단지 2차 증폭 프라이머(D′)가 R-B-C-D와 하이브리다이즈하고 신장되어 니킹 가능한 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지부위를 가진 구조#2를 생성한다. 나타낸 바와같이, 니킹, 중합 및 치환에 의한 이 생성물의 직선형 증폭은, 시그널 프라이머와 하이브리다이즈하여 신장될 수 있는 단편들을 생성시킨다. 이는 구조#3인 이본쇄의 2차 증폭 생성물을 생성시킨다. 이는 완전한 제한 엔도누클레아제 인지부위가 부족하기 때문에 증폭될수 없으나, 리포터 또는 채취그룹이 이본쇄 형태인 경우만 검출가능할 경우에 R/R′에 의해서, 또는, 리포터 그룹이 단독으로 검출가능할 경우 R에 의해서 검출가능하다. 리포터 그룹의 검출이 이본쇄일 것을 요구하지 않는 경우(예를들면 형광라벨), 구조#1, #2 및 #3은 2차 증폭 생성물로서 검출 가능하다.
[실시예 1]
본 발명의 증폭의 실제시간 검출을, 종래의, 증폭된 타겟 서열의 후-증폭 검출과 비교하였다. 각 60μL 반응 혼합물이 0.2μg의 인간 태반 DNA 및 다양한 양의 게놈 M. tb DNA를 함유한다는 것을 제외하고는 본질적으로 Walker 등(1992. Nuc. Acids Res.)에 의해 기술된 바와같이 행한 SDA 반응에서 미코박테리움 투버클로시스(M. tb)의 IS6110서열의 단편들을 증폭시켰다. 증폭 프라이머 서열(S1및 S2) 및 완충 프라이머 서열(B1및 B2)도 또한 Walker 등(1992. Nuc. Acids Res.)에서와 같았다. 시그널 프라이머를 첨합한 증폭 반응을 위해서 ,32P-라벨된 시그널 프라이머32P-CGTTATCCACCATAC(서열 번호:1)를 최종농도 60nM에서 증폭시키기 이전의 반응물에 첨가하였다.
이 반응에서 생성된 예상되는 2차 증폭 생성물은 길이가 35 및 56인 누클레오타이드였다. 증폭된 타겟 서열의 후-증폭 검출을 위하여, Walker등(1992. Nuc. Acids Res., Supra)에 의해 기술된 바와같이, 반응 혼합물의 10분의 1은 서열 번호:1의프라이머 신장에 의한 증폭 생성물 검출에 사용되었고, 그리하여 신장 생성물 길이가 35또는 56인 누클레오타이드를 생성하였다.
M.tb의 게놈 카피 1-500,000의 존재하에서, 37℃에서 2시간 동안 증폭을 진행시켰다. 증폭을 멈춘후, 각 반응물의 10분의 1을 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동시켰다. 본 발명의 시그널 프라이머를 사용하여 M.tb 게놈 DNA의 한 카피를 검출하였다.
또한, 시그널 강도는 타겟 레벨을 감소시킴에 따라 감소하여 2차 증폭 생성물의 레벨이 타겟서열 증폭의 정도를 반영함을 나타내었다. 시그널 프라이머의 실제 시간 신장은, 종래의 후-증폭 프라이머 신장방법보다 겔상에서 몇배 덜 민감하였는데, 아마도,32P-라벨된 시그널 프라이머가 SDA프라이머보다 약 10배 적은 농도로 SDA중에 존재하였기 때문이다. 시그널 프라이머가 결합 또는 신장되기 전에 SDA프라이머가 타겟서열 상에서 신장되는 경우, 시그널은 나타나지 않을 것이다. 따라서, 시그널 프라이머의 하이브리다이즈 동역학을 개선시킴에의해 시그널 프라이머의 농도를 높히면 본 방법의 감지도를 증가시킬 수 있다. 그러므로, 검출을 위해 반응 생성물을 분리시킬 때 시그널 프라이머 농도가 높을수록 바람직하지만, 증폭 프라이머의 농도는 종래 SDA에서 사용되는 농도와 비슷하게 유지할 수 있다.
그러나 형광 이방성과 같은 균일 검출 방법을 위해서는, 낮은 백그라운드를 유지하도록 시그널 프라이머의 농도를 더 낮추는 것이 바람직하다. 시그널 프라이머의 상류를 하이브리다이즈 증폭 프라이머 및 중합효소의 농도가 종래의 SDA에서보다 낮을 경우, 더낮은 농도의 시그널 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 실험은 증폭 반응 혼합물 중에 시그널 프라이머가 존재해도 상당한 레벨의 백그라운드 시그널을 유발하지 않음을 증명하였다. 사실, 백그라운드 시그널 레벨은 후-증폭 프라이머 신장과 비교하여 실제 시간 시그널 프라이머 신장의 의해 검출된 샘플에서 더 낮았다.
[실시예 2]
SDA반응은, 50mM KiPO4(pH 7.5), 0.1mg/mL 소혈청 알부민, 0.5mM dUTP, 0.2mM 각 dGTP, dCTP 및 dATP αS, 7mM MgCl2, 11%(v/v)글리세롤, 지시된 농도의 증폭 프라이머, 25nM 완충 프라이머, 50ng 인간 태반 DNA, 지시된 양의 엑소누클레아제 결핍성 클레노우(Klenow)(United States Biochemicals), 150단위 HicnII(New England Biolabs)내에서, 일반적으로, 상기 기술된 바와같이(Walker, 1993, PCR- Maethods and Appliccations 3,1)수행되었다. 41℃에서 지시된 시간동안 반응시켰다. SDA반응물은 증폭용 IS6110타겟서열을 함유하는 다양한 양의 M.tb DNA 를 함유하였다. 사용된 S1증폭 프라이머 서열, B1완충 프라이머 서열 및 B2완충 프라이머 서열은 Walker등(1992. Nuc. Acids Res., Supra)에 의해 기술된 바와 같았다.
S2증폭 프라이머(서열번호:2)는 , 이들 저자들이 기술한 HincII 부위 및 타겟 결합을 가지나, 5′말단에서는 상위한 서열로 구성되었다. 증폭 프라이머는 누클레오타이드 위치 972-984 및 IS6110서열의 1011-1023에 하이브리다이즈된다. 완충 프라이머는 누클레오타이드 위치 954-956 및 1032-1044에 하이브리다이즈된다. 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동시킨 후 방사선 사진 촬영하여 2차 증폭 생성물을 시각화하였다.
SDA반응은 0.1nM의 5′-32P-라벨된 시그널 프라이머(서열 번호:3)의 존재하에서 3시간 동안 수행하였다. 이 시그널 프라이머는 길이가 28인 누클레오타이드이고, 증폭 프라이머 사이에서 IS6110타겟서열의 누클레오타이드 위치 985-1012에 하이브리다이즈된다. S1및 S2는 각각 180 및 30nM로 존재하였다. 엑소누클레아제 결핍성 클레노우는 0.25단위로 사용되었다. 샘플 1-4는 각각 100,10,1 및 0의 M.tb게놈 분자를 함유하였다. SDA반응동안, 서열 번호:3은 상기 타겟서열을 주형으로 사용하여, 중합효소에 의해 44누클레오타이드로 신장된다. 상기에서 논의된 바와같이, 이 주형은 SDA중 주요하게 생성되는 치환된, 증폭된 타겟 사슬이나, 본래의 타겟 서열상에서의 완충, 증폭 및 시그널 프라이머의 동시 신장이 배제되지는 않고 함께 일어날 것으로 예상된다. 44-mer는 상류의 증폭 프라이머(S2)의 신장에 의해 타겟 서열로부터 치환된다. 44-mer의 3′-말단은 제2의 증폭 프라이머(S1)의 3′-말단에 하이브리다이즈되고 이본쇄 65-mer가 중합효소에 의한 신장 후 형성된다. 44-mer 및 65-mer2차 증폭 생성물은 단지 M.tb타겟 서열(샘플1-3)이 존재할 때만 관찰되었고, 이는 시그널 프라이머 신장 및 이본쇄형태로의 전이를 나타낸다.
길이가 15 누클레오타이드인 0..1nM(샘플1-3)또는 1nM(샘플 4-6)의 5′-32P-시그널프라이머(서열번호:4)의 존재하에서 SDA반응을 반복하였다. 시그널 프라이머는 증폭 프라이머들 사이인, IS6110 타겟서열의 누클레오타이드 위치 999-1013에서 하이브리다이즈된다. S1및 S2는 500nM으로 사용하였다. 엑소누클레아제 결핍성 클레노우 2 단위를 사용하여 SDA를 2시간동안 행하였다. 서열번호:4의 5′-말단에서의 세 개의 누클레오타이드 및 서열번호:2(S2증폭 프라이머)의 3′-말단에서의 세 개의 누클레오타이드는 동일하므로 같은 IS6110결합 위치에 대해 서로 경쟁한다. 샘플 1 및 4는 10000M.tb게놈 분자를 가지고, 반면에 샘플 2 및 5는 100게놈 분자량을 가졌다. 샘플 3 및 5은 M.tb DNA를 함유하지 않았다.
SDA반응시, 45-mer 및 65-mer 2차 생성물은 타겟서열이 증폭될 때생성된다. 이들은 M.tb DNA의 존재하에서만 관찰되었고 이는 시그널 프라이머의 신장 및 이중 사슬 형태로의 전이를 의미한다.(샘플 1,2,4 및 5) M.tb DNA가 없을 때에는 (샘플 3 및 6), 방사성 동위원소로 라벨된 생성물은 나타나지 않았다.
길이가 4 누클레오타이드(서열번호:5)인 5′-32P-라벨된 시그널 프라이머 0.1mM의 존재하에서 SDA를 반복하였다. 시그널 프라이머 3′-말단에서의 26 누클레오타이드(타켓 결합 서열)는 증폭 프라이머 사이인, 누클레오타이드 위치 985-1010에서의 IS6110타겟서열에 하이브리다이즈된다. 타겟 결합 서열 5′는 엔도누클레아제 HincII에 대한 인지부위이다. S1및 S2는 180 및 30nM으로 존재하였다.
엑소누클레아제 결핍성 클레노우를 0.25단위로 사용하였고 SDA를 3시간 동안 행하였다. 샘플 1-4는 100,10,1 및 0 M.tb게놈분자를 포함하였다.
SDA반응시 시그널 프라이머는 중합효소에 의해 길이 58누클레오타이드까지 신장된다. 이 58-mer는 상류의 증폭 프라이머의의 신장에 의해 치환된다. 58-mer의 3′-말단은 다른 증폭 프라이머(S1)에 하이브리다이즈되고, 중합효소에 의한 신장 후 이본쇄 79-mer를형성한다. 시그널 프라이머의 5′-말단에서의 HincII인지부위는 79-mer형성시 HincII에 의해 절단될 수 있다. 즉, 이본쇄 79-mer내에서 원래의 시그널 프라이머를 포함하는 사슬 및, dGTP, dCTP, TTP 및 dATPαS를 사용한 중합효소의 신장을 통해 형성된 사슬 모두가 절단될 수 있다. HincII는 원래의 일본쇄 형태인 시그널 프라이머는 절단하지 않는다. SDA반응시 이본쇄 79-mer의절단은 2차 증폭 생성물로서 검출할 수 있는 5′-32P-라벨된 13-mer를 생성한다.
58-mer 및 79-mer프라이머 신장 2차 증폭 생성물 및 13-mer절단 2차 증폭 생성물은 M.tb타겟 DNA가 존재할 때 (샘플1-3)만 관찰 되었고, 이는 시그널 프라이머의 신장 및 이본쇄 형태로의 전이를 의미한다. M.tb DNA가 없을 때는 2차 증폭 생성물(신장생성물 또는 절단 생성물)은 나타나지 않았다.
SDA를 길이가 33누클레오타이드(서열본호:6)인 5′-32P-라벨된 시그널 프라이머 0.1nM의 존재하에서 반복하였다. 시그널 프라이머의 3′-말단에서의 26 누클레오타이드(타겟 결합 서열)는 증폭 프라이머 사이인, 누클레오타이드 위치 985-1010에서의 IS6110타겟서열에 하이브리다이즈된다. 타겟 결합 서열의 5′말단은 제한 엔도누클레아제 EcoRI에 대한 인지부위이다. S1및 S2는 각각 180 및 30nM으로 존재하였다. 엑소누클레아제 결핍성 클레노우는 0.25단위로 사용하였다. SDA를 3시간 동안 행하였다. 샘플 1-4는 100,10,1 및 0 M.tb 게놈 분자를 함유하였다. SDA후 각SDA반응물에 EcoRI 20단위를 첨가하고, 이 샘플들을 37℃에서 30분 동안 인큐베이트하였다.
SDA반응시, 시그널 프라이머는 중합효소에 의해 49누클레오타이드의 길이로 신장된다. 이 49-mer는 상류의 증폭 프라이머(서열번호:2)의 신장에 의해 치환된다. 49-mer의 3′-말단은 다른 증폭 프라이머(S1)의 3′-말단에 하이브리다이즈되어 중합효소에 의한 신장 후 이본쇄 70-mer를 형성한다. 시그널 프라이머의 5′-말단에서 EcoRI 인지부위는 70-mer의 형성 및 EcoRI의 첨가시 EcoRI에 의해 절단된다. 이본쇄 70-mer의 EcoRI절단은 5′-32P-라벨된 디누클레오타이드인 절단 생성물을생성한다. 이 디누클레오타이드는 방사선 사진술에 의해 2차 증폭 생성물로서 검출할 수 있다.
49-mer 및 70-mer신장 생성물 및 디누클레오타이드 절단 2차 증폭 생성물은 단지 M.tb DNA이 존재할 대(샘플1-3)만 관찰되었고 이는 시그널 프라이머의 신장 및 이본쇄 형태로의 전이를 의미한다. M.tb DNA가 없을 때 2차 증폭 생성물(신장 생성물 또는 절단 생성물)은 관찰되지 않았다.
택일적으로32P-디누클레오타이드 절단 생성물은 액체 신틸레이션 계수법으로 검출하였다. SDA를 O.5nM 5′-32P-라벨된 서열번호 6의 시그널 프라이머의 존재하에서 반복하였다.32P-라벨된 시그널 프라이머는, SDA에서 사용되기 전에, 변성 겔 전기영동에 의한 칸제 라벨링 반응에 사용되는 감마-32P-ATP에서 분리하여 정제시켰다. S1및 S2는 180 및 30nM으로 존재하였다. 엑소누클레아제 결핍성 클레노우를 0.25단위로 사용하였다. SDA를 3시간 동안 행하였다. 샘플 1-7은 105, 104, 103, 102, 10,1 및 0 M.tb 게놈 분자를 함유하였다. SDA후 EcoRI 40단위를 각 SDA 반응물에 첨가시키고 이 샘플들을 37℃에서 30분동안 인큐베이트시켰다.
각 50μl SDA 반응물로부터 12.5μl 부분표본(aliquot)을 취하여 20mM TRISHCL (pH7.4), 50mM KCl 5mM MgCl2내에서 75μl 까지 희석시켰다. 그후 이 샘플 각각은 MICROCON-10마아크로 농축기 (Amicon, Beverly, MA)를 사용하여 여과시키고,32P 활성을 액체 신틸레이션 게수법으로 여액내 및 필터상에서 검출하였다. 이 결과를 다음에 나타내었다.:
이본쇄 70-mer신장 생성물의 EcoRI절단에 의해 방출되는 P-디누클레오타이드는 MICROCON-10필터를 통과할 정도로 작은 반면, 이보다 큰, 초기의 P-라벨된 33-mer시그널 프라이머 및 P-라벨 49-mer 신장 생성물은 필터상에 남아있다. 이 여과검출 방법을 사용하여 IS6110타겟 서열은, SDA 이전에 10 M.tb 게놈만큼 작은 10 M.tb 게놈을 함유한 샘플내에서 검출될 수 있었다.
[실시예 3]
두 시그널 프라이머(채취를 용이하게 하기위해 수식된 것 및 검출을 용이하게 하기위해 수식된 것)를 SDA 반응내 2차 증폭 생성물을 생성하기 위해 사용하였다. 이 실험에서 하나의 시그널 프라이머는 그 5′-말단에 부착된 친화성 리간드(Q′,세개의 비오틴 성분)를 가졌고, 두 번째 시그널 프라이머는 리포터 그룹(R, P-함유 포스 페이트 그룹)으로 5′-말단 라벨되었다. 따라서, 리포터 그룹 및 친화성 리간드(도면 1a 및 도면 1b의 구조 3번 및 구조 9번과 같은) 포함하는 이본쇄 2차 증폭 생성물을 채취 및 검출할 수 있었다. 이 실시예에서는, 스트렙타비딘이 피복된 자성 비드를 사용하여 2차 증폭 생성물을 채취 및 분리시킨 후 신틸레이션 게수방법으로 검출하였다.
비오티닐화된 시그널 프라이머를 다음과 같이 제조하였다. 표준 포스포르아미디트 화학을 이용하여 올리고누클레오타이드 서열번호7을 Applied Biosystems DNA Synthesizer Model 308B을 사용하여 합성하였다. 그후 기계장치를 사용하여 BIOTIN ON 포스포르아미디트(Clonetech)와의 연속적인 세걔의 커플링에 의해 세 개의 비오틴 그룹을 올리고누클레오타이드에 부착시켰다. 합성 후, 올리고누클레오타이드를 농축 암모니아로 처리하여 보호기를 제거하고 변성겔 전기영동법으로 정체시켰다. 2차 증폭 생성물 채취를 위한 친화성 리간드가 부착된 비오티닐화된 시그널 프라이머는 채취 시그널 프라이머로 언급하였고, 본 실시예를 위한, 도면 1a 및 도면 1b의 Q′-C′시그널 프라이머(여기서 Q′는 비오틴으로 구성됨)의 유사체이다.
올리고누클레오타이드 서열번호 1 및 서열번호 8을, Walker 등( 1992, Nucl, Acids, Res., Supra)에 의해 기술된 바와같이, 방사성 포스페이트로 라벨링하여 P-라벨된 시그널 프라이머로 제조하였다. 방사성 동위원소로 동정된 시그널 프라이머를 검출 시그널 프라이머로 일컬으며 본 실시예의 목적용으로는 도면 1a 및 도면 1b의 R-B(여기서 R은 동정에 쓰이는 방사성 동위원소로 구성됨)유사체이다. 실험에서는, 이러한 두 검출 시그널 프라이머 중 하나를 2차 증폭 생성물을 생성하기 위한 채취 시그널 프라이머와의 컨주게이션에 사용하였다.
SDA를 다음 수식과 함께, 본질적으로는 Walker 등( 1992, Nucl, Acids, Res., Supra)에 의해 기술된 바와같이 행하였다. 증폭 프라이머는 서열번호9 및 서열번호 10 (도면 1a 및 도면 1b에서 A 및 D′의 유사체)이었다. 이들 프라이머는 M.tb 의 IS6110삽입 요소의 103누클레오타이드 단편 (누클레오타이드 위치 944-1046)을 증폭시킨다. 각 50μl 반응물은 다음 성분을 함유하였다 : 45mM KPO4,pH7.5;6mM MgCl; 0.1mg/ml 아세틸화된 BSA;12%디메틸설폭사이드;0.5mM dUTP, 0.2mM 각 dGTP, dCTP 및 dATPαS, 500mM 증폭 프라이머; 50mM 완충 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12); 75nM 검출 시그널 프라이머 및 채취 시그널 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 7 또는 서열번호 8 및 서열번호 7); 100ng 인간 태반 DNA; 150단위 HincII(New England Biolabs); 2.5단위 엑소-클레노우 DNA중합효소 (US Biochemicals);효소와 함께 첨가된 ; 3%(v/v)글리세롤 ; 및 M.tb 게놈의 0 또는 10 카피.
MgCl, HincII 및 중합효소를 제외하고 모든 반응 성분들을 모아 이 혼합물을 2분동안 95℃까지 가열시켰다. 그후 이 샘플들은 2분동안 40℃수조에 놓아두었다가 3μl의 0.1 M MgCl를 각 샘플에 첨가하고 샘플들을 혼합시켰다. 50단위/HincII μl, 0.833단위/μl 중합효소 및 50%(v/v)글리세롤을 함유하는 3μl의 효소 혼합물을 첨가하고 샘플들은 2시간동안 40℃에서 인큐베이트시켰다.
인큐베이션 후, 각 반응 혼합물의 5μl 부분표본을 변성 겔 전기영동법으로 분석시켰다. 겔 상에서의 검출은 R의 존재를 요구하기 때문에 게놈 M.tb DNA를 함유하는 샘플에 대하여 50-120누클레오타이드 범위 내 다양한 생성물이 나타났다. 이러한 그룹은 M.tb DNA가 없는 반응에서는 나타나지 않았는데, 이는 이러한 크기 범위내의 반응 생성물이 타겟-특이성임을 의미한다. 이 실시예서의 예상되는 2차 증폭 생성물은 알고 있는 크기 및 도면 1a 및 도면 1b에 개설된 반응 도식에 따른 시그널 프라이머의 결합위치를 게산하여 결정하였고 다음 표에 나타내었다. 도면 1a 및 도면 1b에서 볼 수 있는 것처럼, 구조 3번 (변성 겔상 일본쇄 형태)는 R을 함유하고 있어 검출할 수 있다. 게다가, 구조3의 검출할 수 있는 일본쇄는 구조2번 및 구조9번의 검출할 수 있는 일본쇄와 동일하다. 그러므로, 이들 2차 증폭 생성물은 겔상에서 구별할 수 없다. 또한 구조 5번 (또한 변성 겔상에서 일본쇄 형태)은 R이 존재하기 때문에 구별할수 있다.
스트렙타비딘 피복된 자성 비드(Streptavidin paramagnetic Particles, Nucleic Acid Qualified, 1 mg/ml, Promega Corporation, Madison, WI)를 제조업자가 추천하는 바와 같이. 1X PBS로 세 번 세척하였다. 각 분석에서, 50μl의 비드가 1.5ml 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)내에서 180μl의 1X PBS 중에서 현탁되었고, 20μl의 SDA반응 혼합물과 조합시켰다. 이 샘플들을 10분동안 실온에서, 종종 혼합시키면서 인큐베이트시켰다. 그후 자석을 사용하여 튜브 한 쪽에 비드들을 모으고 상청액을 제거하였다. 그후 비드들을 1X PBS내에 재현탁시켜 세척하고, 자기적으로 튜브 한쪽에 모으고 상청액을 제거시켰다. 세척 과정을 세 번 더 반복하고 비드상에 남아있는 32P활성을 액체 신틸에이션 계수법으로 검출하였다. 이 결과는 다음 표에 나타나 있다.
신틸레이션 게수법 이전에 제거시킨 비드들의 작은 부분 표본(10%)을 50%우레아 존재하에서 95℃까지 가열시키고 변성 폴리아크릴 아민 겔상에서 전기영동시켰다. 단지 구조 3번 및 구조 9번만이 비오틴 수식물 및 P 라벨 모두를 함유하는데, 이는 이들 구조만이 비드에결합되어 검출가능하리라고 예견하였던 바다. 겔의 방사선 사진술은 구조 3번 및 구조9번 2차 증폭 생성물이 자기적 분리 과정시, 비드에 의해 보유되는 우수한 방사성 종임을 보여주었다. 그러나 또한 구조 1에 대응하는 좀더 소량의 종도 방사선 사진 상에 나타났다. 거출 시그널 프라이머의 신장에 의해 생성된 구조 1은 Q′-C′채취 시그널 프라이머(채취 시그널 프라이머 신장 및 구조 2번의 생성 이전; 도면 1a의 구조 1번에 따르는 반응 단계를 볼 것)에 하이브리다이즈될 때 채취할 수 있음도 가능하다. 소량의 구조 1번이 분명히 에견된 구조3번 및 9번에 추가로 검출 및 채취될지라도 채취 및 검출된 모든 증폭 생성물은 타겟 특이성이었고 M.tb DNA가 없는 샘플에서는 나타나지 않았다.
M.tb DNA가 없을 때 (0초기의 게놈 분자) 비드상에서 검출되는 백그라운드 활성은, 반응하지 않는 검출 시그널 프라이머의 비특이적 결합 때문인 것으로 보인다. 이러한 샘플들로부터의 비드에 대한 전기 영동 분석은, 유일한 방사성 물질의 존재가, 심지어 밤새 방사선 사진을 노출시킨 후에도, 검출 시그널 프라이머에 상응하는 희미한 (faint)밴드였다. 그러나 이러한 백그라운드 레벨의 시그널 상에서 2차 증폭 생성물이 분명히 검출되었다.
[서열목록]
(1)일반적인 정보:
(ⅰ)출원인:나디우, 제임스 지. 월커, 조지 티.
(ⅱ)발명의 명칭:핵산 증폭 검출 방법
(ⅲ)서열 수:12
(ⅳ)해당 주소
(A)수신인:벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니, 리차드 제이. 로드릭.
(B)거리:1벡톤 드라이브
(C)시:프랭클린 에이크스
(D)주:뉴 저지
(E)국명:미합중국
(F)우편번호:07417
(ⅴ)컴퓨터 판독형태 :
(A)매체 형태:플로피 디스크
(B)컴퓨터:IBM PC 호환성
(C)작동 시스템:PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어:PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(ⅵ)현재의 출원 데이터
(A)출원 번호:
(B)출원 날자:
(C)분류:
(ⅶ)대리인에 관한 정보
(A)성명: 프기트, 도나 알
(B)등록번호:32,135
(C)관련/일람 번호:P-2821
(2)1번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:15개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ⅸ)서열 기술:서열번호:1:
(2)2번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:37개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ⅸ)특징
(A)명칭/키:misc feature
(B)위치:19.. 24
(C)다른 정보:/기능=HincII 인지부위:
(ⅸ)특징
(A)명칭/키:misc feature
(B)위치:25.. 37
(C)다른 정보:/기능=타켓 결합 서열
(xi)2번의 서열의 열거
(2)3번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:28개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(xi) 3번의 서열의 열거
(2)4번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:15개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix) 4번의 서열의 열거
(2)5번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:42개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ⅸ)특징
(A)명칭 / 키:misc feature
(B)위치:11.. 16
(C)다른 정보:/기능 = HincII 인지부위
(xi) 5번 서열의 열거
(2)6번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:33개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix) 6번의 서열의 열거
(2)7번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:33개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix) 7번의 서열의 열거
(2)8번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:33개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix) 8번의 서열의 열거
(2)9번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:36개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix) 9번의 서열의 열거
(2)10번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:35개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix)10번의 서열의 열거
(2)11번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:12개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix)11번의 서열의 열거
(2)12번 서열에 대한 정보
(ⅰ)서열특징
(A)길이:13개의 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)사슬성:일본쇄
(D)분포상태:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅵ)원 공급원
(A)유기체:미코박테리움 투베르쿨로시스
(ix)12번의 서열의 열거

Claims (1)

  1. (i)사슬치환활성은 가지나 5′-3′엑소누클레아제 활성은 없는 DNA중합효소 및 (ii) 반수식된 이본쇄의 제한 엔도누클레아제 인지부위를 니킹시키는 제한 엔도누클레아제를 포함하는 사슬 치환 증폭(SDA)반응에서, 증폭 생성물과 2차 증폭 생성물을 동시에 생성시키는 방법으로서, (a)시그널 프라이머를 타겟서열과 하이브리다이즈시키고 1차 SDA 증폭 프라이머를 상기 시그널 프라이머의 상류에서 타겟서열과 하이브리다이즈시키는 단계; (b)타겟서열 상에서 상기 하이브리다이즈된 시그널 프라이머를 신장시켜 시그너 프라이머 신장 생성물을 생성시키고, 타겟서열 상에서 하이브리다이즈 1차 증폭 프라이머를 신장시켜서, 1차 증폭 프라이머의 신장이 타겟서열부터 시그널 프라이머 신장 생성물을 치환시키도록하는 단계; (c)2차 SDA 증폭 프라이머를 시그널 프라이머 증폭 생성물과 하이브리다이즈시키고 시그널 프라이머 신장 생성물 상에서 하이브리다이즈된 2차 증폭 프라이머를 신장시켜, 시로 합성된 사슬 및 제한 엔도누클레아제에 대한 이본쇄의 반수식된 인지부위를 포함하는 2차 증폭 프라이머 신장 생성물을 생성시키는 단계; (d)반수식된 인지부위를 니킹시키고 DNA 중합 효소를 사용하여 시그널 프라이머 신장 생성물로부터 합성된 사슬을 치환시키는 단계; (e)시그널 프라이머를 상기 치환된 새로 합성된 사슬과 하이브리다이즈시키고 시그널 프라이머를 신장시켜, 이본쇄의 2차 증폭 생성물이 생성되도록하는 단계를 포함하는 방법.
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