JPWO2019245038A1 - 複合状態を有する細胞混合物を用いた、免疫寛容を誘導する抗体、及び誘導されたリンパ球、また誘導されたリンパ球を用いる細胞治療剤及び治療法 - Google Patents
複合状態を有する細胞混合物を用いた、免疫寛容を誘導する抗体、及び誘導されたリンパ球、また誘導されたリンパ球を用いる細胞治療剤及び治療法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(1) CD4陽性アナジーT細胞と、CD8陽性アナジーT細胞とを含む医薬組成物。
(2) 前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によって誘導される、上記項目に記載の医薬組成物。
(3) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(4) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(5) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(6) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(7) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(8) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(9) さらに、制御性T細胞を含む項目1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(10) 前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(11) CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、CD8陽性細胞を含み、さらに、該組成物はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、医薬組成物。
(12)FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(13)前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(14)前記CD8陽性細胞はCD45RA陰性かつCD45RO陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(15)前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(16)前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(17)前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(18)前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(19)前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(20)上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
(21)前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(22)前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(23)前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(24)細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
(B)該混合によって得られる細胞生成物が、CD8陽性細胞を含むことを確認する工程と、
(C)該細胞生成物がFOXP3陽性およびCD4陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、
を包含する、方法。
(25) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(26) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(27) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(28) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(29) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(30) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(31)前記細胞生成物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載の方法。
(32)前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(33)前記工程(B)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(C)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(34)前記検出が、FACSにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
(35)被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、(A)該細胞がCD8陽性細胞を含むことを確認する工程、および(B)該細胞がFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程を含む、方法。
(36)前記工程(A)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(B)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(37)前記検出が、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
(38)上記項目のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための、阻害因子を含む組成物であって、該阻害因子が、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子である、組成物。
(39) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(40) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(41) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(42) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(43) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(44) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(45)細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子と、(B)CD8を検出するための手段と、(C)FOXP3およびCD4の少なくとも1つを検出するための手段とを含む、キット。
(46) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載のキット。
(47) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載のキット。
(48) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(49) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(50) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載のキットまたは方法。
(52) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載のキットまたは方法。
(53)前記細胞の混合物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載のキット。
(54)前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
(55)被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、(A)CD8を検出するための手段と、(B)FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段とを含む、キット。
(56) 前記CD8を検出するための手段が、抗CD8抗体を含み、FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体を含む、上記項目のいずれかに記載のキット。
(57) 前記検出は、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより行われることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のキット。
(B1)
CD8陽性アナジーT細胞を含む、CD4陽性アナジー細胞とともに用いて免疫寛容を惹起するための医薬組成物。
(B2)
上記項目1〜57または他の項目のいずれかに示す1または複数の特徴をさらに含む、項目B1に記載の医薬組成物。
(C1)
CD4陽性アナジーT細胞を含む、CD8陽性アナジー細胞とともに用いて免疫寛容を惹起するための医薬組成物。
(C2)
上記項目1〜57または他の項目のいずれかに示す1または複数の特徴をさらに含む、項目B1に記載の医薬組成物。
(D1)
被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、 CD4陽性アナジーT細胞と、
CD8陽性アナジーT細胞とを有効量で、該被験体に投与する工程を含む、方法。
(D2)
前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の方法。
(D3) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D4) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D5) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D6) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D7) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D8) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D9) 制御性T細胞を投与する工程をさらに含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(D10) 前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D11) 被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を有効量で、該被験体に投与する工程を含み、該アナジーが誘導された細胞は、CD8陽性細胞を含み、さらに、該アナジーが誘導された細胞はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、方法。
(D12)FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D13)前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D14)前記CD8陽性細胞はCD45RA陰性かつCD45RO陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D15)前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D16)前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D17)
前記アナジーが誘導された細胞は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起するる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D18)前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D19)前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D20)上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための方法。
(D21)前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D22)前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
(D23)前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(E1) 被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬を製造するための、CD4陽性アナジーT細胞およびCD8陽性アナジーT細胞の使用。
(E2) 前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の使用。
(E3) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E4) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E5) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E6) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E7) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E8) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E9) 前記CD4陽性アナジーT細胞およびCD8陽性アナジーT細胞はさらに、制御性T細胞を含む項目1〜8のいずれか一項に記載の使用。
(E10) 前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E11) 被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する医薬を製造するための、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞の使用であって、該アナジーが誘導された細胞は、CD8陽性細胞を含み、該アナジーが誘導された細胞はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、使用。
(E12)前記アナジーが誘導された細胞は、FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E13)前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E14)前記CD8陽性細胞はCD45RA陰性かつCD45RO陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E15)前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E16)前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E17) 前記アナジーが誘導された細胞は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起する、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E18)前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E19)前記アナジーが誘導された細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E20)上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための使用。
(E21)前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E22)前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の使用。
(E23)前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(F1) 被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための、CD4陽性アナジーT細胞およびCD8陽性アナジーT細胞の細胞混合物。
(F2) 前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の細胞混合物。
(F3) 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F4) 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F5) 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F6) 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F7) 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F8) 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F9) さらに、制御性T細胞を含む項目1〜8のいずれか一項に記載の細胞混合物。
(F10) 前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
(F11) 被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞であって、該アナジーが誘導された細胞は、CD8陽性細胞を含み、該アナジーが誘導された細胞はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、アナジーが誘導された細胞。
(F12)FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F13)前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F14)前記CD8陽性細胞はCD45RA陰性かつCD45RO陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F15)前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F16)前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
(F17) 抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起する、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F18)前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F19)前記アナジーが誘導された細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F20)上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのアナジーが誘導された細胞。
(F21)前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F22)前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
(F23)前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
本開示は以下をも提供する。
(G1)CD4陽性アナジーT細胞と、
CD8陽性アナジーT細胞と
を含む医薬組成物。
(G2)前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の組成物。
(G3)さらに、制御性T細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
(G4)前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G5)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、CD8陽性細胞を含み、さらに、該組成物はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、組成物。
(G6)FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(G7)前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(G8)前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G9)前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G10)前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G11)前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G12)前記細胞は、前記抗体と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G13)項目G1〜G12のいずれか一項に記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
(G14)前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
(G15)前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、項目G14に記載の組成物。
(G16)前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(G17)細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
(B)該混合によって得られる細胞生成物が、CD8陽性細胞を含むことを確認する工程と、
(C)該細胞生成物がFOXP3陽性およびCD4陽性の少なくとも1種の細胞を含むこ
とを確認する工程と、
を包含する、方法。
(G18)前記細胞生成物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載の方法。
(G19)前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(G20)前記工程(B)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(C)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(G21)前記検出が、FACSにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
(G22)被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、
(A)該細胞がCD8陽性細胞を含むことを確認する工程、および
(B)該細胞がFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程
を含む、方法。
(G23)前記工程(A)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(B)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、項目G22に記載の方法。
(G24)前記検出が、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
(G25)細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、
(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体と、
(B)CD8を検出するための手段と、
(C)FOXP3およびCD4の少なくとも1つを検出するための手段と
を含む、キット。
(G25A)細胞の混合物を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
(A)CD8を検出するための手段と、
(B)FOXP3およびCD4の少なくとも1つを検出するための手段と
を含む、キット。
(G26)前記細胞の混合物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載のキット。
(G27)前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
(項目G27A)前記医薬は、免疫寛容を利用して処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
(G28)被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
(A)CD8を検出するための手段と、
(B)FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段と
を含む、キット。
(G29)前記CD8を検出するための手段が、抗CD8抗体を含み、FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
(G30)前記検出は、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより行われることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のキット。
本明細書において「約」とは、本明細書で使用される場合、後に続く数値の±10%を意味する。
本明細書において「阻害因子」は、所定の作用(例えば、相互作用、シグナル伝達など)を阻害することができる、あらゆる種類の低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖などをいう。特定の理論に束縛されることは望まないが、本開示において、細胞表面のCD80および/またはCD86と、CD28との相互作用をブロックし、CD28共刺激シグナルを阻害することにより、T細胞にアナジーを誘導する。本開示では、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用をブロックするのに使用される阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。また、上記相互作用を間接的に阻害する因子(例えば、シグナル伝達の上流または下流のシグナルの阻害因子)も組み合わせて使用することも想定される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、本明細書中の記載を参酌して、任意の実施形態を組み合わせ得る。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
本発明者らは、CD80/CD86とCD28との相互作用を阻害する阻害因子を用いてT細胞のアナジーを誘導しても、アナジーが誘導されたT細胞を含む混合物中にCD8陽性細胞が存在しない場合、免疫寛容を誘導する能力が低下することを明らかにした。このことは、CD8陽性細胞を除去しても、免疫抑制にほとんど影響がない可能性を報告する非特許文献4とは対照的であり、予想外であった。
アレルギーおよび自己免疫疾患に関しては、患者の末梢血から得たマクロファージを慣例的な方法により抗原提示能の高い樹状細胞(マクロファージ由来樹状細胞)へと分化させ、放射線(γ線)照射後のこの細胞にアレルギーや自己免疫疾患における過剰反応の原因となっている抗原を提示させ、同じ患者末梢血から得たT細胞群と、抗CD80抗体および/または抗CD86抗体あるいはCTLA4−Ig融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で1〜2週間共培養し、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を患者に投与することで、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的な免疫寛容を誘導し、アレルギーおよび自己免疫疾患の予防および治療に用いる。予防的療法であるか治療であるか、さらに症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
移植片対宿主病においては、移植免疫拒絶反応に対する治療とは対照的に、移植片を提供するドナーのPBMCまたはT細胞等の移植片対宿主病の原因となりうる細胞を、放射線(γ線)照射した宿主由来のPBMCまたはそれ以外の細胞と抗CD80抗体および/または抗CD86抗体あるいはCTLA4−Ig融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で1〜2週間共培養し、宿主に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、移植片対宿主病の原因となっている移植片による宿主への反応を抑制し(免疫寛容を誘導し)移植片対宿主病を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
iPS細胞またはES細胞を用いた治療への応用においては、iPS細胞またはES細胞から分化させた移植に用いる細胞または樹状細胞に放射線(γ線)を照射し、この細胞と移植を受ける患者のPBMCまたはT細胞群を抗CD80抗体および/または抗CD86抗体あるいはCTLA4−Ig融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で1〜2週間共培養し、iPS細胞またはES細胞から分化させた細胞に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、iPS細胞またはES細胞に由来する移植した細胞、組織、および臓器に特異的な免疫寛容を誘導し、それらへの拒絶反応を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
本開示の別の局面において、本開示は、細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、(B)該混合によって得られる細胞生成物が、CD8陽性細胞を含むことを確認する工程と、(C)該細胞生成物がFOXP3陽性およびCD4陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、を包含する、方法を提供する。本発明者らは、十分な免疫抑制能を発揮するためには、アナジーが誘導されたT細胞の混合物中にCD8陽性細胞が含まれていることが重要であることを見出した。したがって、アナジーが誘導されたT細胞を含む医薬の製造において、CD8陽性細胞が含まれていることを担保することが重要である。このように製造された医薬は、被験体由来の抗原または被験体に由来しない抗原によって生じる被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するために使用され得る。CD8陽性細胞を生成するような阻害因子であれば、どのような阻害因子を用いてもよい。
別の局面において、本開示は、細胞製剤(細胞含有医薬)の品質管理方法を提供する。より詳細には、本開示は、被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、(A)該細胞がCD8陽性細胞を含むことを確認する工程、および(B)該細胞がFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程を含む、方法を提供する。被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬において、一定の品質(十分な免疫寛容)を維持するために、そのような細胞を含む医薬中にCD8陽性細胞が含まれているかどうかを管理することが重要な点の一つである。
1.生物由来原料およびその対応状況
一つの実施形態では、アナジーT細胞の製造工程において、表1に記載の生物由来原料基準に適合した生物由来原料を使用する。
ベラタセプト(例えば、Bristol−Myers Squibb、New York、NYから入手可能)
2.細胞製剤の製法
一つの実施形態では、細胞製剤は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値等は、代表例であり、当業者は適宜変更して細胞製剤の製造を行うことができる。
1) 投与19日前頃に、医療機関においてドナーにアフェレーシスを実施し、ドナーアフェレーシス産物を30Gyの放射線を照射し、細胞増殖能を無くした後に、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
2) ドナーアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、ドナー単核球を密度勾配遠心法により分離、回収後、2つに分けて凍結し、−80±10℃で保管する。
3) 投与14日前頃に、医療機関においてレシピエントにアフェレーシスを実施し、レシピエントアフェレーシス産物を、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
4) レシピエントアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、レシピエント単核球を密度勾配遠心法により分離、回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗CD80抗体および抗CD86抗体またはCTLA4−Ig融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
5) 投与7日前頃に培地交換を行う。7日間培養した中間製品を回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗CD80抗体および抗CD86抗体またはCTLA4−Ig融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
6) 投与当日に細胞加工物を密度勾配遠心法により回収後に、洗浄し、生理食塩液に充填する。
7) 医療機関に発送し、医療機関でレシピエントに投与する。
3.工程内管理試験
一つの実施形態では、製造工程内において、表2に記載した工程内管理試験を実施することができる。以下に例示する各種数値等や手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して工程内管理試験を実施することができる。
4.規格試験、特性解析試験
一つの実施形態では、最終製品を用いて表3に記載した規格試験を行うことができる。表3に例示する手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して規格試験、特性解析試験を実施することができる。例えば、その改変例としては、実施例8に例示した規格を挙げることができる。誘導性抑制性T細胞投与時には結果が判明しない場合、工程内管理試験の結果を参考に、治験製品の出荷を判断することができる。
上記治験製品規格試験、特性解析試験は、本明細書に記載されるとおりであり、治験製品規格試験は、外観、細胞数、生細胞率、細胞表面マーカー(CD3、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45RA/CD45RO)、製造工程由来不純物(ドナー由来細胞、培地成分、抗CD80抗体、抗CD86抗体、細胞凍害保護液成分、比重分離液成分)、ウイルス否定試験、無菌試験、マイコプラズマ否定試験、およびエンドトキシンを含み得る。効能試験として、培養細胞を用いたリンパ球混合試験(MLR)によるサイトカイン産生もしくはトリチウム取り込み試験を含み得る。細胞表現型の基準値については、例えば、CD3陽性細胞比率は、代表的には表中の50%以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上あるいは、これらの間の数値(1%、0.5%刻み等で設定し得る)であってもよい。CD3陽性細胞中のCD8陽性CD44陽性細胞比率は、代表的には表中の10%以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上などであってもよい。CD3陽性細胞中のCD4陽性CD44陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上などを基準値として設定してもよい。CD3陽性細胞中のCD8陽性CD45RA陰性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上などを基準値として設定してもよい。CD3陽性細胞中のCD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上などを基準値として設定してもよい。CD3陽性細胞中のCD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上などを基準値として設定してもよい。CD3陽性細胞中のCD4陽性CD25細胞比率は、代表的には表中の5%以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上などであってもよい。細胞数は、1×109個以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、例えば、1×108個以上、5×108個以上、1×109個以上、2×109個以上、3×109個以上などであってもよい。生細胞率は、70%以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上などを基準として採用することもできる。
最終製品は、一例をあげると、下記表に記載の構成物で構成される。これらの規格もまた、当業者は適宜変更して組成を変更して再生医療等製品を構成することができる。
一つの実施形態において、臓器移植後14日後に一回投与する。当業者は、投与方法やその期間等について、本明細書に記載される技術的事項を適宜参酌して必要に応じて変更を行って具体的に実施することができる。
別の局面において、本開示は、細胞製剤を製造するためのキットを提供する。さらに別の局面において、本開示は細胞製剤の品質管理のためのキットを提供する。詳細には、本開示は、細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、(B)CD8を検出するための手段と、(C)FOXP3およびCD4の少なくとも1つを検出するための手段とを含む、キットを提供する。
以下に、自己由来制御性T細胞の典型的な製造方法を説明する。
一つの実施形態では、事前の確認は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬、手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して事前の確認の製造を行うことができる。
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の分離は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の分離を行うことができる。
・アフェレーシスでドナーリンパ球を回収バッグに採取し、その回収バッグを放射線照射する。
・前述の放射線照射済み末梢血単核球を、適量のFicoll−Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)またはLymphocyte separation Solution(ナカライテスク#20828)等(例えば、20mL)が入った遠心管に入れ、860Gで20分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管(例えば、50mL遠心管2本)に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、シリンジ(例えば、18G注射針をつけた50mLシリンジ)またはピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・500Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・500Gで5分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を捨てる。
・予めドナーより採取した血漿を含むALyS505N-0培養液(細胞科学研究所 (CSTI)1020P10))を、細胞ペレットに加え(例えば、全液量が31mLになるまで適量)、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・シリンジ(例えば、18G注射針をつけた1mLシリンジ)またはピペットで、適量(例えば、0.3mL)抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の凍結保存は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の凍結保存を行うことができる。
・凍結バッグ(例えば、フローズバッグF-050 25mL凍結バッグ(株)ニプロ89-101)
を無菌下で開封し、ラベルに必要事項(日付、製造番号、ドナー名)を記入する。
・シリンジ(例えば、18G注射針をつけた30mLシリンジ)で、細胞浮遊液を取り、凍結バッグに入れる。
・ACD液((株)テルモTP-A05ACD、例えば、細胞浮遊液15mLに対して2mL)を、細胞浮遊液が入った凍結バッグに加え、4℃で冷却した保冷剤に挟んで、10分間程度冷やす。
・シリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)を用いて、4℃で冷却したCP−1(極東製薬工業(株) 551-27202-4細胞凍害保護液CP-1)例えば、8.5mL)を、凍結バッグに1分半程度の時間をかけて加える。この際、凍結バッグをゆっくり攪拌する。
・シリンジを用いて、凍結バッグおよびそのポート内の空気を全て抜き取る。
・チューブシーラーを使用して凍結バッグをシールし、まず4℃で約5〜10分冷却し、その後−80℃の冷凍庫で保管する。
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグを、例えば、37℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは無菌下で行う。
・シリンジ(例えば、18G注射針をつけた50mLシリンジ)を用いて、解凍された凍結バッグから細胞浮遊液を抜き取り、遠心管(例えば、50mL遠心管2本に12.5mLずつ)に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、例えば5%アルブミン液(日本製薬(株) 123146364 献血アルブミン5%静注12.5g/250mL)(例えば、細胞浮遊液12.5mLに対して37.5mL)を追加し、よく混和させる。その後、約5分間静置する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液(例えば、5%アルブミン液25mLと生理食塩液19mLから作製する)等の適宜の液を加えて懸濁する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、ALyS505N培養液(例えば、50mL遠心管に対して10mL)を加えて懸濁する。
・ALyS505N-0培養液またはそれと同等の液が入った培養バッグ(例えば、(株)ニプロ87598 ニプロメディウムALyS505NB10)に、抗ヒトCD80抗体(例えば、m2D10.4;Cat.No.16−0809−85、eBioscience社)と抗ヒトCD86抗体(例えば、IT2.2;Cat.No.16−0869−85、eBioscience社)をそれぞれ例えば最終濃度10μg/mLで加え(またはCTLA4−Ig融合タンパク質(例えば、ベラタセプト)等の同等の阻害因子を加え)、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約840mLである。
一つの実施形態では、患者リンパ球の分離は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して患者リンパ球の分離を行うことができる。
・患者より採取した血漿は、恒温槽中、例えば、56℃で30分間加温し、非働化しておく。直ちに使用しないものは、凍結保存する。
・患者より採取した末梢血を、適量の適切な媒体、例えばFicoll−Paque(例えば、20mL)が入った遠心管に入れ、例えば、860Gで20分間、22℃で遠心分離(例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管(例えば、50mL遠心管2本)に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、500Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、500Gで5分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を捨て、細胞ペレットに、例えば、ALyS505N-0培養液(例えば、10mL)を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する(例えば、合計20mLになるまでALyS505N-0培養液を追加する)。ここで、0.5mL程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数、生細胞数および表面抗原の発現を確認する。
・「3.ドナーリンパ球の解凍」で作製したALyS505N-0培養液中ドナー細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに患者由来の非働化血漿を追加する。
・この培養バッグに、上記患者由来細胞浮遊液をシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加え、チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000mLである。
・37℃インキュベーター内で、例えば、1週間培養する。
一つの実施形態では、培地交換は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培地交換を行うことができる。
・インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管(例えば、225mL遠心管4本)に分注する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ALyS505N-0培養液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する(例えば、合計20mLになるまでALyS505N-0培養液を追加する)。ここで、0.3mL程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
・例えば、ALyS505N-0培養液が入った培養バッグに、細胞浮遊液をシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加える。
・抗ヒトCD80抗体(例えば、2D10.4)希釈液と抗ヒトCD86抗体(例えば、IT2.2)希釈液を、それぞれ例えば、最終濃度10μg/mLとなるように(またはCTLA4−Ig融合タンパク質(例えば、ベラタセプト)等の阻害因子を用いてもよい。)、培養バッグにシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加える。
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグと患者由来の非働化血漿を、例えば、37℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは、無菌下で行う。
・シリンジ(例えば、18G注射針をつけた50mLシリンジ)を用いて、解凍された凍結バッグからドナー細胞浮遊液を抜き取り、遠心管(例えば、50mL遠心管2本)に移す。
・ドナー細胞浮遊液の入った遠心管に、5%アルブミン液(例えば、50mL遠心管2本につき、合計で約50mL)を追加し、よく混和させる。その後、約5分間静置する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液(例えば、5%アルブミン液25mLと生理食塩液19mLから作製する)を加えて懸濁する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ALyS505N-0培養液(例えば、50mL遠心管に対して10mL)を加えて懸濁する。
・「3.ドナーリンパ球の解凍」で作製したALyS505N培養液中患者細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに、解凍した患者由来の非働化血漿(例えば、10mL)をシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加え、さらに、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ(例えば、18G注射針をつけた20mLシリンジ)で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000mLである。
・チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。
・37℃インキュベーター内で、例えば、1週間培養する。
一つの実施形態では、二次培養中の検査は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次培養中の検査を行うことができる。
・代表的に、二次培養開始から3日目(培養通算10日目)に少量の培養液を、培養バッグから抜き取り、マイコプラズマ汚染などについて検査する。
一つの実施形態では、培養リンパ球の回収・充填は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培養リンパ球の回収・充填を行うことができる。
・例えば、二次培養開始から7日目(培養通算14日目)インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管(例えば、225mL遠心管4本)に分注する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液を加えて懸濁する。
・例えば、600Gで10分間、22℃で遠心分離(例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液(例えば、10mL)を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する。
・細胞浮遊液を、適量のFicoll−Paque(例えば、20mL)が入った遠心管(例えば、50mL遠心管)に静かに入れて重層させる。
・例えば、860Gで20分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する)する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管(例えば、50mL遠心管)に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、シリンジ(例えば、18G注射針をつけた50mLシリンジ)で吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、500Gで10分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する。
・上清を5mL程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・生理食塩液を追加し(例えば、全液量が50mLになるまで適量)、シリンジ(例えば、例えば、18G注射針をつけた50mLシリンジ)で吸引排出を繰り返して、よく混和させる(a)。
・例えば、500Gで5分間、22℃で遠心分離(遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい)する(b)。
・上清を5mL程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる(c)。
・上記(a)、(b)および(c)をさらに2回繰り返す。
・最後の遠心分離後の上清を、適量(例えば、4mL)を抜き取り、無菌検査およびマイコプラズマ検査に供する。
・再度生理食塩液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を、最終的な容器(例えば、100mL生理食塩液のボトル)に移す。適量(例えば、4mL)を抜き取り、最終的な生成物の、細胞数、生細胞数、表面抗原の発現およびエンドトキシンの含有量を確認する。
一つの実施形態では、二次包装は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次包装を行うことができる。
・代表的には、適切な基準(代表的には、NUHCPC−M−12−ATREG)に基づいてラベルに被験者ID、製造番号、使用期限を入力して印刷し、容器にラベルを貼付する。
・適切な基準(代表的には、NUHCPC−PMF−ATREG14)に基づいて「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を発行する。
・チャック付ビニール袋に試験物および「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を収納する。
・出荷するまで移送容器に入れてモニタリングユニット内に保管する。
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
本実施例では、免疫寛容を惹起するために必要な成分の特定を行うため、機能喪失アッセイを行った。以下に説明する。
(アナジー細胞の生成)
既に文献に記載された方法に従い実験を行った(1-3)。要約すると、C57BL6(以下B6)
マウスおよびBALB/cマウス(日本クレア、日本チャールス・リバー、等)から脾臓を摘出し、赤血球を溶血し脾臓細胞(リンパ球)を得た後、4×106細胞/mlとなるように10%非働化ウシ胎児血清(FCS)(SIGMA # 172012-500ML Lot 11D257またはbiosera #FB-1380/500 Lot.015BS482)を含むRPMI1640培地(Sigma;R8758-500MK)にて調整した。スティミュレイターとなるBALB/c脾臓細胞に放射線(γ線)30Gyを照射したのち、B6脾臓細胞と1:1で混合し、eBioscience社製ハムスター抗マウスCD80抗体(16-10A1)(Cat.No.16−0801−82)とラット抗マウスCD86抗体(GL1)(Cat.No.14−0862−82)を各最終濃度が10μg/mLになる様に添加し、12ウェルプレート(Corning、#3513)(1〜2.5mL)、6ウェルプレート(Corning、Cat.No.3516)(3〜6mL)、6cmシャーレ(Greiner CELLSTAR(登録商標)dish,Cat.No.628160)(3〜6mL)または10cmシャーレ(Corning、Cat.No.430167)(10〜15mL)にて37℃、5%CO2インキュベーター中で14日間培養した。培養開始から7日目に遠心により培養液を除いた後に、新たにBALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と抗CD80抗体/抗CD86抗体とを含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。14日後に細胞を回収しアナジー細胞を得た。
既に文献に記載された方法に従い実験を行った(3)。要約すると、アナジー細胞をレスポンダーB6脾臓細胞との比率が1/2から1/16になるように調整した後に、96ウェルプレート(Corning社製、Cat.No.3799)上での新たに採取したB6マウスおよびBALB/cマウスの脾臓細胞を用いた1×106細胞/mLでの1:1混合培養物(最終的に200μL/ウェルで4ウェルずつ)に添加し、37℃、5%CO2インキュベーター中で培養した(1ウェルあたりに、B6マウスおよびBALB/cマウスの脾臓細胞は、それぞれ1×105細胞、アナジー細胞は、1×105細胞の1/2〜1/16の細胞数)。培養開始4日目に3H−チミジン(10μL)を添加し、培養開始5日目(3H−チミジン添加の16〜20時間後)にCell Harvester(Molecular Devices)により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより3H−チミジン取込み量を測定した。ナイーブなB6リンパ球細胞の無刺激での3H−チミジン取込み量を1としてグラフを作成し、比較検討した。
結果を図1に示す。値は、無刺激状態(ナイーブ)の3H−チミジン取込み量の平均値を1として算出した値を示す。図1aに示すように、何の選別も行わなかった全B6脾臓培養細胞は、抗CD80/86抗体存在下でスティミュレイターBALB/c脾臓細胞と共に培養した(以後、「抗体・スティミュレイター処理」という)後、新鮮な(ナイーブ)B6脾臓細胞のBALB/c脾臓細胞への反応を抑制する効果があることが確認された。このアナジーが誘導された全培養細胞(細胞混合物)は、アナジーCD8陽性細胞、アナジーCD4陽性細胞、制御性T細胞(regT細胞)に加え他の細胞(CD19陽性B細胞)も含むことが予想される。
本実施例では、CD8陽性T細胞の免疫寛容誘導能力(免疫拒絶抑制能力)が、抗体・スティミュレイター処理によるアナジー誘導によるものであることを確認するとともに、同様の実験をFOXP3陽性T細胞においても行った。
実施例1と同様の手法で、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスからそれぞれ得た脾臓細胞に対し、抗体・スティミュレイター処理を行い、アナジー細胞を得た。このアナジー細胞とともに、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスから得た無刺激のナイーブ脾臓細胞を、それぞれPE蛍光標識抗マウスCD8抗体またはPE蛍光標識抗ヒトCD2抗体と反応させた。その後、抗PE磁気ビーズを用いたauto-MACSにより、細胞を、CD8陽性とCD8陰性とに、またはヒトCD2陽性とヒトCD2陰性とに選別した。選別した各細胞を、96ウェルプレート上の混合培養系に添加し、その免疫抑制能を調べた。
結果は図2に示す。
本実施例では、アナジー誘導後の純化細胞が移植後に寛容誘導能力を有するかどうかを確認した。
実施例1と同様の手法で、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスの脾臓細胞から、抗CD80/86抗体存在下でのスティミュレイターBALB/c脾臓細胞との共培養でアナジー細胞を得た。さらに一部の実験では、得られたアナジー細胞(全アナジー細胞)から、実施例1と同様の手法でCD8陽性細胞、CD4陽性細胞またはヒトCD2陽性細胞を選別した。野生型B6マウスに2Gyの放射線(γ線)を照射した3日後にBALB/cマウスの心臓を移植し、直後(または心臓移植と同日のうち)にナイーブB6脾臓細胞または得られたアナジー細胞を尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。各群5匹以上で実験を行った。
図3にその結果を示す。図3aに示す様に、アナジー細胞を移植しない場合、移植した心臓は約2週間までに全例が拒絶される。それに対して、全アナジー細胞投与群では、投与した細胞数に依存して心臓の生着率が改善され、6×106個の全アナジー細胞の移入では、移植した心臓への寛容が誘導されたと判定される100日以降でも全てのマウスで移植した心臓が生着していた。図3bに示す様に、この寛容誘導は、レシピエントマウスに放射線照射した後にアナジー細胞を移入した場合にのみ観察され、放射線照射無しにアナジー細胞を投与した場合や、放射線照射マウスにナイーブ細胞を移入した場合には全く観察されなかった。アナジー細胞からヒトCD2陽性細胞(FoxP3発現regT細胞)、またはアナジーCD8陽性細胞を除去した細胞集団を放射線照射マウスに投与した場合は、全アナジー細胞移入のような100日後での移植した心臓の100%の生着は見られず、明らかに寛容誘導能が低下しており、全アナジー細胞(アナジー細胞混合物)の投与の優位性が明らかであった(図3c)。また、純化したナイーブCD8陽性T細胞の投与では、全てのマウスで移植した心臓は拒絶されたのに対し、アナジーCD8陽性T細胞を移入した場合には投与したマウスのうち40%で寛容が誘導された(図3d)。さらに、ナイーブヒトCD2陽性細胞(FoxP3発現regT細胞)を移入した場合でも寛容が誘導されるマウスはいるものの、アナジーヒトCD2陽性細胞(FoxP3発現regT細胞)の投与の方が、より効果的に寛容を誘導した(図3d)。従って、アナジーCD8、CD4、FoXP3陽性細胞それぞれの単独投与よりも、アナジー細胞混合物の投与は、移植された心臓に対する拒絶反応をより効果的に抑制し、さらにレシピエントに放射線照射等による骨髄抑制を起こすことで、より効果的に寛容を誘導することが示された。
次に、本実施例では、ヒトPBMCに由来するアナジー細胞の能力について評価した。
(アナジー細胞の生成)
既に文献に記載された方法に従い実験を行った(5-8)。Promo cell社製Lymphocyte separation Media(Cat.No.C―44010)またはFicoll−Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)またはLymphocyte separation Solution(ナカライテスク#20828)等を用いて、4人のボランティア(2人をスティミュレイター、2人をレスポンダーとする)のヒト末梢血から単核細胞(PBMC)を分離し、4×106細胞/mlとなるよう2%ヒトAB型血清(プール)添加Biowest社製ALyS505N−0培地(細胞科学研究所(CSTI)1020P10)で調整した。スティミュレイターPBMCには放射線(γ線)30Gyを照射し、レスポンダーPBMCと1:1で混合した。上記にて混合したPBMCに、eBioscience社製マウス抗ヒトCD80抗体(2D10.4)(Cat.No.16−0809−85)とマウス抗ヒトCD86抗体(IT2.2)(Cat.No.16−0869−85)をそれぞれ最終濃度が10μg/mLになる様に添加し、12ウェルプレート(Corning、#3513)、6ウェルプレート(Corning、Cat.No.3516)(、6cmシャーレ(Greiner CELLSTAR(登録商標)dish ,Cat.No.628160)、または10cmシャーレ(Corning、Cat.No.430167)にて37℃、5%CO2インキュベーター中で培養を開始した。培養開始から7日目に遠心により培養液を除いた後に、放射線照射スティミュレイターPBMCと抗CD80抗体/抗CD86抗体を含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。培養14日目に細胞を回収し遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞を得た。一部の実験では、PE蛍光標識マウス抗ヒトCD25抗体(BC96;eBioscience #12-0259-42)、FITC蛍光標識マウス抗ヒトCD4抗体(RPA-T4;eBioscience #11-0049-42)、APC蛍光標識マウス抗ヒトCD8抗体(RPA-T8;eBioscience #17-0088-42)を用いてアナジー細胞を染色後、JSANセルソーター(ベイバイオサイエンス社)を用いて各細胞を純化して混合培養系に添加した。
得られたアナジー細胞をレスポンダーPBMCとの比率が1/2から1/16になるように調整した後に、新たに採取した同一のボランティアのPBMCを用いた96ウェルプレート(Corning社製、Cat.No.3799)上での各2×105個/200μL/ウェルでの4ウェルずつの混合培養系に添加し、37℃、5%CO2インキュベーター中で培養した。培養開始4日目に3H−チミジン(10μL)を添加し、培養開始5日目(3H−チミジン添加の16〜20時間後)にCell Harvester(Molecular Devices)により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより3H−チミジン取込み量を測定した。ナイーブなレスポンダーPBMCの無刺激での3H−チミジン取込み量を1としてグラフを作成し、比較検討した。
結果を図4に示す。
本実験では、抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞のドナー特異的寛容誘導を確認した。
実施例1と同様の手法で、野生型B6マウス(H-2b)から得た脾臓細胞を、抗CD80/86抗体存在下でBALB/cマウス(H-2b)由来の脾臓細胞で刺激し培養してアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を2Gyの放射線照射3日後にBALB/cマウスまたはCBAマウス(H-2k)の心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。
図5に示す様に、抗CD80/86抗体存在下でBalb/Cマウス脾臓細胞で刺激されたB6マウス由来のアナジー細胞のB6マウスへの移入は、移植されたBALB/cマウスの心臓の拒絶を100%阻害し100日後でも心臓が生着している、つまり、寛容が誘導されている。これに対して3rd partyであるCBAマウスの心臓は移植後に速やかに拒絶反応が引き起こされ、約50日で100%拒絶される。
本実験では、アナジー細胞がナイーブ細胞よりも迅速にドナー(スティミュレイター)細胞に結合することで、ナイーブ細胞の反応および増殖を阻害していることを確認した。
実施例1と同様の手法で、B6マウスから得た脾臓細胞を、抗CD80/86抗体存在下でBALB/cマウス由来の脾臓細胞で刺激しアナジー細胞を得た。この実験では、蛍光色素GFPを恒常的に発現する様に遺伝子改変したB6マウスから新たに得た脾臓細胞をレスポンダーとして用いた。12ウェルプレート(Corning社製、Cat.No.3799)内で、上述のレスポンダーB6脾臓細胞およびスティミュレイター(ドナー)BALB/c脾臓細胞をそれぞれ1×106個/ml含む4mlの混合培養系に、上記アナジー細胞を、レスポンダーB6脾臓細胞との比率が1/2になるように添加し、37℃、5%CO2インキュベーター中で培養した。1日後から3日後まで経時的にプレートを観察し、写真を撮った。
図6に写真の代表的な像をしめす。最下段のアナジー細胞を加えた培養系でのみ、培養1日後から細胞の塊(クラスター)が形成され、これはナイーブ細胞とドナー細胞のみ(上から2段目)の系では観察されない。従って、アナジー細胞が、おそらくBALB/c由来の細胞を中心とする細胞塊を形成していることが推察される。培養2日後以降になると、ナイーブB6脾臓細胞も細胞塊を形成し始め、同時にその部位で蛍光が強くなっている。これは、BALB/c脾臓細胞に接着し反応した、蛍光を発するナイーブ細胞の増加によると考えられ、この様な蛍光の増強は、ナイーブ細胞単独培養の上段と、アナジー細胞を添加した培養系では観察されない。従って、ナイーブ細胞の増殖反応はアナジー細胞の添加で抑制されていることが示唆される。この結果から、アナジー細胞はナイーブ細胞よりも迅速にドナー細胞に接着し、ナイーブ細胞によるドナー細胞の認識(接着)を阻害することにより、ナイーブ細胞の反応=増殖を阻害していることが示唆される。
本実験ではアナジー細胞の中で免疫抑制能(アナジー誘導能)を発揮する細胞はCD44陽性であることの確認実験を行った。
実施例1と同様の手法で、野生型B6マウスから得た脾臓細胞を、抗CD80/86抗体存在下でBALB/c細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞をAPC蛍光標識抗マウスCD8抗体(53-6.7;eBioscience#17-0081-82またはBioLegend; #100730)、PerCP/Cy5.5蛍光標識抗マウスCD4抗体(RM4-5;eBioscience #45-0042-82またはGK1.5;BioLegend; #100434)、およびAPC/Cy7蛍光標識抗マウスCD44抗体(BioLegend; #1003028)で染色後、JSANセルソーター(ベイバイオサイエンス社)を用いてCD8陽性CD44陰性細胞またはCD4陽性CD44陰性細胞を除去した後、混合培養系に添加した。さらに、JSANセルソーターを用いてCD8陽性CD44陽性細胞またはCD4陽性CD44陽性細胞を純化して混合培養系に添加する実験も行った。
図7aに示される様に、アナジー細胞からCD8陽性CD44陰性細胞またはCD4陽性CD44陰性細胞を除去しても、全アナジー細胞の添加と同様に、新たな混合培養系におけるレスポンダー細胞であるナイーブB6脾臓細胞の増殖を抑制することが観察された。このことから、CD44陰性細胞には免疫抑制作用すなわちアナジー誘導能は無いことが示された。さらに図7bに示される様に純化したCD8陽性CD44陽性細胞またはCD4陽性CD44陽性細胞には、単独でも免疫抑制能があることが示され、これまでの実施例で示されたアナジーCD8陽性細胞またはアナジーCD4陽性細胞による免疫抑制はCD44陽性細胞により発揮されていることが確認された。
本実施例では、様々な阻害因子を用いても免疫寛容を惹起することができることを示す。
基本的には、実施例1に記載の方法および既に文献に記載された方法に従い実験を行う(1〜3)。レシピエントPBMCおよびドナーPBMCには、それぞれヒト末梢血から新鮮に分離したものを使用するか、または−80℃で凍結保存したものを急速解凍して使用し、これらの細胞はともに、自己血漿または10%非働化ウシ胎児血清(FCS)(SIGMA # 172012−500ML Lot 11D257またはbiosera #FB−1380/500 Lot.015BS482)を含むRPMI1640培地(Sigma;R8758−500MK)にて4×106細胞/mLに調整する。ドナーPBMCには、20Gy放射線を照射しておく。これらのレシピエントPBMCとドナーPBMCとを、1:1で混合し、この混合物に、阻害因子(例えば、抗CD80抗体/抗CD86抗体では、それぞれ最終濃度10μg/ml、ベラタセプト(またはアバタセプト)では、最終濃度10μg/ml〜40μg/ml)を添加する。培養は、6cmシャーレ(Greiner CELLSTAR(登録商標)dish,Cat.No.628160)(培養体積3〜6mL)または10cmシャーレ(Corning、Cat.No.430167)(培養体積10〜15mL)にて37℃、5%CO2インキュベーター中で7日間行う(培養開始時の細胞密度は、4×106細胞/mL)。
培養開始から通算して14日目に遠心により誘導細胞を回収し、基本的には既に文献に記載された方法に従いリンパ球混合試験を行った(3)。細胞懸濁物を、37℃、5%CO2インキュベーターで共培養する。共培養開始4日目に3H−チミジン(10μl)を添加し、共培養開始5日目(3H−チミジン添加の16〜20時間後)に培養液中の3H−チミジンを除去し、3H−チミジン取込み量を測定し、免疫反応抑制能を確認することができる。
細胞製剤の製法については、上述の実施例1〜7における記載を参照のこと。実施例に準じて製造された細胞製剤について、以下のように品質管理を行う。
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、外観について目視で調べる。品質規格に合致する懸濁液は、微黄白色〜淡黄色の細胞からなるはずである。
アナジー細胞を、各表現型についてフローサイトメトリーで調べるために、例えば以下の抗体を使用し、多重染色により解析する:
CD3:FITC蛍光標識抗ヒトCD3抗体(UCHT1;eBioscience #11−0038−42)またはPacific Blue蛍光標識抗ヒトCD3抗体(UCHT1;Invitrogen #CD0328)
CD4:PE蛍光標識抗ヒトCD4抗体(RPA−T4;eBioscience #25−0049−42)
CD8:APC蛍光標識抗ヒトCD8抗体(RPA−T8;eBioscience #17−0088−42)
CD25:PerCP蛍光標識抗ヒトCD25抗体 (MEM−181;eBioscience #A15802)
CD44:PE−Cy7蛍光標識抗ヒトCD44抗体(IM7;eBioscience #25−0441−82)
CD45:Brilliant Violet蛍光標識抗ヒトCD45抗体(HI30;BioLegend #304032)
CD45RA:FITC蛍光標識抗CD45RA抗体(ALB11;Beckman Coulter A07786)またはPE蛍光標識抗CD45RA抗体(ALB11;Beckman Coulter IM1834U)
CD45RO:ECD蛍光標識抗CD45RO抗体(UCHL1;Beckman Coulter IM2712U)またはPE蛍光標識抗CD45RO抗体(UCHL1;Beckman Coulter A07787)またはAPC蛍光標識抗CD45RO抗体(UCHL1;Bay biosciences 20−0457)
手順
CD3陽性細胞比率、生細胞中のCD45陽性細胞比率、CD3陽性細胞中のCD8陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中のCD4陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中のCD8陽性CD45RA陰性細胞比率、CD3陽性細胞中のCD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率、CD3陽性細胞中のCD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率およびCD3陽性細胞中のCD4陽性CD25陽性細胞比率
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、上記抗体に反応させた後に、Zombie NIR Fixable Viability Kit(BioLgened #423106)を用いて死細胞を染色する。この多重蛍光染色された細胞をFACS Verse (BD Bioscience社)において、全生細胞中のCD3陽性細胞の比率を決定する。
基本的には、日本薬局方または該当する各国の薬局方の記載に準拠して試験を行う。以下に、例示的な実施形態を述べる。
アナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、無菌試験に供する。日本薬局方における代表的な無菌試験の一つである直接法では、上清を、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地または液状チオグリコール酸培地に接種し、それぞれ30〜35℃または20〜25℃で14日間以上培養する。その後、培養物を培養期間中に数回観察する。別の代表的な無菌試験であるメンブランフィルター法では、上清を無菌希釈液(例えば、1g/Lの肉製又はカゼイン製ペプトン溶液(pH7.1±0.2))で希釈し、希釈した上清をメンブランフィルター上に移し、濾過する。その後そのメンブランフィルターを、上述の2種類の培地にそれぞれ入れ、14日間以上培養する。品質規格に合致する製品では、培養期間中及び最終日に、培地に肉眼的な微生物の増殖は存在しない。
アナジー細胞浮遊液を、適宜生理食塩液で希釈し、pH6.0〜8.0に調製する。その後、ライセート試薬と混合し、ライセート試液のゲル形成を指標として(ゲル化法)、またはライセート試液のゲル化過程における濁度変化を指標として(比濁法)もしくは合成基質の加水分解による発色を指標として(比色法)、試料中のエンドトキシン濃度を定量的に求める。必要に応じて、ライセート試薬の表示感度を確認する予備試験を行う。品質規格に合致する製品では、エンドトキシン濃度は、0.25EU/mL未満にならなければならない。
培養液、またはアナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、マイコプラズマ否定試験に供する。日本薬局方における代表的なマイコプラズマ否定試験の一つである培養法では、試料を、寒天平板培地に接種し、5〜10%の炭酸ガスを含む窒素ガス中で、適切な湿度のもと35〜37℃で14日間以上培養する、あるいは、試料を、液体培地を入れた容器に接種し、35〜37℃で培養し、液体培地の色調変化を観察したときか、または培養開始から一定期間ごとに液体培養物からアリコートを取り、新たな寒天平板培地に播いて、培養を続ける。その後、全ての寒天平板培地を対象に7日目と14日目に倍率100倍以上の顕微鏡でマイコプラズマの集落の有無を調べる。別の代表的なマイコプラズマ否定試験である指標細胞を用いたDNA染色法では、典型的には、指標細胞であるVero細胞と指定のマイコプラズマ菌株を用いる。この方法では、カバーグラスを沈めた培養ディッシュなどに指標細胞を接種し、5%炭酸ガスを含む空気中、35〜38℃で一日増殖させる。その後試料(培養液または上清)を添加して、同様の条件で3〜6日間培養を続ける。カバーグラス上の培養細胞を固定後、ビスベンズイミド等の染色剤によりDNA蛍光染色し、蛍光顕微鏡(倍率400〜600倍またはそれ以上の倍率)で検鏡し、陰性(非接種)対照及びマイコプラズマ陽性対照と比較しながら、細胞核を囲むように微小な核外蛍光斑点を持つ細胞が0.5%以上存在した場合には、マイコプラズマ陽性と判断する。品質規格に合致する製品では、マイコプラズマ陰性であるべきである。
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより細胞数を測定する。品質規格に合致する、投与に適切なアナジー細胞の数は、1×108〜30×108個(例えば、100mL生理食塩液中)であり、この範囲を下回る場合には、適宜細胞を追加すべきである。
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、0.3〜0.5%トリパンブルー染色液(例えば、カタログ#35525−02、ナカライテスク)と混合し、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより生細胞数を測定する。品質規格に合致する製品では、70%以上の細胞が生細胞であるべきである。
以上の結果から、本開示の組成物は、
1)CD44陽性CD8陽性T細胞とCD44陽性CD4陽性T細胞を中心とする免疫抑制細胞の集団であり、混合物であることにより、その性能は強く発揮される。
2)この細胞集団は同時にFoxP3陽性のregT細胞を含有すると示唆されるが、このregT細胞の抑制能もまた、抗CD80/86抗体存在下での抗原刺激というアナジーを誘導する培養系で増強され、またCD44陽性CD8陽性細胞、CD44陽性CD4陽性細胞の存在下でその抑制能はより強く発揮される。
3)抗CD80/86存在下で一度抗原に反応し選択され、抗原特異的になったアナジーCD8陽性細胞およびアナジーCD4陽性細胞が、ナイーブ細胞より早く、抗原を認識しカバーすることが、免疫抑制の機序の1つであることが証明された。これらは、従来の免疫拒絶抑制実験では判明していなかったことで、非常に重要な知見である。
以下の参考文献は、実施例等において基本技術として参照したものであり、これらの文献が本開示に対して先行技術を構成することを認めるものではない。これらの内容は参考として援用される。
1. Bashuda H, Kimikawa M, Seino K, Kato Y, Ono F, Shimizu A, et al. Renal allograft rejection is prevented by adoptive transfer of anergic T cells in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation. 2005;115(7):1896-902.
2. Bashuda H, Shimizu A, Uchiyama M, Okumura K. Prolongation of renal allograft survival by anergic cells: advantages and limitations. Clin Transplant. 2010;24 Suppl 22:6-10.
3. Luo Z, Gotoh M, Grochowiecki T, Tanaka T, Kimura F, Kawashima H, et al. Anergic T cells generated in vitro suppress rejection response to islet allografts. Transplantation. 2000;69(10):2144-8.
4. Miyao T, Floess S, Setoguchi R, Luche H, Fehling HJ, Waldmann H, et al. Plasticity of Foxp3(+) T cells reflects promiscuous Foxp3 expression in conventional T cells but not reprogramming of regulatory T cells. Immunity. 2012;36(2):262-75.
5. Davies JK, Barbon CM, Voskertchian A, Nadler LM, Guinan EC. Ex vivo alloanergization with belatacept: a strategy to selectively modulate alloresponses after transplantation. Cell transplantation. 2012;21(9):2047-61.
6. Davies JK, Gribben JG, Brennan LL, Yuk D, Nadler LM, Guinan EC. Outcome of alloanergized haploidentical bone marrow transplantation after ex vivo costimulatory blockade: results of 2 phase 1 studies. Blood. 2008;112(6):2232-41.
7. Davies JK, Nadler LM, Guinan EC. Expansion of allospecific regulatory T cells after anergized, mismatched bone marrow transplantation. Science translational medicine. 2009;1(1):1ra3.
8. Davies JK, Yuk D, Nadler LM, Guinan EC. Induction of alloanergy in human donor T cells without loss of pathogen or tumor immunity. Transplantation. 2008;86(6):854-64.
(注記)
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許出願特願2018−119001(2018年6月22日出願)に対して優先権主張の利益を主張するものであり、当該出願の内容は本願において、その内容が(全部であり得る)参考として援用されることが理解される。また、日本国特許出願特願2018−118996および特願2018−119003(いずれも2018年6月22日出願)ならびにそれらに対して優先権主張する国際出願の内容は、その一部または全文が、本明細書において参考として援用される。
Claims (56)
- CD4陽性アナジーT細胞と、
CD8陽性アナジーT細胞と
を含む医薬組成物。 - 前記アナジーT細胞は、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によって誘導される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項7に記載の医薬組成物。
- さらに、制御性T細胞を含む請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記制御性T細胞は、FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、CD8陽性細胞を含み、さらに、該組成物はFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種以上を含む、医薬組成物。
- FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のすべてを含む、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記CD8陽性細胞はCD44陽性である、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 前記CD8陽性細胞はCD45RA陰性かつCD45RO陽性である、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 前記FOXP3陽性細胞はCD4陽性である、請求項11〜14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記FOXP3陽性細胞はCD25陽性である、請求項11〜15のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体またはこれらの組み合わせを含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、請求項2〜18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
- 前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、iPS細胞またはES細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記抗原の含有物は細胞である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
(B)該混合によって得られる細胞生成物が、CD8陽性細胞を含むことを確認する工程と、
(C)該細胞生成物がFOXP3陽性およびCD4陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、
を包含する、方法。 - 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項25に記載の方法。
- 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項26に記載の方法。
- 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、請求項25〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞生成物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、請求項17に記載の方法。
- 前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、請求項24〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(B)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(C)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、請求項24〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出が、FACSにより実施されることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、
(A)該細胞がCD8陽性細胞を含むことを確認する工程、および
(B)該細胞がFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程
を含む、方法。 - 前記工程(A)が、抗CD8抗体によりCD8を検出することを含み、前記工程(B)が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体によりFOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出することを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記検出が、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより実施されることを特徴とする、請求項36に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造するための、阻害因子を含む組成物であって、該阻害因子が、CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子である、組成物。
- 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項38に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項39に記載の組成物。
- 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項40に記載の組成物。
- 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項40に記載の組成物。
- 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、請求項39〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項43に記載の組成物。
- 細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、
(A)CD80および/またはCD86と、CD28との相互作用を阻害することができる阻害因子と、
(B)CD8を検出するための手段と、
(C)FOXP3およびCD4の少なくとも1つを検出するための手段と
を含む、キット。 - 前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項45に記載のキット。
- 前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項46に記載のキット。
- 前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項47に記載の方法。
- 前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項47に記載の方法。
- 前記阻害因子は、抗CD80抗体、抗CD86抗体、CD80およびCD86に対する二重特異性抗体、抗CD28抗体もしくはこれらの抗原結合断片、CTLA4−Ig融合タンパク質、CD28−Ig融合タンパク質からなる群より選択される、請求項46〜49のいずれか一項に記載のキットまたは方法。
- 前記CTLA4−Ig融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項51に記載のキットまたは方法。
- 前記細胞の混合物におけるCD8陽性細胞の存在、およびFOXP3陽性細胞およびCD4陽性細胞の少なくとも1種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、請求項45〜52のいずれか一項に記載のキット。
- 前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、請求項45〜53のいずれか一項に記載のキット。
- 被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
(A)CD8を検出するための手段と、
(B)FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段と
を含む、キット。 - 前記CD8を検出するための手段が、抗CD8抗体を含み、FOXP3およびCD4の少なくとも1種を検出するための手段が、抗FOXP3抗体および抗CD4抗体の少なくとも1種の抗体を含む、請求項45〜55のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出は、FACS、ウェスタンブロット、またはPCRにより行われることを特徴とする、請求項56に記載のキット。
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