WO2023190942A1

WO2023190942A1 - 誘導型抑制性ｔ細胞製剤の品質を評価する方法

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Publication number: WO2023190942A1
Application number: PCT/JP2023/013323
Authority: WO
Inventors: 浩一郎内田; 和由竹田; 由依前原; 文隆河合
Original assignee: 学校法人順天堂; 株式会社Junten Bio
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2023-03-30
Publication date: 2023-10-05
Also published as: TW202405425A

Abstract

本開示によれば、免疫寛容誘導による拒絶反応の治療の最適化が提供される。　本開示によれば、生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する方法であって、（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程とを含み、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、該薬剤を免疫寛容療法用の薬剤とみなす、方法が提供される。

Description

誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の品質を評価する方法

　肝臓移植は末期肝不全患者に対する究極の治療法として広く普及してきた。１９６３年に世界初の臨床肝移植が行われたが、これまでに約３０万件以上、現在では、年間に海外で２５，０００例以上、本邦でも約４００例の症例を数える。この肝移植の発展は手術手技・臓器保存・術前術後管理等の進歩によるが、中でも移植後の拒絶反応を抑制するために用いられる免疫抑制剤の改良が大きく貢献してきた。これまでに用いられた、アザチオプリン（１９６０～７０年代）、シクロスポリン（１９８０年代）、タクロリムス（１９９０年代以降）により、１年及び５年患者生存率はそれぞれ約３５％及び２０％、約７０％及び６０％、並びに約８０％及び７０％と飛躍的に向上してきている。

　本開示では、免疫抑制剤を中止しても移植片が正常に機能する、いわゆる免疫寛容の誘導のため、誘導型抑制性Ｔ細胞の規格を定め、その品質を評価する方法を見出し、またその誘導型抑制性Ｔ細胞を用いて免疫寛容を達成するための方法を確立させた。

　したがって、本開示の技術は、感染症、発癌、代謝性疾患の増悪などの薬剤による副作用などの危険性に常に晒される免疫抑制剤による治療を回避し、免疫抑制剤を中止してもグラフトが正常に機能する免疫寛容の誘導を提供する。

　本発明者らは、鋭意努力した結果、臓器移植患者での免疫拒絶反応を減弱させるための、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体処理を介してドナー抗原選択的な免疫寛容を誘導する細胞とその抑制分子メカニズムに関して、ヒト患者において適切な製法を含む、臨床において実際に使用に最適な技術を提供する。

　本開示によって提供される誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、患者末梢血単核球を、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ８６抗体の存在下で、放射線照射したドナー末梢血単核球と共培養して誘導された誘導型抑制性Ｔ細胞を含むものである。本開示の製剤に含まれる誘導型抑制性Ｔ細胞の構成成分はＴリンパ球を中心とした単核球であり、中でもＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が主である。本開示の製剤の有効成分は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞（制御性ＣＤ４^＋Ｔ細胞）及びＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞（抑制性ＣＤ８^＋Ｔ細胞）である。

　本開示の製剤を臓器移植患者に投与すると、ドナー臓器に発現するＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗原に反応したエフェクターＣＤ４^＋Ｔ細胞とエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞はその活性化が阻害され、新たな制御性ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び抑制性ＣＤ８^＋Ｔ細胞へと誘導される。その結果、ドナーＨＬＡ抗原特異的に免疫拒絶反応が継続的に減弱し、免疫抑制剤の使用量の低減や離脱が可能となる。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する方法であって、
（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、
（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程と
を含み、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、該薬剤を免疫寛容療法用の薬剤とみなす、方法。
（項目２）
　前記患者が免疫抑制剤の投与を受けている、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、前記患者に対する前記免疫寛容療法を変更することを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　（ｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における炎症誘発性サイトカイン産生が上昇している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止し、及び／または
　（ｉｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における抗炎症性サイトカイン産生が低下している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止することを特徴としする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記末梢血リンパ球がＣＦＳＥで染色される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。（項目８）
　工程（ａ）および（ｂ）において、前記ドナーから採取された末梢血リンパ球に代えて、前記ドナーから採取されたＢ細胞を用いることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記生体肝移植後、少なくとも約３日～約６日目以内に行われることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１０、及び／またはＴＧＦβを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
　患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
　アフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、
　アフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、
　該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、第二の免疫抑制剤を投与する工程と、
　該第二の免疫抑制剤の投与後に、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、
　該副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の投与量を段階的に減量する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ２）
　前記拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定され、
　前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間経過時点での肝生検により、前記第一の免疫抑制剤の投与中止が最終決定され、
　さらに、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定される
ことを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３）
　患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
　移植１４日前～３日前にアフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、
　移植１日前にアフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、
　該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、およびカルシニューリン阻害薬の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
　肝移植後４～６日目に、該患者に対して、２０～５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与する工程と、
　肝移植後９日～１１日目のいずれかの時点で、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、
　少なくとも移植後１３週で、該カルシニューリン阻害薬の投与量を減量する工程と、
を含み、
　該拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定され、
　該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週目の時点での肝生検により、該カルシニューリン阻害薬の投与中止が最終決定され、
　さらに、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が該カルシニューリン阻害薬の投与中止後５２週以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定される
ことを特徴とする、方法。
（項目Ａ４）
　前記副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後４週以内に中止される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後２６週以内に中止される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　前記カルシニューリン阻害薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後７８週以内に中止される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
　免疫寛容療法における免疫抑制剤の投与量を減量するための方法であって、
　（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時の投与
　　肝移植後の投与および投与量の減量を行い、所定の期間で投与を終了し、該所定の期間で投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後の投与
　　肝移植後の所定の期間以内に投与を終了する
　　肝移植後所定の期間以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に投与量の増量を可とし、その場合、段階的な減量を行うことを特徴とし、
　（３）第一の免疫抑制剤については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後所定の期間（投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後の第一の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
　　　肝移植後第一の所定の期間の後の第二の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
をそれぞれ目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（第一の免疫抑制剤の減量期間）
　　肝移植後第一の所定の期間（減量１）では、所定の血中トラフ濃度を維持するように用法・用量を調整する
　　肝移植後第二の所定の期間（減量２）以降は、（減量１）の用量を維持して、投与回数を減量スケジュールに従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、第一の免疫抑制剤の減量期間は延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、
方法。
（項目Ｂ２）
　免疫寛容療法における免疫抑制剤を減量するための方法であって、
　（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時に１０００ｍｇを投与する
　　肝移植後１日から１週間にわたり２０ｍｇ／日を投与する
　　１週間ごとに、５ｍｇ／日ずつ減量し、肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後１日から１日２回に分けて合計５００ｍｇ／日を投与する
　　肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に１０００～２０００ｍｇ／日まで増量を可とし、その場合、段階的な減量は５００ｍｇ／日ずつ行う
　（３）カルシニューリン阻害薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後０日～肝移植後２６週まで（カルシニューリン阻害薬の投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から経口または持続静注で投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後１３週：タクロリムス８～１２ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン２００～３００ｎｇ／ｍＬ
　　　肝移植後１３週～肝移植後２６週：タクロリムス５～８ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン１２５～２００ｎｇ／ｍＬ
を目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（カルシニューリン阻害薬の減量期間）
　　肝移植後２６週（減量１）では、タクロリムス３～５ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン７５～１２５ｎｇ／ｍＬの血中トラフ濃度を維持するように１日１回の投与回数で用法・用量を調整する
　　肝移植後３９週（減量２）以降は、肝移植後２６週（減量１）の用量を維持して、投与回数をカルシニューリン阻害薬の減量スケジュール（減量２：週３回、減量３；週２回、減量４：週１回：減量５：離脱）に従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、カルシニューリン阻害薬の減量期間は、総計１３週間延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、方法。（項目Ｂ３）
　前記拒絶反応は、
　（１）発熱または全身倦怠感などの身体所見、および／または
　（２）血液生化学検査における、Ｔ－Ｂｉｌ／ＡＳＴ／ＡＬＴ／γ－ＧＴＰのいずれかの、直近の来院時データからの２倍以上の上昇
によって存在しているか否かが決定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１）
　免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、
　肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、組織診断を行うステップ、ならびに
　該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が所定の中止基準のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップ
を包含する、方法。
（項目Ｃ２）
　免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、
　肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後２６週、減量５の４週後および５２週後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、Ｂａｎｆｆ基準（２０１６年）およびＶｅｎｔｕｒｉ（２０１２年）のスコア化に準じた組織診断を行うステップ、ならびに
　該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が「中等度以上」、慢性拒絶反応の全体的評価が「あり」、及び肝線維化のスコアが「２以上」のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップ
を包含する、方法。
（項目Ｄ１）
　品質が評価された免疫寛容を達成するための薬剤を用いて、生体肝移植を受けた患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、
（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程と、
（ｄ）該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
（ｅ）該生体肝移植後に、該患者に対して、第二の免疫抑制剤を単回投与する工程と、
（ｆ）該第二の免疫抑制剤の投与後に、該患者に対して、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している薬剤を投与する工程と、
　該副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の投与量を段階的に減量する工程と
を含む、方法。
（項目Ｄ２）
　前記患者が免疫抑制剤の投与を受けている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ３）
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ４）
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ５）
　工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、前記患者に対する前記免疫寛容療法を変更することを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ６）
　（ｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における炎症誘発性サイトカイン産生が上昇している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止し、及び／または
　（ｉｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における抗炎症性サイトカイン産生が低下している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止することを特徴としする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ７）
　前記末梢血リンパ球がＣＦＳＥで染色される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。（項目Ｄ８）
　工程（ａ）および（ｂ）において、前記ドナーから採取された末梢血リンパ球に代えて、前記ドナーから採取されたＢ細胞を用いることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ９）
　前記生体肝移植後、少なくとも約３日～約６日目以内に行われることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ１０）
　前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１０、及び／またはＴＧＦβを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｅ１）
　生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤であって、該薬剤が、上記項目のいずれか一項に記載の方法によって品質が評価されたものである、薬剤。
（項目Ｆ１）
　品質が評価された免疫寛容を達成するための薬剤を用いて、生体肝移植を受けた患者において、免疫寛容療法における免疫抑制剤の投与量を減量するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の方法の工程を含む、方法。

　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

図１Ａは、ＭＬＲによる細胞加工物の免疫反応抑制能評価を示す。患者由来細胞と放射線照射したドナー由来細胞を同数、細胞加工物を患者由来細胞数：細胞加工物＝１：１／２、１：１／４、１：１／８、または１：１／１６の割合で混合して培養した後、培養上清中のＩＦＮｇ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１Ａ～Ｃはそれぞれ独立した３回の結果を示す。図１Ｂは、ＭＬＲによる細胞加工物の免疫反応抑制能評価を示す。患者由来細胞と放射線照射したドナー由来細胞を同数、細胞加工物を患者由来細胞数：細胞加工物＝１：１／２、１：１／４、１：１／８、または１：１／１６の割合で混合して培養した後、培養上清中のＩＦＮｇ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１Ａ～Ｃはそれぞれ独立した３回の結果を示す。図１Ｃは、ＭＬＲによる細胞加工物の免疫反応抑制能評価を示す。患者由来細胞と放射線照射したドナー由来細胞を同数、細胞加工物を患者由来細胞数：細胞加工物＝１：１／２、１：１／４、１：１／８、または１：１／１６の割合で混合して培養した後、培養上清中のＩＦＮｇ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１Ａ～Ｃはそれぞれ独立した３回の結果を示す。図２は、本開示の一実施形態に係る誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いて、生体肝移植後の患者の免疫抑制剤の減量を達成するための全体像を示す模式図である。図３Ａは、本開示の一実施形態に係る誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いて、生体肝移植後の患者の免疫抑制剤の減量を行う場合の、生体肝移植から免疫抑制剤の減量までの患者のスケジュールの一例である。図中、「ＪＢ－１０１」は本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を、「ＪＢ－ＣＰＡ」は注射用エンドキサンを、それぞれ示す。図中の凡例は以下のとおりであり、図３Ａ及びＢにおいて共通である。※：本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の輸注と同日の実施は不可とする。◎：末梢血単核球採取前及び採取後に実施する。ただし、採取後の体重の測定は不要とする。なお、末梢血単核球採取前の検査項目は前日の検査データを利用可とする。●：肝移植、注射用エンドキサン投与、又は本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤輸注の前に実施する。免疫抑制療法を肝移植日と同日に開始する場合は、原則として肝移植後、ステロイド以外の免疫抑制剤の投与開始前に実施する。△：医師等の判断により、投与量等を決定する。▲：ドナー肝グラフト採取時（Ｂａｃｋ　ｔａｂｌｅ時可）に実施する。☆：可能な場合、医師の判断で実施する。※ａ：スクリーニング時の検査項目は、肝移植前８週以内の検査データがある場合、患者の同意のもと、その検査データを利用可とする。ただし、組織適合性試験、ウイルス検査１、ウイルス検査２、真菌検査、Ｂ型又はＣ型肝炎検査、抗ＨＬＡ抗体は、生体肝移植に対する適格性検査として実施している場合には、肝移植前８週を超えてその検査データを利用可とする。※ｂ：減量のタイミングは総計１３週間延長することができるが、直近の減量時点ら１３週間以上空けて次の減量を行う。※ｃ：患者の全身状態の観察に加え、血液生化学検査及び肝生検を実施し、免疫抑制剤からの離脱の最終確認を行う。※ｄ：注射用エンドキサン投与後に中止した場合の検査項目を示す。※ｅ：規定観察日と重なる場合、規定観察日の検査結果を用いることとし、重複項目は省略可とする。複数日に分けて実施する場合、原則として１週間以内に実施する。※ｆ：免疫抑制療法開始日を除き、規定されたカルシニューリン阻害薬投与直前に採血し、血中トラフ濃度を測定する（少なくとも前回投与から１２時間以上空けて採血する。※ｇ：拒絶反応が疑われた場合の肝生検及びその組織診断は各実施医療機関で行うことを可能とする。図３Ｂは、本開示の一実施形態に係る誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いて、生体肝移植後の患者の免疫抑制剤の減量を行う場合の、生体肝移植から免疫抑制剤の減量までの患者のスケジュールの一例である。図３Ｃは、本開示の一実施形態に係る誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いて、生体肝移植後の患者の免疫抑制剤の減量を行う場合の、生体肝移植から免疫抑制剤の減量までのドナーのスケジュールの一例である。図中の凡例は以下のとおりである。●：アフェレーシス開始前及び完了後に実施する。ただし、完了後の体重の測定は不要とする。※ａ：スクリーニング時の検査項目は、移植前８週以内の検査データがある場合、ドナーの同意のもと、その検査データを利用可とする。ただし、組織適合性試験、ウイルス検査は、生体肝移植に対する適格性検査として実施している場合には、肝移植前８週を超えてその検査データを利用可とする。※ｂ：アフェレーシス実施後（中断を含む）に治験を終了又は中止する場合は、アフェレーシス実施後７日（許容範囲：＋７）に規定の検査を実施する。※ｃ：閉経後１２ヵ月経過している及び子宮又は両卵巣を摘出している場合、検査不要。図４は、一実施形態に係る本開示の一実施形態に係る誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いた場合の免疫抑制剤の投与・減量スケジュール（免疫抑制剤の投与量調整・減量期間）を示す模式図である。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下の表に本明細書において用いられる略号または名称の正式名称またはその内容を示す。
　（用語の定義）
　本明細書において「約」とは、本明細書で使用される場合、後に続く数値の±１０％を意味するが、本明細書では、「約」のない場合でも、同様に後に続く数値の±１０％を意味し得ることが理解される。本明細書において、「％」の表示は特に断らない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）％を意味する。

　本明細書において、「免疫寛容」とは、特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態のことである。免疫寛容は、免疫細胞（特にＴ細胞）が特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態と、ヒトが特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態の両方またはいずれか一方を意味していてもよい。免疫寛容が惹起されることにより、免疫拒絶反応に対する処置が可能になったり、アレルギーに対する治療が可能になったりすることから注目されている。本明細書において、「アナジー」とは、抗原提示細胞から抗原を提示される際に共刺激が入力されないことにより、当該次回に共刺激のある条件で刺激されても反応できなくなった状態を意味する。したがって、本明細書では「誘導型抑制性細胞」または「アナジー細胞」とは、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）細胞をいい、「誘導型抑制性Ｔ細胞」または「アナジーＴ細胞」は、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）Ｔ細胞であり、活性化されないことのほか、再び同じ抗原にであったときに無反応であるＴ細胞も包含される。なお、本明細書において、「免疫寛容を誘導されたＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」と「誘導型抑制性Ｔ細胞」と「アナジーなＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」とは同意義である。

　本明細書において、「被験体」（英語ではｓｕｂｊｅｃｔ、「対象」と表現されることもある）または「患者」とは、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態では、被験体または患者は、ヒトである。

　本開示の製剤の対象疾患は、生体間で同種臓器移植を受けた患者がもつドナー臓器に対する免疫拒絶反応である。一例をあげると、生体肝臓移植の他、生体腎臓移植、生体肺移植などに伴う免疫拒絶反応を対象としている。

　本開示の製剤によれば、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子により、特定の抗原に対するアナジーが誘導された細胞が投与された被験体（レシピエント）において、アナジーが誘導された当該細胞が被験体から消失した後も、少なくとも一定期間（例えば、数カ月、あるいは、１年、あるいは、３年以上）、特定の抗原に対する免疫寛容の状態が維持され、恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を獲得することができる。これは、アナジーが誘導された細胞が投与された被験体（レシピエント）の生体内で、アナジーが誘導され得る他の細胞において、新たにアナジーが誘導されること、すなわち感染性免疫寛容が誘導されていることを意味する。

　本明細書において、「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、その他の有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。

　本明細書において、「阻害因子」は、所定の作用（例えば、相互作用、シグナル伝達など）を阻害することができる、あらゆる種類の低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖などをいう。特定の理論に束縛されることは望まないが、本開示において、細胞表面のＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックし、ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害することにより、Ｔ細胞にアナジーを誘導する。本開示では、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックするのに使用される阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８－Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。また、上記相互作用を間接的に阻害する因子（例えば、シグナル伝達の上流または下流のシグナルの阻害因子）も組み合わせて使用することも想定される。

　本明細書において広義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団をいう。本明細書における広義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であっても、Ｆｃ部分を欠いている抗体であってもよい。Ｆｃ部分を欠いている抗体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような抗体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）_２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、どのようなタイプの抗体であってもよく、すなわち、当該分野において公知の免疫グロブリンであってもよい。例示的な実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのクラスの抗体である。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、および／またはミュー重鎖を含む。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のカッパまたは軽鎖を含む。例示的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、４つのヒトサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のうちの１つである。また、本開示における使用が想定される抗体としては、ラクダ科動物由来の抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）、サメ由来の抗体（例えば、一本鎖抗体）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ、単一ドメイン抗体）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジ－ｓｃＦＶ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）などが挙げられ、これらは、当該分野において公知である。例えば、Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ　Ｅｎｇ．　２００１　１８巻：９５～１０８頁、（２００１年）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　２４８巻：４７～６６頁、（２００１年）などを参照されたい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。人工的に作出された抗体および抗体の種々の修飾／改変方法については、生化学（２０１６）第８８巻第３号３８０～３８５頁も参照のこと。

　本明細書において狭義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができるイムノグロブリンまたはその集団をいい、その改変体を「抗体の改変体」という。本明細書における狭義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であり得、本明細書における「抗体の改変体」は、上記抗体のＦｃ部分を欠いている改変体であり得る。したがって、本明細書において狭義の抗体は全長抗体とも称され得、抗体の改変体は全長抗体の改変体とも称され得る。Ｆｃ部分を欠いている改変体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような改変体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）_２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また抗体の改変体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。

　本明細書において、「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):86-91.）。

　本明細書において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する同一な抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、および／または同一なエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、"Kohler　G,　Milstein　C.,　Nature.　1975　Aug　7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、"Clackson　et　al.,　Nature.　1991　Aug　15;352(6336):624-628."、または"Marks　et　al.,　J　Mol　Biol.　1991　Dec　5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法によって作製してもよい。

　本開示の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス-ヒトキメラ抗体は、例えば、"Roguska　et　al.,　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　1994　Feb　1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖の
ものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。

　本開示の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（FR）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro　et　al.,　Front　Biosci.　2008　Jan　1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング（Ozaki　et　al.,Blood.1999　Jun1;93(11):3922-3930.）、Re-surfacing　(Roguska　et　al.,　Proc　Natl　Acad　Sci　US　A.1994　Feb　1;91(3):969-973.)、またはFRシャッフル（Damschroder　et　al.,　Mol　Immunol.　2007　Apr;44(11):3049-3060.　Epub　2007　Jan　22.）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Riechmann　et　al.,　Nature.　1988　Mar　24;332(6162):323-327.）。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。

　本開示の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg　et　al.,　Int　Rev　Immunol.1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質（g3p、g10p等）のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan　et　al.,　Nat　Biotechnol.　1996　Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。

　本開示の一実施形態において、本開示の製剤を製造する場合には、本開示の組成物または製剤が投与される被験体（患者）から得た細胞または該被験体から得た細胞に由来する細胞を用いることができる。本開示の一実施形態において、本開示の製剤は、免疫応答を生じさせる被験体自身が生成する抗原、例えば、自己免疫疾患を有する被験体における自己免疫疾患の原因となる被験体自身が生成する抗原である被験体由来の抗原を用いて製造することもできる。本開示の一実施形態において、本開示の製剤は、免疫応答を生じさせ得る外来の抗原である被験体に由来しない抗原を用いて製造することもできる。本開示の一実施形態において、本開示の製剤は、被験体に由来しない抗原を含有する任意の物質または物質の集合物である被験体に由来しない抗原の含有物（ａｎｔｉｇｅｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉａｌ）を用いて製造することもでき、例えば、被験体に由来しない抗原を発現している細胞、細胞集団、組織等が挙げられる。

　臓器、組織または細胞の移植を受けた被験体または患者において、被験体または患者の免疫系が、移植された臓器、組織または細胞に対して攻撃し、損傷または破壊する移植免疫拒絶反応を起こすことが知られており、本開示の一実施形態において、本開示の組成物または製剤はそのような場合にも免疫寛容を引き起こすことができる。

　（好ましい実施形態）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、本明細書中の記載を参酌して、任意の実施形態を組み合わせ得る。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。

＜誘導型抑制性Ｔ細胞製剤＞
　一つの局面において、本開示は、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤およびその用法、用量等の使用法、並びにこれらを用いて生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する技術を提供する。

　一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞は、患者末梢血単核球を、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ８６抗体の存在下で、放射線照射したドナー末梢血単核球と共培養して誘導されることで得られる。本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の構成成分はＴリンパ球を中心とした単核球であり、中でもＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が主である。一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の有効成分は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞（制御性ＣＤ４^＋Ｔ細胞）及びＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞（抑制性ＣＤ８^＋Ｔ細胞）である。理論に縛られるものではないが、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞を臓器移植患者に投与すると、ドナー臓器に発現するＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗原に反応したエフェクターＣＤ４^＋Ｔ細胞とエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞はその活性化を阻害され、新たな制御性ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び抑制性ＣＤ８^＋Ｔ細胞へと誘導される。その結果、ドナーＨＬＡ抗原特異的に免疫拒絶反応が継続的に減弱し、免疫抑制剤の使用量の低減や離脱が可能となることが期待される。

　本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞は、細胞培養加工施設である順天堂大学大学院医学研究科研究基盤センターセルプロセシング室で製造されることができる。

　一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞は、一次包装１バッグ（１００ｍＬ）中に自己由来の誘導型抑制性Ｔ細胞を含む有核細胞が、例えば、約５．０×１０^５個以上、約５．０×１０^６個以上、約５．０×１０^７個以上、約５．０×１０^８個以上、約５．０×１０^９個以上含まれる液剤とすることができる。一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞は、被験者末梢血単核球を抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ８６抗体の存在下で、放射線照射したドナー末梢血単核球と共培養して誘導したものとすることができる。

　一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞は、免疫寛容の誘導効果が奏される限り、貯法や有効期間は特に限られるものではないが、例えば貯法として、約８±３℃、約７±３℃、約６±３℃、約５±３℃、または約４±３℃とすることができる。また有効期間としては、例えば、一次包装完了後約３６時間以内、約３０時間以内、約２４時間以内、約１８時間以内、約１２時間以内、または約６時間以内とすることができる。

　一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の保管用の一次包装されたバッグは、１バッグ／袋で二次包装容器に保管され、更に１バッグ／袋で吸水シートと共に最終包装容器に保管されることができる。一次包装には、「治療用である旨」、「製造番号」、「製品名」、「含有細胞数」、「使用期限」、「保管条件」などが記載されたラベルを貼付することができる。

　本開示では、「免疫寛容を達成するための薬剤」の一例として、「ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子」を挙げることができ、これらには、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、これらの二重抗体の他、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対する阻害因子（例えば、アバタセプトまたはベラタセプト、または本明細書で説明する誘導型抑制性Ｔ細胞）などを挙げることができるがこれらに限定されない。

　本開示では、一例では「抗ＣＤ８０抗体」および「抗ＣＤ８６抗体」に、ＷＯ２０１９／２４５０３７（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０２４７５２）、ＷＯ２０１４／１８６１９３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７１９５）などに記載の抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体をそれぞれ使用することができる。例えば、抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体としては、それぞれキメラ抗ＣＤ８０抗体およびキメラ抗ＣＤ８６抗体を用いてもよい。例えば、抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体としては、それぞれヒト抗ＣＤ８０抗体およびヒト抗ＣＤ８６抗体を用いてもよい。抗ヒトＣＤ８０抗体は、サブクラスＩｇＧ１であってもよい。また抗ヒトＣＤ８６抗体もまた、サブクラスＩｇＧ１であってもよい。抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体をコードするプラスミドを、自己で作製してもよく、外部（例えば、ＴＰＧ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．台湾）に委託してＣＨＯ細胞から発現させ、抗体を産生・精製したものを使用することができる。ＷＯ２０１９／２４５０３７（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０２４７５２）、ＷＯ２０１４／１８６１９３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７１９５）などに具体的に記載されている抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体以外の抗体も使用され得る。

　別の実施形態において、「抗ＣＤ８０抗体」および「抗ＣＤ８６抗体」は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる、任意の阻害因子に置き換え可能である。そのような阻害因子としては、抗ＣＤ８０抗体や抗ＣＤ８６抗体の他、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプトまたはベラタセプト）、ＣＤ２８－Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。ベラタセプトは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹから入手可能である（最終濃度１０μｇ／ｍｌ～４０μｇ／ｍｌ）。

　本開示の一実施形態において、肝移植後の免疫寛容を獲得するための誘導型抑制性Ｔ細胞輸注療法の前処置として、エンドキサンが投与されることができる。エンドキサンとしては、例えば以下のものを用いることができる。
（１）名称
・販売名：注射用エンドキサン　５００ｍｇ
・一般名：注射用シクロホスファミド水和物
（２）組成
　前処置薬として投与する「注射用シクロホスファミド水和物（以下、シクロホスファミド）」は、バイアル１瓶中にシクロホスファミド水和物５３４．５ｍｇ（シクロホスファミド無水物として５００ｍｇに相当）を含む。
（３）貯法
　２８℃（冷蔵庫）で保存
（４）包装及び表示
　シクロホスファミド水和物５３４．５ｍｇを含むバイアルは、１バイアル／箱で白箱に保管される。内包（バイアル）及び外箱（白箱）には、「治療用である旨」、「製造番号」、「識別コード」、「使用期限」、「保管条件」などが記載されたラベルを貼付することができる。

＜品質評価＞
　本開示の一局面において、生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する方法であって、
（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、
（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程と
を含み、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、該薬剤を免疫寛容療法用の薬剤とみなす、方法が提供される。

　一実施形態において、本開示の方法における患者は、事前に免疫抑制剤の投与を受けていてもよいし、受けいていない患者であってもよい。

　一実施形態において、本開示の薬剤は、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子とすることができ、例えば、このような薬剤としては、ベラタセプト、アバタセプト、および以下に説明する誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を挙げることができる。一実施形態において、本開示の薬剤は誘導型抑制性Ｔ細胞製剤とすることができ、この場合、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得ることができる。一実施形態において、本開示の品質評価方法において用いることができる誘導型抑制性Ｔ細胞としては、本開示の他の箇所で説明する誘導型抑制性Ｔ細胞を挙げることができる。

　本開示の一実施形態において、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、前記患者に対する前記免疫寛容療法を変更することができ、例えば、（ｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における炎症誘発性サイトカイン産生が上昇している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させたり、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止したりすることができる。また他の実施形態において、（ｉｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における抗炎症性サイトカイン産生が低下している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させたり、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止したりすることができる。一実施形態において、サイトカイン産生の上昇や低下は、工程（ａ）と工程（ｂ）を比較した場合に、検出可能な差が生じている場合を含むことができる。

　本開示の一実施形態において、末梢血リンパ球はＣＦＳＥで染色していてもよい。また他の実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）において、ドナーから採取された末梢血リンパ球に代えて、ドナーから採取されたＢ細胞を用いることもできる。

　本開示の一実施形態において、免疫抑制剤としては、特に限られるものではないが、例えば、カルシニューリン阻害薬を用いることができ、カルシニューリン阻害薬としては、例えば、タクロリムスまたはシクロスポリンを挙げることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の品質評価方法は、生体肝移植を受けた患者に対して免疫寛容を達成するためのものであり、任意の時点において行うことができるが、例えば、生体肝移植後、少なくとも約２日目以内、約４日目以内、約６日目以内、約８日目以内、または生体肝移植前に行うことができる。また一実施形態において、本開示の方法は、複数回行うこともできる。

　一実施形態において、サイトカインとしては、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１０、ＴＧＦβなどを挙げることができ、このうち、炎症性サイトカインとしては、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などを、抗炎症性サイトカインとしてはＩＬ－１０、ＴＧＦβなどを挙げることができる。

　生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する方法において使用されるサイトカイン産生の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いて、以下のように実施することができる。

１．１．　サンプルの確認
　ＥＬＩＳＡに使用するサンプルは培養上清の情報を確認する。

１．２．　ＥＬＩＳＡ用試薬の調製
　すべての試薬及び使用するサンプルは、使用前に室温に戻しておく。

１．２．１．　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒの調製
　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを蒸留水で２５倍希釈して、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒを調製する。

１．２．２．　Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔの調製
　Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐを蒸留水で５倍希釈して、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）を調製する。

１．２．３．　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０，０００　ｐｇ／ｍＬ）の調製
　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ　Ｓｔａｎｄａｒｄを、バイアルのラベルに記載されている量の蒸留水で融解した後、穏やかに攪拌し、最低１５分間静置し、Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０，０００　ｐｇ／ｍＬ）を調製する。

１．２．４．　スタンダード希釈系列の調製
　Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）　９００　μＬを採取し、Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（１０，０００　ｐｇ／ｍＬ）　１００　μＬと混合し、Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（１，０００　ｐｇ／ｍＬ）を調整する。Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）を用いてＳｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（１，０００　ｐｇ／ｍＬ）を倍々希釈し、２倍希釈系列のスタンダード溶液を調製する。なお、希釈系列溶液の調製にはポリプロピレン製チューブを使用する。Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（１０００　ｐｇ／ｍＬ）は、スタンダードの最高濃度点として使用し、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）はゼロ標準　（Ｂｌａｎｋ）として使用する。

１．２．５．　希釈サンプルの調製
　サンプルをＣａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）で希釈する。均一に混和したサンプルを遠心分離機にセットし、４６０　Ｇ、５分、４℃で遠心分離し、その上清を希釈に用いる。

１．２．６．　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎの調製
　Ｃｏｌｏｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＡとＣｏｌｏｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂを等量で混合し、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製する。調製したＳｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎは遮光保存し、調製後１５分以内に使用する。調製液量は、２００　μＬ／ｗｅｌｌから必要量を算出する。

１．２．７．　Ａｓｓａｙ
１）　一次反応
ａ．　プレートレイアウトを作成する。
ｂ．　必要分のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ＳｔｒｉｐをＰｌａｔｅ　Ｆｒａｍｅにセット（以下、Ａｓｓａｙプレート）する。
ｃ．　ＡｓｓａｙプレートにＡｓｓａｙ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ１－６３を１００　μＬ／ｗｅｌｌ添加する。
ｄ．　ａ．のプレートレイアウトに従い、スタンダード希釈系列、サンプル及びＢｌａｎｋとしてＣａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ５Ｐ　（希釈比１：５）を１００　μＬ／ｗｅｌｌ添加する。なお、本操作はＡｓｓａｙ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ１－６３添加後から１５分以内に完了させる。
ｅ．　Ａｓｓａｙプレートをプレートシールで覆い、２５℃に設定した恒温振とう培養機庫内（室温）に入れ、２時間静置にてインキュベートする。

２）　二次反応
ａ．　Ａｓｓａｙプレートの各ウェルから添加されている溶液を除去し、４００　μＬ／ｗｅｌｌのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで最低４回洗浄する。
ｂ．　Ａｓｓａｙプレートを紙製ワイパーの上で裏返して残っているＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒをすべて除去し、ＩＦＮ－γ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを２００　μＬ／ｗｅｌｌ添加する。新しいプレートシールで覆い、２５℃に設定した恒温振とう培養機庫内（室温）に入れ、２時間静置にて　インキュベートする。

３）　発色
ａ．　Ａｓｓａｙプレートの各ウェルから添加されている溶液を除去し、４００　μＬ／ｗｅｌｌのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで最低４回洗浄する。
ｂ．　Ａｓｓａｙプレートを紙製ワイパーの上で裏返して残っているＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒをすべて除去し、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００　μＬ／ｗｅｌｌを添加する。新しいプレートシールで覆い、２５℃に設定した恒温振とう培養機庫内（室温）に入れ遮光して３０分間静置にて　インキュベートする。
ｃ．　ＡｓｓａｙプレートにＳｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０　μＬ／ｗｅｌｌ添加後、プレートを軽く叩いて攪拌し、ウェル内の溶液の色が青色から黄色に均一に変わっていることを確認する。

４）　測定
ａ．　４５０　ｎｍ／５７０　ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、３０分以内に各ウェルのＯＤを測定する。
ｂ．　測定完了後、ソフトウェア上で検量線が作成され、各サンプルのＩＦＮ－γ量が算出されていることを確認し、上書き保存する。
ｃ．　測定結果を印刷し、データをエクスポートする。

２．　解析
　マイクロプレートリーダーのデータを用いて算出及びグラフ作成を行う。

２．１．　各サンプルのＩＦＮ－γ濃度の比較（ｐｇ／ｍＬ）
　マイクロプレートリーダーのソフトウェア上で算出された各サンプルのＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を比較する。

２．２．　Ａｌｌｏを指標としたＩＦＮ－γ量の割合（％）の比較
　マイクロプレートリーダーのソフトウェア上で算出されたサンプルのＩＦＮ－γ量を用い、ＡｌｌｏのＩＦＮ－γ量を１００％とした場合の各サンプルのＩＦＮ－γ量の割合（％）を算出し、比較する。
　計算式は以下の通りとする。
　各サンプル（Ｎａiｖｅ及びサンプルＮｏ．（１）～（４））のＩＦＮ－γ量÷ＡｌｌｏのＩＦＮ－γ量×１００
　なお、レシピエントとドナーの免疫反応が弱い場合、Ａｌｌｏを指標としたＩＦＮ－γ量の割合（％）の比較が難しいことが予想されるため、４．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した各細胞懸濁液と培地を用いた共培養を実施し、これら培養上清から算出した結果は参考として扱う。

　本開示の一実施形態において、本開示の品質評価方法は、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を利用して行うことができ、ＭＬＲは、一例として、以下のように行うことができる。

　検体の確認
　ＭＬＲ用検体に関する情報（下記項目は一例）を記録する。
・検体識別情報（ＩＤ、製造番号など）
・受領容器
・細胞数
・液量

１．１．１．　ドナー凍結細胞及びレシピエント凍結細胞
　凍結保存したドナー細胞とレシピエント細胞の情報を記録する。

１．２．　ドナー凍結細胞及びレシピエント凍結細胞を解凍する。
１）　解凍する凍結クライオチューブ１～２本に対して、１５ｍＬ遠心管に培地１３ｍＬを分注する。
２）　凍結されたクライオチューブを３７℃のウォーターバスに浸し、半解凍になった時点で引き上げる。
３）　１）で分注した１３ｍＬの培地に解凍した細胞を移す。
４）　遠心分離機に１５ｍＬ遠心管をセットし、４６０Ｇ、５分、４℃で遠心分離する。５）　上清を除去し、適量の培地でペレットを懸濁する。
６）　細胞懸濁液を少量採取し、トリパンブルー溶液で２～１００倍に希釈後、セルカウントする。
７）　６）でカウントした数を基に生細胞濃度を算出する。計算式は以下の通りとする。（４区画合計の生細胞数）÷４×希釈倍率×１０^４＝生細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）

１．１．１．　細胞濃度調整
１）　細胞加工物は、ＣＰＣから提供されるＭＬＲ用検体（細胞加工物）の細胞情報をもとに、培地を用いて任意の細胞濃度に調整することができる。例えば、一実施形態において総細胞濃度２．０×１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬなどに濃度調整することができる。
２）　レシピエント細胞及びドナー細胞は、セルカウントの結果をもとに、培地を用いてそれぞれ任意の生細胞濃度に調整することができる。例えば、一実施形態において生細胞濃度２．０×１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、４．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬなどに濃度調整することができる。

１．２．　共培養の開始
１）　一実施形態において、２．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した各細胞懸濁液と培地を用いて、表２の割合で混合した細胞混合液を調製する（Ｐｌａｔｅ　Ｎｏ．１）。なお、調製は下記の条件で実施する。
２）　一実施形態において、４．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した各細胞懸濁液と培地を用いて、表２の割合で混合した細胞混合液を調製する（Ｐｌａｔｅ　Ｎｏ．２）。なお、調製は下記の条件で実施する。混合の割合ごとにサンプル名を付し、これ以降はサンプル名で識別する。
　混ぜる順番は、どのような順番であってもよい。例えば一実施形態において、レシピエント細胞→細胞加工物→培地→ドナー細胞などとすることができる。
　各細胞懸濁液を１ｗｅｌｌずつ独立に２５０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ丸底プレート３ｗｅｌｌへ播種する。

３）　ＣＯ_２インキュベーターで培養を開始する。

１．１．　培養上清の回収（共培養の終了）
　培養開始から５日経過後に実施する。
１）　培養中の９６ｗｅｌｌ丸底プレートをＣＯ_２インキュベーターから取り出し、コンタミネーションなどの異常が発生していないことを確認し、培養を終了する。
２）　サンプル毎に１ｗｅｌｌにつき２２０μＬの培養上清を１ｗｅｌｌずつ独立に１．５ｍＬエッペンチューブに回収する。
※細胞塊を回収しないよう底面にチップの先端をつけないように注意する
３）　回収した培養上清は、ＥＬＩＳＡのサンプルとして使用する。なお、回収当日にＥＬＩＳＡを実施しない場合は、バイオメディカルフリーザーで凍結保存する。

　上記のようなＭＬＲは、リンパ球の非自己に対する反応性を評価する方法であるため、免疫寛容を誘導する本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の品質を評価するために有用である。例えば、この試験を行うことにより、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の投与後に、患者の移植臓器に対する免疫反応をどの程度抑制できるかを予測することができる。また、一実施形態において、ＭＬＲ試験で使用する患者及びドナー由来のリンパ球は、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の製造の過程で取得されるものを一部分取して使用することができるため、検体採取のために患者及びドナーに追加で負担をかけずに実施することができる。

　本開示の一実施形態において、上記説明したＥＬＩＳＡ法は、従来周知の方法やキットの使用説明書のフローに従って実施することができ、ＭＬＲ法についても、本明細書に記載される事項に加え、従来周知の方法やキットの使用説明書のフローの特徴の一部または全部を適宜利用することができる。

＜誘導型抑制性Ｔ細胞製剤による免疫寛容＞
　本開示の一実施形態において、生体肝移植患者を対象に、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞の輸注後の免疫寛容誘導能（有効性）をＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ達成の有無を指標に評価することができる。

　したがって、本開示の一局面において、患者において免疫寛容を達成するための方法であって、アフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、アフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の連続投与と、該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、該生体肝移植後に、該患者に対して、第二の免疫抑制剤を投与する工程と、該第二の免疫抑制剤の投与後に、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、該副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の投与量を段階的に減量する工程とを含む、方法が提供される。

　また本開示に一実施形態において、前記拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定されることができる。また一実施形態において、前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間経過時点での肝生検により、前記第一の免疫抑制剤の投与中止が最終決定されることもできる。また他の実施形態において、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定されることもできる。

　また本開示の一局面において、患者において免疫寛容を達成するための方法であって、移植１４日前～３日前にアフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、移植１日前にアフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、およびカルシニューリン阻害薬の連続投与と、該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、肝移植後４～６日目に、該患者に対して、２０～５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与する工程と、肝移植後９日～１１日目のいずれかの時点で、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、少なくとも移植後１３週で、該カルシニューリン阻害薬の投与量を減量する工程と、を含み、該拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定され、該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週目の時点での肝生検により、該カルシニューリン阻害薬の投与中止が最終決定され、さらに、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が該カルシニューリン阻害薬の投与中止後５２週以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定されることを特徴とする、方法が提供される。

　本開示の一実施形態において、副腎皮質ステロイドとしては、特に限られるものではないが、例えば、メチルプレドニゾロンを用いることができる。また一実施形態において、代謝拮抗薬としては、特に限られるものではないが、例えば、ミコフェノール酸モフェチルを用いることができる。

　本開示の一実施形態において、第一の免疫抑制剤としては、特に限られるものではないが、例えば、カルシニューリン阻害薬を用いることができ、カルシニューリン阻害薬としては、例えば、タクロリムスまたはシクロスポリンを挙げることができる。また一実施形態において、第二の免疫抑制剤としては、特に限られるものではないが、例えば、シクロホスファミドを挙げることができる。

　本開示の一実施形態において、副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の患者に対する投与は、少なくとも生体肝移植後４週以内に中止することができる。またたの実施形態において、副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の患者に対する投与は、少なくとも生体肝移植後２６週以内に中止することができる。

　本開示の一実施形態において、カルシニューリン阻害薬の患者に対する投与は、少なくとも生体肝移植後７８週以内に中止することができる。

　本開示の一実施形態において、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅの達成は、肝移植後７８週（最大９１週）までに免疫抑制剤から離脱し、その後、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が免疫抑制剤離脱後５２週以上継続している状態と定義することができる。

　本開示の一実施形態において、免疫抑制剤の減量・離脱方法に従い肝移植後２６週以降に減量したときのカルシニューリン阻害薬の減量開始時～離脱時までの投与量の推移、副腎皮質ステロイド及び代謝拮抗薬の離脱持続期間を有効性の副次評価項目として用いることができる。さらに、他の実施形態において、免疫抑制剤、アフェレーシス、シクロホスファミドの安全性を評価することもできる。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤による免疫寛容は、生体肝移植を受ける末期肝不全患者を対象とすることができ、肝移植前観察期間、免疫抑制剤の投与量調整・減量期間、及び免疫抑制剤からの離脱確認期間から構成される。

　本開示の一実施形態において、肝移植前観察期間では、同意取得後、スクリーニング検査を実施すると共にドナーからは肝移植１４日前～３日前までに、被験者からは肝移植前日に、リンフォアフェレーシス法で末梢血単核球を採取することができる。採取した被験者末梢血単核球を、放射線照射して不活化したドナー末梢血単核球（抗原）及び抗ＣＤ８０／抗ＣＤ８６モノクローナル抗体と共に１０日間培養し、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞を誘導することができる。

　一実施形態において、免疫抑制剤の投与量調整・減量期間では、体内リンパ球を一時的に減少させる目的でシクロホスファミド４０ｍｇ／ｋｇ（必要に応じて２０ｍｇ／ｋｇまで減量）を肝移植後５日に投与することができる。その後、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞を、肝移植後１０日に被験者に輸注し、肝移植後７８週（最長９１週）までの本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞による免疫寛容誘導能及び安全性を評価することができる。一実施形態において、被験者は肝移植後少なくとも４週間は入院下で管理することができる。

　一実施形態において、本開示の方法において使用する免疫抑制剤は、特に限られるものではないが、例えば通常の肝移植後に準じる薬剤（副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、カルシニューリン阻害薬など）を用いることができ、本開示の免疫抑制剤の減量・離脱方法に従い減量を行うことができる。

　副腎皮質ステロイド及び代謝拮抗薬ミコフェノール酸モフェチルの投与は、肝移植後４週以内を目標に投与を中止するのが好ましい。ただし、被験者の状態等に応じて医師等の判断により肝移植後４週以内に中止できなかった場合は、カルシニューリン阻害薬の減量開始前までには投与を中止することができる。肝移植後４週からタクロリムスを第一選択とするカルシニューリン阻害薬単剤で免疫抑制を維持し、肝移植後２６週以降は、カルシニューリン阻害薬の減量スケジュールに従い、段階的に減量し、最終的に免疫寛容の獲得による免疫抑制剤からの離脱を行うことができる。一実施形態に係る免疫抑制剤の投与・減量スケジュールは図４に示した。

　一実施形態において、免疫抑制剤からの離脱確認期間では、免疫抑制剤からの離脱後５２週間にわたり、被験者の全身状態、血液生化学検査値等を経時的に観察すると共に、免疫抑制剤から離脱後５２週時に肝生検等により、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ達成の有無を確認することができる。

＜生体肝移植の実施方法＞
　一実施形態において、ドナーの肝グラフト採取術及び被験者の肝移植術、並びにドナーと被験者の術後管理法は各実施医療機関で行われている標準的肝移植術及び術後管理法に準じることができる。一実施形態において、生体肝移植日をＤａｙ０として以降の検査・評価を実施する。

　誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の輸注前処置（エンドキサン投与）
　一実施形態において、エンドキサンは、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤輸注前に被験者のリンパ球を減少させる前処置として使用することができる。医師等は、肝移植後、被験者の全身状態等によりエンドキサン投与の可否を検討し、適格と判断した場合、エンドキサンを肝移植後５日（Ｄａｙ５）に被験者に２３時間かけて点滴静注することができる。一実施形態において、エンドキサンの標準投与量は、約４０ｍｇ／ｋｇとすることができるが、本剤は肝代謝の薬剤であるため、肝移植後の肝機能の推移を確認しながら約２０～約４０ｍｇ／ｋｇの範囲内で用量を調整することもできる。エンドキサンの投与後に骨髄抑制効果白血球減少・好中球減少が大きく出現した症例が報告されているため、他の実施形態において、医師等は過去症例を参考に用量を調整することもできる。

　また一実施形態において、エンドキサンの副作用に対する対応として、次の措置を行うこともできる。

　前処置薬（エンドキサン）の副作用として想定される悪心・嘔吐に対し、予防的にデキサメタゾンを１日目（エンドキサン投与前）に９．９ｍｇ（メチルプレドニゾロン５０ｍｇ相当）、アプレピタント１２５ｍｇ（もしくはホスアプレピタント１５０ｍｇ）、及び５－ＨＴ_３受容体拮抗薬を、２４日目に８ｍｇ（メチルプレドニゾロン４０ｍｇ相当）を投与することができる。なお、アプレピタント（もしくはホスアプレピタント）はＣＹＰ３Ａ４の基質であり軽度から中等度のＣＹＰ３Ａ４阻害（用量依存的）及び誘導作用を有することから、タクロリムスの血中濃度に影響する可能性があるため投与は避けるのが好ましい。また、泌尿器系障害（***，排尿障害等）の発現抑制のためのウロミテキサン投与や、その他の予防的支持療法（抗生物質等の予防的投与）についても実施することができる。

　一実施形態において、エンドキサン投与後に好中球数が１０００／ｍｍ^３未満になった場合、Ｇ－ＣＳＦ製剤を使用することもできる。エンドキサン投与後に誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を投与できなかった場合は、好中球数が１０００／ｍｍ^３未満でなくても、減少傾向が認められ１０００／ｍｍ^３未満になることが予測される場合には、Ｇ－ＣＳＦ製剤の投与を行うことができる。ただし、好中球数が５０００／ｍｍ^３以上に増加した場合は症状に応じて減量、あるいは投与を中止するのが好ましい。

＜誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の輸注＞
　一実施形態において、医師等は、エンドキサン投与後、被験者の全身状態等より誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の輸注の可否を検討し、適格と判断した場合、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を被験者へ輸注することができる。誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の輸注には輸血用フィルターを使用することができ、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の構成細胞は白血球除去フィルターにより除去されるため、使用しないのが好ましい。

　一実施形態において、輸注は、低速度で開始し、被験者の状態を確認しながら、投与速度をあげ、３０分程度で誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の投与を完了することができる。医師等は、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の投与中、被験者の状態を常に観察し、コントロール困難な血圧低下等の症状が出現した場合、直ちに投与を中断し、再開の可否について検討することができる。再開した場合、再度中断を要する状況が起きた場合にはそれ以降の投与を中止することができる。

　＜免疫抑制剤の減量・離脱及びＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ達成の有無の判断各免疫抑制剤の減量・離脱方法（免疫抑制剤の投与量調整・減量期間）＞
　本開示の一局面において、免疫寛容療法における免疫抑制剤の投与量を減量するための方法であって、（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時の投与
　　肝移植後の投与および投与量の減量を行い、所定の期間で投与を終了し、該所定の期間で投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後の投与
　　肝移植後の所定の期間以内に投与を終了する
　　肝移植後所定の期間以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に投与量の増量を可とし、その場合、段階的な減量を行うことを特徴とし、（３）第一の免疫抑制剤については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後所定の期間（投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後の第一の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
　　　肝移植後第一の所定の期間の後の第二の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
をそれぞれ目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（第一の免疫抑制剤の減量期間）
　　肝移植後第一の所定の期間（減量１）では、所定の血中トラフ濃度を維持するように用法・用量を調整する
　　肝移植後第二の所定の期間（減量２）以降は、（減量１）の用量を維持して、投与回数を減量スケジュールに従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、第一の免疫抑制剤の減量期間は延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、方法が提供される。

　本開示の他の局面において、免疫寛容療法における免疫抑制剤を減量するための方法であって、（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時に１０００ｍｇを投与する
　　肝移植後１日から１週間にわたり２０ｍｇ／日を投与する
　　１週間ごとに、５ｍｇ／日ずつ減量し、肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後１日から１日２回に分けて合計５００ｍｇ／日を投与する
　　肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に１０００～２０００ｍｇ／日まで増量を可とし、その場合、段階的な減量は５００ｍｇ／日ずつ行う
　（３）カルシニューリン阻害薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後０日～肝移植後２６週まで（カルシニューリン阻害薬の投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から経口または持続静注で投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後１３週：タクロリムス８～１２ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン２００～３００ｎｇ／ｍＬ
　　　肝移植後１３週～肝移植後２６週：タクロリムス５～８ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン１２５～２００ｎｇ／ｍＬ
を目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（カルシニューリン阻害薬の減量期間）
　　肝移植後２６週（減量１）では、タクロリムス３～５ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン７５～１２５ｎｇ／ｍＬの血中トラフ濃度を維持するように１日１回の投与回数で用法・用量を調整する
　　肝移植後３９週（減量２）以降は、肝移植後２６週（減量１）の用量を維持して、投与回数をカルシニューリン阻害薬の減量スケジュール（減量２：週３回、減量３；週２回、減量４：週１回：減量５：離脱）に従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、カルシニューリン阻害薬の減量期間は、総計１３週間延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、方法が提供される。

　本開示の一実施形態における疫抑制剤の投与量調整・減量期間での免疫抑制剤の投与・減量スケジュールを図４に示す。

　一実施形態において、肝移植後、以下の免疫抑制療法を実施することができる。医師等は、減量・離脱を検討するタイミングで、拒絶反応が認められないことを確認したうえで、各免疫抑制剤の減量・離脱を決定することができる。また、免疫抑制剤による副作用が発現した場合、必要に応じて減量することができる。

　副腎皮質ステロイド（メチルプレドニゾロン等）
　一実施形態において、原則として、肝移植日から被験者の状態に応じて医師等の判断により投与し、肝移植後４週までに投与を中止することが好ましい。肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、肝移植後２６週までに漸減・終了することができる。以下に目安となる投与・減量スケジュールを示す。

　再灌流時メチルプレドニゾロン１０００ｍｇを投与し、肝移植翌日（Ｄａｙ１）からメチルプレドニゾロン２０ｍｇ／日を１週間投与する。副腎皮質ステロイドは１週間を目安に５ｍｇ／日ずつ減量し、肝移植後４週以内を目標に投与を中止する。

　代謝拮抗薬（ミコフェノール酸モフェチル）
　一実施形態において、原則として、肝移植翌日から被験者の状態に応じて医師等の判断により投与し、肝移植後４週までに投与を中止することが好ましい。肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、肝移植後２６週までに漸減・終了することができる。以下に目安となる投与・減量スケジュールを示す。

　肝移植翌日（Ｄａｙ１）からミコフェノール酸モフェチル５００ｍｇ／日（１日２回に分けて）を投与する。約１週間Ｄａｙ７を目標に１０００～２０００ｍｇ／日まで増量し、その後５００ｍｇ／日ごとに段階的に減量し、肝移植後４週以内を目標に投与を中止する。

　カルシニューリン阻害薬（タクロリムスシクロスポリン）
　一実施形態において、カルシニューリン阻害薬はタクロリムスを第一選択とし、副作用等によりタクロリムスが使用できない場合、第二選択としてシクロスポリンを使用することが好ましい。ただし、感染症等によりカルシニューリン阻害薬の一時的な休薬が必要であると医師等が判断した場合、適切な期間、カルシニューリン阻害薬を休止することができる。

　カルシニューリン阻害薬の減量方法は、シクロスポリンカプセルの骨髄移植の場合の用法・用量を参考に設定することができる。血中トラフ濃度の測定は、規定されたカルシニューリン阻害薬投与直前に採血し、測定することができる（少なくとも前回投与から１２時間以上空けて採血・測定）。また、タクロリムスからシクロスポリンへ切り替える際の換算値は、術後経過日数及び被験者の全身状態を考慮して、医師等が総合的に判断して決定することができる。

１）肝移植後０日～２６週までカルシニューリン阻害薬の投与量調整期間）
　一実施形態において、肝移植後０日又は１日（Ｄａｙ０又はＤａｙ１）から経口または持続静注で投与を開始し、肝移植後１３週までは血中トラフ濃度［目標濃度：８～１２ｎｇ／ｍＬ（タクロリムス又は、２００～３００ｎｇ／ｍＬ（シクロスポリン］を維持することができる。肝移植後２６週までは、血中トラフ濃度でタクロリムス５～８ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン１２５～２００ｎｇ／ｍＬを目標に漸減することができる。持続静注を選択した場合、内服可能となった時点から経口投与（１日２回）に切り換えることができる。

　また、カルシニューリン阻害薬としてタクロリムスを投与している場合、医師等は、原則として退院の１週間前を目安に剤型を徐放性製剤に変更し、投与（１日１回）することができる。ただし、タクロリムスの吸収不良や薬物相互作用など医学的な理由により徐放性製剤への変更が難しい場合は、普通製剤の投与を行うことができる。普通製剤を投与する場合は、目標血中トラフ濃度を維持するよう適宜用法・用量を調節し、可能な限り速やかにタクロリムスを徐放性製剤に切り替えるのが好ましい。

２）肝移植後２６週以降（減量期間）
　肝移植後２６週（減量１）では、血中トラフ濃度［目標濃度：３５ｎｇ／ｍＬ（タクロリムス又は、７５１２５ｎｇ／ｍＬ（シクロスポリン）］を維持することができる。また、カルシニューリン阻害薬の投与量調整期間中にタクロリムスを徐放性製剤へ変更できていない場合は、引き続き目標血中トラフ濃度を維持するよう適宜用法・用量を調節し、可能な限り速やかにタクロリムスを徐放性製剤に切り替えることが好ましい。

　肝移植後３９週（減量２）以降は、肝移植後２６週（減量１）の用量を維持して、投与回数を、例えば肝移植後３９週（減量２）では週３回、肝移植後５２週（減量３）では週２回、肝移植後６５週（減量４）では週１回、肝移植後７８週（減量５）に離脱などのように、段階的に減量することができる。シクロスポリンもしくはタクロリムス普通製剤を投与している場合には、血中トラフ濃度を指標に適宜用法・用量を調節し段階的に減量することができる。

　一実施形態において、医師等がカルシニューリン阻害薬の副作用により、カルシニューリン阻害薬の減量が必要と判断した場合は用量を変更することができる。この場合においても次回の来院スケジュールは変更しないこととすることができる。

　一実施形態において、副作用のためにカルシニューリン阻害薬を減量した場合、医師等の判断により、肝移植後７８週（減量５）到達前に免疫抑制剤からの離脱を行うことができる。

３）カルシニューリン阻害薬減量タイミングの延長規定
　一実施形態において、被験者の全身状態等により、カルシニューリン阻害薬の減量が不可又は薬剤（タクロリムスからシクロスポリン）の変更が必要と医師等が判断した場合は、減量のタイミングを総計１３週間延長することができる。減量延長の回数に制限はないが、総延長期間が１３週を超えた場合は、その時点で、免疫抑制剤の離脱を目的とした減量を中止し、被験者に必要な治療を行うことができる。

＜免疫抑制剤（カルシニューリン阻害薬）からの離脱後５２週の離脱持続の有無（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ達成の評価）＞
　一実施形態において、免疫抑制剤（カルシニューリン阻害薬）からの離脱後５２週間にわたり、被験者の全身状態、血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、免疫抑制剤から離脱後５２週時点での肝生検等より、免疫抑制剤からの離脱を最終確認することができる。また、一実施形態において、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が免疫抑制剤離脱後５２週以上継続している場合、当該症例をＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ達成と判断することができる。

＜拒絶反応の定期確認、診断及び治療とその後の対応拒絶反応の定期確認（肝生検）＞
　本開示の一局面において、免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、組織診断を行うステップ、ならびに該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が所定の中止基準のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップを包含する、方法が提供される。

　また本開示の他の局面において、免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後２６週、減量５の４週後および５２週後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、Ｂａｎｆｆ基準（２０１６年）およびＶｅｎｔｕｒｉ（２０１２年）のスコア化に準じた組織診断を行うステップ、ならびに該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が「中等度以上」、慢性拒絶反応の全体的評価が「あり」、及び肝線維化のスコアが「２以上」のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップを包含する、方法が提供される。

　免疫抑制剤の減量・離脱時には、肝機能検査が正常でも肝線維化や慢性拒絶の存在があり得る。このため、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認することができる。また、肝生検は肝生検後の被験者の安全性を考慮して入院下（１泊）で実施することができる。

　一実施形態において、肝移植後２６週、減量５の４週後及び５２週後に定期的な肝生検を行うことができる。また、肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取することができる。拒絶反応の中央病理学的診断用として肝組織を１６Ｇの肝生検用の針を用いて１検体分採取し、拒絶反応の組織診断を行うことができる。

　一実施形態において、肝生検で採取した組織検体の組織診断は、Ｂａｎｆｆ基準（２０１６年）及びＶｅｎｔｕｒｉ（２０１２年）のスコア化に準じ、次の評価を行うことができる。

（１）Ｂａｎｆｆ基準（２０１６年）
　急性拒絶反応
　門脈域及び中心静脈周囲の炎症の程度に基づき、全体的評価を行う。さらに、門脈域炎症、胆管の炎症性傷害、及び静脈内皮炎を表３の基準でスコア化し、その合計点をＲｅｊｅｃｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ　ＲＡＩとして表現する。

　慢性拒絶反応
　胆管消失の程度、中心静脈線維化の程度、動脈消失の程度、及びその他の評価の結果
を表４の基準に従って評価し、この評価結果を基に全体的評価を行う。＊印は通常、摘出肝でのみ観察される構造である。

（２）Ｖｅｎｔｕｒｉ（２０１２年）のスコア化
　移植された肝臓の線維化の程度を表５の基準に従いスコア化する。

（３）組織診断結果で急性拒絶反応の全体的評価が「中等度以上」、慢性拒絶反応の全体的評価が「あり」、及び肝線維化のスコアが「２以上」のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始することができる。

　拒絶反応の確認
　肝移植後の規定来院及び規定外来院時に拒絶反応を確認することができる。以下に確認手順の目安を示す。

１）身体所見
　発熱や全身倦怠感等がある。
２）血液生化学検査
　Ｔ－Ｂｉｌ／ＡＳＴ／ＡＬＴ／γ－ＧＴＰのいずれかが直近の来院時データより２倍以上上昇している。ただし、２倍以上であっても施設基準値以内の場合は安定した肝機能値であると判断する。
３）肝生検と病理学的診断
　上記１）、２）の異常が認められ、拒絶反応が疑われた場合、肝生検及び組織診断を実施医療機関内で行うことを可能とする。
４）拒絶反応の診断
　病理学的に治療すべき拒絶反応の有無の判断を行う。３）の結果から拒絶反応の有無を判断する。

　「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と診断した場合、直ちに拒絶反応に対する治療を開始することができる。

　参考文献
　以下の参考文献は、実施例等において基本技術として参照したものであり、これらの文献が本開示に対して先行技術を構成することを認めるものではない。これらの内容は参考として援用される。
1.　Bashuda　H,　Kimikawa　M,　Seino　K,　Kato　Y,　Ono　F,　Shimizu　A,　et　al.　Renal　allograft　rejection　is　prevented　by　adoptive　transfer　of　anergic　T　cells　in　nonhuman　primates.　The　Journal　of　clinical　investigation.　2005;115(7):1896-902.
2.　Bashuda　H,　Shimizu　A,　Uchiyama　M,　Okumura　K.　Prolongation　of　renal　allograft　survival　by　anergic　cells:　advantages　and　limitations.　Clin　Transplant.　2010;24　Suppl　22:6-10.
3.　Luo　Z,　Gotoh　M,　Grochowiecki　T,　Tanaka　T,　Kimura　F,　Kawashima　H,　et　al.　Anergic　T　cells　generated　in　vitro　suppress　rejection　response　to　islet　allografts.　Transplantation.　2000;69(10):2144-8.
4.　Miyao　T,　Floess　S,　Setoguchi　R,　Luche　H,　Fehling　HJ,　Waldmann　H,　et　al.　Plasticity　of　Foxp3(+)　T　cells　reflects　promiscuous　Foxp3　expression　in　conventional　T　cells　but　not　reprogramming　of　regulatory　T　cells.　Immunity.　2012;36(2):262-75.
5.　Davies　JK,　Barbon　CM,　Voskertchian　A,　Nadler　LM,　Guinan　EC.　Ex　vivo　alloanergization　with　belatacept:　a　strategy　to　selectively　modulate
　alloresponses　after　transplantation.　Cell　transplantation.　2012;21(9):2047-61.
6.　Davies　JK,　Gribben　JG,　Brennan　LL,　Yuk　D,　Nadler　LM,　Guinan　EC.　Outcome　of　alloanergized　haploidentical　bone　marrow　transplantation　after　ex　vivo　costimulatory　blockade:　results　of　2　phase　1　studies.　Blood.　2008;112(6):2232-41.
7.　Davies　JK,　Nadler　LM,　Guinan　EC.　Expansion　of　allospecific　regulatory　T　cells　after　anergized,　mismatched　bone　marrow　transplantation.　Science　translational　medicine.　2009;1(1):1-3.
8.　Davies　JK,　Yuk　D,　Nadler　LM,　Guinan　EC.　Induction　of　alloanergy　in　human　donor　T　cells　without　loss　of　pathogen　or　tumor　immunity.　Transplantation.　2008;86(6):854-64.

　（注記）
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下に実施例を記載する。以下の実施例で用いるヒトの取り扱いは、同意を取得した上で、必要な場合、監督官庁で規定される基準およびヘルシンキ宣言にのっとり、ＩＣＨの基準を尊重し、順天堂大学にて規定される倫理規定に従い、ＧＣＰに基づいて行った。ヘルシンキ宣言やＩＣＨで提唱されている基準ならびに順天堂大学倫理委員会が規定する各種基準を遵守する。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（富士レビオ株式会社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、など）の同等品でも代用可能である。

（実施例１：ＭＬＲおよびＩＦＮ－γ定量ＥＬＩＳＡ）
　凍結保存していたドナー由来細胞を解凍し、培地で２．０ｘ１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。同様に、凍結していた患者由来細胞を解凍し、培地で２．０ｘ１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。
　細胞加工物を培地で２．０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、以下の割合で細胞を混合した。
１．患者由来細胞のみ
２．患者由来細胞：ドナー由来細胞＝１：１
３．患者由来細胞：ドナー由来細胞：細胞加工物＝１：１：１／２
４．患者由来細胞：ドナー由来細胞：細胞加工物＝１：１：１／４
５．患者由来細胞：ドナー由来細胞：細胞加工物＝１：１：１／８
６．患者由来細胞：ドナー由来細胞：細胞加工物＝１：１：１／１６

　３７℃で５日間培養し、培養上清を回収した。その培養上清を５倍希釈し、ＥＬＩＳＡにてＩＦＮｇ量を測定した。ＩＦＮｇ濃度をもとに、上記２．の群を１００％としての割合を計算した。結果を図１Ａ～Ｃに示した。

　図１Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ独立した３回の製造での結果を示す。各図の左側のグラフはＥＬＩＳＡにより測定したＩＦＮｇ濃度を、右側のグラフは患者由来細胞とドナー由来細胞のみを混合培養した群（Ａｌｌｏ）の培養上清中ＩＦＮｇ濃度を１００％とした場合の割合を示す。

　図１Ａの製造例では、細胞加工物を加えてもＩＦＮｇの放出を抑制できておらず、細胞加工物の免疫反応抑制能が低いことが示唆される。図１ＢおよびＣでは、細胞加工物の存在比が大きいほどＩＦＮｇ濃度が少なくなっており、細胞加工物の免疫反応抑制能が高いと考えられる。

（実施例２：生体肝移植および免疫抑制）
　本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を用いて、生体肝移植後の患者の免疫抑制剤の減量を達成するための全体像を図２に示した。ドナーおよび患者（レシピエント）からそれぞれリンパ球を採取し、ＣＤ８０及びＣＤ８６抗体と共培養することで、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を得る。ＣＤ８０及びＣＤ８６抗体としては、ＷＯ２０１９／２４５０３７に開示の抗体を用いる。その後、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞製剤を、生体肝移植後の患者に投与し、免疫抑制剤の減量を行う。

　生体肝移植から免疫抑制剤の減量までのスケジュールは図３Ａ～Ｃのようにして行う。図３Ａ及びＢに患者のスケジュールを、図３Ｃにドナーのスケジュールをそれぞれ示した。

　免疫抑制剤の投与・減量（免疫抑制剤の投与量調整・減量期間）は、図４のスケジュールに従って行う。その後、免疫抑制剤の離脱を達成できたかどうかを確認する。

（実施例３：免疫寛容予測）
　移植前の患者及びドナーより、血液を約４０ｍＬずつ採取し、血球細胞を分離する。一部の血球細胞は凍結して後のＭＬＲ試験に用いる。

　患者由来血球細胞と、放射線を照射したドナー由来血球細胞とを、ＣＤ８０及びＣＤ８６抗体と共培養することで、本開示の誘導型抑制性Ｔ細胞を得る。ＣＤ８０及びＣＤ８６抗体としては、ＷＯ２０１９／２４５０３７に開示の抗体を用いる。
　得られた誘導型抑制性Ｔ細胞の抑制能をＭＬＲで評価する。

　上記の試験を実施することで、実際に誘導型抑制性Ｔ細胞の製造を行う前に、製造された誘導型抑制性Ｔ細胞の、ドナー細胞に対する反応性および／または抑制能を予測することが可能となる。これにより、誘導型抑制性Ｔ細胞の製造を行うかどうか、または誘導型抑制性Ｔ細胞の投与を行うかどうかの指標とすることができる。

（実施例４：生体肝移植および免疫抑制）
　生体肝移植後の患者の免疫抑制を確認した。
　患者は、生体肝移植後１０日目に誘導型抑制性Ｔ細胞を投与され、投与に伴う重篤な有害事象は発症しなかった。免疫抑制剤はプロトコルに準じて、移植後１カ月以内にステロイド、カルシニューリン阻害剤（タクロリムス）、代謝拮抗薬（セルセプト）から、タクロリムス徐放性製剤１種類に減量でき、移植後３６日目に退院となった。

　移植後６カ月間は臨床的にも病理学的にもグラフト傷害は認めなかったため、積極的に免疫抑制剤を減量するステージへと進んだ。免疫抑制剤は３カ月毎に７回／週→３回／週→２回／週→１回／週→０回／週の順に減量し、移植後６２８日目に完全に減量中断することが可能であった。また、免疫抑制剤中断後４週間目の肝生検を実施し、Ｂａｎｆｆ基準で評価された結果、潜在的な病理学的拒絶反応の所見は認めず、安全に免疫寛容を誘導できていることが示唆された。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様に、その内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２２年３月３１日に出願された特願２０２２－６０１６５に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示は、誘導型抑制性Ｔ細胞製剤の品質を評価する方法を提供し、免疫寛容療法に関する各種技術を提供する。

Claims

　生体肝移植を受けた患者に投与される免疫寛容を達成するための薬剤の品質を評価する方法であって、
（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、
（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程と
を含み、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、該薬剤を免疫寛容療法用の薬剤とみなす、方法。
　前記患者が免疫抑制剤の投与を受けている、請求項１に記載の方法。
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、請求項１または２に記載の方法。
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、前記患者に対する前記免疫寛容療法を変更することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　（ｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における炎症誘発性サイトカイン産生が上昇している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止し、及び／または
　（ｉｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における抗炎症性サイトカイン産生が低下している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止することを特徴としする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記末梢血リンパ球がＣＦＳＥで染色される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）および（ｂ）において、前記ドナーから採取された末梢血リンパ球に代えて、前記ドナーから採取されたＢ細胞を用いることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記生体肝移植後、少なくとも約３日～約６日目以内に行われることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１０、及び／またはＴＧＦβを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
　患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
　アフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、
　アフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、
　該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、第二の免疫抑制剤を投与する工程と、
　該第二の免疫抑制剤の投与後に、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、
　該副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の投与量を段階的に減量する工程と
を含む、方法。
　前記拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定され、
　前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間経過時点での肝生検により、前記第一の免疫抑制剤の投与中止が最終決定され、
　さらに、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が前記第一の免疫抑制剤の投与中止後所定の期間以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定される
ことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
　患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
　移植１４日前～３日前にアフェレーシスによりドナーからリンパ球を収集する工程と、
　移植１日前にアフェレーシスにより患者からリンパ球を収集する工程と、
　該ドナー由来の肝臓またはその一部を該患者に対して生体肝移植する工程と、
　該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、およびカルシニューリン阻害薬の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
　肝移植後４～６日目に、該患者に対して、２０～５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与する工程と、
　肝移植後９日～１１日目のいずれかの時点で、該患者に対して、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤を投与する工程と、
　少なくとも移植後１３週で、該カルシニューリン阻害薬の投与量を減量する工程と、
を含み、
　該拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検によって、免疫寛容の達成が確認されるか、または従来の免疫抑制療法への移行を行うかが決定され、
　該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週にわたり、患者の全身状態、および／または血液生化学検査値を経時的に観察すると共に、該カルシニューリン阻害薬の投与中止後少なくとも５２週目の時点での肝生検により、該カルシニューリン阻害薬の投与中止が最終決定され、
　さらに、安定した肝機能値かつ肝生検で病理学的に治療すべき拒絶反応を確認できない状態が該カルシニューリン阻害薬の投与中止後５２週以上継続している場合、該患者が、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅを達成したと決定される
ことを特徴とする、方法。
　前記副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後４週以内に中止される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
　前記副腎皮質ステロイドおよび代謝拮抗薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後２６週以内に中止される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　前記カルシニューリン阻害薬の前記患者に対する投与が、少なくとも前記生体肝移植後７８週以内に中止される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
　免疫寛容療法における免疫抑制剤の投与量を減量するための方法であって、
　（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時の投与
　　肝移植後の投与および投与量の減量を行い、所定の期間で投与を終了し、該所定の期間で投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後の投与
　　肝移植後の所定の期間以内に投与を終了する
　　肝移植後所定の期間以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に投与量の増量を可とし、その場合、段階的な減量を行うことを特徴とし、
　（３）第一の免疫抑制剤については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後所定の期間（投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後の第一の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
　　　肝移植後第一の所定の期間の後の第二の所定の期間の所定の血中トラフ濃度
をそれぞれ目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（第一の免疫抑制剤の減量期間）
　　肝移植後第一の所定の期間（減量１）では、所定の血中トラフ濃度を維持するように用法・用量を調整する
　　肝移植後第二の所定の期間（減量２）以降は、（減量１）の用量を維持して、投与回数を減量スケジュールに従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、第一の免疫抑制剤の減量期間は延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、
方法。
　免疫寛容療法における免疫抑制剤を減量するための方法であって、
　（１）副腎皮質ステロイドについては、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　再灌流時に１０００ｍｇを投与する
　　肝移植後１日から１週間にわたり２０ｍｇ／日を投与する
　　１週間ごとに、５ｍｇ／日ずつ減量し、肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　（２）代謝拮抗薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　肝移植後１日から１日２回に分けて合計５００ｍｇ／日を投与する
　　肝移植後４週以内に投与を終了する
　　肝移植後４週以内に投与を終了できなかった場合は、任意の減量方法を用いて肝移植後２６週までに投与を終了する
　　必要に応じて、肝移植後１週間を目標に１０００～２０００ｍｇ／日まで増量を可とし、その場合、段階的な減量は５００ｍｇ／日ずつ行う
　（３）カルシニューリン阻害薬については、以下のスケジュールに従って投与する工程と、
　　（３－１）肝移植後０日～肝移植後２６週まで（カルシニューリン阻害薬の投与量調整期間）
　　肝移植当日又は肝移植後１日から経口または持続静注で投与を開始し、以下の血中トラフ濃度：
　　　投与開始～肝移植後１３週：タクロリムス８～１２ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン２００～３００ｎｇ／ｍＬ
　　　肝移植後１３週～肝移植後２６週：タクロリムス５～８ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン１２５～２００ｎｇ／ｍＬ
を目標とする
　　（３－２）肝移植後２６週以降（カルシニューリン阻害薬の減量期間）
　　肝移植後２６週（減量１）では、タクロリムス３～５ｎｇ／ｍＬ、又はシクロスポリン７５～１２５ｎｇ／ｍＬの血中トラフ濃度を維持するように１日１回の投与回数で用法・用量を調整する
　　肝移植後３９週（減量２）以降は、肝移植後２６週（減量１）の用量を維持して、投与回数をカルシニューリン阻害薬の減量スケジュール（減量２：週３回、減量３；週２回、減量４：週１回：減量５：離脱）に従い、段階的に減量する、
　　（３－３）必要に応じて、カルシニューリン阻害薬の減量期間は、総計１３週間延長される、
　を含み、各減量は、拒絶反応が存在しないことが確認された場合に実行される、方法。
　前記拒絶反応は、
　（１）発熱または全身倦怠感などの身体所見、および／または
　（２）血液生化学検査における、Ｔ－Ｂｉｌ／ＡＳＴ／ＡＬＴ／γ－ＧＴＰのいずれかの、直近の来院時データからの２倍以上の上昇
によって存在しているか否かが決定される、請求項１９または２０に記載の方法。
　免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、
　肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、組織診断を行うステップ、ならびに
　該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が所定の中止基準のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップ
を包含する、方法。
　免疫寛容療法において、定期的な肝生検により拒絶反応の有無を確認するための方法であって、
　肝移植日にコントロール用の肝組織を移植肝から採取された検体、ならびに肝移植後２６週、減量５の４週後および５２週後の定期的な肝生検から得られた検体に対して、Ｂａｎｆｆ基準（２０１６年）およびＶｅｎｔｕｒｉ（２０１２年）のスコア化に準じた組織診断を行うステップ、ならびに
　該組織診断の結果で急性拒絶反応の全体的評価が「中等度以上」、慢性拒絶反応の全体的評価が「あり」、及び肝線維化のスコアが「２以上」のいずれかの結果を得た場合、「病理学的に治療すべき拒絶反応あり」と判断し、直ちに拒絶反応に対する治療を開始し、免疫寛容療法を中止する、ステップ
を包含する、方法。
　品質が評価された免疫寛容を達成するための薬剤を用いて、生体肝移植を受けた患者において免疫寛容を達成するための方法であって、
（ａ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球とを混合培養する工程と、
（ｂ）該生体肝移植前の患者から採取された末梢血リンパ球と、該生体肝移植のドナーから採取された末梢血リンパ球と、該患者において免疫寛容を達成するための薬剤とを混合培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）におけるサイトカイン産生を測定する工程と、
（ｄ）該生体肝移植後に、該患者に対して、以下：
　副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の連続投与と、
　該生体肝移植への拒絶反応に対する免疫モニタリングおよび／または定期的な肝生検とを行う工程と、
（ｅ）該生体肝移植後に、該患者に対して、第二の免疫抑制剤を単回投与する工程と、
（ｆ）該第二の免疫抑制剤の投与後に、該患者に対して、工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している薬剤を投与する工程と、
　該副腎皮質ステロイド、代謝拮抗薬、および第一の免疫抑制剤の投与量を段階的に減量する工程と
を含む、方法。
　前記患者が免疫抑制剤の投与を受けている、請求項２４に記載の方法。
　前記薬剤が、ある細胞の細胞表面に発現するＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、他の細胞の細胞表面に発現するＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子である、請求項２４または２５に記載の方法。
　前記薬剤が誘導型抑制性Ｔ細胞製剤であり、該誘導型抑制性Ｔ細胞製剤は、前記生体肝移植の患者およびドナー由来の末梢血リンパ球を、ＣＤ８０抗体および／またはＣＤ８６抗体の存在下で共培養することで得られる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）におけるサイトカイン産生が変化している場合に、前記患者に対する前記免疫寛容療法を変更することを特徴とする、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
　（ｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における炎症誘発性サイトカイン産生が上昇している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止し、及び／または
　（ｉｉ）工程（ａ）に比べて、工程（ｂ）における抗炎症性サイトカイン産生が低下している場合に、前記患者に投与する免疫抑制剤の量を増加させ、及び／または前記患者に対する免疫寛容療法を中止することを特徴としする、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
　前記末梢血リンパ球がＣＦＳＥで染色される、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）および（ｂ）において、前記ドナーから採取された末梢血リンパ球に代えて、前記ドナーから採取されたＢ細胞を用いることを特徴とする、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
　前記生体肝移植後、少なくとも約３日～約６日目以内に行われることを特徴とする、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。
　前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１０、及び／またはＴＧＦβを含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。