TW202015710A - 使用具有複合狀態之細胞混合物之誘導免疫耐受之抗體、及被誘導之淋巴球、以及使用被誘導之淋巴球之細胞治療劑及治療法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制之醫藥組合物。本發明提供一種包含CD4陽性失能T細胞與CD8陽性失能T細胞之醫藥組合物。於若干實施形態中，失能T細胞係藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體所誘導。於特定之實施形態中，醫藥組合物可進而包含控制性T細胞(例如，FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性T細胞)。

Description

使用具有複合狀態之細胞混合物之誘導免疫耐受之抗體、及被誘導之淋巴球、以及使用被誘導之淋巴球之細胞治療劑及治療法
本發明係關於一種與免疫耐受相關之新穎技術。更特定而言，本發明係關於一種包含失能T細胞之醫藥組合物、該醫藥組合物之製造、及該醫藥組合物之品質管理。
肝臟移植廣泛用作針對晚期肝衰竭之患者之最終處置。每年日本以外有20,000以上之病例，日本有超過500之病例。
移植係針對晚期之腎臟、心臟、肝臟、胰腺之器官衰竭所選擇之主要處置之一，近年來儘管移植排斥反應之處置取得顯著進步，但若無免疫抑制療法，則移植之大部分最終會被排斥。依賴連續之藥物療法之目前之免疫抑制療法由於係藉由藥物抑制全部免疫反應而非僅抑制明確針對移植之反應，故而器官移植患者容易增加對傳染病或癌之敏感性。
再生醫療亦受到關注，但即便使用誘導性多能性幹細胞(iPS細胞)等，只要非源自自體之細胞，則最終亦存在發生免疫排斥反應之可能性，因此免疫耐受之技術受到關注。
作為該誘導免疫耐受之技術，有T細胞之抗原特異性之免疫不應答(失能)之誘導。具體而言，報告有如下技術：將抑制抗原呈現細胞上之CD80/CD86與未活化(初始)T細胞上之CD28之相互作用的抗體直接投予至器官移植患者，而於體內誘導供給者抗原特異性失能(專利文獻1)；或者於相同抗體之存在下將接受者細胞與經放射線照射之供給者細胞共培養，藉此於體外誘導供給者抗原特異性失能細胞，並將其送返至接受者中(專利文獻2、專利文獻3及非專利文獻1~3)。
據非專利文獻1報告，於在體外誘導供給者抗原特異性失能細胞並放回至接受者中之技術中，即便將CD8陽性細胞去除，亦幾乎不會影響免疫抑制。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特表2002-504120號公報 專利文獻2：日本專利特表2007-131598號公報 專利文獻3：日本專利特表2016-520081號公報 非專利文獻
非專利文獻1：Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64(vol.2), 632-643 (2016) 非專利文獻2：Teraoka S, Koyama I, Bashuda H, Uchida K, Tonsho M, et al. (2017) J Transplant Res 2(1) p1-8 非專利文獻3：Bashuda H et al., J. Clin. Invest. 115:1896-1902 (2005).
[解決問題之技術手段]
本發明者等人首次發現，即便使用抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子誘導T細胞之失能，於經誘導失能之T細胞之混合物中不存在CD8陽性細胞之情形時，與存在CD8陽性細胞之情形相比，誘導免疫耐受之能力亦顯著降低。本發明者等人發現，為了誘導免疫耐受，CD8陽性細胞發揮重要之作用。
因此，本發明提供以下。 (1)一種醫藥組合物，其包含CD4陽性失能T細胞與CD8陽性失能T細胞。 (2)如上述項目所記載之醫藥組合物，其中上述失能T細胞係藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子所誘導。 (3)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (4)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (5)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (6)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (7)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (8)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (9)如項目1至8中任一項所記載之醫藥組合物，其進而包含控制性T細胞。 (10)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。 (11)一種醫藥組合物，其包含由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞，且該組合物包含CD8陽性細胞，進而，該組合物包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。 (12)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。 (13)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。 (14)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述CD8陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。 (15)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。 (16)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。 (17)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述醫藥組合物用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。 (18)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。 (19)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述細胞係藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。 (20)一種醫藥組合物，其包含如上述項目之任一項所記載之組合物，用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (21)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。 (22)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其特徵在於：上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。 (23)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其中上述抗原含有物為細胞。 (24)一種製造包含細胞之醫藥之方法，該方法包括如下步驟： (A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合； (B)確認由該混合獲得之細胞產物包含CD8陽性細胞；及 (C)確認該細胞產物包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞。 (25)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (26)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (27)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (28)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (29)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (30)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (31)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞產物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞產物可用作醫藥。 (32)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (33)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述步驟(B)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(C)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。 (34)如上述項目之任一項所記載之方法，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS實施。 (35)一種管理醫藥品質之方法，該醫藥包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該方法包括如下步驟：(A)確認該細胞包含CD8陽性細胞；及(B)確認該細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞。 (36)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述步驟(A)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(B)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。 (37)如上述項目之任一項所記載之方法，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting，螢光流式細胞分選)、西方墨點法、或PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈鎖反應)實施。 (38)一種用於製造如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物之組合物，其包含抑制因子，且該抑制因子為可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子。 (39)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (40)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (41)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (42)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (43)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (44)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (45)一種套組，其係用於製造包含細胞之混合物之醫藥者，其包含(A)可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、(B)用以檢測CD8之機構、及(C)用以檢測FOXP3及CD4之至少一者之機構。 (46)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (47)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (48)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (49)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (50)如上述項目之任一項所記載之套組或方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (52)如上述項目之任一項所記載之套組或方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (53)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述細胞之混合物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞之混合物可用作醫藥。 (54)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (55)一種用於管理醫藥品質之套組，該醫藥包含用以處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該套組包含(A)用以檢測CD8之機構、及(B)用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構。 (56)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述用以檢測CD8之機構包含抗CD8抗體，用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構包含抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體。 (57)如上述項目之任一項所記載之套組，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS、西方墨點法、或PCR進行。 (B1) 一種醫藥組合物，其用以與CD4陽性失能細胞一起使用而誘發免疫耐受，且包含CD8陽性失能T細胞。 (B2) 如項目B1所記載之醫藥組合物，其進而具有如上述項目1至57或其他項目中任一項所示之1個或複數個特徵。 (C1) 一種醫藥組合物，其係用以與CD8陽性失能細胞一起使用而誘發免疫耐受，且包含CD4陽性失能T細胞。 (C2) 如項目B1所記載之醫藥組合物，其進而具有如上述項目1至57或其他項目中任一項所示之1個或複數個特徵。 (D1) 一種處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之方法，其包括將CD4陽性失能T細胞、 及CD8陽性失能T細胞以有效量投予至該受驗體之步驟。 (D2) 如上述項目所記載之方法，其中上述失能T細胞係由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體誘導。 (D3)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (D4)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (D5)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (D6)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (D7)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (D8)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (D9)如項目1至8中任一項所記載之醫藥組合物，其進而包括投予控制性T細胞之步驟。 (D10)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。 (D11)一種處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之方法，該方法包括將由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞以有效量投予至該受驗體之步驟，該經誘導失能之細胞包含CD8陽性細胞，進而，該經誘導失能之細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。 (D12)如上述項目之任一項所記載之方法，其包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。 (D13)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。 (D14)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CD8陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。 (D15)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。 (D16)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。 (D17) 如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述經誘導失能之細胞誘發抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。 (D18)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。 (D19)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞係藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。 (D20)一種用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之方法，其包含如上述項目之任一項所記載之組合物。 (D21)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。 (D22)如上述項目之任一項所記載之方法，其特徵在於：上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。 (D23)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗原含有物為細胞。 (E1)一種CD4陽性失能T細胞及CD8陽性失能T細胞之用途，其係用於製造用以處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之醫藥。 (E2)如上述項目所記載之用途，其中上述失能T細胞係由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體誘導。 (E3)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (E4)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (E5)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (E6)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (E7)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (E8)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (E9)如項目1至8中任一項所記載之用途，其中上述CD4陽性失能T細胞及CD8陽性失能T細胞進而包含控制性T細胞。 (E10)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。 (E11)一種由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞之用途，其係用於製造處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之醫藥，且該經誘導失能之細胞包含CD8陽性細胞，該經誘導失能之細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。 (E12)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述經誘導失能之細胞包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。 (E13)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。 (E14)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CD8陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。 (E15)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。 (E16)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。 (E17)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述經誘導失能之細胞誘發抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。 (E18)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。 (E19)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述經誘導失能之細胞係藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。 (E20)一種用以處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態之用途，其包含如上述項目之任一項所記載之組合物。 (E21)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。 (E22)如上述項目之任一項所記載之用途，其特徵在於：上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。 (E23)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抗原含有物為細胞。 (F1)一種CD4陽性失能T細胞及CD8陽性失能T細胞之細胞混合物，其係用以處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (F2)如上述項目所記載之細胞混合物，其中上述失能T細胞係由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體誘導。 (F3)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。 (F4)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。 (F5)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。 (F6)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。 (F7)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。 (F8)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。 (F9)如項目1至8中任一項所記載之細胞混合物，其進而包含控制性T細胞。 (F10)如上述項目之任一項所記載之細胞混合物，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。 (F11)一種經誘導失能之細胞，其係由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能者，且用以處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態，該經誘導失能之細胞包含CD8陽性細胞，該經誘導失能之細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。 (F12)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。 (F13)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。 (F14)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述CD8陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。 (F15)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。 (F16)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。 (F17)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其誘發抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。 (F18)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。 (F19)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述經誘導失能之細胞係藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。 (F20)一種經誘導失能之細胞，其係用以處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態，且包含如上述項目之任一項所記載之組合物。 (F21)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。 (F22)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其特徵在於：上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。 (F23)如上述項目之任一項所記載之經誘導失能之細胞，其中上述抗原含有物為細胞。 本發明亦提供以下。 (G1)一種醫藥組合物，其包含 CD4陽性失能T細胞、及 CD8陽性失能T細胞。 (G2)如上述項目所記載之組合物，其中上述失能T細胞係由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體誘導。 (G3)如上述項目之任一項所記載之醫藥組合物，其進而包含控制性T細胞。 (G4)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。 (G5)一種醫藥組合物，其包含由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體誘導失能之細胞，且該組合物包含CD8陽性細胞，進而，該組合物包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。 (G6)如上述項目之任一項所記載之組合物，其包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。 (G7)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。 (G8)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。 (G9)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。 (G10)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述醫藥組合物用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。 (G11)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。 (G12)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述細胞係藉由將上述抗體、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。 (G13)一種醫藥組合物，其包含如項目G1至G12中任一項所記載之組合物，用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (G14)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。 (G15)如項目G14所記載之組合物，其特徵在於：上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。 (G16)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抗原含有物為細胞。 (G17)一種製造包含細胞之醫藥之方法，該方法包括如下步驟： (A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合； (B)確認由該混合獲得之細胞產物包含CD8陽性細胞；及 (C)確認該細胞產物包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞。 (G18)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞產物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞產物可用作醫藥。 (G19)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (G20)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述步驟(B)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(C)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。 (G21)如上述項目之任一項所記載之方法，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS實施。 (G22)一種管理醫藥品質之方法，該醫藥包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該方法包括 (A)確認該細胞包含CD8陽性細胞之步驟、及 (B)確認該細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之步驟。 (G23)如項目G22所記載之方法，其中上述步驟(A)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(B)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。 (G24)如上述項目之任一項所記載之方法，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS、西方墨點法、或PCR實施。 (G25)一種用於製造包含細胞之混合物之醫藥的套組，該套組包含 (A)可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、 (B)用以檢測CD8之機構、及 (C)用以檢測FOXP3及CD4之至少一者之機構。 (G25A)一種用於管理包含細胞之混合物之醫藥品質之套組，該套組包含 (A)用以檢測CD8之機構、及 (B)用以檢測FOXP3及CD4之至少一者之機構。 (G26)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述細胞之混合物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞之混合物可用作醫藥。 (G27)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。 (項目G27A)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述醫藥係用以利用免疫耐受進行處置或預防者。 (G28)一種用於管理醫藥品質之套組，該醫藥包含用以處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該套組包含 (A)用以檢測CD8之機構、及 (B)用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構。 (G29)如上述項目之任一項所記載之套組，其中上述用以檢測CD8之機構包含抗CD8抗體，用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構包含抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體。 (G30)如上述項目之任一項所記載之套組，其特徵在於：上述檢測係藉由FACS、西方墨點法、或PCR進行。
於本發明中，意圖為上述1個或複數個特徵除了所明示之組合以外，可進一步組合而提供。本發明之更進而之實施形態及優點只要視需要閱讀以下之詳細說明加以理解，即可被業者認識到。 [發明之效果]
本發明之組合物包含CD4陽性失能T細胞及CD8陽性失能T細胞，具有高於不含CD8陽性失能T細胞者之免疫耐受之誘導功能。又，於用以誘導免疫耐受之醫藥之製造中，可以CD8陽性細胞作為指標而管理醫藥品質。
以下，示出最佳之形態對本發明進行說明。應理解於本說明書全文中，只要未特別提及，則單數形之表現亦包括其複數形之概念。因此應理解，只要未特別提及，則單數形之冠詞(例如，英文之情形時為「a」、「an」、「the」等)亦包括其複數形之概念。又，應理解，本說明書中所使用之用語只要未特別提及，則以該領域所通常使用之含義使用。因此，只要未作其他定義，則本說明書中所使用之全部專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬領域之業者通常理解之含義相同之含義。於發生矛盾之情形時，本說明書(包括定義)優先。
(用語之定義) 於本說明書中，所謂「約」，於本說明書中使用之情形時，意指其後數值之±10%。
於本說明書中，所謂「免疫耐受」，係不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應、或特異性免疫反應被抑制之狀態。免疫耐受可意指免疫細胞(尤其是T細胞)不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應或特異性免疫反應被抑制之狀態，及人不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應或特異性免疫反應被抑制之狀態之兩者或任一者。藉由誘發免疫耐受，而可處置免疫排斥反應、或可治療過敏，因此受到關注。於本說明書中，所謂「失能」意指藉由在由抗原呈現細胞呈現抗原時不輸入共同刺激，而於該下次有共同刺激之條件下即便被刺激亦無法反應之狀態。因此，本說明書中所謂「失能細胞」係指產生免疫耐受之(免疫不應答之)細胞，「失能T細胞」係產生免疫耐受之(免疫不應答之)T細胞，除了不被活化外，再次遇到相同之抗原時無反應之T細胞亦包含其中。再者，於本說明書中，「經誘導免疫耐受之PBMC(或T細胞)」與「失能之PBMC(或T細胞)」之含義相同。是否為失能細胞例如可藉由確認CD44陽性而確認，但不限定於此。
於本說明書中，所謂「受驗體」，包括飼養動物(例如牛、羊、貓、狗、馬)、靈長類(例如人、及猴等非人靈長類)、兔、及嚙齒類(例如小鼠及大鼠)。於特定之實施形態中，受驗體為人。
於本說明書中，「藥劑」、「劑」或「因子」(均相當於英文之agent)廣義上可交換使用，只要可達成意圖之目的，則可為任意物質或其他要素(例如光、放射能、熱、電等能量)。作為此種物質，例如可列舉：蛋白質、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如包括如cDNA、基因組DNA之DNA、如mRNA之RNA)、多醣、寡醣、脂質、有機低分子(例如，激素、配體、訊息傳遞物質、其他有機低分子化合物、藉由組合化學合成之分子、可用作醫藥品之低分子(例如，低分子配體等)等)、該等之複合分子，但不限定於該等。 於本說明書中，「抑制因子」係指可抑制特定作用(例如相互作用、訊號傳遞等)之所有種類之低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖等。無意受特定之理論約束，但於本發明中，藉由阻斷細胞表面之CD80及/或CD86與CD28之相互作用，抑制CD28共同刺激訊號，而對T細胞誘導失能。於本發明中，用於阻斷CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。於一態樣中，上述蛋白質係抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。於其他態樣中，上述抗體之變體係抗原結合片段。於其他態樣中，上述細胞表面分子之變體係融合蛋白。於其他態樣中，上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。於其他態樣中，上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。又，亦假定亦可組合使用間接抑制上述相互作用之因子(例如，訊號傳遞之上游或下游之訊號之抑制因子)。
於本說明書中，廣義之「抗體」係指可特異性結合於抗原上之特定表位之分子或其集群。本說明書中之廣義之「抗體」可為全長抗體(即具有Fc部分之抗體)，亦可為Fc部分缺失之抗體。Fc部分缺失之抗體只要可結合於目標抗原即可，作為此種抗體，例如可列舉Fab抗體、F(ab')2 抗體、Fab'抗體、Fv抗體、scFv抗體等，但並不限定於該等。抗體可為任意類型之抗體，即，可為該領域中公知之免疫球蛋白。於例示性之實施形態中，抗體為同型IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM類別之抗體。於例示性之實施形態中，本說明書所記載之抗體包含1條或複數條α、δ、ε、γ、及/或μ重鏈。於例示性之實施形態中，本說明書所記載之抗體包含1條或複數條κ或輕鏈。於例示性之態樣中，抗體為IgG抗體，為4種人類亞型：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之1種。又，作為假定於本發明中使用之抗體，可列舉來自駱駝科動物之抗體(例如，VHH抗體)、來自鯊魚之抗體(例如，單鏈抗體)、肽體(peptibody)、奈米抗體(nanobody、單域抗體)、微型抗體(minibody)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、串聯二-scFV、串聯三-scFv)等，該等於該領域為公知。例如，請參照Kortt等、Biomol Eng. 2001 18卷：95~108頁、(2001年)及Todorovska等、J Immunol Methods. 248卷：47~66頁、(2001年)等。又，抗體包括抗體修飾物或抗體非修飾物。抗體修飾物可為抗體與例如聚乙二醇等各種分子結合。抗體修飾物可藉由使用公知之方法對抗體進行化學修飾而獲得。關於人工製作之抗體及抗體之各種修飾/變體化方法，亦參照生物化學(2016)第88卷第3號380~385頁。
於本說明書中，狹義之「抗體」係指可特異性結合於抗原上之特定表位之免疫球蛋白或其集群，將其變體稱為「抗體之變體」。本說明書中之狹義之「抗體」可為全長抗體(即具有Fc部分之抗體)，本說明書中之「抗體之變體」可為上述抗體之Fc部分缺失之變體。因此，本說明書中狹義之抗體亦可稱為全長抗體，抗體之變體亦可稱為全長抗體之變體。Fc部分缺失之變體只要可結合於目標抗原即可，作為此種變體，例如可列舉Fab抗體、F(ab')2 抗體、Fab'抗體、Fv抗體、scFv抗體等，但並不限定於該等。又，抗體之變體包括抗體修飾物或抗體非修飾物。抗體修飾物可為抗體與例如聚乙二醇等各種分子結合。抗體修飾物可藉由使用公知之方法對抗體進行化學修飾而獲得。
於本發明之一實施形態中，關於「多株抗體」，例如為了誘導產生對抗原具有特異性之多株抗體，可藉由對哺乳類(例如大鼠、小鼠、兔、牛、猴等)、鳥類等投予含有目標抗原之免疫原而生成。免疫原之投予可注入1種以上之免疫劑、及於需要之情形時注入佐劑。佐劑有時亦用於增加免疫應答，可含有弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全或不完全)、礦物凝膠(氫氧化鋁等)、或界面活性物質(脫脂酸卵磷脂等)等。免疫方案為該技術領域所公知，有時根據所選擇之宿主生物，藉由誘發免疫應答之任意之方法實施(蛋白質實驗手冊，羊土社(2003):86-91.)。
於本發明之一實施形態中，「單株抗體」包括構成集群之各抗體除了少量具有可自然產生之突變之抗體以外，實質上為對應於單一表位之相同抗體的情形。或者構成集群之各抗體亦可除了少量具有可自然產生之突變之抗體以外，實質上為相同抗體。單株抗體具有高度特異性，與典型地包含對應於不同表位之不同抗體、及/或典型地包含對應於同一表位之不同抗體的通常之多株抗體不同。除了該特異性以外，單株抗體就可由未被其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養而合成之方面而言有用。「單株」之形容可表示可由實質上均一之抗體集群獲得之特徵，並非意指必須藉由某種特定之方法生產抗體。例如，單株抗體亦可藉由與"Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-497."所揭示之融合瘤法相同之方法製作。或者單株抗體亦可藉由與美國專利第4816567號所記載之重組法相同之方法製作。或者單株抗體亦可使用與"Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628."、或"Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-597."所記載之技術相同之方法自噬菌體抗體庫單離。或者亦可藉由"蛋白質實驗手冊，羊土社(2003):92-96."所揭示之方法製作。
於本發明之一實施形態中，「嵌合抗體」例如為將異種生物間之抗體之可變區與抗體之恆定區連結而成者，可藉由基因重組技術構建。小鼠-人嵌合抗體例如可藉由"Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1994Feb 1;91(3):969-973."所記載之方法製作。用以製作小鼠-人嵌合抗體之基本之方法例如為將存在於經選殖化之cDNA中之小鼠前導序列及可變區序列連結於已存在於哺乳類細胞之表現載體中之編碼人類抗體恆定區之序列。或者亦可將存在於經選殖化之cDNA中之小鼠前導序列及可變區序列連結於編碼人類抗體恆定區之序列後，連結於哺乳類細胞表現載體。人類抗體恆定區之片段可設為任意之人類抗體之H鏈恆定區及人類抗體之L鏈恆定區者，例如人H鏈者可列舉Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，L鏈者可列舉Cλ或Cκ。
於本發明之一實施形態中，「人類化抗體」例如為具有來自非人種之1個以上之CDR、及來自人免疫球蛋白之架構區(FR)、進而具有來自人免疫球蛋白之恆定區且結合於所需之抗原之抗體。抗體之人類化可使用該技術領域已知之各種方法實施(Almagro et al., Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.)。例如，可列舉CDR移植(Ozaki et al.,Blood.1999 Jun1;93(11):3922-3930.)、Re-surfacing (Roguska et al., Proc Natl Acad Sci US A.1994Feb 1;91(3):969-973.)、或FR重排(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.)等。為了將抗原結合改型(較佳為改善)，人FR區之胺基酸殘基可置換為來自CDR供給者抗體之對應之殘基。該FR置換可藉由該技術領域周知之方法實施(Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-327.)。例如，可藉由CDR與FR殘基之相互作用之建模鑑定對抗原結合重要之FR殘基。或者亦可藉由序列比較鑑定於特定之位置異常之FR殘基。
於本發明之一實施形態中，「人類抗體」例如為包含構成抗體之重鏈之可變區及恆定區、輕鏈之可變區及恆定區之區域來自編碼人免疫球蛋白之基因之抗體。作為主要之製作方法，有人類抗體製作用基因轉殖小鼠法、噬菌體呈現法等。於人類抗體製作用基因轉殖小鼠法中，若對經剔除內源性Ig之小鼠導入功能性之人之Ig基因，則代替小鼠抗體而產生具有多種抗原結合能力之人類抗體。若進一步免疫該小鼠，則可藉由先前之融合瘤法獲得人類單株抗體。例如，可藉由"Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93."所記載之方法製作。噬菌體呈現法典型而言為以不喪失噬菌體之感染性之方式使外源基因以融合蛋白之形式於作為大腸菌病毒之一之M13或T7等纖維狀噬菌體之鞘蛋白(g3p、g10p等)之N末端側表現之系統。例如，可藉由"Vaughan et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-314."所記載之方法製作。
於本說明書中，所謂「來自受驗體之細胞」係指自投予本發明之組合物之受驗體獲得之細胞或來自從該受驗體獲得之細胞之細胞。於本說明書中，所謂「來自受驗體之抗原」係指使免疫應答產生之受驗體自身所產生之抗原，例如指成為具有自體免疫疾病之受驗體之自體免疫疾病之原因的受驗體自身所產生之抗原。於本說明書中，所謂「不來自受驗體之抗原」係指可使免疫應答產生之外來之抗原。於本說明書中，「不來自受驗體之」「抗原含有物(antigen-containing material)」係指含有不來自受驗體之抗原之任意之物質或物質之集合物，例如可列舉表現不來自受驗體之抗原之細胞、細胞集群、組織等。
於本說明書中，所謂「移植免疫排斥反應」係指接受器官、組織或細胞之移植之受驗體中受驗體之免疫系統對所移植之器官、組織或細胞進行攻擊而將其損傷或破壞。
於本說明書中，所謂「過敏」係指針對不來自受驗體之抗原而過度發生免疫應答之狀態。引起過敏之不來自受驗體之抗原亦稱為過敏原，例如可列舉蟎抗原、蛋白抗原、牛奶抗原、小麥抗原、花生抗原、大豆抗原、蕎麥抗原、芝麻抗原、米抗原、甲殼類抗原、幾維果抗原、蘋果抗原、香蕉抗原、桃抗原、番茄抗原、金槍魚抗原、大馬哈魚抗原、青花魚抗原、牛肉抗原、雞肉抗原、豬肉抗原、貓皮屑抗原、昆蟲抗原、花粉抗原、狗皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、乳膠、半抗原及金屬等，但不限定於該等。
於本說明書中，所謂「自體免疫疾病」係指免疫系統對自身之細胞、組織或器官進行不理想之免疫應答之任意之疾病。作為自體免疫疾病，例如可列舉類風濕性關節炎、多發性硬化症、1型糖尿病、炎症性腸病(例如，克隆氏病或潰瘍性大腸炎)、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、硬皮病、自體免疫性甲狀腺病、圓形禿、葛瑞夫茲氏病(Graves' Disease)、格-巴二氏(Guillain-Barre)症候群、乳糜瀉、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、風濕熱、胃炎、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、胰島炎、***、***、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、重症肌無力症、原發性黏液水腫、惡性貧血、自體免疫性溶血性貧血、愛迪生氏病、硬皮病、古巴士德氏(Goodpasture)症候群、腎炎(例如，絲球體腎炎)、牛皮癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、特發性血小板減少性紫癜、特發性白血球減少症、韋格納(Wegener)肉芽腫及多發性/皮肌炎，但不限定於該等。
於本說明書中，所謂「移植物抗宿主病」係指所移植之器官、組織或細胞因免疫應答而攻擊接受移植之受驗體之細胞、組織或器官而將其損傷或破壞。
於本說明書中，所謂「由iPS細胞、ES細胞或來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應」係指iPS細胞或ES細胞所具有之抗原、或者來自iPS細胞或ES細胞之細胞、組織或器官所具有之抗原產生之免疫排斥反應。
(較佳之實施形態) 以下記載較佳之實施形態之說明，但應理解，該實施形態係本發明之例示，本發明之範圍並不限定於此種較佳之實施形態。又，應理解業者可參考如以下之較佳之實施例，於本發明之範圍內容易地進行修飾、變更等。關於該等實施形態，業者可適當參酌本說明書中之記載而將任意之實施形態加以組合。又，業界理解，本發明之以下之實施形態可單獨使用，或可將該等組合使用。
(醫藥以及治療及預防) 本發明者等人發現，即便使用抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導T細胞之失能，於含有經誘導失能之T細胞之混合物中不存在CD8陽性細胞之情形時，誘導免疫耐受之能力亦降低。該情況與報告即便去除CD8陽性細胞對免疫抑制亦幾乎無影響之可能性之非專利文獻4形成對照，令人意外。
於一態樣中，本發明提供一種包含CD4陽性失能T細胞與CD8陽性失能T細胞之醫藥組合物。此種醫藥組合物可用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。該失能T細胞可藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導。此種抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。於一態樣中，上述蛋白質係抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。於其他態樣中，上述抗體之變體係抗原結合片段。於其他態樣中，上述細胞表面分子之變體係融合蛋白。於其他態樣中，上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。於其他態樣中，上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
於若干實施形態中，CD80及/或CD86係藉由抗原呈現細胞表現，CD28係藉由T細胞表現。
於若干實施形態中，本發明之醫藥組合物可進而包含控制性T細胞、例如FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性T細胞。此種控制性T細胞並非直接參與不表現針對特定抗原之特異性免疫反應之「免疫耐受」者，並非必需成分，但可抑制免疫應答，因此於較佳之實施形態中，本發明之組合物可進而含有控制性T細胞。
於本發明之其他態樣中，本發明提供一種包含由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞之醫藥組合物，該組合物包含CD8陽性細胞，進而，該組合物包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。此種醫藥組合物可用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。於特定之實施形態中，本發明之組合物可包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。
本發明者發現，經誘導失能之CD8陽性細胞及CD4陽性細胞(亦稱為CD8陽性失能細胞及CD4陽性失能細胞)大量含有CD44陽性之細胞。因此，於若干實施形態中，CD8陽性細胞及/或CD4陽性細胞可為CD44陽性。又，失能細胞之生成之確認除了CD44以外，亦可使用CD45RA/CD45RO。例如，於一態樣中，CD8陽性細胞及/或CD4陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。
於若干實施形態中，FOXP3陽性細胞可為CD4陽性及/或CD25陽性。本發明之組合物較佳為進而包含控制性T細胞，控制性T細胞可為FOXP3陽性，進而可為CD4陽性及/或CD25陽性。
於若干實施形態中，可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。於一態樣中，上述蛋白質係抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。於其他態樣中，上述抗體之變體係抗原結合片段。於其他態樣中，上述細胞表面分子之變體係融合蛋白。於其他態樣中，上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。於其他態樣中，上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。於若干實施形態中，CD80及/或CD86係藉由抗原呈現細胞表現，CD28係藉由T細胞表現。於特定之實施形態中，可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子可為抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白。作為假定於本發明中使用之抑制因子，如上所述可列舉CTLA-4 Ig融合蛋白。CTLA-4 Ig融合蛋白以如下方式發揮功能：關於抗原呈現細胞上對CD80/CD86之結合，與T細胞上作為共同刺激受體之CD28競爭，其結果抑制T細胞之活化。於本發明中，作為上述CTLA-4 Ig融合蛋白，假定阿巴西普(Orencia(註冊商標))、貝拉西普或Maxy-4。貝拉西普含有顯著增大對CD80及CD86之結合性之2個胺基酸置換(L104E及A29Y)(參照Davies JK等、Cell Transplant.(2012); 21(9):2047~61、Adams AB等、J Immunol. (2016) 197(6): 2045~50)。又，作為可期待與CTLA4-Ig融合蛋白相同之效果之抑制因子，亦可列舉CD28-Ig融合蛋白(Peach RJ等、J Exp Med. (1994) 180(6): 2049~2058)。本發明之抑制因子亦可以核酸之形態使用。若列舉一例，則亦可假定將編碼CTLA4-Ig融合蛋白之核酸經由腺病毒載體等導入至細胞中並使其表現。例如，參照Jin YZ等、Transplant Proc.(2003); 35(8):3156~9。
於若干實施形態中，失能細胞可為藉由將抗體等抑制因子、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導之細胞。抗原含有物可為細胞，為了防止該細胞之增生及活化，可被放射線照射。
於特定之實施形態中，可提供一種醫藥組合物，其係用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態，其包含本發明之組合物。作為由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態，例如可列舉移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應等需要免疫耐受之疾病、障礙或狀態，但不限定於該等。
於若干實施形態中，其特徵在於：移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。
於本發明作為對象之疾病等為移植免疫排斥反應之實施形態中，失能細胞可藉由將抗體等抑制因子、來自接受者之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及來自供給者之抗原或來自供給者之抗原含有物加以混合而誘導。來自供給者之抗原含有物可為PBMC、脾臟細胞或來自要移植之器官之細胞等。
於本發明作為對象之疾病等為過敏之實施形態中，失能細胞可藉由將抗體等抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及引起過敏之不來自受驗體之抗原加以混合而誘導。
於本發明作為對象之疾病等為自體免疫疾病之實施形態中，失能細胞可藉由將抗體等抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及成為自體免疫疾病之原因之來自受驗體之抗原加以混合而誘導。
於本發明作為對象之疾病等為移植物抗宿主病之實施形態中，失能細胞可藉由將抗體等抑制因子、提供移植物之供給者之PBMC或脾臟細胞、及來自接受者之抗原或該抗原含有物加以混合而誘導。來自接受者之抗原含有物可為PBMC、脾臟細胞或移植器官之部位之周邊之細胞或來自其之細胞等。
於本發明作為對象之疾病等為iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應之實施形態中，失能細胞可藉由將抗體等抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及自iPS細胞或ES細胞分化之用於移植之細胞加以混合而誘導。
以下示出利用本發明之疾病等之治療例，但不限定於以下。
(過敏及自體免疫疾病) 關於過敏及自體免疫疾病，藉由慣例之方法使自患者之末梢血液獲得之巨噬細胞分化為抗原呈現能力較高之樹狀細胞(來自巨噬細胞之樹狀細胞)，使照射放射線(γ射線)後之該細胞呈現引起過敏或自體免疫疾病中之過度反應之抗原，於抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等合適之抑制因子之存在下與自相同患者末梢血液獲得之T細胞群共培養1~2週，而獲得對引起過敏或自體免疫疾病之抗原具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至患者，而誘導對引起過敏或自體免疫疾病之抗原具有特異性之免疫耐受，用於過敏及自體免疫疾病之預防及治療。根據為預防療法或治療，進而根據症狀之強弱等各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(移植物抗宿主病) 於移植物抗宿主病中，與對移植免疫排斥反應之治療相反地，將提供移植物之供給者之PBMC或T細胞等可成為移植物抗宿主病之原因之細胞與照射過放射線(γ射線)之來自宿主之PBMC或其以外之細胞在抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等合適之抑制因子之存在下共培養1~2週，獲得對宿主具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至宿主，而抑制成為移植物抗宿主病之原因之由移植物引起之對宿主之反應(誘導免疫耐受)，預防及治療移植物抗宿主病。根據為預防療法或治療，進而根據所移植之組織或其大小、症狀之強弱等各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應) 於在使用iPS細胞或ES細胞之治療中之應用中，對自iPS細胞或ES細胞分化之用於移植之細胞或樹狀細胞照射放射線(γ射線)，於抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等合適之抑制因子之存在下將該細胞與接受移植之患者之PBMC或T細胞群共培養1~2週，獲得對自iPS細胞或ES細胞分化之細胞具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至宿主，而誘導對來自iPS細胞或ES細胞之移植之細胞、組織、及器官具有特異性之免疫耐受，預防及治療對該等之排斥反應。根據為預防療法或治療，進而根據所移植之組織或其大小、症狀之強弱之各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(醫藥之製造方法) 於本發明之其他態樣中，本發明提供一種製造包含細胞之醫藥之方法，該方法包括：(A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟；(B)確認由該混合獲得之細胞產物包含CD8陽性細胞之步驟；及(C)確認該細胞產物包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞之步驟。本發明者等人發現，為了發揮出充分之免疫抑制功能，重要的是於經誘導失能之T細胞之混合物中含有CD8陽性細胞。因此，於包含被誘導失能之T細胞之醫藥之製造中，重要的是保證包含CD8陽性細胞。由此製造之醫藥可用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自受驗體之抗原產生之受驗體之疾病、障礙或狀態。只要為如生成CD8陽性細胞之抑制因子，則可使用任意抑制因子。
於若干實施形態中，細胞產物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明細胞產物可用作醫藥。
於上述步驟(B)中，為了確認包含CD8陽性細胞，可使用抗CD8抗體檢測CD8。於上述步驟(C)中，為了確認包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞，可使用抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。作為用以檢測之具體之方法，可列舉流式細胞儀(FACS)、西方墨點法、RNA之檢測等，但不限定於該等。用以檢測之具體之方法較佳為FACS。RNA之檢測可藉由PCR等該領域公知之方法進行。FOXP3係於細胞內表現者，可將細胞固定後進行透過處理將細胞內染色，同樣可藉由FACS等方法檢測。作為對該方法所使用而言合適之市售之製品，可列舉：eBioscienceTM 人類調節性T細胞染色套組(Human Regulatory T Cell Staining Kit)#3(cat#88-8995-40)、eBioscienceTM 小鼠調節性T細胞染色套組(Mouse Regulatory T Cell Staining Kit)#1(cat#88-8111-40)、eBioscienceTM 人類/非人靈長類調節性T細胞染色套組(Human/Non-Human Primate Regulatory T Cell Staining Kit)#1(cat#88-4999-40)、及eBioscienceTM 人類調節性T細胞全血染色套組(Human Regulatory T Cell Whole Blood Staining Kit)(cat#88-8996-40)等。
(品質管理方法) 於其他態樣中，本發明提供一種細胞製劑(含細胞之醫藥)之品質管理方法。更詳細而言，本發明提供一種管理醫藥品質之方法，該醫藥包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該方法包括：(A)確認該細胞包含CD8陽性細胞之步驟；及(B)確認該細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之步驟。於包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞之醫藥中，為了維持一定之品質(充分之免疫耐受)，重要點之一為對此種包含細胞之醫藥中是否包含CD8陽性細胞進行管理。
於上述步驟(A)中，為了確認包含CD8陽性細胞，可使用抗CD8抗體檢測CD8。於上述步驟(B)中，為了確認包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞，可使用抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。作為用以檢測之具體之方法，可列舉FACS、西方墨點法及PCR等，但不限定於該等。FOXP3係於細胞內表現者，可將細胞固定後進行透過處理將細胞內染色，同樣可藉由FACS等方法檢測。
以下示出典型之本發明之細胞製劑之製造及品質管理方法之一例。
(包含失能T細胞之細胞製劑之製造及品質管理) 1. 來自生物之原料及其應對狀況 於一實施形態中，於失能T細胞之製造步驟中，使用與表1所記載之來自生物之原料基準相符之來自生物之原料。
失能T細胞之投予係於對接受者實施來自供給者之器官移植(例如，肝臟移植)後進行。供給者器官(例如，肝臟)中亦以不去除病毒之狀態含有作為來自自體之失能T細胞之材料的來自供給者之單核球，於含有來自供給者之單核球之狀態下將供給者器官(例如，肝臟)移植至接受者。因此，認為用作來自自體之失能T細胞之材料的來自供給者之單核球不屬於來自生物之原料。
[表1]
Figure 108121865-A0304-0001
 貝拉西普(例如，可從Bristol-Myers Squibb、New York、NY獲得) 2. 細胞製劑之製法 於一實施形態中，細胞製劑可以如下方式製造。以下所例示之各種數值等為代表例，業者可適當變更而製造細胞製劑。 1) 於投予19天前，於醫療機構對供給者實施血球分離(Apheresis)，對供給者血球分離產物照射30 Gy之放射線，消除其細胞增生能力後，向實施細胞加工之細胞培養加工設施發送。 2) 收置供給者血球分離產物後，於細胞培養加工設施藉由密度梯度離心法將供給者單核球分離、回收後，分成2份冷凍，於-80±10℃下保管。 3) 於投予14天前，於醫療機構對接受者實施血球分離，將接受者血球分離產物向實施細胞加工之細胞培養加工設施發送。 4) 收置接受者血球分離產物後，於細胞培養加工設施藉由密度梯度離心法將接受者單核球分離、回收，與經解凍之供給者單核球以及抗CD80抗體及抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子共培養。 5) 於投予7天前更換培養基。將培養7天之中間製品回收，與經解凍之供給者單核球以及抗CD80抗體及抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子共培養。 6) 於投予當天藉由密度梯度離心法將細胞加工物回收後洗淨，填充至生理食鹽液中。 7) 發送至醫療機構，於醫療機構投予至接受者。
(製造及品質試驗流程之代表例)
[化1]
Figure 02_image001
3. 步驟內管理試驗 於一實施形態中，於製造步驟內可實施表2所記載之步驟內管理試驗。以下所例示之各種數值等及程序為代表例，業者可適當變更而實施步驟內管理試驗。
[表2]
Figure 108121865-A0304-0002
 4.標準試驗、特性解析試驗 於一實施形態中，可使用最終製品進行表3所記載之標準試驗。表3所例示之程序為代表例，業者可適當變更而實施標準試驗、特性解析試驗。例如，作為其改變例，可列舉實施例8所例示之標準。於投予誘導性抑制性T細胞時未判明結果之情形時，可參考步驟內管理試驗之結果，判斷臨床試驗製品之出貨。
又，可使用製造步驟內之細胞、最終製品進行表3所記載之特性解析試驗。
[表3]
Figure 108121865-A0304-0003
 上述臨床試驗製品標準試驗、特性解析試驗如本說明書所記載，臨床試驗製品標準試驗可包括外觀、細胞數、活細胞率、細胞表面標記物(CD3、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45RA/CD45RO)、來自製造步驟之雜質(來自供給者之細胞、培養基成分、抗CD80抗體、抗CD86抗體、細胞凍傷保護液成分、比重分離液成分)、病毒否定試驗、無菌試驗、黴漿菌否定試驗、及內毒素。作為效能試驗，可包括利用使用培養細胞之淋巴球混合試驗(MLR)之細胞激素產生或氚摻入試驗。關於細胞表型之基準值，例如，CD3陽性細胞比率代表性而言可以表中之50%以上作為基準值，或者亦可為例如30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上或該等之間之數值(可每隔1%、0.5%等進行設定)。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞比率代表性而言可以表中之10%以上作為基準值，或亦可為例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD44陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD25細胞比率代表性而言可以表中之5%以上作為基準值，或亦可為例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等。細胞數代表性而言可採用1×109 個以上作為基準，或亦可為例如1×108 個以上、5×108 個以上、1×109 個以上、2×109 個以上、3×109 個以上等。活細胞率代表性而言可採用70%以上作為基準，或亦可採用50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上等作為基準。
(最終製品之組成) 最終製品若列舉一例，則包含下述表所記載之構成物。又，關於該等之標準，業者亦可適當變更，變更組成而構成再生醫療等製品。
[表3-1]
Figure 108121865-A0304-0004
 對於標準試驗、特性解析試驗，業者可適當參考本說明書所記載之技術性事項，視需要進行變更而具體實施。
5.再生醫療等製品之投予方法 於一實施形態中，於器官移植後14天後投予一次。關於投予方法及其期間等，業者可適當參考本說明書所記載之技術性事項，視需要進行變更而具體實施。
(套組) 於其他態樣中，本發明提供一種用以製造細胞製劑之套組。進而，於其他態樣中，本發明提供一種用以管理細胞製劑之品質之套組。詳細而言，本發明提供一種用於製造包含細胞之混合物之醫藥的套組，該套組包含(A)可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、(B)用以檢測CD8之機構、及(C)用以檢測FOXP3及CD4之至少一者之機構。
於若干實施形態中，細胞之混合物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明細胞之混合物可用作醫藥。
藉由本發明之套組所製造之包含細胞之混合物之醫藥包含被誘導失能之CD8陽性T細胞與FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞，可用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自受驗體之抗原產生之受驗體之疾病、障礙或狀態。
於其他態樣中，提供一種用於管理醫藥品質之套組，該醫藥包含用以處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該套組包含(A)用以檢測CD8之機構、及(B)用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構。於若干實施形態中，用以檢測CD8之機構包含抗CD8抗體，用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構包含抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體。檢測例如可藉由FACS、西方墨點法、PCR等進行。
(來自自體之控制性T細胞製造程序) 以下，對來自自體之控制性T細胞之典型之製造方法進行說明。
事前之確認 於一實施形態中，事前之確認可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑、程序等為代表例，業者可適當變更而進行事前之確認之製造。
實施供給者及患者之傳染病篩選檢查，對於供給者，確認HBs抗原、HCV抗體、HIV-1/2、HTLV-1抗體全部為陰性。
1. 供給者淋巴球之分離(於無菌下進行)代表例 於一實施形態中，供給者淋巴球之分離可以如下方式製造。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之分離。 ・藉由血球分離將供給者淋巴球採集至回收袋中，對該回收袋照射放射線。 ・將前述經放射線照射之末梢血液單核球置於添加有適量之Ficoll-Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)或淋巴球分離液(Nacalai Tesque #20828)等(例如，20 mL)之離心管中，於22℃下以860 G離心分離(將離心分離機之加速器設定為slow、制動器設定為slow)20分鐘。 ・捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50 mL離心管2根)。 ・於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50 mL注射器)或吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・捨棄上清液，再次追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用吸管將細胞顆粒反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘。 ・捨棄上清液。 ・將含有預先自供給者採集之血漿之ALyS505N-0培養液(細胞科學研究所 (CSTI)1020P10)加入細胞顆粒中(例如添加適量至總液量成為31 mL為止)，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・利用注射器(例如，帶有18G注射針之1 mL注射器)或吸管抽出適量(例如，0.3 mL)，對細胞數及活細胞數進行確認。
2. 供給者淋巴球之冷凍保存(於無菌下進行) 於一實施形態中，供給者淋巴球之冷凍保存可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之冷凍保存。 ・冷凍袋(例如，冷凍袋F-050 25 mL冷凍袋Nipro股份有限公司89-101) 於無菌下開封，於標籤記下必要事項(日期、製造編號、供給者名)。 ・以注射器(例如，帶有18G注射針之30 mL注射器)取細胞懸浮液，裝入冷凍袋中。 ・將ACD液(Terumo股份有限公司TP-A05ACD，例如相對於細胞懸浮液15 mL為2 mL)添加至裝有細胞懸浮液之冷凍袋中，***至4℃下冷卻之保冷劑中，冷卻10分鐘左右。 ・使用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)，將於4℃下冷卻之CP-1(極東製藥工業股份有限公司 551-27202-4細胞凍傷保護液CP-1，例如8.5 mL)歷經1分半左右之時間添加至冷凍袋中。此時，緩慢攪拌冷凍袋。 ・使用注射器，將冷凍袋及其氣口內之空氣全部抽出。 ・使用管封機將冷凍袋密封，首先於4℃下冷卻約5~10分鐘，其後於-80℃之冷凍庫中保管。
3. 供給者淋巴球之解凍(於無菌下進行) 於一實施形態中，供給者淋巴球之解凍可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之解凍。 ・將保存之供給者細胞之冷凍袋於例如37℃恆溫槽中解凍。其後之操作較佳為於無菌下進行。 ・使用注射器(例如，帶有18G注射針之50 mL注射器)，自經解凍之冷凍袋中抽出細胞懸浮液，轉移至離心管(例如，50 mL離心管2根，每根中12.5 mL)中。 ・於加入有細胞懸浮液之離心管中追加例如5%白蛋白液(日本製藥股份有限公司 123146364 捐血白蛋白5%靜脈注射12.5 g/250 mL)(例如相對於細胞懸浮液12.5 mL為37.5 mL)，使其充分混合。其後，靜置約5分鐘。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加洗淨用之白蛋白加生理食鹽液(例如，由5%白蛋白液25 mL與生理食鹽液19 mL製作)等適當液體並懸浮。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加ALyS505N培養液(例如，相對於50 mL離心管為10 mL)並懸浮。 ・於裝有ALyS505N-0培養液或與其等同之液體之培養袋(例如，Nipro股份有限公司87598 Nipro培養基ALyS505NB10)中分別以例如最終濃度10 μg/mL添加抗人CD80抗體(例如，m2D10.4；Cat.No.16-0809-85、eBioscience公司)與抗人CD86抗體(例如，IT2.2；Cat.No.16-0869-85、eBioscience公司)(或添加CTLA4-Ig融合蛋白(例如，貝拉西普)等同等之抑制因子)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)將上述細胞懸浮液注入添加至該培養袋中。於一例中，培養袋中之總液量約為840 mL。
4. 患者淋巴球之分離~一次培養開始(於無菌下進行) 於一實施形態中，患者淋巴球之分離可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行患者淋巴球之分離。 ・將從患者採集之血漿於恆溫槽中、例如56℃下加溫30分鐘而預先滅活。不立即使用者進行冷凍保存。 ・將從患者採集之末梢血液加入至裝有適量合適之介質、例如Ficoll-Paque(例如，20 mL)之離心管中，例如，於22℃下以860 G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為slow、制動器設定為slow)20分鐘。 ・捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50 mL離心管2根)。 ・於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・例如，於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・捨棄上清液，再次追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用吸管將細胞顆粒反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・例如，於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘。 ・捨棄上清液，於細胞顆粒中例如添加ALyS505N-0培養液(例如，10 mL)並懸浮，製作細胞懸浮液(例如，追加ALyS505N-0培養液至合計達到20 mL為止)。此處，抽出0.5 mL左右之細胞懸浮液，確認細胞數、活細胞數及表面抗原之表現。 ・於裝有「3.供給者淋巴球之解凍」中製作之ALyS505N-0培養液中供給者細胞及抗體等抑制因子之培養袋中追加來自患者之滅活血漿。 ・利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)將上述來自患者之細胞懸浮液注入添加至該培養袋中，使用管封機將培養袋密封。於一例中，培養袋中之總液量約為1000 mL。 ・於37℃培養箱內培養例如1週。
5-1. 培養基更換(例如，第1週，較佳為於無菌下進行) 於一實施形態中，培養基更換可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行培養基更換。 ・自培養箱取出培養袋，將內容物分注於離心管(例如，225 mL離心管4根)中。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(例如，較佳為可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加例如ALyS505N-0培養液並懸浮，製作細胞懸浮液(例如，追加ALyS505N-0培養液至合計達到20 mL為止)。此處，抽出0.3 mL左右之細胞懸浮液，對細胞數及活細胞數進行確認。 ・例如，利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)將細胞懸浮液注入添加至裝有ALyS505N-0培養液之培養袋中。 ・將抗人CD80抗體(例如，2D10.4)稀釋液與抗人CD86抗體(例如，IT2.2)稀釋液分別以例如最終濃度成為10 μg/mL之方式(或亦可使用CTLA4-Ig融合蛋白(例如，貝拉西普)等抑制因子)利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)注入添加至培養袋中。
5-2. 供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始(例如，第1週，於無菌下進行) 於一實施形態中，供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始。 ・將保存之供給者細胞之冷凍袋與來自患者之滅活血漿於例如37℃恆溫槽中解凍。其後之操作較佳為於無菌下進行。 ・使用注射器(例如，帶有18G注射針之50 mL注射器)，自經解凍之冷凍袋中抽出供給者細胞懸浮液，轉移至離心管(例如，50 mL離心管2根)中。 ・於加入有供給者細胞懸浮液之離心管中追加5%白蛋白液(例如，每2根50 mL離心管合計約50 mL)，使其充分混合。其後，靜置約5分鐘。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加洗淨用之白蛋白加生理食鹽液(例如，由5%白蛋白液25 mL與生理食鹽液19 mL製作)並懸浮。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加例如ALyS505N-0培養液(例如，相對於50 mL離心管為10 mL)並懸浮。 ・於裝有「3.供給者淋巴球之解凍」中製作之ALyS505N培養液中患者細胞及抗體等抑制因子之培養袋中利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)注入添加經解凍之來自患者之滅活血漿(例如，10 mL)，進而利用注射器(例如，帶有18G注射針之20 mL注射器)將上述細胞懸浮液注入添加至該培養袋中。於一例中，培養袋中之總液量約為1000 mL。 ・使用管封機將培養袋密封。 ・於37℃培養箱內培養例如1週。
6. 二次培養中之檢查(培養細胞抽出試驗) 於一實施形態中，二次培養中之檢查可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行二次培養中之檢查。 ・代表性而言，於二次培養開始起第3天(培養總計第10天)自培養袋抽出少量之培養液，檢查黴漿菌污染等。
7. 培養淋巴球之回收、填充(於無菌下進行) 於一實施形態中，培養淋巴球之回收、填充可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行培養淋巴球之回收、填充。 ・例如，於自二次培養開始起第7天(培養總計第14天)自培養箱取出培養袋，將內容物分注於離心管(例如，225 mL離心管4根)中。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加生理食鹽液並懸浮。 ・例如，於22℃下以600 G離心分離(例如，較佳為可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加生理食鹽液(例如，10 mL)並懸浮，製作細胞懸浮液。 ・將細胞懸浮液平穩地加入至裝有適量Ficoll-Paque(例如，20 mL)之離心管(例如，50 mL離心管)中，形成多層。 ・例如，於22℃下以860 G離心分離(將離心分離機之加速器設定為slow、制動器設定為slow)20分鐘。 ・捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50 mL離心管)中。 ・於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50 mL注射器)反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・例如，於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。 ・將上清液保留5 mL左右，其餘捨棄，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。 ・追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50 mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50 mL注射器)反覆抽吸排出，使其充分混合(a)。 ・例如，於22℃下以500 G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘(b)。 ・將上清液保留5 mL左右，其餘捨棄，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合(c)。 ・將上述(a)、(b)及(c)進一步重複2次。 ・抽出適量(例如，4 mL)最後之離心分離後之上清液，供於無菌檢查及黴漿菌檢查。 ・再次添加生理食鹽液並懸浮，將細胞懸浮液轉移至最終之容器(例如，100 mL生理食鹽液之瓶)中。抽出適量(例如，4 mL)，確認最終產物之細胞數、活細胞數、表面抗原之表現及內毒素之含量。
8. 二次包裝 於一實施形態中，二次包裝可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行二次包裝。 ・代表性而言，基於合適之基準(代表性而言，NUHCPC-M-12-ATREG)，對標籤輸入受驗者ID、製造編號、使用期限並印刷，將標籤貼附於容器。 ・基於合適之基準(代表性而言，NUHCPC-PMF-ATREG14)，發行「用法、用量、效能或效果以及使用上之注意或操作上之注意」。 ・將試驗物及「用法、用量、效能或效果以及使用上之注意或操作上之注意」收納於帶拉鏈塑膠袋中。 ・出貨前裝入移送容器中保管於監控單元內。
(註釋) 於本說明書中，「或者」於可採用文章中所列舉之事項之「至少一者以上」時使用。「或」亦相同。於本說明書中，於明確記載為「2個值之範圍內」之情形時，該範圍亦包含2個值自身。
本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請案等參考文獻係以與分別具體地記載者相同之程度將其整體作為參考援引至本說明書中。
以上，為了使本發明容易理解而示出較佳之實施形態進行說明。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述說明及以下之實施例係僅以例示為目的而提供，並非以限定本發明之目的提供。因此，本發明之範圍並不限定於本說明書中具體記載之實施形態或實施例，而僅由申請專利之範圍所限定。 實施例
以下，基於實施例更具體地說明本發明。但本發明並不限定於該等實施例。再者，於本說明書整體中，所引用之全部文獻係藉由參照直接併入至本案中。
(實施例1：功能喪失分析) 於本實施例中，為了特定出誘發免疫耐受所必需之成分，而進行功能喪失分析。以下進行說明。
(材料及方法) (失能細胞之生成) 依照已記載於文獻之方法進行實驗(1-3)。概括而言，自C57BL6(以下B6)小鼠及BALB/c小鼠(CLEA Japan、Charles River Laboratories Japan等)摘下脾臟，將紅血球溶血而獲得脾臟細胞(淋巴球)後，以成為4×106 細胞/ml之方式，藉由含有10%滅活胎牛血清(FCS)(SIGMA # 172012-500ML Lot 11D257或biosera #FB-1380/500 Lot.015BS482)之RPMI1640培養基(Sigma;R8758-500MK)進行調整。對成為刺激者之BALB/c脾臟細胞照射放射線(γ射線)30 Gy後，以1：1與B6脾臟細胞混合，以最終濃度分別成為10 μg/mL之方式添加eBioscience公司製造之倉鼠抗小鼠CD80抗體(16-10A1)(Cat. No.16-0801-82)與大鼠抗小鼠CD86抗體(GL1)(Cat. No.14-0862-82)，利用12孔板(Corning，#3513)(1~2.5 mL)、6孔板(Corning，Cat. No.3516)(3~6 mL)、6 cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat. No.628160)(3~6 mL)或10 cm培養皿(Corning，Cat. No.430167)(10~15 mL)於37℃下在5%CO2 培養箱中培養14天。自培養開始起第7天，藉由離心去除培養液後，重新於與培養開始時相同之條件下添加含有來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。於14天後回收細胞而獲得失能細胞。
於一部分實驗中，使PE螢光標記抗小鼠CD8抗體(53-6.7; eBioscience、#12-0081-85)與失能細胞進行反應後，藉由使用抗PE磁珠(Miltenyi Biotec #1300-10-639)之auto-MACS(Miltenyi Biotec)，將細胞篩選區分為CD8陽性與CD8陰性。又，使用PE螢光標記CD19抗體(1D3; eBioscience、#12-0193-85)進行同樣之操作，將細胞篩選區分為CD19陽性與CD19陰性。將該等細胞用於免疫反應抑制功能試驗。進而，於一部分實驗中，以可藉由細胞表面抗原之表現識別FOXP3表現控制性T細胞(regT細胞)之方式，使用以應答者細胞同時表現FoxP3與人CD2之方式進行基因改型之來自B6之小鼠(4)，藉由使用PE螢光標記抗人CD2抗體(RPA-2.10; eBioscience、#12-0029-42)與抗PE磁珠之auto-MACS，篩選區分人CD2陽性細胞(FoxP3表現regT細胞)與人CD2陰性細胞，用於免疫反應抑制功能試驗。
(免疫反應抑制功能之評價) 依照已記載於文獻之方法進行實驗(3)。概括而言，以與應答者B6脾臟細胞之比率成為1/2至1/16之方式調整失能細胞後，添加於96孔板(Corning公司製造，Cat. No.3799)上使用新採集之B6小鼠及BALB/c小鼠之脾臟細胞之1×106 細胞/mL的1：1混合培養物(最終為200 μL/孔，每4孔為一組)中，於37℃、5%CO2 培養箱中培養(每1孔中，B6小鼠及BALB/c小鼠之脾臟細胞分別為1×105 細胞，失能細胞為1×105 細胞之1/2~1/16之細胞數)。於培養開始第4天添加3 H-胸苷(10 μL)，於培養開始第5天(添加3 H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3 H-胸苷摻入量。將初始之B6淋巴球細胞之無刺激下的3 H-胸苷摻入量設為1而作圖，進行比較研究。
(結果) 將結果示於圖1。值表示將無刺激狀態(初始)之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1所算出之值。如圖1a所示，未進行任何篩選之全B6脾臟培養細胞於抗CD80/86抗體存在下與刺激者BALB/c脾臟細胞一起培養(下文稱為「抗體-刺激者處理」)後，確認到有抑制新鮮之(初始)B6脾臟細胞與BALB/c脾臟細胞之反應之效果。預想該經誘導失能之全培養細胞(細胞混合物)除了失能CD8陽性細胞、失能CD4陽性細胞、控制性T細胞(regT細胞)以外亦包含其他細胞(CD19陽性B細胞)。
使用自該抗體-刺激者處理後之細胞混合物純化出CD8陽性細胞(大部分為CD44陽性之失能CD8陽性細胞)而得之試樣進行實驗，結果可知，即便為僅失能CD8陽性細胞之細胞集群亦有抑制效果(黑色)，表明去除失能CD8陽性細胞之剩餘細胞集群無抑制效果(灰色)(圖1b)。
進而，如圖1c所示，自抗體-刺激者處理後之細胞混合物純化人CD2陽性細胞=regT細胞，結果表明，即便僅regT細胞之細胞集群亦有抑制效果(黑色)，又，去除regT細胞之剩餘細胞集群亦有同樣之抑制效果(灰色)。
另一方面，如圖1d所示，於自抗體-刺激者處理後之細胞混合物純化CD19陽性細胞(B細胞)之情形時，表明僅B細胞之細胞集群無抑制效果(黑色)，但去除B細胞之剩餘細胞集群有抑制效果(灰色)。
如上所述，若欠缺CD8陽性細胞，則免疫反應之抑制=免疫耐受之誘導顯著降低，即便僅CD8陽性細胞亦表現出較強之免疫耐受誘導，因此可理解CD8陽性細胞對於有效之免疫耐受之誘導而言為必需細胞。因此，於製造免疫耐受誘導細胞製品時，可理解確認有無CD8陽性細胞於品質管理上較為重要。
經純化之FOXP3陽性細胞集群或欠缺FOXP3陽性細胞之細胞集群均觀察到同樣之抑制作用，該情況與CD8陽性細胞具有誘導免疫耐受之能力不矛盾。又，亦與作為控制性T細胞而廣為人知之FOXP3陽性細胞具有免疫抑制功能相吻合。因此認為，於抗體-刺激者處理後之全部失能細胞中，失能CD8陽性細胞與FOXP3陽性細胞均為對誘導免疫耐受有效之細胞，該混合物最有效地誘導免疫耐受。
由關於CD19進行篩選之實驗可知，CD19陽性細胞(B細胞)無抑制效果，可理解不需要CD19陽性細胞。
(實施例2：利用CD80/86阻斷之抑制功能獲得分析) 於本實施例中，確認CD8陽性T細胞之免疫耐受誘導能力(免疫排斥抑制能力)取決於利用抗體-刺激者處理之失能誘導，並且於FOXP3陽性T細胞中亦進行同樣之實驗。
(材料及方法) 藉由與實施例1相同之方法，對於自野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行基因改型之來自B6之小鼠分別獲得之脾臟細胞進行抗體-刺激者處理，獲得失能細胞。使自野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行基因改型之來自B6之小鼠獲得之無刺激之初始脾臟細胞與該失能細胞一起分別與PE螢光標記抗小鼠CD8抗體或PE螢光標記抗人CD2抗體進行反應。其後，藉由使用抗PE磁珠之auto-MACS，將細胞篩選區分為CD8陽性與CD8陰性、或人CD2陽性與人CD2陰性。將所篩選之各細胞添加至96孔板上之混合培養體系中，研究其免疫抑制功能。
(結果) 結果示於圖2。
如圖2a(值表示將無刺激狀態(初始)之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1所算出之值)所示，表明失能CD8陽性細胞有抑制效果(黑色)、及自無刺激之初始脾臟細胞單離之CD8陽性細胞無抑制效果(灰色)。進而，如圖2b所示，抗體-刺激者處理後之regT細胞(黑色)亦發揮出免疫抑制功能，其抑制功能與無刺激之初始之regT細胞(灰色)相比較強。
根據該等可知，為了使CD8陽性細胞誘發免疫耐受(免疫反應之抑制)，必需於抗CD80/86抗體存在下藉由使用刺激者BALB/c脾臟細胞之刺激誘導失能，同樣之情況亦適用於regT細胞發揮更強力之免疫抑制功能時。即表明，藉由抗體-刺激者處理誘導之失能CD8陽性細胞與regT細胞有強力之免疫耐受誘導功能。
(實施例3：純化失能細胞之移植後之耐受誘導能力) 於本實施例中，確認失能誘導後之純化細胞於移植後是否具有耐受誘導能力。
(材料及方法) 利用與實施例1相同之方法，藉由在抗CD80/86抗體存在下與刺激者BALB/c脾臟細胞共培養，而自野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行基因改型之來自B6之小鼠之脾臟細胞獲得失能細胞。進而，於一部分實驗中，藉由與實施例1相同之方法從所獲得之失能細胞(全部失能細胞)中篩選CD8陽性細胞、CD4陽性細胞或人CD2陽性細胞。對野生型B6小鼠照射2 Gy之放射線(γ射線)，3天後移植BALB/c小鼠之心臟，然後立即(或與心臟移植同一天內)自尾靜脈投予初始B6脾臟細胞或所獲得之失能細胞，觀察心臟之排斥。以各組5隻以上進行實驗。
(結果) 將其結果示於圖3。如圖3a所示，於不移植失能細胞之情形時，所移植之心臟於約2週內全例被排斥。與此相對，於全部失能細胞投予組中，依賴於所投予之細胞數，心臟之植活率有所改善，於移入6×106 個全部失能細胞之情況中，判定已誘導對所移植之心臟之耐受，即便於100天後，全部小鼠所移植之心臟亦植活。如圖3b所示，該耐受誘導僅於對接受者小鼠照射放射線後移入失能細胞之情形時觀察到，於不照射放射線而投予失能細胞之情形、或對放射線照射小鼠移入初始細胞之情形時完全未觀察到。於將自失能細胞去除人CD2陽性細胞(FoxP3表現regT細胞)、或失能CD8陽性細胞而得之細胞集群投予至放射線照射小鼠之情形時，未觀察到如移入全部失能細胞般100天後所移植之心臟100%植活之情況，耐受誘導功能顯著降低，全部失能細胞(失能細胞混合物)之投予之優勢明顯(圖3c)。又，於投予純化出之初始CD8陽性T細胞時，全部小鼠中所移植之心臟被排斥，與此相對，於移入失能CD8陽性T細胞之情形時，經投予之小鼠中40%被誘導耐受(圖3d)。進而，於移入初始人CD2陽性細胞(FoxP3表現regT細胞)之情形時亦存在被誘導耐受之小鼠，但投予失能人CD2陽性細胞(FoxP3表現regT細胞)時更有效地誘導耐受(圖3d)。因此表明，與分別單獨投予失能CD8、CD4、FoXP3陽性細胞相比，失能細胞混合物之投予可更有效地抑制對所移植之心臟之排斥反應，進而藉由利用對接受者照射放射線等引起骨髓抑制，而更有效地誘導耐受。
該結果與實施例1並不矛盾，即便於單獨投予純化出之失能CD8、CD4、FoxP3陽性細胞或初始FoxP3陽性細胞之情形時，只要其細胞數較多，則不否定表現出與失能細胞混合物之移入同等地抑制對所移植之心臟之排斥反應(耐受誘導=移植100天以上之心臟之植活)之可能性。又，由於該實驗中使用經基因改型之小鼠，故而可藉由細胞表面之人CD2之表現而於細胞存活之狀態下純化Foxp3表現細胞=抑制性T細胞，但通常無法於活細胞中檢測細胞內之Foxp3之表現。於使用CD25陽性CD4陽性T細胞代替之情形時，已知含有經活化之CD4陽性T細胞多於抑制性T細胞，其免疫抑制功能較弱。又，由於Foxp3陽性抑制性T細胞較少，故而失能Foxp3表現抑制性細胞非常難純化。實際上，為了獲得圖3d所示之1×106 個人CD2表現細胞=FoxP3表現細胞，必需1×107 個以上之全部失能細胞。因此，此處所示之結果明確表明混合物更實用且更有效。
(實施例4：來自人PBMC之失能細胞之能力) 繼而，於本實施例中，對來自人PBMC之失能細胞之能力進行評價。
(材料及方法) (失能細胞之生成) 依照已記載於文獻之方法進行實驗(5-8)。使用Promo cell公司製造之淋巴細胞分離培養基(Cat. No.C-44010)或Ficoll-Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)或淋巴球分離液(Nacalai Tesque #20828)等，自4位志願者(以2人作為刺激者、2人作為應答者)之人末梢血液中分離單核細胞(PBMC)，以成為4×106 細胞/ml之方式利用添加有2%人AB型血清(混合血漿)之Biowest公司製造之ALyS505N-0培養基(細胞科學研究所(CSTI)1020P10)進行調整。對刺激者PBMC照射放射線(γ射線)30 Gy，與應答者PBMC以1：1混合。於上述混合之PBMC中，以最終濃度分別成為10 μg/mL之方式添加eBioscience公司製造之小鼠抗人CD80抗體(2D10.4)(Cat. No.16-0809-85)與小鼠抗人CD86抗體(IT2.2)(Cat. No.16-0869-85)，利用12孔板(Corning，#3513)、6孔板(Corning，Cat. No.3516)、6 cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat. No.628160)、或10 cm培養皿(Corning，Cat. No.430167)於37℃、5% CO2 培養箱中開始培養。自培養開始起第7天，藉由離心去除培養液後，於與開始培養時相同之條件下添加含有放射線照射過之刺激者PBMC與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。於培養第14天將細胞回收，藉由離心洗脫培養液，獲得失能細胞。於一部分實驗中，使用PE螢光標記小鼠抗人CD25抗體(BC96; eBioscience #12-0259-42)、FITC螢光標記小鼠抗人CD4抗體(RPA-T4; eBioscience #11-0049-42)、APC螢光標記小鼠抗人CD8抗體(RPA-T8; eBioscience #17-0088-42)將失能細胞染色後，使用JSAN細胞分選儀(Bay bioscience公司)將各細胞純化，並添加至混合培養體系中。
(免疫反應抑制功能之評價) 以與應答者PBMC之比率成為1/2至1/16之方式調整所獲得之失能細胞後，添加至使用新採集之同一志願者之PBMC的96孔板(Corning公司製造，Cat. No.3799)上分別為2×105 個/200 μL/孔、每4孔一組之混合培養體系中，於37℃、5% CO2 培養箱中培養。於培養開始第4天添加3 H-胸苷(10 μL)，於培養開始第5天(添加3 H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3 H-胸苷摻入量。將初始之應答者PBMC之無刺激下之3 H-胸苷摻入量設為1而作圖，進行比較研究。
(結果) 將結果示於圖4。
圖4a表示「抗體-刺激者處理後之全部失能細胞」之用量依賴之免疫反應抑制功能。可知抗體-刺激者處理後之全部失能細胞之比率越高，抑制效果越高。
圖4b係將抗體-刺激者處理後之全部失能細胞分選，自左起第3根柱起向右依序使用包含CD8陽性CD44陽性失能細胞與regT細胞之純化出CD25陽性細胞之細胞集群(灰色)、純化出CD4陽性CD25陽性regT細胞之細胞集群(縱條紋)、進而於純化出之CD4陽性CD25陽性regT細胞中添加純化出之CD8陽性細胞而成之細胞集群(黑色)，比較免疫抑制功能。根據此處所示之結果可知，regT細胞單獨情況下無免疫抑制功能，藉由與CD8陽性T細胞共存而發揮出免疫抑制功能。
圖4c係將抗體-刺激者處理後之全部失能細胞篩選區分為CD4陽性細胞(灰色)與CD4陰性細胞(斜線)，並與該全部失能細胞(黑色)比較免疫抑制功能。值表示將無刺激狀態(初始)之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1所算出之值。CD4陽性細胞中包含regT細胞，CD4陰性細胞中包含CD8陽性細胞。CD4陽性細胞及CD4陰性細胞均表現出免疫抑制。
圖4b中單獨之regT細胞無法發揮免疫抑制功能，於與CD8陽性細胞之共存在下發揮出regT細胞之免疫抑制功能，該等情況提示，為了發揮出regT細胞之充分之免疫抑制功能，必需CD8陽性細胞或regT細胞以外之CD4陽性細胞之存在。認為CD4陰性細胞之免疫抑制功能係來自其中所含之失能CD8陽性T細胞。
(實施例5：表現抗原特異性抑制之實驗) 於本實驗中，確認抗體-刺激者處理後之全部失能細胞之供給者特異性耐受誘導。
(材料及方法) 藉由與實施例1相同之方法，將自野生型B6小鼠(H-2b )獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以來自BALB/c小鼠(H-2b )之脾臟細胞刺激培養而獲得失能細胞。對該失能細胞照射2 Gy之放射線，3天後將其自尾靜脈對移植有BALB/c小鼠或CBA小鼠(H-2k )之心臟之野生型B6小鼠投予5×106 個，觀察心臟之排斥。
(結果) 如圖5所示，於抗CD80/86抗體存在下經Balb/C小鼠脾臟細胞刺激之來自B6小鼠之失能細胞向B6小鼠之移入100%抑制所移植之BALB/c小鼠之心臟之排斥，100天後心臟亦植活，即耐受被誘導。與此相對，作為第三方之CBA小鼠之心臟於移植後迅速引起排斥反應，約50天內被100%排斥。
以上表明，於抗CD80/86抗體存在下與抗原反應之來自宿主之淋巴球具有抑制該抗原特異性之免疫反應之功能。
(實施例6：利用失能細胞之選擇性早期接著之初始細胞之免疫反應抑制) 於本實驗中，確認藉由失能細胞比初始細胞迅速地結合於供給者(刺激者)細胞，而抑制初始細胞之反應及增生。
(材料及方法) 藉由與實施例1相同之方法，將自B6小鼠獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以來自BALB/c小鼠之脾臟細胞刺激而獲得失能細胞。於該實驗中，使用自以恆常表現螢光色素GFP之方式進行基因改型之B6小鼠新獲得之脾臟細胞作為應答者。於12孔板(Corning公司製造，Cat. No.3799)內，以與應答者B6脾臟細胞之比率成為1/2之方式，於上述分別以1×106 個/ml含有應答者B6脾臟細胞及刺激者(供給者)BALB/c脾臟細胞之4 ml之混合培養體系中添加上述失能細胞，於37℃、5%CO2 培養箱中培養。1天後至3天後經時觀察板，並拍攝照片。
(結果) 圖6表示照片之代表性圖像。僅最下段之添加有失能細胞之培養體系中，培養1天後起形成細胞塊(群集)，該情況於僅初始細胞與供給者細胞(由上至下第2段)之系統中未觀察到。因此，推測失能細胞大概以來自BALB/c之細胞為中心形成細胞塊。培養2天之後，初始B6脾臟細胞亦開始形成細胞塊，同時該部位螢光變強。認為該情況係由接著於BALB/c脾臟細胞並反應之發出螢光之初始細胞的增加引起，此種螢光之增強於單獨培養初始細胞之上段、及添加有失能細胞之培養體系中未觀察到。因此，提示初始細胞之增生反應可藉由添加失能細胞而抑制。該結果提示，失能細胞比初始細胞更迅速地接著於供給者細胞，抑制利用初始細胞之供給者細胞之識別(接著)，藉此抑制初始細胞之反應=增生。
(實施例7：發揮免疫抑制功能(失能誘導功能)之細胞之屬性) 於本實驗中，進行確認失能細胞中發揮免疫抑制功能(失能誘導功能)之細胞為CD44陽性之實驗。
(材料及方法) 藉由與實施例1相同之方法，將自野生型B6小鼠獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以BALB/c細胞刺激而獲得失能細胞。利用APC螢光標記抗小鼠CD8抗體(53-6.7; eBioscience #17-0081-82或BioLegend; #100730)、PerCP/Cy5.5螢光標記抗小鼠CD4抗體(RM4-5; eBioscience #45-0042-82或GK1.5; BioLegend; #100434)、及APC/Cy7螢光標記抗小鼠CD44抗體(BioLegend; #1003028)將該失能細胞染色後，使用JSAN細胞分選儀(Bay bioscience公司)將CD8陽性CD44陰性細胞或CD4陽性CD44陰性細胞去除後，添加於混合培養體系中。進而，亦進行使用JSAN細胞分選儀將CD8陽性CD44陽性細胞或CD4陽性CD44陽性細胞純化並添加至混合培養體系中之實驗。
(結果) 如圖7a所示，即便自失能細胞中去除CD8陽性CD44陰性細胞或CD4陽性CD44陰性細胞，亦與添加全部失能細胞同樣地觀察到抑制新混合培養體系中作為應答者細胞之初始B6脾臟細胞之增生。由此表明，CD44陰性細胞不具有免疫抑制作用、即失能誘導功能。進而，如圖7b所示，表明純化出之CD8陽性CD44陽性細胞或CD4陽性CD44陽性細胞即便於單獨情況下亦具有免疫抑制功能，確認此前實施例所示之利用失能CD8陽性細胞或失能CD4陽性細胞之免疫抑制係藉由CD44陽性細胞而發揮。
又，同時藉由FACS研究失能細胞之表型，結果如圖7c所示，失能CD8陽性T細胞中具有較強之免疫抑制功能之失能CD44陽性細胞為16.61%，失能CD4陽性T細胞中具有較強之免疫抑制功能之失能CD44陽性細胞為31.01%。
(實施例8：使用各種抑制因子之免疫耐受之誘發) 於本實施例中，顯示使用各種抑制因子亦可誘發免疫耐受。
(失能細胞之生成) 基本上依照實施例1所記載之方法及已記載於文獻之方法進行實驗(1~3)。接受者PBMC及供給者PBMC分別使用自人末梢血液新鮮分離者，或將-80℃下冷凍保存者急速解凍而使用，該等細胞均藉由包含自體血漿或10%滅活胎牛血清(FCS)(SIGMA #172012-500ML Lot 11D257或biosera #FB-1380/500 Lot.015BS482)之RPMI1640培養基(Sigma；R8758-500MK)調整為4×106 細胞/mL。預先對供給者PBMC照射20 Gy放射線。將該等接受者PBMC與供給者PBMC以1：1混合，於該混合物中添加抑制因子(例如，若為抗CD80抗體/抗CD86抗體，則最終濃度分別為10 μg/ml，若為貝拉西普(或阿巴西普)，則最終濃度為10 μg/ml~40 μg/ml)。培養係利用6 cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat. No.628160)(培養體積3~6 mL)或10 cm培養皿(Corning，Cat. No.430167)(培養體積10~15 mL)於37℃下在5% CO2 培養箱中進行7天(開始培養時之細胞密度為4×106 細胞/mL)。
自培養開始起第7天，藉由離心而將經培養之接受者PBMC回收，利用上述培養基調整為4×106 細胞/mL。於該經培養之接受者PBMC中，以細胞數比成為2：1之方式添加新製備之經照射之供給者PBMC，進而亦添加抑制因子(例如，若為抗CD80抗體/抗CD86抗體，則最終濃度分別為5 μg/ml~10 μg/ml，若為貝拉西普(或阿巴西普)，則最終濃度為10 μg/ml~40 μg/ml)。培養係於與上述相同之條件下進行7天(細胞密度：4×106 細胞/mL)。
(免疫反應抑制功能之評價) 於自培養開始起算第14天藉由離心回收誘導細胞，基本上依照已記載於文獻之方法進行淋巴球混合試驗(3)。將細胞懸浮物於37℃下於5%CO2 培養箱中共培養。於共培養開始第4天添加3H-胸苷(10 μl)，於共培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)去除培養液中之3H-胸苷，測定3H-胸苷摻入量，可確認免疫反應抑制功能。
(實施例9：細胞製劑之品質管理) 關於細胞製劑之製法，參照上述實施例1~7中之記載。對依照實施例製造之細胞製劑，以如下方式進行品質管理。
應滿足之品質標準之代表例如以下所述。
[表4] 最終製品之品質標準
Figure 108121865-A0304-0005
 (細胞製劑之品質管理試驗) 為了藉由本說明書所記載之方法研究例如依照實施例1~7之記載所生成之失能細胞是否符合最終製品之品質標準，而實施以下之試驗。
・外觀 對於懸浮於生理食鹽液中之失能細胞，藉由目視研究外觀。符合品質標準之懸浮液應包含微黃白色~淡黃色之細胞。
・細胞表型及失能細胞之純度 為了針對各表型而藉由流式細胞儀研究失能細胞，例如使用以下之抗體，藉由多重染色進行解析： CD3：FITC螢光標記抗人CD3抗體(UCHT1；eBioscience #11-0038-42)或太平藍(Pacific Blue)螢光標記抗人CD3抗體(UCHT1；Invitrogen #CD0328) CD4：PE螢光標記抗人CD4抗體(RPA-T4；eBioscience #25-0049-42) CD8：APC螢光標記抗人CD8抗體(RPA-T8；eBioscience #17-0088-42) CD25：PerCP(peridinin-chlorophyll-protein，多甲藻葉綠素蛋白)螢光標記抗人CD25抗體 (MEM-181；eBioscience #A15802) CD44：PE-Cy7螢光標記抗人CD44抗體(IM7；eBioscience #25-0441-82) CD45：亮紫(Brilliant Violet)螢光標記抗人CD45抗體(HI30；BioLegend #304032) CD45RA：FITC螢光標記抗CD45RA抗體(ALB11；Beckman Coulter A07786)或PE螢光標記抗CD45RA抗體(ALB11；Beckman Coulter IM1834U) CD45RO：ECD(phycoerythrin-eexas red，藻紅素德州紅)螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Beckman Coulter IM2712U)或PE螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Beckman Coulter A07787)或APC螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Bay biosciences 20-0457) 程序 CD3陽性細胞比率、活細胞中之CD45陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD4陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率及CD3陽性細胞中之CD4陽性CD25陽性細胞比率 使懸浮於生理食鹽液中之失能細胞與上述抗體反應後，使用Zombie NIR Fixable Viability Kit(BioLgened #423106)將死細胞染色。對於該經多重螢光染色之細胞，於FACS Verse (BD Bioscience社)中，確定全部活細胞中之CD3陽性細胞之比率。
符合品質標準之失能細胞應為50%以上之細胞為CD3陽性。同時，基於螢光，確定活細胞中之CD45陽性細胞之比率、存活之全部CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞之比率、CD4陽性CD44陽性細胞之比率、CD8陽性CD45RA陰性細胞之比率、CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞之比率、CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞之比率、CD4陽性CD25陽性細胞之比率。
符合品質標準之失能細胞應為活細胞之95%以上之細胞為CD45陽性，且不以顯著量含有紅血球及血小板等雜質。進而，符合品質標準之失能細胞係CD3陽性細胞集群中5%以上為CD8陽性CD44陽性、5%以上為CD4陽性CD44陽性、5%以上為CD8陽性CD45RA陰性、5%以上為CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性、5%以上為CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性、且5%以上為CD4陽性CD25陽性之細胞。
・安全性 基本上依照日本藥典或相當之各國藥典之記載進行試驗。以下，說明例示性之實施形態。
無菌試驗方法 對失能細胞懸浮液輕輕地進行離心分離，將其上清液供於無菌試驗。於作為日本藥典中具有代表性之無菌試驗之一的直接法中，將上清液接種於大豆酪蛋白消化物培養基或液狀硫代乙醇酸培養基，分別於30~35℃或20~25℃下培養14天以上。其後，於培養期間中數次觀察培養物。於作為另一具有代表性之無菌試驗之膜濾法中，藉由無菌稀釋液(例如，1 g/L之肉製或酪蛋白製蛋白腖溶液(pH值7.1±0.2))稀釋上清液，將經稀釋之上清液轉移至膜濾器上進行過濾。其後將該膜濾器分別放入至上述2種培養基中培養14天以上。於符合品質標準之製品中，於培養期間中及最終日，培養基中不存在肉眼可見之微生物之增生。
內毒素試驗方法 藉由生理食鹽液將失能細胞懸浮液適當稀釋，製備成pH值6.0~8.0。其後，與溶解物試劑混合，以溶解物試液之凝膠形成作為指標(凝膠化法)，或以溶解物試液之凝膠化過程中之濁度變化作為指標(比濁法)或以合成受質之水解引起之顯色作為指標(比色法)，定量求出試樣中之內毒素濃度。視需要進行確認溶解物試劑之顯示感度之預備試驗。於符合品質標準之製品中，內毒素濃度必須未達0.25 EU/mL。
黴漿菌否定試驗 對培養液、或失能細胞懸浮液輕輕地進行離心分離，將其上清液供於黴漿菌否定試驗。於作為日本藥典中具有代表性之黴漿菌否定試驗之一的培養法中，將試樣接種於瓊脂平板培養基中，於包含5~10%之二氧化碳之氮氣中，於合適之濕度下在35~37℃下培養14天以上，或者將試樣接種於裝有液體培養基之容器中，於35~37℃下培養，於觀察到液體培養基之色調變化時，或自開始培養起每隔一定期間自液體培養物中取出等分試樣，接種於新瓊脂平板培養基中繼續培養。其後，以全部瓊脂平板培養基為對象，於第7天及第14天以倍率100倍以上之顯微鏡觀察有無黴漿菌之群落。於作為另一具有代表性之黴漿菌否定試驗之使用指標細胞之DNA染色法中，典型而言，使用作為指標細胞之Vero細胞與指定之黴漿菌菌株。於該方法中，將指標細胞接種於沈有蓋玻璃之培養皿等中，於包含5%二氧化碳之空氣中在35~38℃增生一天。其後添加試樣(培養液或上清液)，於同樣之條件下繼續培養3~6天。將蓋玻璃上之培養細胞固定後，藉由雙苯甲亞胺等染色劑進行DNA螢光染色，以螢光顯微鏡(倍率400~600倍或其以上之倍率)進行鏡檢，與陰性(未接種)對照及黴漿菌陽性對照加以比較，於以包圍細胞核之方式具有微小之核外螢光斑點之細胞存在0.5%以上之情形時，判斷為黴漿菌陽性。符合品質標準之製品應為黴漿菌陰性。
・細胞數 對於懸浮於生理食鹽液中之失能細胞，使用血球計數板於顯微鏡下、或藉由自動細胞計數器測定細胞數。符合品質標準之適於投予之失能細胞數為1×108 ~30×108 個(例如，100 mL生理食鹽液中)，於低於該範圍之情形時，應適當追加細胞。
・活細胞率 將懸浮於生理食鹽液中之失能細胞與0.3~0.5%錐蟲藍染色液(例如，目錄#35525-02、Nacalai Tesque)混合，使用血球計數板於顯微鏡下、或藉由自動細胞計數器測定活細胞數。符合品質標準之製品應70%以上之細胞為活細胞。
(考察) 根據以上結果，證明本發明之組合物： 1)為以CD44陽性CD8陽性T細胞與CD44陽性CD4陽性T細胞為中心之免疫抑制細胞之集群，藉由為混合物，而較強發揮出其性能。 2)提示該細胞集群同時含有FoxP3陽性之regT細胞，又，該regT細胞之抑制功能亦被抗CD80/86抗體存在下之抗原刺激這一誘導失能之培養體系所增強，且於CD44陽性CD8陽性細胞、CD44陽性CD4陽性細胞之存在下，更強地發揮出該抑制功能。 3)於抗CD80/86存在下與抗原反應一次而被選擇成為抗原特異性之失能CD8陽性細胞及失能CD4陽性細胞先於初始細胞識別抗原並將其包覆係免疫抑制之機制之一。該等於先前之免疫排斥抑制實驗中未被判明，因此為非常重要之見解。
該等見解可成為用以抑制免疫排斥之細胞製劑之品質管理中重要之檢查點。
表4所示之最終製品之標準為代表例，細胞表型等之基準值可適當變更，作為其改變例，可列舉表3所記載之例。
參考文獻 以下參考文獻於實施例等中作為基本技術加以參照，並不認為該等文獻相對於本發明而構成先前技術。將該等之內容作為參考引用。 1. Bashuda H, Kimikawa M, Seino K, Kato Y, Ono F, Shimizu A, et al. Renal allograft rejection is prevented by adoptive transfer of anergic T cells in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation. 2005;115(7):1896-902. 2. Bashuda H, Shimizu A, Uchiyama M, Okumura K. Prolongation of renal allograft survival by anergic cells: advantages and limitations. Clin Transplant. 2010;24 Suppl 22:6-10. 3. Luo Z, Gotoh M, Grochowiecki T, Tanaka T, Kimura F, Kawashima H, et al. Anergic T cells generated in vitro suppress rejection response to islet allografts. Transplantation. 2000;69(10):2144-8. 4. Miyao T, Floess S, Setoguchi R, Luche H, Fehling HJ, Waldmann H, et al. Plasticity of Foxp3(+) T cells reflects promiscuous Foxp3 expression in conventional T cells but not reprogramming of regulatory T cells. Immunity. 2012;36(2):262-75. 5. Davies JK, Barbon CM, Voskertchian A, Nadler LM, Guinan EC. Ex vivo alloanergization with belatacept: a strategy to selectively modulate alloresponses after transplantation. Cell transplantation. 2012;21(9):2047-61. 6. Davies JK, Gribben JG, Brennan LL, Yuk D, Nadler LM, Guinan EC. Outcome of alloanergized haploidentical bone marrow transplantation after ex vivo costimulatory blockade: results of 2 phase 1 studies. Blood. 2008;112(6):2232-41. 7. Davies JK, Nadler LM, Guinan EC. Expansion of allospecific regulatory T cells after anergized, mismatched bone marrow transplantation. Science translational medicine. 2009;1(1):1ra3. 8. Davies JK, Yuk D, Nadler LM, Guinan EC. Induction of alloanergy in human donor T cells without loss of pathogen or tumor immunity. Transplantation. 2008;86(6):854-64. (註釋) 如以上所述，已使用本發明之較佳之實施形態例示本發明，但業界理解，本發明應僅由申請專利之範圍解釋其範圍。理解本說明書中所引用之專利、專利申請案及其他文獻應與將其內容本身具體記載於本說明書中之程度同樣地將其內容作為對本說明書之參考而援引。本申請案對日本專利申請案特願2018-119001(2018年6月22日提出申請)主張優先權主張之利益，理解於本案中該申請案之內容(可為全部)係作為參考而被援引。又，日本專利申請案特願2018-118996及日本專利申請案特願2018-119003(均於2018年6月22日提出申請)以及對該等主張優先權之國際申請案之內容係其一部分或全文作為參考被援引至本說明書中。 [產業上之可利用性]
本發明提供一種包含經誘導對特定之抗原具有特異性之免疫耐受之細胞的醫藥組合物。本發明提供一種可於基於此種技術之製劑等相關之產業(製藥)中利用之技術。
圖1表示特定出用以誘發免疫耐受所必需之成分之功能喪失分析之結果。(i)失能細胞之生成：自C57BL6(以下簡記為B6)小鼠及BALB/c小鼠摘下脾臟，獲得脾臟細胞(淋巴球)。其後，對成為刺激者之BALB/c脾臟細胞照射放射線(γ射線)30 Gy後，將其與來自B6之脾臟細胞以1：1混合，將抗CD80抗體與抗CD86抗體以最終濃度分別成為10 μg/mL之方式添加，於合適之體積之培養液中在37℃、5%CO2 培養箱中開始培養。自培養開始起第7天，藉由離心去除培養液後，重新於與培養開始時相同之條件下添加含有來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。於培養第14天回收細胞而獲得失能細胞。(ii)各細胞表型之篩選：使所獲得之失能細胞與PE(Phycoerythrin，藻紅素)螢光標記抗CD8抗體進行反應後，藉由使用抗PE磁珠之自動磁性細胞分離裝置(auto-MACS)，將細胞篩選區分為CD8陽性與CD8陰性。又，使用PE螢光標記CD19抗體進行同樣之操作，將細胞篩選區分為CD19陽性與CD19陰性。進而，以可藉由細胞表面抗原之表現識別FOXP3表現控制性T細胞(regT細胞)之方式，使用以應答者細胞同時表現FoxP3與人CD2之方式進行了基因改型之來自B6之小鼠，藉由使用PE螢光標記抗人CD2抗體與抗PE磁珠之auto-MACS，篩選區分人CD2陽性細胞(表現FoxP3之regT細胞)與人CD2陰性細胞，用於免疫反應抑制功能試驗。(iii)免疫反應抑制功能試驗：使用新採集之來自B6小鼠之脾臟細胞作為應答者，又，使用新採集之BALB/c小鼠之脾臟細胞作為刺激者，於96孔板之各孔中以200 μL之體積製作以1：1之比率含有各細胞之混合培養物(每孔之各細胞數為1×105 個)。對於該混合培養物，以與應答者B6脾臟細胞之細胞數之比率成為1、1/2、1/4、1/8、或1/16之方式，添加未進行任何篩選之全部失能細胞(圖1a)、僅有失能CD8陽性細胞之細胞集群或去除失能CD8陽性細胞之剩餘細胞集群(圖1b)、僅有regT細胞之細胞集群或去除regT細胞之剩餘細胞集群(圖1c)、或者僅有CD19陽性細胞(B細胞)之細胞集群或去除B細胞之剩餘細胞集群(圖1d)，於37℃、5%CO2 培養箱中培養。於培養開始第4天添加3 H-胸苷，於培養開始第5天(添加3 H-胸苷之16~20小時後)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3 H-胸苷摻入量。各圖中，「naive」係僅有應答者之孔，「allo」係僅有應答者與刺激者之孔，將「naive」之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1而作圖。 圖2(圖2a、圖2b)表示利用CD80/86阻斷之抑制功能獲得分析之結果。藉由與實施例1相同之方法，對於自野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行了基因改型之來自B6之小鼠分別獲得之脾臟細胞，利用來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體進行處理，獲得失能細胞。使自野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行了基因改型之來自B6之小鼠獲得之無刺激之初始脾臟細胞與該失能細胞一起分別與PE螢光標記抗小鼠CD8抗體或PE螢光標記抗人CD2抗體進行反應。其後，藉由使用抗PE磁珠之auto-MACS，將細胞篩選區分為CD8陽性與CD8陰性、或人CD2陽性與人CD2陰性。將篩選出之各細胞添加至實施例1所記載之96孔板上之混合培養體系中，研究其免疫抑制功能。各圖中，「naive」(更準確而言，i表示分音符號(上方有2個點)；本說明書中相同)係僅有應答者之孔，「allo」係僅有應答者與刺激者之孔，將「naive」之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1而作圖。 圖3表示藉由使用小鼠之實驗確認失能誘導後之純化細胞於移植後是否具有耐受誘導能力之結果。藉由與實施例1相同之方法，對於野生型B6小鼠及以同時表現FoxP3與人CD2之方式進行了基因改型之來自B6之小鼠之脾臟細胞，利用來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體進行處理，獲得失能細胞。藉由與實施例1相同之方法從所獲得之失能細胞(全部失能細胞)中篩選CD8陽性細胞、CD4陽性細胞或人CD2陽性細胞。對野生型B6小鼠照射2 Gy之放射線(γ射線)，3天後移植BALB/c小鼠之心臟，然後立即(或與心臟移植同一天內)自尾靜脈投予初始B6脾臟細胞或所獲得之失能細胞，觀察心臟之排斥。以各組5隻以上進行實驗。圖3a表示不移植失能細胞之情形、或者投予2×106 個、4×106 個或6×106 個全部失能細胞之情形時之心臟移植小鼠之累積存活。圖3b表示對接受者小鼠照射放射線之效果。分別進行不對接受者小鼠照射放射線+全部失能細胞5×106 個、對接受者小鼠照射2.5 Gy放射線+初始B6脾臟細胞4×106 個、或對接受者小鼠照射2.5 Gy放射線+全部失能細胞4×106 個之處置，追蹤其後之小鼠之存活。圖3c及圖3d表示投予各種純化細胞集群之情形時之心臟移植小鼠之存活。 圖4表示來自人PBMC之失能細胞之能力。(i)失能細胞之生成：自4位志願者(以2人作為刺激者、2人作為應答者)之人末梢血液中分離單核細胞(PBMC)，對刺激者PBMC照射放射線(γ射線)30 Gy，與應答者PBMC以1：1混合。以最終濃度分別成為10 μg/mL之方式於混合而成之PBMC中添加抗人CD80抗體與抗人CD86抗體，於合適之體積之培養液中在37℃、5%CO2 培養箱中開始培養。自培養開始起第7天，藉由離心去除培養液後，於與開始培養時相同之條件下添加含有放射線照射過之刺激者PBMC與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。於培養第14天回收細胞，藉由離心洗脫(washout)培養液，獲得失能細胞。(ii)各細胞表型之篩選：藉由PE螢光標記小鼠抗人CD25抗體、FITC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)螢光標記小鼠抗人CD4抗體、APC(Allophycocyanin，別藻藍蛋白)螢光標記小鼠抗人CD8抗體將所獲得之失能細胞染色後，使用JSAN細胞分選儀(Bay bioscience公司)將各細胞純化。(iii)免疫反應抑制功能試驗：將新採集之同一志願者之PBMC用作應答者、刺激者，於96孔板之各孔中以200 μL之體積製作以1：1之比率含有各細胞之混合培養物(每孔之各細胞數為2×105 個)。對於該混合培養物，以與應答者PBMC之細胞數之比率成為1/2、1/4、1/8、或1/16之方式添加全部失能細胞，於37℃、5%CO2 培養箱中培養(圖4a)。於圖4b中，對於上述混合培養物，以與應答者PBMC之細胞數之比率分別成為1/2之方式添加純化出CD25陽性細胞之細胞集群(CD25+)、純化出CD4陽性CD25陽性regT細胞之細胞集群(CD4+CD25+)、或添加純化出之CD4陽性CD25陽性regT細胞及純化出之CD8陽性細胞而成之細胞集群(CD25+/CD8+)。於圖4c中，對於上述混合培養物，以與應答者PBMC之細胞數之比率成為1/2、1/4、1/8、或1/16之方式，添加純化出CD4陽性細胞之細胞集群、純化出CD4陰性細胞之細胞集群、或全部失能細胞，並比較免疫抑制功能。各圖中，「naive」係僅應答者之孔，「allo」係僅應答者與刺激者之孔，將「naive」之3 H-胸苷摻入量之平均值設為1而作圖。 圖5係表示利用失能細胞之免疫抑制對抗原具有特異性之圖。該圖表示於抗CD80/86抗體存在下將由Balb/C小鼠脾臟細胞刺激之來自B6小鼠之失能細胞移入B6小鼠後之心臟之植活率。100%抑制所移植之BALB/c小鼠之心臟之排斥，即便100天後心臟亦植活，與此相對，作為異體(第三方)之CBA小鼠之心臟於移植後迅速引起排斥反應，顯示約50天內被100%排斥。 圖6表示藉由失能細胞比初始細胞迅速地結合於供給者(刺激者)細胞，而抑制初始細胞之反應及增生。藉由與實施例1相同之方法，對於自B6小鼠獲得之脾臟細胞，利用來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體進行處理，獲得失能細胞。於該實驗中，使用自以恆常表現螢光色素GFP(green fluorescent protein，綠色螢光蛋白)之方式進行基因改型之B6小鼠新獲得之脾臟細胞作為應答者。於12孔板內，以與應答者B6脾臟細胞之比率成為1/2之方式，於上述分別以1×106 個/ml含有應答者B6脾臟細胞及刺激者(供給者)BALB/c脾臟細胞之4 ml之混合培養體系中添加上述失能細胞，於37℃、5%CO2 培養箱中培養。於開始培養1天後至3天後經時觀察板，並拍攝照片。 圖7表示失能細胞中發揮免疫抑制功能(失能誘導功能)之細胞為CD44陽性。藉由與實施例1相同之方法，對於自B6小鼠獲得之脾臟細胞，利用來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體進行處理，獲得失能細胞。藉由PE螢光標記抗小鼠CD8抗體、PE螢光標記抗小鼠CD4抗體、及APC螢光標記抗小鼠CD44抗體將該失能細胞染色後，使用JSAN細胞分選儀去除CD8陽性CD44陰性細胞或CD4陽性CD44陰性細胞製作細胞集群，以與應答者B6脾臟細胞之比率成為1/2、1/4、1/8、或1/16之方式將該細胞集群或全部失能細胞添加至混合培養體系中(圖7a)。進而，使用JSAN細胞分選儀純化出CD8陽性CD44陽性細胞或CD4陽性CD44陽性細胞而製作細胞集群，以與應答者B6脾臟細胞之比率成為1/2、1/4、或1/8之方式添加至混合培養體系中(圖7b)。圖7c表示藉由FACS研究失能細胞之表型所得之結果。

Claims (56)

  1. 一種醫藥組合物，其包含： CD4陽性失能T細胞、及 CD8陽性失能T細胞。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中上述失能T細胞係藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子所誘導。
  3. 如請求項2之醫藥組合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
  4. 如請求項3之醫藥組合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
  5. 如請求項4之醫藥組合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
  6. 如請求項4之醫藥組合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
  7. 如請求項3至6中任一項之醫藥組合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
  9. 如請求項1至8中任一項之醫藥組合物，其進而包含控制性T細胞。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物，其中上述控制性T細胞為FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性。
  11. 一種醫藥組合物，其係包含經可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞者，且該組合物包含CD8陽性細胞，進而，該組合物包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種以上。
  12. 如請求項5之醫藥組合物，其包含FOXP3陽性細胞、CD4陽性細胞及CD8陽性細胞之全部。
  13. 如請求項11或12之醫藥組合物，其中上述CD8陽性細胞為CD44陽性。
  14. 如請求項11或12之醫藥組合物，其中上述CD8陽性細胞為CD45RA陰性且CD45RO陽性。
  15. 如請求項11至14中任一項之醫藥組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD4陽性。
  16. 如請求項11至15中任一項之醫藥組合物，其中上述FOXP3陽性細胞為CD25陽性。
  17. 如請求項1至16中任一項之醫藥組合物，其中上述醫藥組合物用於抗原特異性之免疫耐受或免疫抑制。
  18. 如請求項3之醫藥組合物，其中上述抗體包含抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之組合。
  19. 如請求項2至18中任一項之醫藥組合物，其中上述細胞係藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原、或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合之步驟誘導的細胞。
  20. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至19中任一項之組合物，用於處置或預防由來自受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。
  21. 如請求項20之醫藥組合物，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中上述移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。
  23. 如請求項20至22中任一項之醫藥組合物，其中上述抗原含有物為細胞。
  24. 一種製造包含細胞之醫藥之方法，該方法包括如下步驟： (A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物加以混合； (B)確認由該混合獲得之細胞產物包含CD8陽性細胞；及 (C)確認該細胞產物包含FOXP3陽性及CD4陽性之至少1種細胞。
  25. 如請求項24之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
  26. 如請求項25之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
  27. 如請求項26之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
  28. 如請求項26之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
  29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  30. 如請求項29之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
  31. 如請求項17之方法，其中上述細胞產物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞產物可用作醫藥。
  32. 如請求項24至31中任一項之方法，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。
  33. 如請求項24至32中任一項之方法，其中上述步驟(B)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(C)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。
  34. 如請求項33之方法，其中上述檢測係藉由FACS實施。
  35. 一種管理醫藥品質之方法，該醫藥包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該方法包括如下步驟： (A)確認該細胞包含CD8陽性細胞、及 (B)確認該細胞包含FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞。
  36. 如請求項35之方法，其中上述步驟(A)包括藉由抗CD8抗體檢測CD8，上述步驟(B)包括藉由抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體檢測FOXP3及CD4之至少1種。
  37. 如請求項36之方法，其中上述檢測係藉由FACS、西方墨點法、或PCR實施。
  38. 一種用以製造如請求項1至23中任一項之醫藥組合物之組合物，其包含抑制因子，且該抑制因子為可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子。
  39. 如請求項38之組合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
  40. 如請求項39之組合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
  41. 如請求項40之組合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
  42. 如請求項40之組合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
  43. 如請求項39至42中任一項之組合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  44. 如請求項43之組合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
  45. 一種用於製造包含細胞之混合物之醫藥的套組，該套組包含： (A)可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、 (B)用以檢測CD8之機構、及 (C)用以檢測FOXP3及CD4之至少一者之機構。
  46. 如請求項45之套組，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
  47. 如請求項46之套組，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
  48. 如請求項47之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
  49. 如請求項47之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
  50. 如請求項46至49中任一項之套組或方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  51. 如請求項51之套組或方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
  52. 如請求項45至52中任一項之套組，其中上述細胞之混合物中之CD8陽性細胞之存在、以及FOXP3陽性細胞及CD4陽性細胞之至少1種細胞之存在表明上述細胞之混合物可用作醫藥。
  53. 如請求項45至53中任一項之套組，其中上述醫藥用於處置或預防由上述來自受驗體之抗原或上述不來自受驗體之抗原產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態。
  54. 一種用於管理醫藥品質之套組，該醫藥包含用於處置或預防由在來自受驗體之細胞表現之抗原或不來自該受驗體之抗原所產生之該受驗體之疾病、障礙或狀態的細胞，該套組包含： (A)用以檢測CD8之機構、及 (B)用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構。
  55. 如請求項45至55中任一項之套組，其中上述用以檢測CD8之機構包含抗CD8抗體，用以檢測FOXP3及CD4之至少1種之機構包含抗FOXP3抗體及抗CD4抗體之至少1種抗體。
  56. 如請求項56之套組，其中上述檢測係藉由FACS、西方墨點法、或PCR進行。
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