JP2016520081A - 調節性ｔ細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

本出願は調節性Ｔ細胞の生成、特に抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体の存在下で生成されるものに関係する。本出願は、臓器移植を受ける被験体の処置における調節性Ｔ細胞の使用にも関係する。本出願は、移植組織片を受ける被験体の処置における調節性Ｔ細胞の使用にも関係する。調節性Ｔ細胞は、１以上の抗体と共に被験体に投与されてもよい。【選択図】図８Ｂ

Description

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１３年５月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８２４，５９０号の利益を主張し、該仮出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。

肝臓移植は、末期の肝不全の患者に対する最終的な処置として広く使用されてきた。毎年、海外では２０，０００の症例があり、日本では５００を超える症例がある。

移植は、末期の腎臓、心臓、肝臓、及び膵臓の臓器不全に対する選択の主な処置の１つであり、近年における移植拒絶反応の処置の著しい進歩にもかかわらず、移植の大部分は最終的には拒絶される。連続的な薬物療法に依存する現在の免疫抑制レジメンは、薬物までもが移植に対して明確に向けられた反応を阻害することができないので、臓器移植患者に、感染症や癌に対する感受性の増加を生じやすくしてしまう。

本明細書には、免疫応答により媒介される被験体の疾病を処置する方法が提供され、該方法は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物を前記被験体に投与する工程であって、それにより調節性Ｔリンパ球の集団を生じさせる、工程を含む。

１つの実施形態において、組成物は、ＣＤ８０に特異的に結合する抗体と、ＣＤ８６に特異的に結合する抗体とを含む。

別の実施形態において、抗体は、ＣＤ８０上で１以上のエピトープに、及び、ＣＤ８６上で１以上のエピトープに結合する。

また別の実施形態において、抗体はＣＤ８０及びＣＤ８６を遮断する及び／又は中和する。

また、本明細書には、調節性Ｔリンパ球の集団を生じさせるエキソビボでの方法が提供され、該方法は、同種抗原又は非細胞性タンパク質抗原（ｎｏｎ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）を提示する細胞の存在下で、ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む組成物を用いてＴ細胞を培養する工程を含む。

１つの実施形態において、非細胞性タンパク質抗原は、ヒト・ガンマ・グロブリン、ウマ・ガンマ・グロブリン、又はオバルブミンである。

別の実施形態において、Ｔ細胞はレシピエント動物から得られ、同種抗原を提示する細胞は、ドナー動物から得られる細胞、又はドナー動物から得た抗原でパルスされた（ｐｕｌｓｅｄ）細胞の何れかである。

また、本明細書には、上記方法により調製される細胞培養物が提供され、該細胞培養物は、培地中でエキソビボの方法により得られる培養細胞を含む。１つの実施形態において、ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体は前記培地から取り除かれる。抗体は、例えば細胞を洗浄して、それらを培地中で再構成することにより、培養培地から取り除かれてもよい。これらの方法から得られた細胞は、必要とするレシピエント被験体に更に投与されてもよい。

また、本明細書には、レシピエント被験体の臓器又は組織移植の拒絶反応を抑える方法が提供され、該方法は、次の工程を含む：（ａ）レシピエント被験体からＴ細胞のサンプルを得る工程；（ｂ）移植されている臓器又は組織のソースであるドナー被験体から同種抗原のサンプルを得る工程；（ｃ）ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む組成物の存在下で、同種抗原の前記サンプルにＴ細胞の前記サンプルを曝露する工程であって、それにより調節性Ｔリンパ球の集団を含む組成物を生じさせる、工程；及び（ｄ）調節性Ｔリンパ球の前記集団を含む組成物をレシピエント被験体に投与する工程。工程（ｃ）は、工程（ｄ）の前に前記組成物から抗体を取り除く工程を更に含んでもよい。

１つの実施形態において、約１×１０^９乃至約１×１０^１５の細胞は、前記レシピエント被験体に投与されてもよい。調節性Ｔリンパ球の集団は、臓器又は組織の移植の前、同時、又はその後に、レシピエント被験体に投与される。１つの実施形態において、被験体はヒトである。

別の実施形態において、方法は、レシピエント被験体に１以上の免疫抑制薬を投与する工程を更に含んでもよい。免疫抑制薬の限定しない例は、例えば、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）等）、アドリアマイシン、アザチオプリン（ＡＺ）、ブスルファン、シクロホスファミド、デオキシスパガリン（ＤＳＧ）；ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド、化学名：２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］−１，３−プロパンジオール塩酸塩とも称される）、フルダラビン、５−フルオロウラシル、レフルノミド（ＬＥＦ）；メトトレキサート、ミゾリビン（ＭＺ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、非ステロイド性抗炎症剤、シロリムス（ラパマイシン）、副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾロンとメチルプレドニゾロン）、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ２８を遮断する薬剤、抗体（例えばムロモナブ−ＣＤ３、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、抗胸腺細胞グロブリンなど）、及びそれらの組み合わせを含む。１以上の免疫抑制薬は、臓器又は組織の移植の前、同時、又はその後に、レシピエント被験体に投与されてもよい。

＜参照による組み込み＞
本明細書に言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

実施形態の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本実施形態の特徴及び利点のより良い理解は、実施形態の原理が利用される、具体例を明記する後述の詳細な説明、及び以下の添付図面を参照することによって得られる。
図１のＡ−Ｄは、典型的な培養の前後の表面抗原分析に関するフローサイトメトリーの結果を示す。調節性Ｔ細胞マーカーが、抗ＣＤ８０と抗ＣＤ８６抗体の存在下で、照射された第２群のヒト体皮細胞（刺激物）による培養後、ヒト体皮細胞中に現われた。フローサイトメトリー・プロットは、０日目（左のパネル、ＡとＣ）及び培養後１４日目（右のパネル、ＢとＤ）に、ＣＤ２５とＦｏｘＰ３（上部；図１のＡとＢ）、及びＣＤ２５とＣＴＬＡ−４（下部；図１のＣとＤ）について染色された抗原反応性細胞を示した。 図２のＡ−Ｂは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における、ＣＤ８０とＣＤ８６を備えた培養細胞による抑制効果を示す。（ＣＤ８０とＣＤ８６を備えた以前に培養した第２群の細胞を加える際の）一方向のＭＬＲにおいて、新鮮なヒト体皮細胞は、照射された第２群の細胞に対する増殖反応を抑えられ（上部のグラフ；図２のＡ）、照射された第３群の細胞に対する優れた反応を示し（下部のグラフ；図２のＢ）、抑制効果が抗原特異性であることを示す。それらの実験は、２人の健康な人の末梢の白血球を使用して行われる。図２のＡは、調節性Ｔ細胞の培養において使用されるドナーの抗原（放射されたリンパ球）を使用したＭＬＲの結果を示し、図２のＢは、第３群のドナー（放射されたリンパ球）からの抗原のＭＬＲの結果を示す。各グラフ上のカラム１乃至３は、レシピエントのリンパ球、放射されたリンパ球、及び２週間培養されたリンパ球が個々に培養される時の細胞増殖を示す。カラム４は、ドナーの抗原（放射されたリンパ球）（対照）による共培養及び刺激の追加後の、レシピエントのリンパ球の細胞増殖である。このシステムにおける培養細胞の１／１、１／２、及び１／４の量を加えた結果は、カラム５乃至７に示されるが、培養細胞を加えることにより、リンパ球の増殖は強く阻害され、細胞数の追加は、１／４（０．２５×１０^５）においてさえも強力な免疫抑制効果を示す。 連続する洗浄後に抗ＣＤ８０と抗ＣＤ８６抗体が培地から取り除かれることを実証する、様々な研究に関するＥＬＩＳＡ結果を提供する。 図４のＡ−Ｄは、典型的な培養の前後の表面抗原分析に関するフローサイトメトリーの結果を示す。調節性Ｔ細胞マーカーは、ＣＤ８０とＣＤ８６の存在下で、ドナー細胞（抗原刺激物）と共に共培養されることにより、レシピエントＴ細胞において誘導される。図２に記載される誘導法によって、レシピエント体皮細胞は、ＣＤ８０／８６に対する抗体の存在下で、照射されたドナー細胞と共に培養された。それらの表現型はまた、培養の０日目（左のパネル；図４のＡとＣ）と１４日目（右のパネル；図４のＢとＤ）に、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（上部パネル；図４のＡとＢ）及びＣＤ２５＋ＣＴＬＡ−４＋（下部パネル；図４のＣとＤ）であった。 図５のＡ−Ｂは、処置レジメンの実例及び移植後のＣｓＡレベルを提供する。図５のＡは、レジメン（グループＡ）の概略図を提供する。ＣｓＡ（８ｍｇ／ｋｇ／ｄ）は、アスタリスクによって示された日に筋肉内に投与された。ＣＰ（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＰＯＤ６、７、及び８にて筋肉内に投与された。操作中、脾臓はドナーとレシピエントの両方から取り除かれた。レシピエントの脾臓Ｔ細胞は、抗ＣＤ８０／ＣＤ８６ ｍＡｂの存在下で１３日間、照射されたドナー脾細胞と共に共培養され、レシピエントに注入された。その後、これ以上免疫抑制は与えられなかった。図５のＢは、レシピエント（グループＡ）におけるＣｓＡ全血レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフを提供する。ＣｓＡ（８ｍｇ／ｋｇ）は、操作の日から移植の７日後まで毎日、及び、その後９、１１、並びに１３日目に筋肉内に注入された。実線、１年以上生存する動物（ｎ＝３）；点線、１年以内に死亡する動物（ｎ＝３）。 図６のＡ−Ｂは、実施例に記載されるような症例２に関するプロトコルの実例を提供する。簡潔に、１．５×１０^９の調節性Ｔ細胞は、手術後２週間で注入され、免疫抑制剤（シクロスポリン（ＣＹＡ）：３００ｍｇ／日、ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｅｉｌ）（ＭＭＦ）：２０００ｍｇ／日、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）：５００ｍｇ／日）は、徐々に減らされる（図６のＡ）。処置後、２２５日目の用量は、ＣＹＡ５００ｍｇ／日及びＭＭＦ５０ｍｇ／日であり、ＭＰは完全に中止される（図６のＢ）。 図７のＡ−Ｄは、図６に示された症例２のプロトコルの誘導された調節性Ｔ細胞のフローサイトメトリーを提供する。この図は、培養の０日目（左のパネル；図７のＡとＣ）及び２週間後（右のパネル；図７のＢとＤ）に、ＣＤ４^＋細胞のために選別された細胞集団におけるＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞（上部パネル；図７のＡとＢ）及びＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（下部パネル；図７のＣとＤ）を示す。 症例５のＭＬＲ阻害効果の結果を提供する。（インビトロ（図８Ａ）において試験される）調節性細胞は、ドナーの抗原特異性のリンパ球増殖を阻害する。 症例５のＭＬＲ阻害効果の結果を提供する。（肝臓移植患者（症例５；図８Ｂ）において試験される）調節性細胞は、ドナーの抗原特異性のリンパ球増殖を阻害する。

移植組織がレシピエントの免疫系によって拒絶される場合、移植拒絶反応が生じて、移植組織を破壊する。移植拒絶反応は、ドナーとレシピエントの間の分子の類似の判定により、及び、移植後の免疫抑制薬の使用により和らげることができる。本発明者は、臓器移植の拒絶を抑えるのに有用な調節性Ｔ細胞の新たな亜群を同定した。

＜肝臓移植における従来の免疫抑制療法の問題＞
肝臓移植は、末期の肝不全の患者に対する最終的な処置として広く使用されてきた。肝臓移植のこの発展は、外科技術、臓器保存、及び手術前と手術後の管理等の進歩に依存するが、中でも、免疫抑制剤における改善がそれに対して非常に貢献してきた。１年と５年の生存率は、使用されてきたアザチオプリン（１９６０−７０年代）、シクロスポリン（１９８０年代）、及びタクロリムス（１９９０年代以来）により、３５％と２０％、７０と６０％、及び８０％と７０％、それぞれ劇的に増大した（引用文献１、２）。世界初の臨床的な肝臓移植は１９６３年に実行された。現在まで、３００，０００を超える症例が実行され、毎年海外では２０，０００を超える症例があり、日本では５００を超える症例がある。これらの患者は、拒絶反応を制御するために生涯、免疫抑制剤を摂取しなければならず、常に感染症及び発癌性などの薬物により誘発される副作用の危険性に曝されるので、医薬と医療の経済の両方に影響を与える、重要な未解決の問題が存在する。これらの問題を排除するために、いわゆる免疫寛容の誘導が必要とされ、それにより、免疫抑制剤が中止されたとしても移植片が適切に機能する。

ＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー（Ｔ_Ｈ）リンパ球は、健常人において、例えば細菌とウィルスなどの病原体から被験体を守る免疫応答における不可欠な役割を果たす細胞である。しかし、被験体が移植臓器を受け取る場合、これらの細胞は主に臓器移植の拒絶反応を引き起こす。ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とする抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制剤の投与によって、臓器移植の拒絶を減ずることができることが、以前に判定された。近年、抗体療法は、幾つかの例において、有害な拒絶応答を制御する又は調節することができるＴ細胞の亜母集団の生成に通じることが示された。抗ＣＤ４抗体の存在が完全なＴ細胞活性化を妨げるので、調節性細胞はそのような例において生成され得、細胞は調節性又は抑制性の表現型に初期化される（ｄｅｆａｕｌｔ）。

＜免疫寛容及び調節性Ｔ細胞＞
１９７０年代前半から、抑制的な（サプレッサー）Ｔ細胞が、小動物を使用する自己免疫疾患と臓器移植のモデルにおける免疫寛容の状態を持つレシピエントにおいて見出され、このリンパ球は、未処置の（ｎａｉｖｅ）宿主へ、養子移入によって免疫寛容（感染性寛容）を移すことができる。

これらの発見物は、サプレッサーＴ細胞に関する研究を進めた。共同調査者であるＯｋｕｍｕｒａ（引用文献３）は、１９７０年代前半に世界で初めて、このサプレッサーＴ細胞を発表した移植免疫の分野における第一人者である。サプレッサーＴ細胞に関する研究は、その細胞学的同定方法を確立するのが難しかったために否定されたことがあるが、近年、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋及びＦｏｘｐ３^＋などの表現型／マーカーが発見され、調節性Ｔ細胞：Ｔｒｅｇは再び注目を集め（引用文献４）、インビトロ及び小動物の移植モデルに集中して同じ細胞を使用する効果が、多くの研究において報告された。

＜調節性Ｔ細胞のエキソビボの誘導及び増殖＞
同種異型の臓器移植における移植片の移植片拒絶反応は、レシピエントの細胞媒介性免疫によって主に引き起こされる。この細胞媒介性免疫がドナー抗原特異反応であるので、樹状細胞などの抗原提示細胞によって提示されたドナー抗原は、ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞を認識し、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞が活性化され、拒絶反応が最終的に引き起こされる。同時刺激は、ヘルパーＴ細胞の活性化において必要とされ、１９９０年代前半に初めて知られたものであるが、Ｏｋｕｍｕｒａらのグループは、同時刺激は、Ｔ細胞上のＣＤ２８の、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６の上にある抗原提示細胞への結合によって伝えられ、レシピエントＴ細胞は、細胞培養において、抗ＣＤ８０抗体と抗ＣＤ８６抗体を加えることにより、ドナー抗原提示細胞に対する免疫応答を引き起こさず、その結果、ドナーの抗原特異性アネルギーの状態に通じることを、見出した。最近の研究において、アネルギーＴ細胞はドナーの抗原特異性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）として作用すると見出された。加えて、共同調査者である、Ｏｋｕｍｕｒａ、Ｂａｓｈｕｔａ、Ｓｅｉｎｏらは、リンパ球培養培地において抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体を加えることにより、エキソビボで抗原特異性のＴｒｅｇ様の細胞を誘導することに成功し、採取した細胞を注入することによりマウス心臓移植モデルにおける長期的な移植片生着を確証した（引用文献６）。更に、サル腎臓移植モデルを使用する前臨床試験のために同じプロトコルを試みる研究において、移植の２週間前及び２週間後の、ドナーの脾細胞と抗ＣＤ８０／ＣＤ８６抗体の下での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の共培養及び誘導から採取されたＴｒｅｇ様の細胞のレシピエントへの注入により、免疫抑制剤であるシクロスポリンの初期の退薬が可能となり、移植腎は長期間（＞６００日）の生着を達成し、ドナーの抗原特異性の免疫寛容は、免疫抑制遊離状態でさえも成功裡に誘導された（引用文献７）。

＜抗体、調節性Ｔ細胞の生成、細胞培養、及びその用途＞
本明細書には、免疫応答により媒介される被験体の疾病を処置する方法が提供され、該方法は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物を、前記被験体に投与する工程であって、それにより調節性Ｔリンパ球の集団を生じさせる、工程を含む。

１つの実施形態において、組成物は、ＣＤ８０に特異的に結合する抗体と、ＣＤ８６に特異的に結合する抗体とを含む。

別の実施形態において、抗体は、ＣＤ８０上で１以上のエピトープに、及び、ＣＤ８６上で１以上のエピトープに結合する。

また別の実施形態において、抗体はＣＤ８０及びＣＤ８６を遮断する及び／又は中和する。

また別の実施形態において、抗原結合性フラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄフラグメント、可変性の重鎖、可変性の軽鎖、ｄＡｂフラグメント、ＡＶＩＭＥＲ、二重特異性抗体、又は重鎖二量体でもよい。重鎖二量体は例えば、ラクダ又はサメの重鎖構成物でもよい。

ＣＤ８０又はＣＤ８６に特異的に結合する任意の抗体は、例えば、以下の実施例に見出されるものなど、本明細書に記載される組成物において使用されてもよい。市販で入手可能な抗体及びハイブリドーマは、例えばＡＴＣＣから得てもよい；可変性の重鎖及び軽鎖の配列は、例えばＮＣＢＩ ＰｕｂＭｅｄなどの公開データベースで見出されてもよい；及び、Ｂａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどの企業も、商業上、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体を生産する。

本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、天然であるか、又は部分的或いは完全に合成して製造されたかにかかわらず、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインであるか、又はそれに相同する結合ドメインを有する、任意のポリペプチド又はタンパク質を包含する。この用語は更に、「抗原結合性フラグメント」、及び、下記のような同様の結合フラグメントと交換可能な他の用語を含む。

天然の（Ｎａｔｉｖｅ）抗体及び天然の免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は典型的に１つの共有結合のジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスフィルド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の中で異なる。重鎖と軽鎖は各々、規則的に間隔を空けた鎖内のジスルフィド架橋を有する。重鎖は各々、一端に、多くの不変ドメイン（「Ｃ_Ｈ」又は「ＣＨ」）が後続する可変性ドメイン（「Ｖ_Ｈ」又は「ＶＨ」）を有する。軽鎖は各々、一端に可変性ドメイン（「Ｖ_Ｌ」又は「ＶＬ」）を、他端に不変ドメイン（「Ｃ_Ｌ」又は「ＣＬ」）を有しており；軽鎖の不変ドメインは重鎖の第１不変ドメインと位置合わせされ、軽鎖の可変性ドメインは重鎖の可変性ドメインと位置合わせされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変性ドメインの間に界面を形成すると考えられる。

用語「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」、又は「合成ポリペプチド」は、本明細書で使用されるように、対応するポリヌクレオチド配列又はその一部、或いはアミノ酸配列又はその一部が、設計され、新たに合成され、修飾され、又は同等な自然発生の配列と比較された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体又は抗原結合フラグメント）或いは合成遺伝子は、当該技術分野で既知の方法によって調製することができ、限定されないが核酸又はアミノ酸配列の化学合成を含む。合成遺伝子は典型的に、アミノ酸又はポリヌクレオチドのレベル（或いはその両方）の何れかにおいて自然発生の遺伝子とは異なり、及び、典型的には合成発現調節配列のコンテキスト内に位置付けられる。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然の遺伝子と比較して、必ずしも異なるアミノ酸でタンパク質をコード化せず；例えば、それらはまた、異なるコドンを組み込むが同じアミノ酸をコード化する、合成ポリヌクレオチド配列を包含し得る（即ち、ヌクレオチドの変化はアミノ酸レベルにおけるサイレント変異を表わす）。

抗体に関して、用語「可変性ドメイン」は、その特定の抗原に関する個々の特定の抗体の結合及び特異性において使用される、抗体の可変性ドメインを指す。しかし、可変性は、抗体の可変性ドメインの至る所で平等に分布されない。むしろ、それは、軽鎖と重鎖に可変性ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメント（ＣＤＲとしても知られる）に集中される。可変性ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と呼ばれる。未修飾の重鎖及び軽鎖の可変性ドメインは各々、４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を含んでおり、大部分が、ループ接合を形成する３つのＣＤＲが散在したβ−シート構成、及び、幾つかの場合にはβ−シート構造の一部を採用する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによって近接して共に保持され、他の鎖のＣＤＲにより、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）， ｐａｇｅｓ ６４７−６６９を参照）。

用語「超可変領域」及び「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、抗原に相補的な様式で結合する３つの配列領域からのアミノ酸残基を含み、ＶＨ及びＶＬの鎖の各々についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として知られている。軽鎖可変性ドメインにおいて、ＣＤＲは典型的に、およその残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）、及び８９−９７（ＣＤＲＬ３）に相当し、重鎖可変性ドメインにおいて、ＣＤＲは典型的に、「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））」に従い、およその残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）、及び９５−１０２（ＣＤＲＨ３）に相当する。異なる抗体のＣＤＲが挿入物を含み、故にアミノ酸のナンバリングが異なり得ることを理解されたい。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムは、異なる抗体間のナンバリングにおける任意の挿入を反映するために、特異的な残基（例えば、軽鎖においてＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、及び２７Ｆ）に付けられる文字を利用する、ナンバリング機構によりそのような挿入物を含む（ａｃｃｏｕｎｔｓ ｆｏｒ）。代替的に、軽鎖可変性ドメインにおいて、ＣＤＲは典型的に、およその残基２６−３２（ＣＤＲＬ１）、５０−５２（ＣＤＲＬ２）、及び９１−９６（ＣＤＲＬ３）に相当し、重鎖可変性ドメインにおいて、ＣＤＲは典型的に、「Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６： ９０１−９１７ （１９８７））」に従いおよその残基２６−３２（ＣＤＲＨ１）、５３−５５（ＣＤＲＨ２）、及び９６−１０１（ＣＤＲＨ３）に相当する。

本明細書で使用されるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、抗原結合ポケット又は溝の一部を形成するフレームワーク・アミノ酸残基を指す。幾つかの実施形態において、フレームワーク残基は、抗原結合ポケット又は溝の一部であるループを形成し、ループ中のアミノ酸残基は抗原に接触することもあれば、しない場合もある。フレームワーク領域は通常、ＣＤＲの間に領域を含む。軽鎖可変性ドメインにおいて、ＦＲは典型的に、およその残基０−２３（ＦＲＬ１）、３５−４９（ＦＲＬ２）、５７−８８（ＦＲＬ３）、及び９８−１０９に相当し、重鎖可変性ドメインにおいて、ＦＲは典型的に、「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））」に従いおよその残基０−３０（ＦＲＨ１）、３６−４９（ＦＲＨ２）、６６−９４（ＦＲＨ３）、及び１０３−１３３に相当する。軽鎖に関するＫａｂａｔのナンバリングについて上記で議論したように、重鎖も、同様の様式で挿入物を占める（例えば、重鎖においてＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。代替的に、軽鎖可変性ドメインにおいて、ＦＲは典型的に、およその残基０−２５（ＦＲＬ１）、３３−４９（ＦＲＬ２）、５３−９０（ＦＲＬ３）、及び９７−１０９（ＦＲＬ４）に相当し、重鎖可変性ドメインにおいて、ＦＲは典型的に、「Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６： ９０１−９１７ （１９８７））」に従いおよその残基０−２５（ＦＲＨ１）、３３−５２（ＦＲＨ２）、５６−９５（ＦＲＨ３）、及び１０２−１１３（ＦＲＨ４）に相当する。

抗体の不変ドメイン（Ｆｃ）は、抗体の抗原への結合に直接関係しないが、むしろ、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介した抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。Ｆｃドメインはまた、患者への投与後に、循環における抗体のバイオアベイラビリティを増加させることができる。マウスＦｃドメインのヒトＦｃドメインへの置換はまた、側部のＨＡＭＡ反応を減少させることができる。

重鎖の不変領域のアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンは異なる分類に割り当てることができる。５つの主要な分類の免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びにこれらの幾つかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けることができる。異なる分類の免疫グロブリンに相当する、重鎖不変ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なる分類の免疫グロブリンのサブユット構造及び三次元配置は、周知である。

任意の脊椎動物種の抗体の「軽鎖」は、不変ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ又は（κ）及びラムダ又は（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てることができる。

用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合性フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗体フラグメント」、又は「抗体の機能性フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントに言及するために、本明細書で互換的に使用される。そのような用語の中に含まれる抗体フラグメントの限定しない例は、限定されないが、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、及びＣ_Ｈ１のドメインから成る一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含有する二価フラグメント）；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨとＣ_Ｈ１のドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈのドメインを含有するＦｖフラグメント；（ｖ）Ｖ_Ｈドメインを含有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６）；及び（ｖｉ）分離されたＣＤＲを含む。加えて、この定義において、単一の重鎖及び単一の軽鎖を含む「半分の」抗体が含まれる。二重特異性抗体などの単鎖抗体の他の形態も本明細書に包含される。

「Ｆ（ａｂ’）_２」及び「Ｆａｂ」の部分は、ペプシン及びパパインなどプロテアーゼによりＩｇを処置することによって作成され得、２つの重鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリンを消化することにより生成される抗体フラグメントを含む。例えば、パパインは、２つの重鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合のＩｇＧの上流（ＩｇＧ ｕｐｓｔｒｅａｍ）を切断することで、２つの同種抗体フラグメントを生成し、そこでは、Ｖ_Ｌ及びＣ_Ｌ（軽鎖定常領域）で構成される軽鎖、及び、重差の定常領域におけるＶ_Ｈ及びＣ_Ｈγ１（γ１）領域で構成される重鎖フラグメントは、ジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で接続される。これら２つの同種抗体フラグメントの各々はＦａｂ’と呼ばれる。ペプシンも、２つの重差の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合のＩｇＧの下流を切断することで、２つの上述のＦａｂ’がヒンジ領域で接続されるフラグメントより僅かに大きな抗体フラグメントを生成する。この抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）_２と呼ばれる。

Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ドメイン及び重鎖の第１不変ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域から１以上のシステインを含む重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシル末端で、少数の残基を追加することにより、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、不変ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に係る、本明細書における指定である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’の対として製造される。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む抗体フラグメントを指す。この領域は、堅い、非共有結合の、又は共有結合の関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）において１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変性ドメインの二量体から成る（ジスルフィドが結合したＦｖ’ｓは、当該技術分野、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１２３９−１２４５に記載された）。この構成において、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために、個々の可変性ドメインの３つのＣＤＲが相互に作用する。総じて、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの鎖の各々からのＣＤＲの１つ以上の組み合わせが、抗体に抗原結合特異性を与える。例えば、ＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ３が、レシピエント抗体又はその抗原結合性フラグメントのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの鎖に移された場合に抗体に抗原結合特異性を与えるのに十分であり、ＣＤＲのこの組み合わせは、本明細書に記載される技術を用いて、結合や親和性などについて試験することができることを、理解されたい。単一の可変性ドメイン（又は、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえ、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、親和性はおそらく、第２可変性ドメインと組み合わさった場合よりも低い。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（Ｖ_ＬとＶ_Ｈ）は別個の遺伝子によってコード化されるが、それらは、対となりＶ_ＬとＶ_Ｈの領域が一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作られることを可能にする合成リンカーによる組み換え方法を使用して、連結され得る（単一の鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：７７８）。そのようなｓｃＦＶはまた、抗体の用語「抗原結合部分」の中に包含されるように意図される。特異的なｓｃＦｖの任意のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列は、完全なＩｇ（例えばＩｇＧ）分子又は他のアイソタイプをコード化する発現ベクターを生じさせるために、Ｆｃ領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に結合され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌはまた、タンパク質化学又は組み換えＤＮＡ技術の何れかを使用した、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はＩｇの他のフラグメントの生成において使用することができる。

「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」の抗体フラグメントは、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌのドメインを含み得、ここで、これらドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。幾つかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にする、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌのドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの評価については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）を参照。

用語「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」は、ヒト起源の治療用タンパク質の分類を指し、これは、抗体と抗体フラグメントとは関係がなく、Ａ−ドメインと称される（分類Ａモジュール、補体タイプの繰返し、又はＬＤＬ−レセプターの分類Ａドメインとも称される）、様々なモジュラー及び再使用可能な結合ドメインで構成される。それらは、インビトロのエクソンシャフリング及びファージディスプレイにより、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１４９３−１４９４； Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：２２０）。結果として生じるタンパク質は、単一のエピトープの結合タンパク質と比較して改善された親和性（幾つかの場合、ナノモル以下（ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ））及び特異性を示すことができる、複数の独立した結合ドメインを含むことができる。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号、第２００５／０１６４３０１号、第２００５／００５３９７３号、及び第２００５／００８９９３２号、第２００５／００４８５１２号、並びに第２００４／０１７５７５６号を参照し、その各々は、全体において参照により本明細書に組み込まれる。

既知の２１７ヒトＡ−ドメインの各々は、〜３５アミノ酸（〜４ｋＤａ）を含む。これらのドメインは、長さが平均５のアミノ酸となるリンカーによって分離される。天然のＡドメインは、主としてカルシウム結合とジスルフィド形成によって媒介される、均一で安定した構造へと迅速且つ効率的に折り重なる。１２のアミノ酸のみの保存されたスカホード・モチーフは、この共通構造に必要とされる。最終的な結果は複数のドメインを含む単一タンパク質鎖であり、その各々は別個の機能を表わす。タンパク質のドメインは各々独立して結合し、各ドメインのエネルギー的寄与は付加的である。これらのタンパク質は、結合活性マルチマーから「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」と呼ばれた。

用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を備える小さな抗体フラグメントを指し、フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対にすることを可能にするには短すぎるリンカーの使用によって、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対になり、且つ２つの抗原結合部位を生成することを強いられる。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：６４４４ ６４４８（１９９３）においてより十分に記載される。

抗原結合ポリペプチドはまた、例えばラクダ及びサメの抗体などの重鎖二量体を含む。ラクダ及びサメの抗体は、Ｖ様及びＣ様のドメイン（何れも軽鎖がない）の２つの鎖の同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）の対を含む。ラクダにおける重鎖二量体ＩｇＧのＶ_Ｈ領域が、軽鎖との疎水的相互作用を行う必要はないので、通常軽鎖に接触する重鎖における領域は、ラクダにおける親水性アミノ酸残基に変更される。重鎖二量体ＩｇＧのＶ_ＨドメインはＶ_ＨＨドメインと呼ばれる。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変性ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインを称される）及び５つのＣ様の不変ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。ラクダにおいて、抗体多様性のレパートリーは、Ｖ_Ｈ又はＶ_ＨＨの領域におけるＣＤＲ１、２、及び３によって判定される。ラクダのＶ_ＨＨ領域におけるＣＤＲ３は、平均１６のアミノ酸となる、その相対的に長い長さを特徴とする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（９）： １１２９）。これは、他の多くの種の抗体のＣＤＲ３領域と対照的である。例えば、マウスＶ_ＨのＣＤＲ３には平均９のアミノ酸がある。ラクダ由来の抗体可変領域のライブラリ（ラクダの可変領域のインビボの多様性を維持する）は、例えば米国特許出願第２００５００３７４２１号に開示された方法によって作ることができる。

非ヒト（例えばマウス）抗体の「キメラ」形態は、非ヒトＩｇに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体を含む。大部分では、キメラ抗体はマウス抗体であり、ここで、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンのものは、マウスＦｃの適所に挿入される。詳しくは、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２９ （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２： ５９３−５９６ （１９９２）を参照。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるように、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生の変異体を除いては同一である集団を含む。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。更に、異なる決定因子（エピトープ）に向けられる異なる抗体を含み得る従来の（多クローン性）抗体の製剤とは対照的に、モノクローナル抗体は各々、抗原上にある単一の決定因子に向けられる。修飾因子「単クローン」は、抗体のほぼ均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されることはない。例えば、モノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）」に最初に記載されるハイブリドーマ方法によって作られ得、又は、組み換えＤＮＡ方法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作られ得る。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば「Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８ （１９９１）」及び「Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７ （１９９１）」に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから分離することができる。

抗体は、飽和した硫酸アンモニウムの沈殿、真性グロブリン沈澱法、カプロン酸方法、カプリル酸方法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２）、或いは、以下に詳述されるような抗Ｉｇカラム又はタンパク質Ａ、Ｇ、又はＬのカラムを使用する親和性クロマトグラフィーにより、上述の培養上清又は腹水から分離され、且つ精製され得る。

免疫グロブリン分子を構築する場合、可変領域又はその一部は、本明細書に記載される抗体の何れかを作り出すために１以上の定常領域又はその一部に融合、接続、又はさもなくば連結され得る。これは、限定されないが、分子をコード化する核酸の分子クローニング技術又は直接合成を含む、当該技術分野で既知の様々な方法で達成されてもよい。

本明細書で使用されるように、「免疫反応性」は、アミノ酸残基（「結合部位」又は「エピトープ」）の配列に特異的である結合剤、抗体、又はそのフラグメントを指すが、他のペプチド／タンパク質に交差反応する場合、それらがヒトへの使用のための投与のために処方されるレベルで有毒ではない。用語「結合」は、例えば生理学的条件下での共有結合、静電気、疎水性、並びにイオン及び／又は水素結合の相互作用による、２つの分子間の直接会合（ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指し、塩架橋及び水架橋、及び他の従来の結合手段などの相互作用を含む。用語「優先的に結合する」は、結合剤が、関連しないアミノ酸配列に結合するよりも優れた親和性をもって結合部位に結合することを意味する。親和性は、関連しないアミノ酸配列のための結合剤の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、又は、少なくとも１０００倍大きい場合がある。用語「免疫反応性」及び「優先的に結合する」は、本明細書で互換的に使用される。

本明細書で使用されるように、用語「親和性」は、２つの薬剤の可逆的結合に関する平衡定数を指し、Ｋｄとして表される。エピトープに関する抗体の親和性など、リガンドへの結合タンパク質の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）乃至約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ乃至約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ乃至約１フェムトモル（ｆＭ）であり得る。本明細書で使用されるように、用語「結合活性」は、希釈後の分離に対する２以上の薬剤の複合体の抵抗性を指す。明白な親和性は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、又、当業者に精通する任意の他の技術などの方法により判定することができる。結合活性は、スキャチャード解析、又は、当業者に精通する任意の他の技術等の方法により判定することができる。

「エピトープ」は、抗体の可変領域結合ポケットとの結合相互作用を形成することができる、抗原又は他の高分子の一部を指す。そのような結合相互作用は、１以上のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明示することができる。抗原結合は、例えば、ＣＤＲ３又はＣＤＲ３の対、或いは、幾つかの場合において、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌの鎖の合計６のＣＤＲまでの相互作用に関与することができる。エピトープは、直線ペプチド配列（即ち、「連続的」）であり得るか、又は、非隣接アミノ酸配列（即ち、「立体構造的」又は「不連続」）で構成され得る。抗体は１以上のアミノ酸配列を認識することができ；それ故、エピトープは１より多くの異なるアミノ酸配列を定義することができる。抗体により認識されたエピトープは、当業者に周知のペプチドマッピングと配列分析の技術によって判定することができる。結合相互作用は、ＣＤＲの１以上のアミノ酸残基との分子間接触として明示することができる。

用語「特異的な」は、抗体によって認識されたエピトープを含有する抗原以外の分子への任意の有意な結合を抗体が示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多くの抗原によって運ばれる特定のエピトープに特異的な場合に適用可能であり、その場合、抗体はエピトープを運ぶ多様な抗原に結合することができる。用語「優先的に結合する」又は「特異的に結合する」は、抗体が関連しないアミノ酸配列に結合するよりも大きな親和性によりエピトープに結合するが、エピトープを含有する他のポリペプチドに交差反応する場合、ヒトへの使用のための投与のために処方されるレベルでは有毒ではないことを意味する。１つの態様において、そのような親和性は、関連しないアミノ酸配列のための抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、又は、少なくとも１０００倍大きい場合がある。用語「免疫反応性」、「結合する」、「優先的に結合する」、及び「特異的に結合する」は、本明細書で互換的に使用される。用語「結合」は、例えば生理学的条件下での共有結合、静電気、疎水性、並びにイオン及び／又は水素結合の相互作用による、２つの分子間の直接会合を指し、塩架橋及び水架橋、同様に、他の従来の結合の手段などの相互作用を含む。

「分離された」（「ほぼ純粋」と互換的に使用される）は、ポリペプチドに適用される場合、ポリペプチド又はその一部を意味し、それは、その起源又は操作により：（ｉ）発現ベクターの一部の発現生成物として宿主細胞に存在し；又は（ｉｉ）自然に結合するもの以外の、タンパク質又は他の化学部分に結合し；又は（ｉｉｉ）自然に生じず、例えば、少なくとも１つの疎水性部分をタンパク質に補われるか又は追加されることにより化学的に操作されるタンパク質であり、それにより該タンパク質は自然には見出されない形態である。「分離される」ことにより、それは更に、（ｉ）化学合成される；又は（ｉｉ）宿主細胞中で発現され、及び関連し且つ混在するタンパク質から遠ざけて精製される、タンパク質を意味する。この用語は一般的に、自然に発生する他のタンパク質と核酸から分離されたポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドはまた、それを精製するために使用される抗体又はゲルマトリックス（ポリアクリルアミド）などの物質から分離される。

また、本明細書には、調節性Ｔリンパ球の集団を生じさせるエキソビボでの方法が提供され、該方法は、同種抗原又は非細胞性タンパク質抗原を提示する細胞の存在下で、ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む組成物を用いてＴ細胞を培養する工程を含む。１つの実施形態において、非細胞性タンパク質抗原は、ヒト・ガンマ・グロブリン、ウマ・ガンマ・グロブリン、又はオバルブミンである。

細胞は、臓器又は移植片の移植を受ける被験体によって得られてもよい。例えば、Ｔ細胞はレシピエント動物から得られ、同種抗原を提示する細胞は、ドナー被験体から得られる細胞、又はドナー被験体から得た抗原でパルスされた細胞の何れかである。

また、本明細書には、上記方法により調製される細胞培養物が提供され、該細胞培養物は、培地中でエキソビボの方法により得られる培養細胞を含む。１つの実施形態において、ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体は前記培地から取り除かれる。抗体の除去は、実施例に記載されるものなどの任意の因習的に容認された研究室方法によるものでもよい。抗体は、例えば細胞を洗浄して、細胞を培地中で再構成することにより、培養培地から取り除かれてもよい。これらの方法から得られた細胞は、必要とするレシピエント被験体に更に投与されてもよい。任意の商業上許容可能な培地（例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等）は、従来の研究室方法に従う条件下で細胞を培養するために使用されてもよい。

培養後、本明細書に記載される処置方法において使用される調節性Ｔ細胞は、例えばＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、及びＦｏｘｐ３^＋などの細胞表面マークを示す。

また、本明細書には、レシピエント被験体の臓器又は組織移植の拒絶反応を抑える方法が提供され、該方法は、次の工程を含む：（ａ）レシピエント被験体からＴ細胞のサンプルを得る工程；（ｂ）移植されている臓器又は組織のソースであるドナー被験体から同種抗原のサンプルを得る工程；（ｃ）ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む組成物の存在下で、同種抗原の前記サンプルにＴ細胞の前記サンプルを曝露する工程であって、それにより調節性Ｔリンパ球の集団を含む組成物を生じさせる、工程；及び（ｄ）調節性Ｔリンパ球の前記集団を含む組成物をレシピエント被験体に投与する工程。工程（ｃ）は、工程（ｄ）の前に前記組成物から抗体を取り除く工程を更に含んでもよい。

１つの実施形態において、約１×１０^９乃至約１×１０^１５の細胞は、前記レシピエント被験体に投与されてもよい。被験体に投与される細胞の数は、レシピエント被験体の年齢、体重、身長、及び健康状態に基づき、医師の経験に基づいて判定されてもよい。調節性Ｔリンパ球の集団は、臓器又は組織（移植片）の移植の前、同時、又はその後に、レシピエント被験体に投与される。１つの実施形態において、被験体はヒトである。被験体への細胞又は抗体の投与は、例えば注射又は点滴等の任意の手段によるものでもよい。

本明細書には、発作の多様な様式を防ぐ又は阻害するために（例えば、Ｔ細胞発作の阻害、抗体反応の阻害、及びサイトカインと補体の効果の阻害）、移植片又は臓器の拒絶反応を阻害する又は遅らせる方法が提供される。レシピエントに一致させるためのドナーの予備検査が、特に超急性拒否反応を妨げる際に、拒絶反応を妨げるのを支援するために実行される。

本実施形態のために、「治療上有効な量」は、従来の意味において、即ち、処置される被験体に健康的な利便性を提供し、それにより一実施形態において移植臓器が拒絶されないのに十分な量を意味する。別の実施形態において、治療上有効な量は、処置される被験体に健康的な利便性を提供するのに十分な量であり、それにより、一実施形態において、拒絶までの時間は、処置を受けていない被験体と比較して、約１ヵ月、約６ヶ月、約１２か月、約１．５年、約２年、約３年、約４年、約５年、約１０年、約１５年、約２０年以上遅らされる。

本明細書に記載されるレシピエントは、例えば、造血細胞又は骨髄移植、膵島細胞の同種移植、又は、心臓移植、腎臓−膵移植、腎移植、肝移植、肺移植、及び膵移植から成る群から選択された固形臓器移植のレシピエントでもよい。移植片又は移植体の付加的な例は、限定されないが、維管束組織、目、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、軟骨、肝細胞、又は造血細胞などの、同種移植した細胞、組織、又は臓器を含む。幾つかの実施形態において、移植片拒絶反応は、移植した細胞、組織、又は臓器の急性の体液性拒絶反応である。他の実施形態において、移植片拒絶反応は、移植した細胞、組織、又は臓器の慢性の体液性拒絶反応である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団は移植前に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団は移植の時間に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団は移植後に投与される。

本明細書に記載される方法において使用されてもよい特異的なプロトコルの限定しない例は、実施例と図面においてより詳細に提供される。

更なる薬物が、幾つかの例に必要とされるように、移植片拒絶反応を遅らせるため（即ち、移植片生着又は臓器移植のレシピエントの生存を延ばすため）に利用されてもよい。本明細書に記載される方法の何れかは、別の処置と共に施されてもよい。例えば、患者は処置中に１つ以上の免疫抑制薬を投与されてもよい。免疫抑制薬は、免疫系が臓器移植を拒絶するのを妨げることを支援するものでもよい。免疫抑制薬の限定しない例は、限定されないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）等）、アドリアマイシン、アザチオプリン（ＡＺ）、ブスルファン、シクロホスファミド、デオキシスパガリン（ＤＳＧ）；ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド、化学名：２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］−１，３−プロパンジオール塩酸塩とも称される）、フルダラビン、５−フルオロウラシル、レフルノミド（ＬＥＦ）；メトトレキサート、ミゾリビン（ＭＺ）；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、非ステロイド性抗炎症剤、シロリムス（ラパマイシン）、副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾロンとメチルプレドニゾロン）、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ２８を遮断する薬剤、抗体（例えばムロモナブ−ＣＤ３、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、抗胸腺細胞グロブリンなど）、又はそれらの組み合わせを含む。

シクロスポリンＡは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の阻害により、移植片拒絶反応を阻害するための最も広く使用された免疫抑制薬の１つである（それは、インターロイキン−２のｍＲＮＡ転写を妨げる）。より直接的に、シクロスポリンは、Ｔ細胞受容体刺激後に通常生じるカルシニューリン活性化を阻害する。カルシニューリンは、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）を脱リン酸化し、それにより、ＮＦＡＴは、核に侵入してインターロイキン−２促進剤に結合することが可能となる。このプロセスを遮断することにより、シクロスポリンＡは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と、その他に生じる事象の結果として生じるカスケードを阻害する。タクロリムスは、カルシニューリン阻害を介してインターロイキン−２の産生を阻害することにより作用する、別の免疫抑制剤である。ラパマイシン（シロリムス）、ＳＤＺ ＲＡＤ、及びインターロイキン−２受容体遮断薬は、インターロイキン−２の作用を阻害し、それ故、上述の事象のカスケードを妨げる薬物である。プリン又はピリミジンの生合成の阻害剤も、移植片拒絶反応を阻害するために使用される。これらの阻害剤はＤＮＡ合成を妨げ、それにより、Ｔ細胞の増殖を含む細胞***を阻害する。結果は、新たなＴ細胞の形成を妨げることによるＴ細胞活性の阻害である。プリン合成の阻害剤は、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びミゾリビン（ブレジニン）を含む。ピリミジン合成の阻害剤は、ブレキナル・ナトリウム及びレフルノミドを含む。シクロホスファミドは、プリン及びピリミジンの合成の両方の阻害剤である。Ｔ細胞活性化を阻害する別の方法は、Ｔ細胞に特異的に結合する抗体によりレシピエントを処置することである。例えば、ＯＫＴ３はＣＤ３に対するマウス・モノクローナル抗体である。この抗体は、最初にＴ細胞受容体を介してＴ細胞を活性化し、その後、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する。

同種移植拒否反応を遅らせるための他の薬物及び方法が利用可能である。１つの方法は、例えば照射によりＴ細胞を消耗することである。特に主要なＨＬＡの部分的なミスマッチがある場合、Ｔ細胞の消耗は骨髄移植において頻繁に使用されてきた。レシピエントは、ＣＤ４０リガンド−ＣＤ４０の相互作用の阻害剤（遮断薬）を投与されてもよい。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団及び免疫抑制剤は移植前に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団及び免疫抑制剤は移植の時間に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載される細胞の集団及び免疫抑制剤は移植後に投与される。

本出願は、本出願の例示的な実施形態として提供される以下の限定しない実施例への言及により、より良く理解されるであろう。以下の実施例は、より完全に実施形態を示すために提示されるものであるが、本出願の広範な範囲を制限するもととは解釈されるべきではない。

＜調節性Ｔ細胞の調製＞
＜組成物＞
１００ｍｌの食塩水において抗ＣＤ８０抗体（２Ｄ１０．４）と抗ＣＤ８６（ＩＴ２．１）の存在下で２週間培養することにより採取された細胞を懸濁することで、ドナーのリンパ球と患者のリンパ球を得る。

＜原材料＞
主な原材料は以下の通りである。

１． ドナーのリンパ球：構成成分の血液採取デバイス（４×１０^９以上の）に収集される末梢血単核細胞。

２． 患者（レシピエント）のリンパ球：構成成分の血液採取デバイス（５×１０^９以上の）に収集される末梢血単核細胞。

リンパ球の量が適切でない場合、患者の脾臓由来のリンパ球を加える。

３． Ｂａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．の抗ＣＤ８０抗体（２Ｄ１０．４）；品質規格：非ＧＭＰ製造（ｎｏｎ−ＧＭＰ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、エンドトキシン無し。

４． Ｂａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．の抗ＣＤ８６抗体（ＩＴ２．２）；品質規格：非ＧＭＰ製造、エンドトキシン無し。

＜作用機構＞
培養した調節性Ｔ細胞による免疫寛容の誘導を予測する。

＜効果＞
セクション２．４に記載した作用機構に従い、免疫抑制剤の用量を減らし、肝臓移植後の初期に中止することが予測される。

＜製造法＞
製造法を試験物質の標準手順に記載する。主な製造プロセスは以下の通りである。

１． ４×１０^９より多くの単核細胞を、構成成分の血液採取デバイスを使用してドナーの末梢血から採取し、凍結保存する。

２． ５×１０^９より多くの単核細胞を、構成成分の血液採取デバイスを使用して患者の末梢血から採取する。細胞の数が十分でない場合、肝臓移植の時点で除去した脾臓からリンパ球を採取し、加えることが可能である。

３． ドナーの単核細胞２×１０^９を解凍し、患者の血漿、抗ＣＤ８６抗体、及び抗ＣＤ８０抗体の存在下で患者の単核細胞と共に共培養する。

４． 培養細胞を１週後に回収し、再度、ドナーの単核細胞２×１０^９を解凍し、患者の血漿、抗ＣＤ８６抗体、及び抗ＣＤ８０抗体の存在下で患者の単核細胞と共に共培養する。

５．１週後、培養細胞を回収して洗浄し、１００ｍｌの食塩水中で懸濁する。

＜品質規格＞
品質規格を試験物質の標準手順に記載する。中間の試験物質と最終試験物質の品質規格は、以下の通りである。中間の試験物質のサンプルを、最終試験物質の調製の４日前に培養培地から採取する。最終試験物質のサンプルを、最終試験物質の採取直後に細胞懸濁液から採取する。

＜非臨床研究の結果＞
健康なヒトの末梢血サンプルの小規模培養試験

＜試験方法＞
一方はドナーに類似し、他方は患者（レシピエント）に類似する、２人の健康な成人から末梢血を採取し、少数の細胞を使用する。調節性Ｔ細胞の誘導実験を、同じ条件として製造法及び使用された抗体と共に実行する。培養前後の細胞に関して、細胞数と表面抗原を解析し、ＭＬＲにより免疫抑制の効果を調べた。

＜調節性Ｔ細胞の誘導の結果＞
上述の方法に従い、実験を４回実行した。結果の要約を表１に示す。

合計のリンパ球数は、培養前の２３．８９±１１．３９×１０^６から、２週間の培養後に６．８０±７．４６×１０^６に達する。現在の培養系に残存することができないリンパ球の特異的な画分、及び他の白血球の死滅により、この細胞の数の減少が考慮される。

表面抗原の解析に従い、これらリンパ球の表現型を解析し；ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞の２週間の培養に従い、４０．８３±３．５２％から５５．０１±５．３９％までの約１５％の増加を認識する。他方、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞は、０．２１±０．０４％から２．７３±１．２７％までの比率において１０倍より多く増加した。故に、調節性Ｔ細胞は、現在の培養系によって選択的に誘導されるものと考慮される。更に、ＣＤ４^＋細胞の中の比率に関して、それは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞に関して１．２９±０．６０％から６．１６±２．０１％に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞に関して１．９０±１．２７％から４．６８±１．４９％に、及び、ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦｏｘｐ３^＋細胞に関して１．０４±０．７９％から２．４０±２．２４％に、それぞれ増加した。

図１は、典型的な培養の前後の表面抗原分析に関するフローサイトメトリーの結果を示す。この図は、ＣＤ４^＋細胞からＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞とＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞を示す。

＜培養細胞の特性＞
培養後に、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞の比率は著しく増加したが、その頻度は数パーセントに留まる。試験物質の特性を理解するために、培養細胞に従って表面抗原を解析することにより、試験物質に含まれた細胞の画分を調べた。上記の実験から採取した細胞を使用して、実験を４回行った。結果を表２に示す。

培養細胞の中で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は５５．０１±５．３９％を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は２６．５±４．６８％を含み、Ｔ細胞は８０％より多くを含む。これとは対照的に、Ｂ及びＮＫ細胞は、それぞれ５．９８±０．８５％と２．８１±１．４５％を含む。加えて、単球は４．８３±３．４１％を含む。更に、樹状細胞は２．３％を含み、顆粒球は約０．２％を含む。

＜培養細胞の免疫抑制効果＞
次に、誘導した調節性Ｔ細胞を含有する細胞の免疫抑制効果を示すために、ＭＬＲ方法を使用して実験を行った。３つの実験の結果の概要を図２に示す。

図の上のグラフは、調節性Ｔ細胞の培養において使用されるドナーの抗原（放射されたリンパ球）を使用したＭＬＲの結果を示し、下のグラフは、第３群のドナー（放射したリンパ球）からの抗原のＭＬＲの結果を示す。各グラフ上のカラム１乃至３は、レシピエントのリンパ球、放射されたリンパ球、及び２週間培養されたリンパ球が個々に培養される場合の細胞増殖を示す。カラム４は、ドナーの光源（放射されたリンパ球）（対照）による共培養及び刺激の追加後の、レシピエントのリンパ球の細胞増殖である。このシステムにおける培養細胞の１／１、１／２、及び１／４の量を加えた結果は、カラム５乃至７に示されるが、培養細胞を加えることにより、リンパ球の増殖は強く阻害され、細胞数の追加は、１／４（０．２５×１０^５）においてさえも強力な免疫抑制効果を示す。

＜洗浄後の残りの抗体に関する研究＞
培養に使用される抗体が、患者に投与される最終試験物質に残らないことが望ましい。このため、この研究の試験物質の製造プロセスに関して、洗浄剤の数を研究するために、洗浄剤の数と抗体の残りの量を小規模の試験で調べた（ｎ＝４）。この研究に使用する抗ヒトＣＤ８０及びＣＤ８６抗体に関して、アイソタイプはマウスＩｇＧであり；これらの抗体の残りの量に関しては、ＥＬＩＳＡを使用してマウスＩｇＧを測定することにより研究された。洗浄を合計４回行い、毎時間の残りの抗体濃度を４つの試験において研究した。結果を図３に示す。残りの抗体は一度洗浄した後に全ての場合に見出され、抗体は、２回の洗浄後、４つ事例のうち３つにおいて検知可能ではなく、残りの抗体は３回以上の洗浄後ではいかなる場合でも見られない。それ故、この研究における試験物質の製造プロセスにおける４回の洗浄により、抗体が試験物質に残り、患者の体に入る危険性を回避することができる。

＜アフェレーシスにより健康なヒトから採取した細胞の大規模の培養試験＞
＜試験方法＞
構成成分の採取方法（アフェレーシス）を使用して、一方はドナーに類似し、他方は患者（レシピエント）に類似する２人の健康な成人から末梢血単球を採取し、実際の細胞治療のための細胞に類似する多数の細胞を使用する。調節性Ｔ細胞の誘導実験を、同じ条件として製造法及び使用された抗体と共に実行する。加えて、培養前後の細胞に関して、細胞数と表面抗原を解析した。

＜調節性Ｔ細胞の誘導の結果＞
上述の方法に従い、実験を実行した。結果の要約を表３に示す。

合計のリンパ球数は、培養前の１０．９５×１０^９から、２週間の培養後に３．１４×１０^９に達する。現在の培養系に残存することができないリンパ球の特異的な画分、及び他の白血球の死滅により、この細胞の数の減少が考慮され、これらは、小規模の培養試験におけるものに類似する。加えて、この細胞数は「４つの以前に実行した臨床研究」において示される。Ｔｏｋｙｏ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅの腎臓移植に対する調節性Ｔ細胞治療において、それは、実際の処置において細胞の数に匹敵し、適切にこの試験を行なう証拠の１つであると考慮される。

表面抗原の解析に従い、これらリンパ球の表現型を解析し；ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞の２週間の培養に従い、４３．３％から５４．４％までの約１１％の増加を見出す。他方、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞は、０．３６％から４．４１％までの比率において１２倍より多く増加した。故に、現在の培養系によって選択的に誘導されるので、調節性Ｔ細胞は考慮され、それは小規模試験の結果に類似する。

更に、ＣＤ４＋細胞の中の比率に関して、それは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞に関して１．２％から９．２％に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞に関して０．７％から１４．１％に、及び、ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦｏｘｐ３^＋細胞に関して１．６％から３．３％に、それぞれ増加した（表３）。

図４は、典型的な培養の前後の表面抗原分析に関するフローサイトメトリーの結果を示す。この図は、ＣＤ４^＋細胞からＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞とＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞を示す。

これらの結果は、「４つの以前に実行した臨床研究」において示される。Ｔｏｋｙｏ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅの腎臓移植に対する調節性Ｔ細胞治療において、細胞は、実際の処置におけるものとほぼ同一である。この研究から得た細胞を用いて、Ｔｏｋｙｏ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅで以前に行われた臨床研究と同等の効果が得られることが予測される。

＜培養細胞の特性＞
培養後に、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞の比率は著しく増加したが、その頻度は数パーセントに留まる。試験物質の特性を理解するために、培養細胞に従って表面抗原を解析することにより、試験物質に含まれた細胞の画分を調べた。結果を表４に示す。

培養細胞の中で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は５４．４％を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は３０．０％を含み、Ｔ細胞は８４％より多くを含む。これとは対照的に、Ｂ及びＮＫ細胞は、それぞれ６．５％と７．４％を含む。加えて、単球は１％を含む。更に、樹状細胞は０．２％を含み、顆粒球は約０．１％を含む。

＜動物を使用する調節性Ｔ細胞治療の研究＞
＜マウスを使用する研究＞
本発明者は、リンパ球培養培地において抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体を加えることにより、エキソビボで抗原特異性のＴｒｅｇ様の細胞を誘導することに成功し、採取した細胞を注入することによりマウス心臓移植モデルにおける長期的な移植片生着を確証した（引用文献６）。

＜サルを使用する研究＞
サル腎臓移植モデルを使用する非臨床試験のために同じプロトコルを試みる研究において、移植の２週間前及び２週間後の、ドナーの脾細胞と抗ＣＤ８０／ＣＤ８６抗体の下での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の共培養及び誘導から採取された調節性Ｔ細胞のレシピエントへの注入により、免疫抑制剤であるシクロスポリンの退薬が、手術の約６０日後に可能となり、その後、移植腎は免疫抑制の無い状態でも長期間の生着を達成し（図５）、以下の表において、移植されたサルの処置及び結果に関するデータを提供する。

値を平均±ＳＤとして表す。全てのレシピエントから脾臓を摘出した。生存カラムにおける数は、グループにおける各動物に関する値を表わす。^Ａ急性拒絶により死亡；^Ｂ４×１０^６細胞の接種を受けた；^Ｃ腎生検の後に出血により死亡；^Ｄ尿道狭窄症による水腎症により死亡。

ドナー及び第３群の皮膚移植をこれらの動物に行った後、ドナーの皮膚はくっつく（ａｒｒｉｖｅｓ）が、第三群の皮膚は拒絶され、これはドナーの抗原に特異的な免疫寛容の誘導を示す（引用文献７）。

＜以前の臨床研究の結果＞
＜腎臓移植における調節性Ｔ細胞治療（第１相試験）＞
誘導した調節性Ｔ細胞を使用する細胞治療の前臨床研究の結果に基づき、共同調査者である、Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｌｌｅｇｅのＴｅｒａｏｋａらは、２００８年８月から２００９年１０月まで生体ドナーの腎臓移植の９つの症例について同じ処置を試みた（引用文献８）。

＜患者のバックグラウンド＞
第Ｉ相臨床研究において試験された患者のバックグラウンドを、表５に示す。患者の年齢は２６歳と５３歳の間であり、基礎疾患など他の情報を表５に示す。

＜典型的な臨床経過＞
症例２（図６）に見られるように、１．５×１０^９の調節性Ｔ細胞は、手術後２週間で注入され、免疫抑制剤（シクロスポリン（ＣＹＡ）：３００ｍｇ／日、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）：２０００ｍｇ／日、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）：５００ｍｇ／日）は、徐々に減らされる。ここで、２２５日目の用量は、ＣＹＡ５００ｍｇ／日及びＭＭＦ５０ｍｇ／日であり、ＭＰは完全に中止される。同じ期間中、急性拒絶反応又は明白な副作用は、腎機能と腎生検において観察されなかった。免疫抑制薬の用量も、他の症例において１／２乃至１／５までに成功裡に減らされた。これら症例に関し、症例２におけるものと同じ急性拒絶反応又は明白な副作用は、腎機能と腎生検において観察されなかった。誘導された調節性Ｔ細胞のフローサイトメトリーの結果を図７に示す。これら細胞は、インビトロ、及び腎臓移植患者（症例５）にあり、ドナーの抗原特異性のリンパ球増殖（図８Ａ、図８Ｂ）を阻害する。

＜細胞培養の結果＞
第Ｉ相臨床研究において行われた細胞培養の９の症例の結果を、表６に示す。合計のリンパ球数は、培養前の６．５０±１．１７×１０^９から、２週間の培養後に１．０８±０．５１×１０^９に達する。非臨床試験の結果に類似する、現在の培養系に残存することができないリンパ球の特異的な画分、及び他の白血球の死滅により、この細胞の数の減少が考慮される。

表面抗原の解析に従い、これらリンパ球の表現型を解析し；ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞の２週間の培養に従い、３６．６９±９．８３％から４１．１５±１１．１８％までの約５％の増加を認識する。他方、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞は、３．０４±１．５３％から１．８４±０．５７％までの比率において１．５倍より多く増加した。故に、現在の培養系によって選択的に誘導されるので、調節性Ｔ細胞は考慮され、それは非臨床試験の結果に類似する。

更に、ＣＤ４^＋細胞の中の比率に関して、それは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞に関して４．６３±０．０３％から８．８７±３．４１に、及びＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞に関して４．０９±０．１３％から８．５４±３．２９％に、それぞれ増加した。

＜有害事象＞
第Ｉ相臨床研究において、調節性Ｔ細胞との偶発的な関連性により引き起こされるか、或いはそれを有すると判定される有害事象は報告されていない。

＜引用文献＞
１． Ｔｏｄｏ Ｓ， Ｆｕｎｇ ＪＪ， Ｓｔａｒｚｌ ＴＥ， Ｔｚａｋｉｓ Ａ， Ｄｏｙｌｅ Ｈ， Ａｂｕ−Ｅｌｍａｇｄ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｎｔｅｒ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦＫ ５０６ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａｎｎ Ｓｕｒｇ １９９４； ２２０ （３）： ２９７−３０８； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ３０８−２９９．

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３． Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ， Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ＬＡ， Ｍｕｒｐｈｙ ＤＢ， ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈ−２ （ｉ−ｒｅｇｉｏｎ） ｌｏｃｉ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７６； １４４ （３）： ６８５−６９８．

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７． Ｂａｓｈｕｄａ Ｈ， Ｋｉｍｉｋａｗａ Ｍ， Ｓｅｉｎｏ Ｋ， Ｋａｔｏ Ｙ， Ｏｎｏ Ｆ， Ｓｈｉｍｉｚｕ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｎｅｒｇｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００５； １１５ （７）： １８９６−１９０２．

８． Ｉｃｈｉｒｏ Ｋｏｙａｍａ． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ＳＳ３−８ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ４５ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００９．

＜エキソビボの寛容誘導＞
この実験は、生体ドナーの肝臓移植における調節性Ｔ細胞に基づく細胞治療による、免疫抑制剤の好結果の減少と中止について考察する。

目的：免疫抑制剤（ＩＳ）の長期の使用は、有意な免疫学的及び非免疫学的な悪影響に関連する。故に、ＩＳの最小化、その後の完全休止は、臓器移植における最終的な目標であった。

エキソビボで生成されたドナー抗原特異性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の注入は、非ヒト霊長類における腎移植術の後にＩＳの初期の退薬及び寛容の誘導を可能にする。

本研究を、生体ドナーの肝臓移植（ＬＤＬＴ）におけるＴｒｅｇに基づく細胞治療の安全性及び効果を判定するために行った。

方法：研究を、１０の連続した成人のＬＤＬＴにより行った。ＬＤＬＴの前日に、照射されたドナー−ＰＭＢＣ、抗ＣＤ８０ ｍＡｂ、及び抗ＣＤ８６ ｍＡｂと共に共培養するレシピエント−ＰＢＭＣ（＋脾細胞）により２週間、Ｔｒｅｇはエキソビボで生じ始めた。免疫抑制剤を移植直後に投与した。免疫抑制剤はステロイド＋ＭＭＦ＋タクロリムス（ＴＡＣ）又はシクロスポリン（ＣＹＡ）であり、一方で前者の２つ（ステロイド＋ＭＭＦ）を一か月以内に止めた。シクロホスファミド（４０ｍｇ／ｋｇ）を手術後５日目（ＰＯＤ）に与え、ＴｒｅｇをＰＯＤ１３で注入した。ＴＡＣ（又はＣＹＡ）を６か月まで維持し、そこから、１日１回、そしてその後、週に３回、２回、及び１回といったように２−３カ月毎に低減して、そして最終的に止められる。

結果：症例１乃至９は、症例５を除いて、Ｔｒｅｇ注入の減少中、及びその中止後に、優れた肝臓機能を維持した。症例５は、Ｔｒｅｇの不適当な生成により、通常のＩＳと交換され、研究から除外した。有害事象は全ての患者に観察されなかった。

２週間の共培養は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（６．７±３．８％乃至２８．１±７．７％）及びＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞（８．２±６．０％乃至２６．２±７．７％）を増加させた。培養細胞は、細胞数依存性の様式で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害した。

結論：エキソビボで生成したドナー抗原特異性Ｔｒｅｇに基づく細胞治療により、１０の症例の内９つにおいてＩＳの初期の減少が、そして最終的にはＬＤＬＴ後に１０の症例の内３つにおいて中止が可能となった。

本出願の特定の実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは明白であろう。多数の変形、変化、及び置換は、実施形態から逸脱することなく、当業者によって想到される。本明細書に記載される実施形態の様々な代替案が、本明細書に記載される方法を実行する際に利用され得ることを理解されたい。

Claims (22)

1. 免疫応答により媒介される被験体の疾病を処置する方法であって、該方法は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、抗体又はその抗原結合性フラグメントの投与は、調節性Ｔリンパ球の集団の生成を誘導する、ことを特徴とする方法。
2. 組成物は、ＣＤ８０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント、及びＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＣＤ８０上で１以上のエピトープに、及びＣＤ８６上で１以上のエピトープに結合する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＣＤ８０とＣＤ８６を遮断する及び／又は中和する、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１つに記載の方法。
5. 調節性Ｔリンパ球の集団を生じさせるエキソビボでの方法であって、該方法は、同種抗原又は非細胞性タンパク質抗原を提示する細胞の存在下で、ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物を用いて、Ｔ細胞を培養する工程を含む、ことを特徴とする方法。
6. 非細胞性タンパク質抗原は、ヒト・ガンマ・グロブリン、ウマ・ガンマ・グロブリン、及びオバルブミンから成る群から選択される、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. Ｔ細胞はレシピエント動物から得られ、同種抗原を提示する細胞は、ドナー動物から得られる細胞、又はドナー動物から得た抗原でパルスされた細胞の何れかである、ことを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記方法により作り出された調節性Ｔリンパ球は、必要とする被験体に更に投与される、ことを特徴とする請求項５乃至７の何れか１つに記載の方法。
9. 細胞及び培地を含む、請求項５乃至７の何れか１つに記載の方法により調製される細胞培養物。
10. 抗体は培地から取り除かれる、ことを特徴とする請求項９に記載の細胞培養物。
11. 抗体は洗浄により取り除かれる、ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養物。
12. レシピエント被験体の臓器又は組織移植の拒絶反応を抑える方法であって、該方法は：
    （ａ）レシピエント被験体からＴ細胞のサンプルを得る工程；
    （ｂ）移植されている臓器又は組織のソースであるドナー被験体から同種抗原のサンプルを得る工程；
    （ｃ）ＣＤ８０とＣＤ８６に特異的に結合する抗体を含む組成物の存在下で、同種抗原のサンプルにＴ細胞のサンプルを曝露する工程であって、それにより調節性Ｔリンパ球の集団を含む組成物を生じさせる、工程；及び
    （ｄ）調節性Ｔリンパ球の集団を含む組成物をレシピエント被験体に投与する工程
    を含む、方法。
13. 工程（ｃ）は組成物から抗体を取り除く工程を更に含む、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 約１×１０^９乃至約１×１０^１５の細胞は、レシピエント被験体に投与される、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 調節性Ｔリンパ球の集団は、臓器又は組織の移植の前、同時、又はその後に、レシピエント被験体に投与される、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
16. 被験体はヒトである、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
17. レシピエント被験体に１以上の免疫抑制薬を投与する工程を更に含む、請求項１２乃至１６の何れか１つに記載の方法。
18. １以上の免疫抑制薬は、カルシニューリン阻害剤、アドリアマイシン、アザチオプリン（ＡＺ）、ブスルファン、シクロホスファミド、デオキシスパガリン（ＤＳＧ）；ＦＴＹ７２０（２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］−１，３−プロパンジオール塩酸塩）、フルダラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レフルノミド（ＬＥＦ）、メトトレキサート、ミゾリビン（ＭＺ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、非ステロイド性の抗炎症剤、シロリムス（ラパマイシン）、副腎皮質ステロイド、ＣＴＬＡ−４を遮断する薬剤、ＣＤ２８を遮断する薬剤、抗体、又はそれらの組み合わせである、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. １以上の免疫抑制薬は、臓器又は組織の移植の前、同時、又はその後に、レシピエント被験体に投与される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
20. カルシニューリン阻害剤はタクロリムス（ＦＫ−５０６）又はシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
21. 副腎皮質ステロイドはプレドニゾロン又はメチルプレドニゾロンである、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
22. 抗体は、ムロモナブ−ＣＤ３、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、又は抗胸腺細胞グロブリンである、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。