JPWO2019078263A1 - 多能性幹細胞から人工神経筋接合部を得る方法 - Google Patents
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Abstract
Description
NMJの形成と維持は、神経細胞や筋細胞などのNMJの構成要素間での制御された連続的相互作用を必要とする多段階プロセスである。NMJ関連疾患の発病プロセスにはNMJの機能障害だけでなくその発生段階での障害も関与することが知られている。インビボのNMJの形成と維持を再現するヒト多能性幹細胞(hiPSC)由来のNMJはこれらの疾患の病態生理学の解明とそれらの治療薬の発見にとって優れたモデルとなりうる。近年、インビトロでNMJを再構築する幾つかの試みがなされた。例えば、非特許文献1および非特許文献2では、それぞれ、hiPSC由来運動ニューロン(MN)と初代筋細胞との共培養またはhiPSC由来MNとhiPSC由来筋細胞との共培養により得られるNMJモデルがアセチルコリン受容体(AChR)の集合体を形成することが示されたが、形態面及び機能面での成熟には至っておらず、NMJモデルとして不十分であった。
[1](i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造方法。
[2]工程(i)のMyoDの一過的発現が薬剤を用いた発現誘導によって行われる、[1]に記載の方法。
[3]工程(ii)の神経栄養因子がGlial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) 、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)およびNeurotrophin 3 (NT-3)である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]工程(i)が4〜20日間行われる、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]工程(ii)が20〜120日間行われる、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]人工神経筋接合部が運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、[7]に記載の方法。
[9]それぞれ多能性幹細胞から誘導された、運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、細胞集団。
[10][9]に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
[11][9]に記載の細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程、
を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
[12](i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程(i)及び/または(ii)に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、被検物質を評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
シュワン細胞は神経終末の成熟、AChRクラスタの成熟およびNMJの維持にかかわっているという報告があり(The Journal of Neuroscience, September 21, 2016, 36(38):9770-9781)、本発明の方法によれば、シュワン細胞を含有する、より成熟した機能的なNMJが得られる。
本発明の方法により、約30日程度の短期間でヒトNMJが形成可能であり、形成後約100日程度の長期間にわたって培養・維持することが可能である。
本発明の方法によれば、インビボシナプス形成ステップが再現されるがこれはNMJシナプス形成の理解からNMJ関連疾患の発病の解明および候補治療薬のスクリーニング等に有用である。
本発明の人工神経接合部の製造法は、
(i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程
を含む。
人工神経筋接合部とは、インビトロで多能性幹細胞から誘導された神経筋接合部を意味する。神経筋接合部とは、運動神経細胞の突起末端よりアセチルコリンが放出され、筋管細胞に存在する受容体が受け取ることができる構造を意味する。神経筋接合部の存在は、例えば、免疫染色や蛍光顕微鏡観察を行い、運動神経細胞が発現するシナプス小胞タンパク質(例えば、SV2)と筋管細胞が発現するアセチルコリン受容体が共局在することによって確認することができる。
運動ニューロンは、HB9、Islet1、ChATから選択される一つ以上のマーカーの陽性を指標にして同定することができる。
筋細胞は、ミオシン重鎖(MHC)およびMEF2cから選択される一つ以上のマーカーの陽性を指標にして同定することができる。
シュワン細胞は、S-100マーカーなどの陽性を指標にして同定することができる。
人工神経筋接合部は運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞の割合は、神経筋接合部としての機能が維持できる割合であれば特に制限されない。
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、***幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
本発明で用いられるMyoDとしては、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるヒトmyogenic differentiation 1(MYOD1)および他の哺乳動物におけるそのオルソログ、並びにそれらの転写変異体、スプライシング変異体などが挙げられる。あるいは、上記いずれかのタンパク質と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上のアミノ酸同一性を有し、且つ該タンパク質と同等の機能(例、筋特異的プロモーターの転写活性化など)を有するタンパク質であってもよい。
MyoDをコードする核酸としては、配列番号1の塩基番号221〜1183で表されるヌクレオチド配列からなるヒトmyogenic differentiation 1(MYOD1)cDNAおよび他の哺乳動物におけるそのオルソログ、並びにそれらの転写変異体、スプライシング変異体などが挙げられる。あるいは、上記いずれかの核酸と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上のヌクレオチド同一性を有し、且つ該核酸にコードされるタンパク質と同等の機能(例、筋特異的プロモーターの転写活性化など)を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。あるいは、上記いずれかの核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するセンス鎖を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、「0. 1×SSC、0.1%SDS、60℃」の条件を挙げることができ、かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。
ベクターには、MyoDをコードするDNAが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。プロモーターとして、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(cytomegalovirus)プロモーター、RSV(Rous sarcoma virus)プロモーター、MoMuLV(Moloney mouse leukemia virus)LTR、HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase)プロモーター、EF-αプロモーター、CAGプロモーターおよびTREプロモーター(tetO配列が7回連続したTet応答配列をもつCMV最小プロモーター)が例示される。
例えば、上記のTREプロモーターを用いた場合、同一の細胞において、tetRおよびVP16ADとの融合タンパク質またはリバース(reverse)tetR(rtetR)およびVP16ADとの融合タンパク質(rtTA)を同時に発現させることが望ましい。このTet-Onシステムでは薬剤が存在しないときは該融合タンパク質がTREに結合せず、転写は起こらないが、薬剤を添加することにより該融合タンパク質がTREプロモーターに結合し、転写が起こるので、薬剤を添加している間に一過的にMyoDを発現させることができる。
一方、MyoDがRNAまたはタンパク質の場合、上記の期間においてMyoDが細胞内で存在するように導入を複数回行ってもよい。
好ましい分化誘導条件は、マトリゲルでコーティングされた培養皿に接着させた多能性幹細胞を10%KSRを含有するαMEM培地で培養する条件である。
<神経栄養因子>
神経栄養因子とは、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、Nerve Growth Factor (NGF)、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)、Neurotrophin 3 (NT-3)、Neurotrophin 4/5 (NT-4/5)、Neurotrophin 6 (NT-6)、basic FGF、acidic FGF、FGF-5、Epidermal Growth Factor (EGF)、Hepatocyte Growth Factor (HGF)、Insulin、Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1)、Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2)、Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF)、TGF-b2、TGF-b3、Interleukin 6 (IL-6)、Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF)およびLIFなどが挙げられる。本発明において好ましい神経栄養因子は、NT-3、GDNF、およびBDNFである。神経栄養因子は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞から人工神経筋接合部を作製するキットが含まれる。当該キットには、上述した工程(i)および(ii)に使用する細胞、培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。例えば、MyoDが誘導可能な状態で導入された多能性幹細胞、テトラサイクリンまたはその誘導体などの薬剤、神経栄養因子、細胞外マトリクスでコートされた培養器、基礎培地から成る群より選択される1種類以上の試薬を含むキットが挙げられる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
本発明の人工神経筋接合部は運動ニューロン、筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞培養物として得ることができる。
当該神経筋接合部を含有する細胞培養物は、神経筋接合部の障害(機能不全や形成不全)によって引き起こされる病態(例えば、重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、脊髄性筋委縮症)の病態のモデル系として有用である。したがって、例えば、神経筋接合部の障害によって引き起こされる病態を治療するための細胞製剤や当該病態の治療薬のスクリーニング系として使用できる。
治療を必要とする患者への治療剤の投与方法としては、例えば、得られた人工神経筋接合部(筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞培養物)を患部に注射等で局所投与する方法などが挙げられる。治療剤に含まれる細胞培養物の細胞数は、疾患の程度などに合わせて適宜調整される。医薬組成物(細胞製剤)の使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド(DMSO)や血清アルブミン等を、また、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分(例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を細胞製剤に含有させてもよい。
本発明では、上記のようにして得られた運動ニューロン、筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法を提供する。
(i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程(i)及び/または(ii)に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、薬剤を選択または評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニング方法または評価方法である。
細胞株
MyoD−201B7は、Tanaka et al., PLOS ONE 2013, Volume 8, Issue 4, e61540に記載されたように、201B7ヒトiPS細胞株にドキシサイクリン(DOX)誘導性MYOD1発現piggy bacベクターを形質移入することにより構築された。MYOD1はmCherryタンパク質およびrtTAとともに発現され、MYOD1の発現はmCherryタンパク質の発光により検出した。
Tanaka et al., PLOS ONE 2013に記載された手順に従って、MyoD−201B7株の筋分化を行った。具体的には、マトリゲル被覆プレート上にMyoD−201B7細胞を播種し、筋分化培地(10%KSR+αMEM)にドキシサイクリンを1μg/mL添加することで筋分化を誘導した。ドキシサイクリン添加後10日目の時点で培地を神経栄養因子(BDNF、GDNF、NT3;10ng/mlずつ、R&Dシステムズ)を添加したニューロベーサル(Neurobasal)培地に変更することで神経分化を誘導した。その後、同培地を3〜4日毎に交換して培養を継続した。
筋分化の2日目にFACS Aria BDおよびFACS Divaソフトウェアを使用してmCherry陽性細胞を選別した。選別された細胞をマトリゲル被覆96ウェルプレートに再播種し(8.8×104細胞/ウェル)、ドキシサイクリンを含む、または含まない筋分化培地中で培養した。20日目にニューロンに対する筋管の比率を免疫細胞化学により定量した。
α7s ILCE−7S(ソニー株式会社)を使用して赤色フィルター処理光源および蛍光(Fluo8、緑色)を使用した位相差像を15fpsで連続撮像した。ブロックマッチング法に基づく運動ベクトル分析を提供するSI8000セルモーションイメージングシステム(ソニー株式会社)を使用して目的領域(ROI)における赤色分離像を使用する運動定量と緑色分離像を使用する明度分析を実施した。
SI8000セルモーションイメージングシステム(ソニー株式会社)を使用して38fpsで移動像の撮像と運動分析の両方を実施した。
MyoD−201B7細胞を2.2×104細胞/ウェルの密度で播種し、Costar96ウェル黒壁/透明底プレート内でNMJに分化させた。20日目に増殖培地を取り除き、37℃で1時間にわたって細胞に100μLのFluo−8記録培地を添加した。それらの細胞をPBSで2度洗浄し、次にIn Cell Analyzer 2000で撮像した。F/F0比率として蛍光強度を表した。
MyoD−201B7細胞を2.2×104細胞/ウェルの密度でマトリゲル被覆96ウェル黒壁/透明底プレートに播種した。それらの培養物が収縮し始めるまで毎日各ウェルの半量の培地を交換した。増殖培地を取り除き、37℃で1時間にわたって細胞に100μLのFluo−8記録培地を負荷した。それらの細胞をPBSで2度洗浄し、次にウェルに分化培地を添加した。FDSSマイクロプレートリーダーでCaオシレーションをモニターし、1分の間隔でデータポイントを収集し、頻度および振幅の定量用のFDSSソフトウェアを使用してそれらのデータポイントを分析した。
統計分析にはMicrosoft Excel 2013の統計関数を使用した。結果を平均値±SEMとして表した。ステューデントのt検定およびウィルコクソンの順位和検定を用いて統計学的有意性を決定した。P<0.05を有意であると見なした。
NMJ培養物を4℃で0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中の2%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒド中で一晩にわたって前固定した。1%四酸化オスミウム溶液中で後固定を室温で1時間にわたって行った。エタノール(30%、50%、70%、90%、95%および100%)内で試料を脱水し、Epon樹脂中に包埋した。超薄切片(80nm)を切断し、酢酸ウラニルとアルカリ性クエン酸鉛で染色した。透過電子顕微鏡(H−7650、日立)でそれらの標本を検査した。
SEM観察用の試料を4℃で2%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒド中で一晩にわたって前固定した。1%四酸化オスミウム溶液中で後固定を室温で1時間にわたって行った。濃度等級を割り当てたエタノール(30%、50%、70%、90%、95%および100%)内で試料を脱水し、残留水分を除去するために臨界点乾燥機で乾燥した。それらの試料に陰極スプレー法によりプラチナを被覆し、その後で走査電子顕微鏡(S−4700、日立)で撮像した。
使用した一次抗体は、抗ニューロフィラメント(Millipore番号MAB5254、1:500)、抗シナプス小胞プロテイン2(DSHB番号SV2、1:20)、抗MHC(Millipore番号A4.1025、1:1000)、抗Islet1(DSHB番号40.2D6、1:100)、抗HB9(DSHB番号81.5C10、1:100)、抗ChAT(Millipore番号AB144P、1:100)および抗Tuj1(Covance番号MMS435P、1:1000)であった。複合体化抗BTX−647(Invitrogen)を0.5ug/mlの濃度で使用した。共焦点顕微鏡(Fluo View−1000、オリンパス、またはLSM−710、Zeiss)により試料を画像化した。
光活性化ドメインを含むプラスミド(pLenti−Synapsin−hChR2(H134R)−EYFP−WPRE、Addgeneプラスミド番号20945)はカール・ダイセロス(Karl Deisseroth)からAddgeneに寄託されたものを購入して用いた。標的遺伝子を神経性細胞に形質導入するためにレンチウイルス形質導入システム(ViraPower hiperformレンチウイルス発現システム、Invitrogen)を使用した。NMJ培養物を37℃で48時間にわたって5%CO2でウイルスを含む培地で処理した。ウイルス感染後、その培地を取り除き、ニューロベーサル培地を標的遺伝子の発現のために加えた。その培地を3〜4日毎に交換した。適切な光学的設定を用いた共焦点顕微鏡観察によりEYFP発現を検査した。光活性化を488nmのレーザー波長により実施した。EYFPシグナルに加えて筋肉運動分析のために明視野像を同時に撮像した。
MetaMorphソフトウェア(モレキュラーデバイス、米国)により画像分析と定量を行った。
ドキシサイクリン(DOX)誘導性ベクターによるMYOD1の一時的発現によってhiPSCは効率的に成熟筋管(myotubes)に誘導される。この方法を用いることによって我々はまずDox誘導性コンストラクトを形質移入した201B7−iPSCクローン(201B7MYOD)を筋管に分化させた。10日目に神経細胞分化に適した培地に切り替えることで(図1A)、20日目に筋管の表面上に集合し、軸索末端に対して並置されたAChRが検出され、NMJ様の構造体を得ることができた(図1E)。その構造体中にはシュワン細胞も検出された(図1F)。
シナプス前細胞種およびシナプス後細胞種に関係するマーカーが検出された(図1C、1D)。
電子顕微鏡(EM)像よりNMJ培養物の中で筋管に結合する軸索末端の膨張および終末ボタンの上を覆うシュワン細胞が示された(図1Gおよび図1I)。
シナプス小胞とミトコンドリアが、高電子密度活動帯によって明確に分割される(図1H、I)NMJの前シナプス部位と後シナプス部位に蓄積した。
これらの観察結果より我々のインビトロNMJはNMJの主要な細胞種を含有しており、構造的にもNMJの特徴を備えていた。
このように、我々はNMJ培養系において一連のhNMJ発生ステージを観察することができた。
電気的活動の細胞間伝播を可能にする筋管と筋管との間の細胞間チャネルであるギャップジャンクションがNMJの発生中に一時的に発現される。我々が運動ベクトル分析のフレームレートを増加することにより収縮を詳しく観察したとき、筋管の収縮は完全に同期されていなかったが、それは隣接する領域に伝播した(図3C)。その収縮の伝播はギャップジャンクション阻害剤gap27によって中断され、この収縮がギャップジャンクションを介した活動電位の伝播によって引き起こされることを示した(図3D)。
このように、我々のインビトロNMJがインビボNMJ発生の初期ステージにおける重要な特徴を再現していることがこれらの機能分析から示された。
このように、光遺伝学的NMJ系により長期培養中の我々のNMJの機能的成熟が証明された。
NMJ培養から培地を除去し、PBSで1分間の洗浄を3回行い、4%パラホルムアルデヒド/PBSを用いて室温で10分間固定した。0.1% BSA/PBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド+0.1% Tritonを用いて室温で10分間透過処理をした。0.1% BSA/PBSで5分間の再水和を3回行い、0.1% BSA/PBS + 0.5% Tween-20を用いて室温で1時間のブロッキング処理をし、パラフィルム層を備えたペトリ皿にカバースリップを移動して乾燥させた。50μlのPBSで希釈した一次抗体(Islet1又はNeuNに対する抗体)を用いて室温で1時間反応させ、PBSで5分間の洗浄を3回行い、PBSで希釈した二次抗体を用いて室温で1時間反応させ(遮光下)、PBSで5分間の洗浄を3回行った。スライドをddH2Oで数回洗浄して乾燥した。5μlのグリセロール:PBS (1:1)を加え、共焦点顕微鏡(LSM-710, Zeiss)で観察した。画像解析にはMetaMorphソフトウェア (Molecular devices、米国) を用いた。
NMJ培養から培地を除去し、トリプシンで細胞を剥離し、PBSで1分間の洗浄を3回行い、4%パラホルムアルデヒド/PBSを用いて室温で10分間固定した。0.1% BSA/PBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド+0.1% Tritonを用いて室温で5分間透過処理をした。0.1% BSA/PBSで1分間の洗浄を3回行い、0.1% BSA/PBSを用いて室温で20分間のブロッキング処理をした。PBSで希釈した一次抗体(Islet1又はHB9に対する抗体)を用いて室温で1時間反応させ、PBSで洗浄を3回行い、PBSで希釈した二次抗体を用いて室温で45分間反応させ(遮光下)、PBSで1分間の洗浄を3回行った。フローサイトメーター(Aria 2, BD)とFlowJoソフトウェア(BD)を用いて解析を行った。
免疫染色の結果から、運動神経は30日目くらいから認められ、その割合は60日目で神経細胞全体の27.4%(NeuN陽性細胞に対するIslet1陽性細胞の割合)であることがわかった(図5A)。
また、フローサイトメトリーの結果から、培養30日目においては全細胞数の13.16%がHB9陽性細胞であり、19.61%がIslet1陽性細胞であり、培養60日目においては全細胞数の4.56%がHB9陽性細胞であり、10.84%がIslet1陽性細胞であることがわかった(図5B)。
作成した201B7MYOD-SMNKD細胞におけるSMNタンパク発現をウェスタンブロット法で解析した。
培養30日目の201B7MYOD-SMNKD細胞について、一次抗体としてNF+SV2又はAChRに対する抗体を用いて前述の免疫染色と同様のプロトコールで免疫染色をした。
PBS(pH7.4)で希釈した、2%パラホルムアルデヒド+2%グルタルアルデヒドで組織を1時間固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液で5分間、3回の完全な洗浄を行い、0.1Mカコジル酸緩衝液で希釈した1%四酸化オスミウムで組織を60分間固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液で15分間、3回の完全な洗浄を行った。リン酸緩衝液で希釈した下記グレードのエタノールで順に脱水した:30%エタノールで5分間、50%エタノールで5分間、70%エタノールで5分間、90%エタノールで10分間、95%エタノールで15分間を2回、100%エタノールで30分間を3回。その後、臨界点乾燥し、スタッドに固定し、スパッタ被覆し、デシケーターに保管し、走査電子顕微鏡(S-4700, Hitachi)で観察した。
100mMのリン酸緩衝液(pH7.0)で希釈した、2%パラホルムアルデヒド+2%グルタルアルデヒドでサンプルを2〜24時間にわたり前固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液で希釈した1%四酸化オスミウムで1〜2時間にわたり室温で後固定し、次の順で脱水した:30%アセトンで15分間、50%アセトンで15分間、70%アセトンで15分間、90%アセトンで15分間、100%アセトンで30分間を3回。その後、樹脂包埋(Epon mixを用い、アセトンで15分間の処理を2回)、樹脂浸透(2:1混合のアセトン:樹脂で1時間、次いで、1:1混合のアセトン:樹脂で1時間、1:2混合のアセトン:樹脂で1時間、100%樹脂でオーバーナイト)をし、その後、新鮮な樹脂に置換して1時間処理した。その後、鋳型中で新鮮な樹脂に包埋し、60〜70℃で72時間重合した。超薄切片化し、透過型電子顕微鏡(H-7650, Hitachi)で観察し、成熟筋管(myotubes)の収縮の運動解析を行った。記録及び解析は、SI8000 Cell Motion Imaging System(Sony Corporation)を用いて行った。
201B7MYOD-SMNKD細胞におけるSMNタンパク発現量は、SMNタンパクをノックダウンしていない201B7MYOD細胞の同発現量に対して60%程度低下することがわかった(図6A)。
201B7MYOD-SMNKD細胞(SMN KD)におけるNMJの領域は、201B7MYOD細胞(Control)のそれよりも顕著に小さかった(図6B)。
201B7MYOD細胞(Control)培養のSEM画像では、非常に伸長したmyotubeと軸索の束が観察され、広がった軸索末端にアンカーしたmyotubeが観察された(図6C)。
201B7MYOD-SMNKD細胞(SMN KD)培養では、201B7MYOD細胞(Control)培養よりも、myotubeが平坦で薄く、軸索末端は少なかった。また、細胞内のmyotube、及びNMJ関連構造の細部は、201B7MYOD細胞(Control)培養との間で全く異なっていた。201B7MYOD-SMNKD細胞におけるミトコンドリアの形態及び状態は損傷しており、筋繊維はその構造の中で完全な状態であるものは少なかった(図6D)。
機能的な差異を評価するために観察したNMJ依存性筋肉収縮の振幅とパターンについては、201B7MYOD細胞(Control)に比べ、201B7MYOD-SMNKD細胞(SMN KD)では、収縮領域が小さかった。また、201B7MYOD-SMNKD細胞(SMN KD)では収縮の同期は崩壊しており、201B7MYOD細胞(Control)に比べ、筋肉収縮の最大速さは小さかった(図6E)。
201B7MYOD-SMNKD細胞では、筋肉収縮の間、myotubeの崩壊がよく観察されたが、201B7MYOD細胞では脆弱性は観察されなかった(図6F)。
この現象は、SMA-myotubeが筋肉収縮に影響を受けやすい可能性を有しており、SMA患者で見られる筋委縮と関連があることを示唆していると考えられる。
したがって、本発明のインビトロNMJ誘導方法が疾患モデルや薬剤評価に使用できることが明らかとなった。
Claims (12)
- (i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造方法。 - 工程(i)のMyoDの一過的発現が薬剤を用いた発現誘導によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)の神経栄養因子がGlial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) 、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)およびNeurotrophin 3 (NT-3)である、請求項1または2に記載の方法。
- 工程(i)が4〜20日間行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(ii)が20〜120日間行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 人工神経筋接合部が運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項7に記載の方法。
- それぞれ多能性幹細胞から誘導された、運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、細胞集団。
- 請求項9に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
- 請求項9に記載の細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程、
を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。 - (i)多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
(ii)(i)で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程(i)及び/または(ii)に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、被検物質を評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
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