JP2022157515A - 多能性幹細胞、神経細胞及びその応用 - Google Patents

多能性幹細胞、神経細胞及びその応用 Download PDF

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Setsu Endo
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耕一 齊藤
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栄之 岡野
Hideyuki Okano
純宏 前田
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Abstract

【課題】外来性プロモーターを使用することなく細胞内タウを可視化して定量することが可能である神経細胞、及び上記神経細胞を製造することができる多能性幹細胞を提供すること、上記の多能性幹細胞又は神経細胞を用いる物質のスクリーニング方法、及び上記方法でスクリーニングされた物質を提供すること、並びにＴａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒとｇＲＮＡを含むキットを提供すること。【解決手段】タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する、多能性幹細胞。【選択図】なし

Description

本発明は、タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように改変された多能性幹細胞に関する。本発明はさらに、上記多能性幹細胞から分化した神経細胞に関する。本発明はさらに、上記の多能性幹細胞又は神経細胞を用いる物質のスクリーニング方法、及び上記方法でスクリーニングされた物質に関する。本発明はさらに、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒとｇＲＮＡを含むキットに関する。
アルツハイマー病等の神経変性疾患の発症メカニズムは多岐に渡るため、様々なメカニズムに基づいた治療薬の研究開発が期待されている。タウは、神経変性疾患の発症に関わる主要因子であると考えられており、神経変性疾患の患者の脳内において増加する。またタウの蓄積量と認知機能低下に相関があることが報告されており、タウは、神経変性疾患の治療ターゲットとして期待されている。しかし、どのようにタウ蓄積が引き起こされるのか、またそのタウ蓄積をどのように制御すれば治療に繋がるのか、タウ蓄積の下流で何が起こっておりどのように制御されるべきかについては未だ明らかになっていない。そのため、タウを標的とした創薬の研究ツールとして、細胞内におけるタウの増減、局在変化を可視化定量できるヒト神経細胞の樹立が望まれていた。
タウ蛍光タンパク質の融合体遺伝子を利用して、細胞内タウを可視化定量する細胞評価系についての報告はある。例えば、非特許文献１には、タウを発現しない非神経細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に対して、外部からＲＦＰ－Ｔａｕ遺伝子を導入し、外来性プロモーター制御により人工的にＲＦＰ－Ｔａｕを発現させ、ＲＦＰの蛍光によりタウと微小管との共局在性を定量する方法、およびウェスタンブロッティングによりＲＦＰ－Ｔａｕタンパク質を定量する方法が記載されている。非特許文献１においては、細胞が非神経細胞であることに加え、外来性プロモーターによる人工的な発現であり、タウ遺伝子自身のプロモーターに依存した神経細胞内での発現や、タウの神経細胞内での発現や分布を測定するものではない。非特許文献２には、マウスにおいて変異Ｔａｕ－ＧＦＰを導入し、外来性プロモーターにより発現促進させ、マウス脳内におけるタウの局在及び発現量をＧＦＰ蛍光により可視化することが記載されている。非特許文献３においても、外来性プロモーターにより強制的にタウを発現させることが記載されている。
非特許文献４には、Ｎｇｎ２ （Ｔｅｔ－ｏｎ）の発現により、ヒトｉＰＳ細胞から神経細胞を作製することが記載されている。非特許文献４においては、発現したタウを蛍光染色により定量している。
特許文献１には、細胞株での特定遺伝子の特定部位のスプライシングの有無をＧＦＰの発現で評価する系が記載されている。
Human Molecular Genetics, 2015, Vol. 24, No. 14 3971-3981 J Neurosci. 2017 Nov 22; 37(47): 11485-11494 Neuron. 2007 Feb 1;53(3):337-51 Stem Cell Reports. 2017 Oct 10; 9(4): 1221-1233
国際公開ＷＯ２００８／１０２９０３号公報
非特許文献１から３に記載されているような外来性プロモーターを使用して発現したタウは、細胞内の分布や機能がヒト体内のものとは異なる可能性がある。また、マウスとヒトではタウタンパク質の構造や発現するアイソフォームが異なるため、神経細胞内外のタウの結合や放出の様式が異なっている可能性がある。さらに、アルツハイマー病のモデルマウスにおいては、神経毒性物質に対して、マウス神経細胞と比較してヒト神経細胞がより脆弱であること、タウ病理が強く発現することが報告されているなど、タウを介した神経細胞の応答が、生物種により異なる可能性がある。そこで、ヒト神経細胞において、内因性のタウ発現制御下で発現したタウを可視化し、タウ発現量や局在の簡便な評価を可能にする細胞の確立が期待されていた。また、非特許文献４においては、蛍光染色を用いているため、染色操作のばらつき(細胞の剥がれなど)を制御することが難しい上に、抗体の特異性によって全てのタウ分子種を可視化出来ていない可能性が高い。また、定量精度が抗体の性質に左右される。
本発明は、外来性プロモーターを使用することなく細胞内タウを可視化して定量することが可能である神経細胞、及び上記神経細胞を製造することができる多能性幹細胞を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記の多能性幹細胞又は神経細胞を用いる物質のスクリーニング方法、及び上記方法でスクリーニングされた物質を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒとｇＲＮＡを含むキットを提供することを解決すべき課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、先ず、レポーター分子をコードするＤＮＡを内因性タウ遺伝子に隣接して導入することにより、タウタンパク質をレポーター分子との融合タンパク質として発現できるようにした多能性幹細胞を作製した。本発明者は次いで、上記の多能性幹細胞を神経細胞に分化させることによって、細胞内タウを可視化して分析することが可能である神経細胞を製造することに成功した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する、多能性幹細胞。
＜２＞ 多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、＜１＞に記載の多能性幹細胞。
＜３＞ 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、＜１＞又は＜２＞に記載の多能性幹細胞。
＜４＞ レポーター分子が蛍光タンパク質である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の多能性幹細胞。
＜５＞ レポーター分子をコードするＤＮＡが、内因性タウ遺伝子の上流側に位置している、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の多能性幹細胞。
＜６＞ ＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の多能性幹細胞から分化した神経細胞。
＜７＞ タウタンパク質とレポーター分子との融合タンパク質が発現している、＜６＞に記載の神経細胞。
＜８＞ タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する、神経細胞。
＜９＞ 株化神経細胞または初代神経細胞である、＜８＞に記載の神経細胞。
＜１０＞ レポーター分子が蛍光タンパク質である、＜８＞又は＜９＞に記載の神経細胞。
＜１１＞ レポーター分子をコードするＤＮＡが、内因性タウ遺伝子の上流側に位置している、＜８＞から＜１０＞の何れか一に記載の神経細胞。
＜１２＞ ＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の多能性幹細胞又は＜６＞から＜１１＞の何れか一に記載の神経細胞を用いる、物質のスクリーニング方法。
＜１３＞ タウの発現量の増減の評価、又はタウの細胞内における分布の評価を、レポーター分子の発現に基づいて行う、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞ タウの発現量の増減を、レポーター分子の発現強度に基づいて評価する、＜１２＞又は＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞ ＜１２＞から＜１４＞の何れか一に記載の方法でスクリーニングされた物質。
＜１６＞ タウ遺伝子挿入部位の上流および下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍとレポーター分子をコードするＤＮＡを含むＴａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒと、タウ遺伝子の切断部位を決定するｇＲＮＡを含む、キット。
＜１７＞ タウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号１に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号２に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であるか、あるいはタウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号３に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号４に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列である、＜１６＞に記載のキット。
＜１８＞ ｇＲＮＡが配列番号５又は６に記載の配列と９０％以上の同一性を有する配列を標的配列とする、＜１７＞に記載のキット。
本発明の多能性幹細胞及び神経細胞によれば、細胞内における内因性タウの発現量および分布を評価することが可能である。本発明の多能性幹細胞及び神経細胞によれば、外来性のタウ遺伝子導入は不要であり、また外来性プロモーターを使用することなく、内因性タウの発現を評価することができる。
図１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＭＡＰＴ遺伝子のN末端へのＴａｇＧＦＰ２融合を示す。 図２は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＭＡＰＴ遺伝子のC末端へのＴａｇＧＦＰ２融合を示す。 図３はＣＳＩＶ－ｍｉＲ９／９＊－１２４－ｍＲＦＰ１－ＴＲＥ－ＥＦ－ＢｓｄＴベクターのマップを示す。 図４は、神経細胞誘導に用いたベクターの模式図を示す。 図５は、ｉＰＳ細胞由来神経細胞におけるＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ蛍光を示す。 図６は、 蛍光Ｔａｕ定量および明視野神経突起長の解析の結果を示す。
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。
本明細書において、“ＮＰ＿”、“ＮＭ＿”、“ＮＧ＿”とそれに続く数字は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに標準配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として登録されているアミノ酸配列（ＮＰ＿～）、転写物のヌクレオチド配列（ＮＭ＿～）、ゲノムＤＮＡ配列（ＮＧ＿～）のＩＤを各々表す。
＜多能性幹細胞＞
本発明の多能性幹細胞は、タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有している。
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞***を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性および自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いる。更に好ましくはｉＰＳ細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞である。多能性幹細胞は、特に好ましくはヒト多能性幹細胞である。本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞が用いられる。
ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、上記の初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１４５－１１４７（１９９８））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、Ｒｉｄｅｏｕｔ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００）、Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｃｅｌｌ（２０１３）ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１５，４８２－４８６（２００７））、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５，９８３－９８５（２００７））、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１，３４６－３５２（２００７））、Ｒｅｖａｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，９，４３２－４４９（２００７））、Ｒｅｖａｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１０，１１－２４（２００８））。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはＳｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ Ｎ．， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ．９：６２３－６２９，２００４；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４４４：４８１－４８５，２００６；Ｃｈｕｎｇ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１１３－１１７，２００８；Ｚｈａｎｇ Ｘ．， ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６６９－２６７６，２００６；Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３６５，２００３等が参考になる。尚、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ ＢＩＯなどから入手可能である。
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を、ＬＩＦ（白血病阻止因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）の存在下で培養すること等により樹立することができる（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，７０，８４１－８４７（１９９２）、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２３），１３７２６－１３７３１（１９９８）、Ｔｕｒｎｐｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２１（５），５９８－６０９，（２００３））。
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
ｉＰＳ細胞の作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ： Ｃｅｌｌ １２６ （４），６６３－６７６， ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ １３１（５），８６１－７２，２００７）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１），１０１－１０６，２００８）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５４（７２０４），６４６－６５０，２００８）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ １３６（３），４１１－４１９，２００９）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Ｚｈｏｕ Ｈ， Ｗｕ Ｓ，Ｊｏｏ ＪＹ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，３８１－３８４，２００９； Ｋｉｍ Ｄ，Ｋｉｍ ＣＨ，Ｍｏｏｎ ＪＩ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，４７２－４７６，２００９）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７），７９５－７９７，２００８； Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２６９－１２７５，２００８；Ｓｉｌｖａ Ｊ， ｅｔ ａｌ： ＰＬｏＳ． Ｂｉｏｌ．６（１０），ｅ２５３，２００８）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルス（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ Ｍ， ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３），９４５－９４９，２００８）、プラスミド（Ｏｋｉｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２（５９０３），９４９－９５３，２００８）、トランスポゾンベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｋ， Ｍｉｃｈａｅｌ ＩＰ，Ｍｏｈｓｅｎｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ４５８，７６６－７７０，２００９；Ｋａｊｉ Ｋ，Ｎｏｒｒｂｙ Ｋ， Ｐａｃ ａ Ａ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５８，７７１－７７５，２００９；Ｙｕｓａ Ｋ， Ｒａｄ Ｒ，Ｔａｋｅｄａ Ｊ， ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３６３－３６９，２００９）、或いはエピソーマルベクター（Ｙｕ Ｊ，Ｈｕ Ｋ，Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ Ｋ，Ｔｉａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，２００９）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
ｉＰＳ細胞は、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、国立大学法人京都大学、又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
本発明の多能性幹細胞は、上記した多能性幹細胞に、レポーター分子をコードするＤＮＡを、内因性タウ遺伝子に隣接して導入することによって製造することができる。レポーター分子をコードするＤＮＡが、内因性タウ遺伝子に隣接して導入されていることにより、本発明の多能性幹細胞においては、タウタンパク質をレポーター分子との融合タンパク質として発現することができる。
内因性タウ遺伝子としては、野生型タウ遺伝子または変異型タウ遺伝子のいずれでもよいが、好ましくは野生型タウ遺伝子である。
タウ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ、ＭＡＰＴとも呼ばれる）は、ヒトでは第１７番染色体（１７ｑ２１．１）に存在するＭＡＰＴ遺伝子（Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｆｕｌｌ ｎａｍｅ：ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ、Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌ；ＭＡＰＴ、ＮＧ＿００７３９８．１）にコードされるタンパク質で、選択的スプライシングによって生じる６つのアイソフォームが同定されている。
各アイソフォームは、Ｎ末端側の特徴的な２９アミノ酸配列（Ｎ）の数（０－２個）と、Ｃ末端側の微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）の数（３又は４個）が異なるため、これらの配列の数によって、０Ｎ３Ｒ型（３５２アミノ酸、ＮＰ＿０５８５２５．１、ＮＭ＿０１６８４１．４）、１Ｎ３Ｒ型（３８１アミノ酸、ＮＰ＿００１１９０１８０．１、ＮＭ＿００１２０３２５１．１）、２Ｎ３Ｒ型（４１０アミノ酸、ＮＰ＿００１１９０１８１．１、ＮＭ＿００１２０３２５２．１）、０Ｎ４Ｒ型（３８３アミノ酸、ＮＰ＿０５８５１８．１、ＮＭ＿０１６８３４．４）、１Ｎ４Ｒ型（４１２アミノ酸、ＮＰ＿００１１１６５３９．１、ＮＭ＿００１１２３０６７．３）、２Ｎ４Ｒ型（４４１アミノ酸、ＮＰ＿００５９０１．２、ＮＭ＿００５９１０．５）に分類されている（カッコ内に、一例として、ヒトの各アイソフォームのアミノ酸残基数、標準アミノ酸配列のＩＤ、転写物の標準ヌクレオチド配列のＩＤを示す）。
本発明におけるタウ遺伝子は、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類、又はマーモセットなどの霊長類）のタウ遺伝子であってもよい。哺乳動物の生体の脳において選択的スプライシングによって生じる可能性のあるタウタンパク質のアイソフォームは、上記した０Ｎ３Ｒ型、１Ｎ３Ｒ型、２Ｎ３Ｒ型、０Ｎ４Ｒ型、１Ｎ４Ｒ型、及び２Ｎ４Ｒ型の６種類である。
ヒトの胎児期の脳では３Ｒ型タウのみが発現するが、ヒト成人脳では上記６種類すべてが発現し、正常人では、４Ｒ型（４リピートタウ）と３Ｒ型（３リピートタウ）の発現比（＝４リピートタウ／３リピートタウ）は同程度である。
マウスでは新生仔までは３Ｒ型タウのみが発現するが、離乳期以降は４Ｒ型タウのみが発現する。
ラットおよびマーモセットでも、脳では新生仔までは３Ｒ型タウのみが発現するが、離乳期以降は４Ｒ型タウのみが発現する。
本発明では、特に定めがない限り、タウとは、３リピートタウ及び４リピートタウのいずれでもよい。
内因性タウ遺伝子としては、変異型タウ遺伝子でもよい。変異型タウ遺伝子としては、ＦＴＤＰ－１７の家系より同定された変異型タウ遺伝子が挙げられる。変異には、（ｉ）タウタンパク質のアミノ酸配列を変化させる変異と、（ｉｉ）４リピートタウ／３リピートタウの発現比を上昇または低下させる変異が知られている。
上記（ｉ）のタイプの変異は、通常、最も長いアイソフォームである２Ｎ４Ｒ型（４４１アミノ酸、ＮＰ＿００５９０１．２、ＮＭ＿００５９１０．５のアミノ酸配列をベースとして、タウタンパク質に生じるアミノ酸変異で表される。例えば、“Ｐ３０１Ｓ”という記載は、ＮＰ＿００５９１０．５のアミノ酸配列の第３０１位のプロリン残基（Ｐ）がセリン残基（Ｓ）に置換したタウタンパク質を生じる遺伝子変異であることを意味し、“Ｋ２８０Δ”は、上記配列の第２８０位のリジン残基が欠失したタウタンパク質を生じる遺伝子変異（すなわち、変異型タウタンパク質をコードしている）を意味する。これまで、ＦＴＤＰ－１７の家系より同定された（ｉ）のタイプの変異部位はエクソン９－１３に集中していることから、エクソン９－１３に変異を有するタウ遺伝子でもよい。変異としては、例えば、Ａ１５２Ｔ、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２９７Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Ｎ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｓ３０５Ｎ、Ｓ３０５Ｓ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３８９Ｒ、及びＲ４０６Ｗから選ばれる１以上の変異が挙げられる。
上記（ｉｉ）のタイプの変異としては、ＦＴＤＰ－１７の家系よりイントロン１０内の変異が多数同定されており、それらの変異型タウ遺伝子でもよい。野生型タウ遺伝子のイントロン１０の塩基配列としては、ＮＧ＿００７３９８．１の第１２０９８３－１２４８３３番目の塩基からなる塩基配列が例示される。このうち、スプライシング時に形成されるステムループ及びその近傍、すなわち、イントロン１０の第１－２０番目のヌクレオチドに１以上の変異を有するタウ遺伝子が好ましく、そのような例として、第３、１１、１２、１３、１４、１６、又は１９番目の塩基が置換されたＭＡＰＴ遺伝子が挙げられる。
本発明の神経細胞は、変異型タウ遺伝子を有する多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞でもよい。変異型タウ遺伝子を有する多能性幹細胞としては、変異型タウ遺伝子を内因性に保有する動物の体細胞から作製された多能性幹細胞が挙げられる。
レポーター分子としては、ルシフェラーゼなど発光を触媒する酵素、発色タンパク質、発光タンパク質、又は蛍光タンパク質などの、可視化による検出が可能なタンパク質が挙げられる。レポーター分子としては、ＢｉＦＣ（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ：二分子蛍光補完）やＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（化学発光）などの遺伝子内相補による検出系を用いてもよい。ＢｉＦＣにおいては、蛍光タンパク質を２つに分断し、それぞれを解析したい２種のタンパク質に融合させる。細胞内で２つの融合タンパク質が近接すると、蛍光タンパク質の立体構造が再構築されて蛍光が生じる。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標） ２ 分子テクノロジー（ＮａｎｏＢｉＴ：ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標） Ｂｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）においては、Ｌａｒｇｅ ＢｉＴ（ＬｇＢｉＴ ； １８ ｋＤａ）およびＳｍａｌｌ ＢｉＴ（ＳｍＢｉＴ ； １１ アミノ酸ペプチド）のサブユニットをそれぞれ標的タンパク質との融合体として発現させ、タンパク質間相互作用が起こるとサブユニットの相補性が促進され発光酵素として明るい光が生じる。レポーター分子としては、好ましくは蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質の種類は特に限定されず、任意の蛍光タンパク質を使用することができる。蛍光タンパク質の具体例としては、以下のものを挙げることができる。なお、ＢＦＰは青色蛍光タンパク質、ＣＦＰはシアン蛍光タンパク質、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質、ＹＦＰは黄色蛍光タンパク質、ＲＦＰは赤色蛍光タンパク質を意味する。
Figure 2022157515000001
レポーター分子をコードするＤＮＡを、内因性タウ遺伝子に隣接して導入するための方法としては、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（タレン）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集技術を使用することができるが、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とは、ゲノム上の狙った箇所を認識するｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、核酸分解酵素Ｃａｓ９を細胞に導入することにより，ｇＲＮＡと相補的塩基配列を持つ特異的ＤＮＡ鎖に二本鎖切断を引き起こす技術である。ｇＲＮＡは好ましくはｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ゲノム編集の対象である核内の内因性タウ遺伝子にアクセスするために、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡを細胞内の核内へと導入する必要がある。導入のためのベクターとしては、プラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡは、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法などにより細胞に導入することができる。
レポーター分子をコードするＤＮＡは、内因性タウ遺伝子の上流側に位置していてもよいし、内因性タウ遺伝子の下流側に位置していてもよいが、好ましくは内因性タウ遺伝子の上流側に位置している。即ち、レポーター分子は、タウタンパク質のＮ末端側に融合していてもよいし、タウタンパク質のＣ末端側に融合していてもよいが、好ましくはタウタンパク質のＮ末端側に融合している。レポーター分子がタウタンパク質のＮ末端側に融合している場合には、タウおよびレポーター分子の発現が強くなり、蛍光観察などによるタウの検出がより容易になる。レポーター分子をコードするＤＮＡと内因性タウ遺伝子は、連結して一つのタンパク質として発現されていれば、リンカーがあってもなくてもよい。遠すぎると途中で離れてしまう可能性があるため，リンカーは１００塩基以内が好ましく、より好ましくは７０塩基以内であり、最も好ましくは３塩基以内である。リンカーが翻訳された後のアミノ酸としては、５０アミノ酸以内が好ましく、より好ましくは３０アミノ酸以内であり、最も好ましくは１アミノ酸以内が好ましい。
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒは、ｇＲＮＡ配列によって決定されるタウ遺伝子の切断部位付近（Ｎ末端またはＣ末端）から上流及び下流のタウ遺伝子配列と相同性を持つ必要がある。上流の相同性配列をｌｅｆｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ、下流の相同性配列をｒｉｇｈｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍと呼ぶ。ｌｅｆｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍおよびｒｉｇｈｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍは合計１６００ ｂｐ前後である。好ましくはそれぞれ約８００ｂｐずつである。Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍはタウ遺伝子配列と全く同一である必要はなく、ｇＲＮＡ認識配列にｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎを入れておくことが好ましい。Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒは、ｌｅｆｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍおよびｒｉｇｈｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍの内側に、タウ遺伝子に挿入するレポーター分子をコードするＤＮＡを有する。好ましくは、レポーター分子をコードするＤＮＡに加えて、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを有する。より好ましくは、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク質をコードする遺伝子は両端にＰｉｇｇｙＢａｃ配列を持つ形で配置する。薬剤耐性遺伝子は、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ耐性遺伝子などである。好ましくは、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子である。蛍光タンパク質は表１に記載のものがあるが、好ましくはｍＲＦＰ耐性遺伝子である。また、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒはＧａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ感受性遺伝子を有することが好ましい。
ｇＲＮＡはタウ遺伝子の切断部位を設定する配列であり、タウ遺伝子のＮ末端またはＣ末端の配列を認識する標的配列を含む。標的配列はＰＡＭ配列（ＮＧＧ）下流に２０塩基程度で設定することが好ましい。ｇＲＮＡは好ましくはｓｇＲＮＡである。
本発明によれば、タウ遺伝子挿入部位の上流および下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍとレポーター分子をコードするＤＮＡを含むＴａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒと、タウ遺伝子の切断部位を決定するｇＲＮＡを含む、キットが提供される。
一例においては、タウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号１に記載の配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号２に記載の配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）の同一性をもつ配列である。別の例においては、タウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号３に記載の配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号４に記載の配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）の同一性をもつ配列である。
好ましくは、ｇＲＮＡは配列番号５又は６に記載の配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）の同一性を有する配列を標的配列とする。
レポーター分子をコードするＤＮＡを導入した多能性幹細胞は、多能性幹細胞の培養に適した培地を使用して培養することができる。多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を使用する場合には、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素)、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）等を使用することができる。培養は、プレート（例えば、６ｗｅｌｌプレート等）上で行ってもよいし、フラスコ内で行ってもよいが、好ましくはプレート上で行うことができる。培養期間は特に限定されず、例えば、１日～１０日間培養することができる。好ましくは5日～8日である。
上記した培養により増殖した細胞を回収し、細胞が保持するタウ遺伝子の近傍の配列をＤＮＡシーケンスにより確認することにより、レポーター分子をコードするＤＮＡが導入されていることを確認することができる。
＜神経細胞＞
本発明は、上記した本発明の多能性幹細胞から分化した神経細胞に関する。
本発明の神経細胞は、タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する細胞である。本発明の神経細胞は、株化神経細胞または初代神経細胞のいずれでもよい。
本発明の神経細胞は、タウタンパク質とレポーター分子との融合タンパク質を発現することができる。レポーター分子の具体例、好ましい形態は、本明細書中上記した通りである。本発明の神経細胞においては、細胞内タウを、レポーター分子の発現を指標として可視化又は定量することができる。
多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導する方法としては、特に限定されないが、低分子化合物処置などを用いて多能性幹細胞から神経幹細胞を作製後、神経細胞へ誘導する方法と、遺伝子発現などにより神経細胞へ直接誘導する方法がある。
多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導する方法としては、例えば、
（１）無血清培地中で培養して胚様体（神経前駆細胞を含む細胞塊）を形成させて分化させる方法（ＳＦＥＢ法：Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ８：２８８－２９６， ２００５； ＳＦＥＢｑ法：Ｗａｔａｙａ Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， １０５：１１７９６－１１８０１， ２００８）；
（２）ストローマ細胞上で培養して分化させる方法（ＳＤＩＡ法：Ｋａｗａｓａｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｎ， ２８：３１－４０， ２０００）；
（３）薬剤を添加したマトリゲル上で培養して分化させる方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２７：２７５－２８０， ２００９）；
（４）サイトカインの代替物として低分子化合物を含む培地中で培養して分化する方法（米国特許第５，８４３，７８０号）；
（５）多能性幹細胞に神経誘導因子（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）等）を導入し発現させることで分化させる方法（ＷＯ２０１４／１４８６４６；及びＺｈａｎｇ Ｙ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｎ，７８：７８５－９８，２０１３）；
（６）多能性幹細胞にｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入し発現させることで分化させる方法；
及びこれらの方法の組み合わせ等が挙げられる。
上記のうち、（５）多能性幹細胞にｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２を導入して発現させる方法は、短期間且つ高効率で成熟した神経細胞が得られることから好ましい。さらに、（６）多能性幹細胞にｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入し発現させることで分化させる方法も好ましい。多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導する方法としては、好ましくは、Ｎｇｎ２単独またはＮｇｎ２とｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現により神経細胞へ直接誘導する方法である。最も好ましくは、ＴＥＴ－ｏｎプロモーターによるＮｇｎ２単独またはＮｇｎ２＋ｍｉＲ－９／９＊－１２４発現によって神経細胞へ誘導する方法である。
Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質は発生期において神経細胞への分化を促進することが知られる転写因子であり、そのアミノ酸配列はヒトではＮＰ＿０７６９２４、マウスではＮＰ＿０３３８４８で例示される。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２遺伝子（Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｆｕｌｌ ｎａｍｅ：ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２、Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌ：ＮＥＵＲＯＧ２、Ｎｇｎ２遺伝子とも呼ばれる）はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質をコードするＤＮＡのことであり、例えば、標準配列として登録されているＮＭ＿００９７１８（マウス）もしくはＮＭ＿０２４０１９（ヒト）、又はそれらの転写派生体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ）のヌクレオチド配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、上記標準配列及び転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有するＤＮＡであってもよい。
ストリンジェントな条件とは、複合体又はプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、及び上記鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、いっそう好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
多能性幹細胞におけるＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２の発現は、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（タンパク質）を、多能性幹細胞に導入することによって実施することができる。
多能性幹細胞におけるｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現は、ｍｉＲ－９／９＊－１２４をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を、多能性幹細胞に導入することによって実施することができる。
本発明において、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２をコードする核酸、およびｍｉＲ－９／９＊－１２４をコードする核酸を細胞に導入する場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクターをリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法を用いて多能性幹細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物用プラスミドを使用し得る。ベクターには、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質またはｍｉＲ－９／９＊－１２４を発現させるための制御配列（プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等）を含むことができ、さらに、必要に応じて薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列等を含んでもよい。特に、所望の時期にＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質またはｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現を迅速に誘導できるように、タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が誘導可能なプロモーター配列に機能的に接合していることが好ましい。
誘導可能なプロモーターとしては、薬剤応答性プロモーターを挙げることができ、その好適な例として、テトラサイクリン応答性プロモーター（ｔｅｔＯ配列が７回連続したテトラサイクリン応答配列（ＴＲＥ）を有するＣＭＶ最小プロモーター）が挙げられる。例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ／Ｏｆｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ発現誘導システムが例示されるが、テトラサイクリンの存在下において対応する遺伝子を発現させられることが望ましいことから、Ｔｅｔ－Ｏｎシステムが好ましい。すなわち、ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔＲ（ｒｔｅｔＲ）及びＶＰ１６ＡＤとの融合タンパク質（ｒｔＴＡ）を同時に発現させるシステムである。なお、Ｔｅｔ－Ｏｎシステムは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手して用いることができる。また、ｃｕｍａｔｅ応答性プロモーター（Ｑ－ｍａｔｅシステム、Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）社等）、エストロゲン応答性プロモーター（ＷＯ２００６／１２９７３５、及びＧｅｎｏＳｔａｔ誘導性発現システム、Ｕｐｓｔａｔｅ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）、ＲＳＬ１応答性プロモーター（ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ哺乳類誘導性発現システム、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）等も好適に用いることができる。このうち、発現誘導物質の特異性の高さと毒性の低さから、テトラサイクリン応答性プロモーターとｃｕｍａｔｅ応答性プロモーターが特に好ましく、最も好ましくはテトラサイクリン応答性プロモーターである。
ｃｕｍａｔｅ応答性プロモーターを用いる場合には、ＣｙｍＲリプレッサーを多能性幹細胞内で発現する様式を合わせ持つことが好適である。
また、制御配列及び上記プロモーターの調節因子（ｒｔＴＡ及び／又はＣｙｍＲリプレッサー等）は、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２遺伝子またはｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入したベクターによって供給されてもよい。
テトラサイクリン応答性プロモーターを用いた場合には、テトラサイクリン又はその誘導体であるドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、本願では以降、ＤＯＸと略記）を培地に所望の期間含んだ状態で所望の細胞を培養することでＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２またはｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現を維持することができる。また、ｃｕｍａｔｅ応答性プロモーターを用いた場合には、培地にｃｕｍａｔｅを所望の期間含んだ状態で所望の細胞を培養続けることで、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２またはｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現を維持することができる。
薬剤応答性プロモーターを用いた場合にも、培地から対応する薬剤を除去する（例えば、薬剤を含まない培地に置換する）ことで、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２またはｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現を停止することができる。
本発明において、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２をコードする核酸や、ｍｉＲ－９／９＊－１２４をＲＮＡの形態で導入する場合、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の手法によって多能性幹細胞内に導入してもよい。細胞内でのＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２またはｍｉＲ－９／９＊－１２４の発現を維持するため、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等、導入を行っても良い。
本発明において、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２をタンパク質の形態で導入する場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクション等の手法によって多能性幹細胞内に導入してもよい。細胞内でのＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２の発現を維持するため、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等、導入を行っても良い。
本発明において、神経細胞誘導のためにＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２またはｍｉＲ－９／９＊－１２４を多能性幹細胞で発現させる期間は、特に上限はないが、ヒト多能性幹細胞の場合には、２日間以上、好ましくは３日間以上、さらに好ましくは４日間以上である。
Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２やｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入し発現させることで分化させる方法の発現誘導以降は、多能性幹細胞を、神経細胞への分化誘導に適した培地（神経分化用培地と呼ぶ）中で培養することが好ましい。そのような培地としては、基本培地のみ、又は、神経栄養因子を添加した基本培地を用いることができる。本発明における神経栄養因子とは、神経細胞の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体のリガンドであり、例えば、Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４／５（ＮＴ－４／５）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ６（ＮＴ－６）、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ、ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ、ＦＧＦ－５、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ１）、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＩＧＦ ２）、Ｇｌｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、ＴＧＦ－ｂ２、ＴＧＦ－ｂ３、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６（ＩＬ－６）、Ｃｉｌｉａｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）及びＬＩＦ等が挙げられる。このうち、好ましい神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、及び／又はＮＴ－３である。
基本培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｆ１２）培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、及びこれらの混合培地などが包含される。
基本培地には血清が含有されていてもよいし、無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７ Ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよく、また、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロン及びプトレシンなどの１つ以上の物質も含有してもよい。
本発明では、神経分化用培地として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍに、Ｂ２７ Ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ｄｂｃＡＭＰ、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、Ｙ２７６３２、ＤＡＰＴ（N-［N-（3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）］-（S）-phenylglycine t-butyl ester）を添加した培地を使用することが特に好ましい。
神経細胞の分化誘導を行う際の培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
本発明における神経細胞とは、好ましくは、β－ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＮｅｕＮ、Ｎ－ＣＡＭ（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）から成る神経細胞に特異的なマーカー遺伝子を少なくとも１以上発現し、且つ、β－ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の突起（以降、神経突起と呼ぶ）を有する細胞である。
本発明においてより好ましい神経細胞は、形態的に成熟した神経細胞であり、さらに好ましくはグルタミン酸作動性神経細胞である。ここで、形態的に成熟した神経細胞とは、細胞体が肥厚し、且つ、神経突起が十分に伸展（目安として、神経突起長が細胞体の直径の約５倍以上に伸展）した神経細胞である。
＜スクリーニング方法＞
本発明は、上記した本発明の多能性幹細胞又は神経細胞を用いる、物質のスクリーニング方法に関する。さらに本発明は、上記したスクリーニング方法でスクリーニングされた物質に関する。
本発明の神経細胞は、中枢神経疾病に対する薬剤候補物質のスクリーニングや病態メカニズム解析に利用可能である。本発明においては、タウの発現量の増減の評価、又はタウの細胞内における分布の評価を、レポーター分子の発現に基づいて行うことができる。好ましくは、タウの発現量の増減は、レポーター分子の発現強度に基づいて評価することができる。レポーター分子として蛍光タンパク質を使用する場合には、蛍光タンパク質に融合したタウの発現により、タウの発現量の増減の評価、又はタウの細胞内における分布の評価を、蛍光の発現に基づいて行うことができるため、薬剤などの物質のスクリーニングを簡易的に行うことができる。
本発明の神経細胞は生きたままで、レポーター分子の発現をリアルタイムにモニタリングすることができる。モニタリングに使用することができる機器としては、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）カメラなどがある。また、リアルタイムでのモニタリングが不要な場合にはホルマリン等で神経細胞を固定した後に観察することもできる。さらに、固定後にタウまたは蛍光タンパク質に対する抗体を用いて染色することも可能であるが、固定および染色操作による細胞の剥がれや染色のばらつきなどが定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、非染色での解析が望ましい。
本発明においては、例えば、
（１）本発明の神経細胞と被験物質とを接触させる工程；
（２）上記神経細胞におけるタウ発現量を測定する工程；及び
（３）工程（１）において被験物質と接触させた場合の工程（２）で測定したタウ発現量が、工程（１）において被験物質と接触させなかった場合のタウ発現量よりも低値であった場合、上記被験物質を、タウオパチーの予防薬又は治療薬として選択する工程；
を含む、タウオパチーの予防又は治療薬のスクリーニング方法が提供される。
工程（１）において被験物質と接触させなかった場合のタウ発現量より低値であるとは、低ければ特に限定されるものではないが、被験物質と接触させなかった場合のタウ発現量を１００％とすると、被験物質との接触により、好ましくは８０％以下、より好ましくは５０％以下へタウ発現量を低下させる作用を持つ被験物質を選択する。
本発明のスクリーニング方法は、タウオパチーの予防又は治療薬と成り得る化合物又はリード化合物のスクリーニングにおいて有用である。
タウオパチーとしては、アルツハイマー型認知症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、第１７染色体遺伝子に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７；ＦＴＤＰ－１７）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ＦＴＤ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、大脳皮質変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＣＢＤ）、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）等が挙げられる。
被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、海洋生物由来の抽出物、細胞培養上清、及び微生物発酵産物等が挙げられる。
また、被験物質は、（１）生物学的ライブラリー法、（２）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（３）１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリー法、及び（４）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ（１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２： １４５－６７）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９－１３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２－６；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８－８５；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３－５；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ．ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３－５１）。化合物ライブラリーは、溶液（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２－２１を参照のこと）又はビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５－６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、及び同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５－９）若しくはファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８－８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－１０；米国特許出願公開第２００２／０１０３３６０号）として作製され得る。
本発明において、被験物質と神経細胞を接触させることは、神経細胞の培養液へ被験物質を添加することで行ってもよい。接触は、蛍光などの指標の変化が確認できる時間であれば、特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上である。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解性、毒性等）によって適宜調節可能である。
被験物質と神経細胞を接触させる際に用いる、神経細胞の培養液は、神経細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、例えば、上述した神経分化用培地が挙げられる。
被験物質と神経細胞を接触させる際の培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（１）遺伝子編集によるＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ遺伝子を持つｉＰＳ細胞の作製
タウ遺伝子に対する遺伝子編集は健常者由来ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパンより入手）に対して実施した。ヒトｉＰＳ細胞はｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ）でコーティングした６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素)を用いてフィーダーフリー培養した。培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、遠心により細胞ペレットを取得した。細胞ペレットをＮｅｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｒ（ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ、およびｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒを含む）と混和したのち、Ｎｅｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたエレクトロポレーションによって導入した。Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒはＨＲ７１０ＰＡ－１ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入）に対し、タウ遺伝子とのｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ（ＬＨＡ，ＲＨＡ）、挿入する蛍光タンパク質遺伝子配列（ＴａｇＧＦＰ２）、およびＰｉｇｇｙＢａｃ配列（５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ）に挟まれた株選択に使用する遺伝子領域（ＥＦ１－ＲＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｈｙｇ）を挿入することで作製した（図１及び図２）。タウ遺伝子とのｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ（ＬＨＡ，ＲＨＡ）の塩基配列を以下に示す。また、切断するゲノム配列を認識させるｓｇＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の配列を以下に示す。
Left homology arm (N末端へのTagGFP2挿入用)
TTTTGCTGCCAGTTGACATCTGATTGAACCATCTCTTCACTTCTCCGTGCCTCACTTTCCTTACCAGACAGGCTCTGCTGATGCTGTCCCTCTCCTGTTCAGTCGTGCCCTCACCGTTAAAGAGAAAGAGCAAACTGCTGGGCAGCAGCATTGATTTTTTTAATGAAGTGGAAAGAGAGCTGGGAATAACAAGTCGGGCCCACCTCACCTGCCTCACCTGGTGGGTTTATTTGTTTTGTTTTTTTTTTTTTGTTTTGAGACAGAGTTTCACCCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGTAATCTCAGCTCACTGCAACCTCCACCTGCCAGGTTCAATTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTGGGATTACAGGCACCTGCCACATGCCTGGCTAATTATTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTTACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGATCCCCTGACCTCAGGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATCACAGGCGTGAGCCACCATGCCTGGCCGTCACCTGGTGGTGTTGAATATGAACTGCTGCGGTGTTGGTAAATTAAGCAAGCAGATAGATGTAAATAACGCTTGGGCAGGAATATGGAGCACGGGATGAGGATGGGCGGCCAACTGTTAGAGAGGGTAGCAGGGAGGCTGAGATCTGCCTGCCATGAACTGGGAGGAGAGGCTCCTCTCTCTCTTCACCCCCACTCTGCCCCCCAACACTCCTCAGAACTTATCCTCTCCTCTTCTTTCCCCAGGTGAACTTTGAACCAGG（配列番号１）
Right homology arm (N末端へのTagGFP2挿入用)
ATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCAAGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGGTTAGTGGACAGCCATGCACAGCAGGCCCAGATCACTGCAAGCCAAGGGGTGGCGGGAACAGTTTGCATCCAGAATTGCAAAGAAATTTTAAATACATTATTGTCTTAGACTGTCAGTAAAGTAAAGCCTCATTAATTTGAGTGGGCCAAGATAACTCAAGCAGTGAGATAATGGCCAGACACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGGCCCAGGCAGGAGGATCCCTTGAGGCCAGGAATTTGAGACCGGCCTGGGCAACATAGCAAGACCCCGTCTCTAAAATAATTTAAAAATTAGCCAGGTGTTGTGGTGCATGTCTATAGTCCTAGCTACTCAGGATGCTGAGGCAGAAGGATCACTTGAGCCCAGGAGTTCAAGGTTGCAGTAAGCTGTGATTATAAAACTGCACTCCAGCCTGAGCAACAGAGCAAGACCCTGTCAAAAAAAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAGAAAGAAATTTACCTTGAGTTACCCACATGAGTGAATGTAGGGACAGAGATTTTAGGGCCTTAACAATCTCTCAAATACAGGGTACTTTTTGAGGCATTAGCCACACCTGTTAGCTTATAAATCAGTGGTATTGATTAGCATGTAAAATATGTGACTTTAAACATTGCTTTTTATCTCTTACTTAGATC（配列番号２）
Left homology arm (C末端へのTagGFP2挿入用)
ATACTAAGCAGCCTGTGTATCTATACACTCACACGTGTTTGTTTATGTGTGGAATATCTCTGGAGGGTACACAAGAAACTTAAAATGATCACTGTCTCTGGGGAGGGTACCTGGGTGCCTGGGAGGCAGGTCAGGGAAGGAGTGGGCACAGGTATTACCAATTGGAAGACAATAAAAACAACAGCTCCTGGCCAGGCGCAGTGGCTCACGCCTGTAATGGCAGCACTCTGAGAGGCTGAGGCGGGCAGATTGCTTGCGTCCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACATAGCAAAACCCCGTTTCTATTAAAAATACAAAAAATTAGCCAGGTGTGGTGGCATGCACCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGTGGGAGAATCACCTGAGCCTGGGAGGTCAAGGCTGCAGTGAGGTGAGATTGTGCCACCGCACTCTAGCCTGGGCGATAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAACAAACAAAAAACAGTCCCTGGCACTCTGGGCCAGGCCTGGCAGGGCAGTTGGCAGGGCTGGTCTTTCTCTGGCACTTCATCTCACCCTCCCTCCCTTCCTCTTCTTGCAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCTGACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTG（配列番号３）
Right homology arm (C末端へのTagGFP2挿入用)
TCAGGCCCCTGGGGCGGTCAATAATTGTGGAGAGGAGAGAATGAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCCGCCCTCTGCCCCCAGCTGCTCCTCGCAGTTCGGTTAATTGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCACTCGGCTTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAGTAAGAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAGTAATAAAATATTTAAAAAAAAACATTCAAAAACATGGCCACATCCAACATTTCCTCAGGCAATTCCTTTTGATTCTTTTTTCTTCCCCCTCCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTCTGAAAGCTGCTTCTGGGGGATTTCAAGGGACTGGGGGTGCCAACCACCTCTGGCCCTGTTGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGTGGCAGCAACAAAGGATTTGAAACTTGGTGTGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGGGGTTGGGGTGGGGCGGGAGGCCACGGGGGAGGCCGAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGCACAAGAAGTGGGAGTGGGAGAGGAAGCCACGTGCTGGAGAGTAGACATCCCCCTCCTTGCCGCTGGGAGAGCCAAGGCCTATGCCACCTGCAGCGTCTGAGCGGCCGCCTGTCCTTGGTGGCCGGGGGTGGGGGCCTGCTGTGGGTCAGTGTGCCACCCTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAGGGACAGCGGGTAAAAAGAGAAGGCAAGCTGGCAGGAGGGTG（配列番号４）
Ｎ－ＴａｇＧＦＰ２ Ｔａｕ ｓｇＲＮＡ：
ＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡ（配列番号５）
Ｃ－ＴａｇＧＦＰ２ Ｔａｕ ｓｇＲＮＡ：
ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧ（配列番号６）
エレクトロポレーション処置の後、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を添加し遠心した。細胞ペレットをＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２を含む）に懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにおいて培養した。培養３日目に１００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎを添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）に培地交換し、培養５日目に２．５μｇ／ｍＬのＧａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（富士フイルム和光純薬）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）に培地交換した。増殖したコロニーを顕微鏡下でピックし、単一細胞由来のクローンを取得した後、細胞の持つタウ遺伝子の配列をＤＮＡシーケンスで確認することで、目的配列が挿入されていることを確認した。さらに、薬剤耐性遺伝子配列を除去するため、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いたリポフェクションによりＥｘｃｉｓｉｏｎ ｏｎｌｙ Ｐｉｇｇｙｂａｃ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入）を導入し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いて培養した。コロニーを顕微鏡下でピックし、単一細胞由来のクローンを取得した。その後、細胞の持つタウ遺伝子の配列をＤＮＡシーケンスで確認することで、目的配列が挿入されていることを確認し、ＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ遺伝子を持つｉＰＳ細胞クローンを選択した。
（１）レンチウイルスの作製
非特許文献（Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ２０２０，９，５３２；）の方法に従ってレンチウイルスの作製を行った。簡潔に記載すると、パッケージングコンストラクト（ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ）、ＶＳＶ－ＧおよびＲｅｖ発現コンストラクト（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖ）、ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ （ＳＩＮ）レンチウイルスベクターコントストラクト（ＣＳＩＶ－ｍｉＲ９／９＊－１２４－ｍＲＦＰ１－ＴＲＥ－ＥＦ－ＢｓｄＴ）の３種類のプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてトランスフェクションすることでレンチウイルスを産生させた。さらに、培養上清を超遠心により濃縮し、レンチウイルスを濃縮した。濃縮後、ｌｅｎｔｉ－Ｇｏｓｔｉｘ ＰＬＵＳ（タカラバイオ）を用いて力価の測定を行い、実験に用いた。
ＣＳＩＶ－ｍｉＲ９／９＊－１２４－ｍＲＦＰ１－ＴＲＥ－ＥＦ－ＢｓｄＴ（図３）を示す。
（２）ｉＰＳ細胞へのＴＥＴ－ｏｎ誘導性Ｎｇｎ２およびｍｉＲ－９／９＊－１２４ベクターの導入
非特許文献（Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ２０２０，９，５３２；）の方法に従って、図４に示すようなＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクター（ｐＣＭＶ－ＨｙＰＢａｓｅ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ）、ｒｔＴＡベクター（ＰＢ－ＣＡＧｒｔＴＡ３Ｇ－ＩＨ）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）ベクター（ＰＢ－ＴＥＴ－ＰＨ－ｌｏｘ６６ＦＲＴ－ＮＥＵＲＯＧ２）を作製した。これらベクターをＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）で培養したｉＰＳ細胞に対して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いたリポフェクションで導入し、さらに、ｍｉＲ－９／９＊－１２４遺伝子を含むレンチウイル（ＣＳＩＶ－ｍｉＲ９／９＊－１２４－ｍＲＦＰ１－ＴＲＥ－ＥＦ－ＢｓｄＴ）をｉＰＳ細胞に導入した。その後、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ， Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓを用いた薬剤セレクションによって、ベクターが安定導入されたｉＰＳ細胞株を取得した。
（３）ｉＰＳ細胞由来神経細胞におけるＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ蛍光の確認
（２）で作製したｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔで剥離し、Ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＤＬ）およびｉＭａｔｒｉｘでコーティングした９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅまたは３８４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ）を含む神経誘導培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｐｌｕｓ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２％のＢ２７ Ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％のＣｕｌｔｕｒｅ Ｏｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２００μｍｏｌ／ＬのｂｃＡＭＰ、２００μｍｏｌ／ＬのＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、１０μｍｏｌ／ＬのＹ２７６３２、１０μｍｏｌ／ＬのＤＡＰＴ（N-［N-（3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）］-（S）-phenylglycine t-butyl ester）、４μｇ／ｍｌのＤｏｘを添加したもの）で培養することで神経細胞へ分化誘導した。分化誘導開始から６日目以降は神経維持培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｐｌｕｓ培地に２％のＢ２７ Ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％のＣｕｌｔｕｒｅ Ｏｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２００μｍｏｌ／ＬのｄｂｃＡＭＰ、２００μｍｏｌ／ＬのＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）を添加したもの）で培地交換し、１９日間培養した後、蛍光顕微鏡で観察した。未編集のｉＰＳ細胞由来神経細胞をネガディブコントロールとして観察を行った。結果を図５に示す。図５に示す通り、Ｎ末端型（ＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ）神経細胞およびＣ末端型（Ｔａｕ－ＴａｇＧＦＰ２）神経細胞の両方で蛍光が観察された。Ｎ末端型（ＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕ）神経細胞の方が、Ｃ末端型（Ｔａｕ－ＴａｇＧＦＰ２）神経細胞より蛍光が強かった。
（４）蛍光Ｔａｕ定量および明視野神経突起長の解析
神経誘導５日目の神経細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで剥離した。ＰＤＬおよびｉＭａｔｒｉｘによりコーティングした９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに対し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。培養には神経再播種培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｐｌｕｓ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＨＡＭ＝１：１の培地に、２％のＢ２７ Ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％のＣｕｌｔｕｒｅ Ｏｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｔ、２００μｍｏｌ／ＬのｄｂｃＡＭＰ、２００μｍｏｌ／ＬのＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、２μｇ／ｍｌのＤｏｘを添加したもの）を用いて培養した。また、神経細胞に対して１～２μｍｏｌ／ＬのＴａｕ Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, #D-001910-03）を処置し、約２週間培養した。生細胞のまま、ＴａｇＧＦＰ２－Ｔａｕの蛍光撮像（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５３５ｎｍ）および明視野撮像を、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥヘルスケア）を用いて行った。神経突起における蛍光強度、または陽性神経突起長をタウ発現量の指標とすることで神経細胞内のタウ発現を定量した。また、明視野撮像によって神経突起長により神経細胞毒性を定量した。結果を図６に示す。図６に示す通り、ＴａｇＧＦＰ２蛍光強度およびＴａｇＧＦＰ２陽性突起長が低下していたことから、神経細胞内のタウ量が低下していることを検出できた。さらに、Ｔａｕ ｓｉＲＮＡ処置により位相差突起長が明確に変化しなかったことも同時に確認できた。

Claims (18)

  1. タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する、多能性幹細胞。
  2. 多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１に記載の多能性幹細胞。
  3. 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
  4. レポーター分子が蛍光タンパク質である、請求項１から３の何れか一項に記載の多能性幹細胞。
  5. レポーター分子をコードするＤＮＡが、内因性タウ遺伝子の上流側に位置している、請求項１から４の何れか一項に記載の多能性幹細胞。
  6. 請求項１から５の何れか一項に記載の多能性幹細胞から分化した神経細胞。
  7. タウタンパク質とレポーター分子との融合タンパク質が発現している、請求項６に記載の神経細胞。
  8. タウタンパク質がレポーター分子との融合タンパク質として発現されるように、内因性タウ遺伝子に隣接して導入された、レポーター分子をコードするＤＮＡを有する、神経細胞。
  9. 株化神経細胞または初代神経細胞である、請求項８に記載の神経細胞。
  10. レポーター分子が蛍光タンパク質である、請求項８又は９に記載の神経細胞。
  11. レポーター分子をコードするＤＮＡが、内因性タウ遺伝子の上流側に位置している、請求項８から１０の何れか一項に記載の神経細胞。
  12. 請求項１から５の何れか一項に記載の多能性幹細胞又は請求項６から１１の何れか一項に記載の神経細胞を用いる、物質のスクリーニング方法。
  13. タウの発現量の増減の評価、又はタウの細胞内における分布の評価を、レポーター分子の発現に基づいて行う、請求項１２に記載の方法。
  14. タウの発現量の増減を、レポーター分子の発現強度に基づいて評価する、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法でスクリーニングされた物質。
  16. タウ遺伝子挿入部位の上流および下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍとレポーター分子をコードするＤＮＡを含むＴａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒと、タウ遺伝子の切断部位を決定するｇＲＮＡを含む、キット。
  17. タウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号１に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号２に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であるか、あるいはタウ遺伝子挿入部位の上流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号３に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列であり、タウ遺伝子挿入部位の下流のＨｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍが配列番号４に記載の配列と９０％以上の同一性をもつ配列である、請求項１６に記載のキット。
  18. ｇＲＮＡが配列番号５又は６に記載の配列と９０％以上の同一性を有する配列を標的配列とする、＜１７＞に記載のキット。
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