JPWO2017065277A1 - ２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、薬剤感受性ヒト細胞株の判定方法 - Google Patents

２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、薬剤感受性ヒト細胞株の判定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明の課題は、２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、癌細胞の新しい分類方法を提供することである。同一のサンプル由来の２種のプロテインキナーゼの活性の比から、癌細胞を新たに分類し、薬剤感受性を予測する。
【選択図】なし

Description

本発明は、２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、癌細胞の新規サブタイプ分類法及び、該サブタイプ分類法に基づくガン細胞の薬剤感受性の判定方法に関する。さらに、生体由来の細胞のプロテインキナーゼの活性測定に基づく、該生体の薬剤効果判定方法を含む。
固形癌（悪性腫瘍）はその発症・転移部位により「乳」癌、「大腸」癌などと命名されているものの、その病因たる癌細胞は様々であり、分子生物学の発達と共に１つの組織の癌が様々に分類され、抗がん剤の効き目との相関関係が研究されてきた。
乳癌は乳汁を分泌する乳腺小葉上皮、あるいは乳管までの通り道である乳管の上皮が悪性化したものであり、近年の日本人女性の悪性腫瘍のなかでは最も頻度の高いものとなっている。乳癌はＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２も含め、様々な遺伝子の関与が示唆され、その発現量により様々なサブタイプに分類されている。
たとえば、癌細胞の増殖のエストロゲン依存性に関係するエストロゲン受容体（ＥＲ）・プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の発現量による分類や、がん遺伝子でもある受容体型チロシンキナーゼであるＨＥＲ２（ＨｕｍａｎＥＧＦＲ−Ｒｅｌａｔｅｄ２）の発現量による分類がそれである。
エストロゲン受容体（ＥＲ）・プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の発現量の大きい癌には、抗エストロゲン薬（タモキシフェンなど）が有効であり、ＨＥＲ２の発現が高い癌には抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である、トラスツズマブなどが有効であり、患者に投与される。
従って、乳がんは、エストロゲン受容体（ＥＲ）・プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の発現量の大きい場合やＨＥＲ２の発現が高い場合には病理学的完全奏効（ｐＣＲ）率が高い。すなわち、
１：（ＥＲ・ＰｇＲ陽性、ＨＥＲ２陽性）＝（抗エストロゲン薬感受性、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体感受性）（ルミナルＢ（ＨＥＲ２陽性）型）、
２：（ＥＲ・ＰｇＲ陽性、ＨＥＲ２陰性）＝（抗エストロゲン薬感受性、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体非感受性）（ルミナルＡ型又はルミナルＢ（ＨＥＲ２陰性）型）、又は
３：（ＥＲ・ＰｇＲ陰性、ＨＥＲ２陽性）＝（抗エストロゲン薬非感受性、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体感受性）（非ルミナル型）
の場合は、ｐＣＲ率が高い。
ＨＥＲ２やＥＲは治療法の効果との間に関連性があるため、効果予測因子と呼ばれており、臨床において応用されている（非特許文献１０）。一方、その因子の有無と予後が相関する因子のことを予後因子という。ＰｇＲは現在予後因子と考えられている。効果予測因子の検出には、主として腫瘍組織サンプルの免疫組織化学的方法（ＩＨＣ法）が多用されている。腫瘍細胞の染色強度と染色された細胞の比率の両方を加味する方法（ＡｌｌｒｅｄＳｃｏｒｅなど）や染色強度を評価せず染色された腫瘍細胞の比率のみで判定する方法（Ｊ−Ｓｃｏｒｅなど）のいずれかが用いられる。
ＨＥＲ２の場合、一般にＩＨＣ法で検査し、その結果が０あるいは１＋の場合は陰性、３＋の場合は陽性、２＋の場合はＦＩＳＨ法（Fluorescence in situ hybridization）によって増幅の有無を調べ、増幅があれば陽性、なければ陰性と判定する。
ＥＲの場合、ＡｌｌｒｅｄＳｃｏｒｅでは３〜８が陽性とされる一方、染色細胞の比率で判定する場合は１０％をカットオフ値とすることが多かったが、１％でも存在する場合は、ＥＲ陽性と判定すべきとの意見もある。いずれにせよ、一定のカットオフ値を設定すれば、これらの遺伝子（効果予測因子）が陽性と判断された場合、効果的な治療レジメンの指針となりうる。
しかしながら、乳癌細胞の中には、ＥＲ、ＰｇＲ及びＨＥＲ２のいずれの発現も確認されず、上記抗エストロゲン薬やＨＥＲ２モノクローナル抗体が抗がん剤として効かないトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）（ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性、ＨＥＲ２陰性）というものがあることが報告されている。
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は全乳がん中１１〜２３％存在し、現在予後不良とされている。上記標的特異的な薬剤だけでなく、その他の一般的な抗がん剤の効き目も患者によって異なっており、さらなるサブタイプ化が必要であることが示唆されている（非特許文献７、８）。
現在ＴＮＢＣは遺伝子プロファイルにより，アカデミックには少なくとも以下の６種類のサブタイプに分類できることが示されている：
二種類のbasal-like（ＢＬ１とＢＬ２）サブタイプ（細胞周期関連遺伝子やDNA傷害応答性遺伝子が高発現）；
Ｉmmunomodulatory（ＩＭ）サブタイプ（免疫反応に関連した遺伝子が高発現）；
Ｍesenchymal（Ｍ）サブタイプ (TGF-βやWnt/β-cateninシグナルに関連した遺伝子が高発現)；
Ｍesenchymal-stem like（ＭＳＬ）サブタイプ（Ｍタイプ発現＋幹細胞関連遺伝子高発現）；
Ｌuminal androgen receptor（ＬＡＲ）サブタイプ（ＡＲやluminal関連遺伝子の高発現）。
しかしながら、このような遺伝子発現プロファイルは、癌細胞の薬剤感受性と関連付けるのは難しく、現在基礎研究が行われる最中である（特許文献１、２、３；非特許文献１、２、９）。
特開2009-050183号公報 特開2013-174616号公報 特表2007-503809号公報 特表2010-507384号公報 特表2010-536371号公報 特表2015-505959号公報
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本願発明者らも癌細胞のプロファイリングにより、抗がん剤の投与指針を決めることができないか研究を続け、複数の遺伝子発現プロファイルでなく、複数のシグナルカスケードによりサブタイプに分類できるのではないかと作業仮説を打ち立てた。
その作業仮説に基づき、本願発明者らは様々な複数のカスケードで癌細胞の分類化ができないか模索した。しかしながら、既存の遺伝子発現量に基づく分類では、本願明細書比較例に示すように、有意な相関関係が得られなかった。
しかしながら、本願発明者らは自らの作業仮説を信じ、さらに鋭意研究を行い、以下に述べる手段により、みずからの作業仮説を立証した。
従って、本願発明の解決すべき課題は、上記作業仮説の立証であり、より具体的には、癌細胞の新規サブタイプ分類法及び、該サブタイプ分類法に基づくガン細胞の薬剤耐性の判定方法を提供することである。かかる方法は、たとえば癌患者から単離した癌組織細胞を用いて、当該癌細胞の薬剤感受性を判定し、その結果を当該癌患者の薬剤治療の際に用いることなどにも応用できる。
本願発明者らは、鋭意研究と様々な試行錯誤（比較例参照）を繰り返した。上記で述べた関連遺伝子の発現量、発現パターン、変異パターン、シグナル伝達経路に含まれる分子のリン酸化パターン、リン酸化量等間接的な因子の測定方法などを試したものの、いずれも有意な相関関係を得ることが出来ず、唯一以下の態様のみにおいて、シグナルカスケードと薬剤耐性の相関関係を得ることができた。
すなわち、本発明は、癌の生存増殖に関連する２種類の主要なシグナル伝達経路を担うキナーゼであるＭＥＫ及びＰＩ３Ｋの酵素活性を直接測定し、またはさらに補正因子（例えば細胞数を反映する総タンパク量や阻害剤有無に左右されない細胞内タンパク発現量など）を用いることで、（ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性・ＭＥＫ阻害剤感受性）、（ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性・ＭＥＫ阻害剤非感受性）、（ＰＩ３Ｋ阻害剤非感受性・ＭＥＫ阻害剤感受性）、（ＰＩ３Ｋ阻害剤非感受性・ＭＥＫ阻害剤非感受性）の４つのサブタイプに癌細胞を分類する方法である。
キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）とは、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸結合を有する分子からリン酸基をターゲット分子に転移する（リン酸化する）酵素の総称であり（酵素番号：ＥＣ２．７．１〜２．７．４）、ホスファターゼとは、該ターゲット分子からを加水分解し、リン酸基を解離させる酵素の総称である。
リン酸化は通常、真核生物の場合、タンパク質のセリン、トレオニン、そしてチロシンの残基に起こり、その標的により、キナーゼは主としてセリン／トレオニンキナーゼとチロシンキナーゼに分類される。
キナーゼ自身が、膜受容体であったり、他のキナーゼのターゲット分子であったりすることにより、細胞内において複雑なシグナルネットワークを形成する。
たとえば、チロシンキナーゼ（あるいは蛋白質チロシンキナーゼ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ； ＰＴＫ、ＥＣ ２．７．１０．）は、細胞の分化、増殖、接着、あるいは免疫反応などに関わるシグナル伝達に関与し、増殖因子が結合することによって活性化する受容体型と、増殖因子が結合しない非受容体型の２型に大別される。チロシンキナーゼが活性化されると、受容体自身、あるいは標的とするタンパクを特異的にリン酸化する。受容体自身の自己リン酸化により、このリン酸化部位を認識するさまざまなシグナル伝達因子が受容体に結合し、シグナル伝達が始まる。また標的タンパクのリン酸化により、細胞内のさまざまなタンパクが次々と活性化し、シグナル伝達が始まる。ヒトのチロシンキナーゼは１００種類以上あると報告されており、がん、アテローマ性動脈硬化症や乾癬などでは、過剰に活性化していることが報告されている。
「ＰＩ３Ｋ」（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ; ＥＣ ２．７．１．１３７）は、細胞膜の構成成分であるイノシトールリン脂質のイノシトール基３位のヒドロキシル基のリン酸化を行う酵素である。
ＥＣ番号（酵素番号：Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ）は酵素を整理すべく反応形式に従ってＥＣに続く４組の数字で表したものであり、国際生化学連合（現在のＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素委員会によって規定されたものである。たとえばＰＩ３Ｋであれば、
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC2/7/1/137.html
にその定義が記載されている。
ＰＩ３Ｋは、構造によりＣｌａｓｓＩ、ＩＩ、ＩＩＩに分類される。
クラスＩ ＰＩ３Ｋはヘテロ二量体であり、アミノ酸配列の相同性からクラスＩＡとクラスＩＢにさらに分けられる。クラスＩＡは ｐ１１０α、β およびδからなり、調節サブユニットであるｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５βおよびｐ５５γと結合している。ｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０αは同一遺伝子（Ｐｉｋ３ｒ１）のスプライシングバリアントであり、ｐ８５βとｐ５５γはそれぞれＰｉｋ３ｒ２およびＰｉｋ３ｒ３遺伝子に由来する。クラスＩＡはＰＫＢ(Protein Kinase-B)（セリン・スレオニンキナーゼのＡｋｔ(v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene)）の活性化に関与している。一方、クラスＩＢ ＰＩ３Ｋであるｐ１１０γは哺乳類においてのみ発現が見られ、Ｇタンパク質のβγサブユニットやｐ１０１によってその機能を調節される。クラスＩＢのＰＩ３キナーゼは主にＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）からの刺激により活性化され、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２のリン酸化により産生されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は細胞内情報伝達機構においてセカンドメッセンジャーとして機能する。
クラスＩＩにはα、βおよびγの４つが存在するが、いずれも調節サブユニットを有さず単量体で酵素活性を示す。
クラスＩＩＩ ＰＩ３ＫはＰｔｄＩｎｓからＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐを産生し機能的にはクラスＩＩに近いが、構造的にはクラスＩにより類似しておりヘテロ二量体を形成して機能する。クラスＩＩＩ ＰＩ３Ｋはタンパク質輸送などに関与している。
「ＰＩ３Ｋ阻害薬」としては、これに限定されないがウォルトマンニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）（Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８＝４２８．４４ ＣＡＳ番号１９５４５−２６−７）

やＬＹ２９４００２、ＡＳ６０５２４０やＺＳＴＫ４７４、ＰＩ３Ｋδ特異的阻害薬であるＩＣ４８６０６８やＩＣ８７１１４などがこれにあたる。
ＭＥＫとはＭＡＰｋｉｎａｓｅ−ＥＲＫｋｉｎａｓｅＫｉｎａｓｅ又はＭＡＰ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）を意味し、ＭＡＰキナーゼの活性化に必須のトレオニン・セリン残基のリン酸化を行う酵素である（ＥＣ ２．７．１２．２）。
ＥＲＫ１／２の活性化にはＭＥＫ１及びＭＥＫ２が、ＪＮＫサブファミリーにはＭＥＫ４及びＭＥＫ７が、ｐ３８サブファミリーにはＭＥＫ３及びＭＥＫ６が、ＥＲＫ５サブファミリーの活性化にはＭＥＫ５が各々関与している。
「ＭＥＫ阻害薬」としては、これに限定されないがトラメチニブ（Ｃ２６Ｈ２３ＦＩＮ５Ｏ４＝６１５．３９４８ ＣＡＳ： ８７１７００−１７−３）

やＳＬ３２７、Ｕ０１２６、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ−９８０５９などがこれにあたる。
ウォルトマンニンが全てのサブクラスのＰＩ３Ｋ阻害薬であるのに対し、トラメチニブはＭＥＫ１及びＭＥＫ２を特異的に阻害する。
ＭＥＫはＥＲＫ−ＭＡＰＫ経路（増殖シグナル経路）に関与する遺伝子である。細胞膜の増殖因子受容体にリガンド（増殖因子）が結合し２量体化すると、アダプター分子、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｓを経由して、Ｒａｆ→ＭＥＫ→ＥＲＫとリン酸化反応するＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫカスケード）によりシグナルが伝達される。活性化したＥＲＫは最終的に核へ移行し、転写因子が活性化され、細胞増殖、細胞分化の遺伝子が発現する（ＥＲＫ−ＭＡＰＫ経路）。
一方、ＰＩ３Ｋは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路（生存シグナル経路）のトリガーとなる遺伝子である。増殖因子による刺激は、同時にアポトーシス誘導を抑制する経路にも伝わり、細胞死を防ぐ。このアポトーシス抑制活性の経路はＰＩ３Ｋのリン酸化活性から始まり、Ａｋｔのリン酸化を通して、細胞の生存やアポトーシス誘導を阻害する（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路）。
キナーゼ活性測定の主要な方法は以下で構成される。
１）細胞からタンパク質の抽出を行い、試料液中に存在するターゲットキナーゼに特異的な抗体を加えて該キナーゼを捕捉した後、該キナーゼに特異的な基質を加え酵素反応をさせる。
２）その後酵素反応の生成物であるＡＤＰを測定し、活性に換算する。
ＰＩ３Ｋ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤に感受性なヒト癌細胞を判定するための解析方法は、
１）得られたキナーゼの活性値の比（ＰＩ３Ｋ／ＭＥＫ）
２）得られたキナーゼの活性値を公知の方法で測定される総タンパク量で補正した値
３）得られたキナーゼの活性値を公知の方法で測定されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）で補正した値のいずれかを用い、各阻害剤の各細胞株に対するＩＣ５０（５０％阻害濃度）との対応関係を解析した。
複数の癌細胞株について、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋ活性の測定および解析を行うことにより、高確率でＰＩ３Ｋおよび／またはＭＥＫ阻害剤に感受性である細胞株を選び出すことが可能となった。
従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２６］の通りである。
［１］癌細胞を分類する方法であって、
１）ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、
２）ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性でありＭＥＫ阻害剤に非感受性である、
３）ＭＥＫ阻害剤感受性でありＰＩ３Ｋ阻害剤に非感受性である、または
４）ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である、
のいずれかに分類する方法；好ましくは
癌細胞を区別する方法であって、
１）ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性でありＭＥＫ阻害剤に非感受性である癌細胞、及び／又は
ＭＥＫ阻害剤感受性でありＰＩ３Ｋ阻害剤に非感受性である癌細胞を
２）ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、及び／又は
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である癌細胞と
区別する方法；
［２］前記方法が、癌細胞中のＰＩ３ＫおよびＭＥＫの酵素活性を用いて判定することを特徴とする［１］の方法；
［３］前記方法が、癌細胞中のＰＩ３ＫおよびＭＥＫの酵素活性の比により判定することを特徴とする［１］または［２］の方法；
［４］前記方法が、さらに総タンパク量を用いて補正することにより判定することを特徴とする［１］または［２］の方法；
［５］前記方法が、さらに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性値を用いて補正することにより判定することを特徴とする［１］または［２］の方法；
［６］前記酵素活性が、ＰＩ３ＫまたはＭＥＫに特異的に結合する抗体を用いて該酵素を捕捉することにより測定される［１］から［５］のいずれかの方法；
［７］前記酵素活性が、ＰＩ３Ｋおよび／またはＭＥＫに特異的な基質を用いることにより測定される［１］から［６］のいずれかの方法；
［８］前記酵素活性が、ＡＤＰの生成量を測定することによって行われることを特徴とする［１］から［７］のいずれかの方法；
［９］ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤の効果予測を判定するために使用される、［１］から［８］のいずれかの方法；
［１０］ＰＩ３Ｋ阻害剤がウォルトマンニンである［１］から［９］のいずれかの方法；
［１１］ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである［１］から［９］のいずれかの方法；
［１２］癌細胞が単離された組織試料である、［１］から［１１］のいずれかの方法；
［１３］組織試料が生検組織試料である、［１２］の方法；
［１４］生検組織試料が、トリプルネガティブ乳癌患者由来である［１３］の方法。
［１５］抗ＰＩ３Ｋ抗体と抗ＭＥＫ抗体を含む、［１］から［１４］のいずれかの方法に用いるためのキット。
［１６］１） 界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤を含む細胞溶解用の第一試薬
２Ａ）抗ＭＥＫ抗体を含むＭＥＫ測定用第二試薬
２Ｂ）抗ＰＩ３Ｋ抗体を含むＰＩ３Ｋ測定用第二試薬
３Ａ）ＭＥＫの基質ならびにＡＴＰを含むＭＥＫ測定用第三試薬
３Ｂ）ＰＩ３Ｋの基質ならびにＡＴＰを含むＰＩ３Ｋ測定用第三試薬
４） Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ；ＡＤＰ−Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ；Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｄｉｐｈｏｒａｓｅ並びにＮＡＤＰを含む第四試薬
５） ＬｕｍｉｎｏｌとＰｅｒｏｘｉｄａｓｅを含む第五試薬
ならびに
６）界面活性剤を含む洗浄用第六試薬
を含む、ＰＩ３Ｋ活性ならびにＭＥＫ活性測定用キット；
［１７］１）対象組織細胞を第一試薬で溶解し；
２Ａ）該溶解物の一部にＭＥＫ測定用第二試薬に添加して、対象組織細胞中のＭＥＫを回収し；任意で洗浄用第六試薬で回収したＭＥＫを洗浄後、ＭＥＫ測定用第三試薬を添加反応後、第四試薬添加反応、第五試薬添加反応して、ＭＥＫ活性を測定し；
２Ｂ）該溶解物の一部にＰＩ３Ｋ測定用第二試薬に添加して、対象組織細胞中のＭＥＫを回収し；任意で洗浄用第六試薬で回収したＰＩ３Ｋを洗浄後、ＰＩ３Ｋ測定用第三試薬を添加反応後、第四試薬添加反応、第五試薬添加反応して、ＰＩ３Ｋ活性を測定するための、［１６］のキット。
［１８］活性成分としてＰＩ３Ｋ阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって；
該癌細胞のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して大きい、上記医薬組成物。
［１９］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して大きい癌細胞を含む癌治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ阻害剤；
［２０］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して大きい癌細胞の増殖抑制用医薬の製造における、ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用；
［２１］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して大きい癌細胞を含む癌治療の方法であって、癌患者にＰＩ３Ｋ阻害剤を投与することを含む、方法；
ここで、参照標準はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、又はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく；
癌細胞は乳癌細胞、好ましくはトリプルネガティブ乳癌細胞であってよい。
［２２］活性成分としてＭＥＫ阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって；
該癌細胞のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して小さい、上記医薬組成物；
［２３］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して小さい癌細胞を含む癌治療における使用のための、ＭＥＫ阻害剤；
［２４］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して小さい癌細胞の増殖抑制用医薬の製造における、ＭＥＫ阻害剤の使用；
［２５］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して小さい癌細胞を含む癌治療の方法であって、癌患者にＭＥＫ阻害剤を投与することを含む、方法；
ここで、参照標準はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、又はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく、
癌細胞は乳癌細胞、好ましくはトリプルネガティブ乳癌細胞であってよい。
［２６］癌の診断治療の方法であって、
１）患者から癌細胞組織を採取し、
２）採取された癌細胞のＭＥＫ活性とＰＩ３Ｋ活性を測定し、
３）ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が、参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して
大きい場合は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を該患者に投与し；
小さい場合は、ＭＥＫ阻害剤を該患者に投与する
ことを含む方法であって；
ここで、参照標準はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、又はＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく
癌は乳癌、好ましくはトリプルネガティブ乳癌である。
［２７］ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比の、抗がん剤の癌に対する効果予測因子としての使用；
［２８］抗がん剤が、ＰＩ３Ｋ阻害剤又は／及びＭＥＫ阻害剤である［２７］の使用；
［２９］癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２７］又は［２８］の使用。
キナーゼを阻害する薬剤開発及びそれに関するコンパニオン診断技術の開発が盛んに進められている。診断技術としては、シグナル伝達に関連する遺伝子の発現量や変異パターンを確認する方法があり、実臨床に使用されている。
抗癌剤開発ではキナーゼ活性を直接阻害する薬剤が分子標的薬として様々に開発されている一方で、それらの有効性すなわち、キナーゼ活性の阻害程度を直接評価する診断技術は存在せず、公知のコンパニオン診断技術としては、がん関連遺伝子の発現量、発現パターン、変異パターン、シグナル伝達経路に含まれる分子のリン酸化パターン、リン酸化量等間接的な因子の測定方法に留まっている。それら測定される因子を用いた解析では、各種分子標的薬の効果を予測するのに十分な情報を必ずしも提供できるとは限らない。
かかる状況において本願発明は、新しい研究アプローチ及びそれに基づく新たな癌細胞の分類方法を提供し、キナーゼを阻害する薬剤開発及びそれに関するコンパニオン診断技術の開発の一助となることができる。
各薬剤の阻害率による細胞株の分類 薬剤濃度１μＭにおける２５％増殖阻害率を指標にした。 各薬剤の阻害率による細胞株の分類 薬剤濃度１００ｎＭにおける１２．５％増殖阻害率を指標にした。 各薬剤の阻害率による細胞株の分類 薬剤濃度１０μＭにおける５０％増殖阻害率を指標にした。 ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性値による細胞分類との比較 ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量値による細胞分類との比較（比較例１） リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量値による細胞分類との比較（比較例２） リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量値による細胞分類との比較（比較例３） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＬＤＨ活性、Ｙ：ＭＥＫ活性／ＬＤＨ活性によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＬＤＨ活性、Ｙ：ＭＥＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例４） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／ＬＤＨ活性、Ｙ：リン酸化ＭＥＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例５） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／ＬＤＨ活性、Ｙ：リン酸化ＥＲＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例６） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性、Ｙ：ＰＩ３Ｋ活性／ＬＤＨ活性によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量、Ｙ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例７） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例８） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＡＫＴ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例９） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性、Ｙ：ＭＥＫ活性／ＬＤＨ活性によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量、Ｙ：ＭＥＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例１０） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＭＥＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例１１） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＥＲＫ発現量／ＬＤＨ活性によるグリッド解析（比較例１２） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／総タンパク量、Ｙ：ＭＥＫ活性／総タンパク量によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／総タンパク量、Ｙ：ＭＥＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１３） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／総タンパク量、Ｙ：リン酸化ＭＥＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１４） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／総タンパク量、Ｙ：リン酸化ＥＲＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１５） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性、Ｙ：ＰＩ３Ｋ活性／総タンパク量によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量、Ｙ：ＰＩ３Ｋ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１６） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１７） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＡＫＴ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１８） Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性、Ｙ：ＭＥＫ活性／総タンパク量によるグリッド解析 Ｘ：ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量、Ｙ：ＭＥＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例１９） Ｘ：リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＭＥＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例２０） Ｘ：リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量、Ｙ：リン酸化ＥＲＫ発現量／総タンパク量によるグリッド解析（比較例２１） ＭＥＫ活性測定におけるＨＰＬＣ法との相関性 ＰI３Ｋ活性測定におけるＨＰＬＣ法との相関性 培養細胞から作製した担癌マウスより摘出した腫瘍中のキナーゼ活性比（ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性） ＭＤＡ−ＭＢ−２３１から作製された担癌マウスを用いた薬剤投与による腫瘍成長抑制 ＨＣＣ７０から作製された担癌マウスを用いた薬剤投与による腫瘍成長抑制 ＳＵＭ１８５ＰＥから作製された担癌マウスを用いた薬剤投与による腫瘍成長抑制
悪性腫瘍は、遺伝子変異によって自律的で制御されない増殖を行うようになった細胞集団（腫瘍、良性腫瘍と悪性腫瘍）のなかで周囲の組織に浸潤し、または転移を起こす腫瘍であり、悪性腫瘍（Malignant tumor）の用語は病理学において
１）癌腫（Carcinoma）：上皮組織由来の悪性腫瘍
２）肉腫（Sarcoma）：非上皮組織由来の悪性腫瘍
３）その他：白血病など
に分類され、本願において「癌細胞」とは癌腫の細胞を意味する。特に限定しないが、頭頸部癌（上顎癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、舌癌、甲状腺癌）、胸部癌（乳癌、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌））、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、肛門癌、泌尿器の癌（腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌）、生殖器癌（子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌）、卵巣癌、外陰癌、膣癌）、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）などの癌細胞がこれにあたる。
「阻害剤感受性」とは、特に限定しないが、細胞が阻害剤により増殖阻害を起こすことを言う。一例としては、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、ＨＥＲ２陽性癌と認定された癌が抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるトラスツズマブで増殖阻害を起こし、良好なｐＣＲを示す場合、「阻害剤感受性」であると定義できる。また、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、ルミナル型（ＥＲ・ＰｇＲ陽性）癌と認定された癌が、抗エストロゲン薬であるタモキシフェンで増殖阻害を起こし、良好なｐＣＲを示す場合、「阻害剤感受性」であると定義できる。
「阻害剤非感受性」とは、特に限定しないが細胞が阻害剤により増殖阻害を起こさないことを言う。一例としては、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、ＨＥＲ２陰性癌と認定された癌が抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるトラスツズマブで増殖阻害を起こさず、ｐＣＲを改善しない場合、「阻害剤非感受性」であると定義できる。また、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、非ルミナル型（ＥＲ・ＰｇＲ陰性）癌と認定された癌が、抗エストロゲン薬であるタモキシフェンで増殖阻害を起こさず、ｐＣＲを改善しない場合、「阻害剤非感受性」であると定義できる。
あるいは、「阻害剤非感受性」とは実施例で用いた癌細胞株がトリプルネガティブ乳癌であると規定されるのと同様の条件下で、阻害剤添加条件下で細胞増殖阻害を起こさないことを「阻害剤非感受性」と定義してもよい。
さらには、細胞が、阻害剤濃度１００ｎＭ、１μＭ、又は１０μＭにおいて、１２．５％、２５％又は５０％以上の増殖阻害率を示すことを「阻害剤感受性」と定義してもよい。逆に、細胞が、阻害剤濃度１００ｎＭ、１μＭ、又は１０μＭにおいて、１２．５％、２５％又は５０％未満の増殖阻害率を示すことを「阻害剤非感受性」と定義してよい。
より好ましくは薬剤濃度１００ｎＭにおける１２．５％以上の増殖阻害率、薬剤濃度１μＭにおける２５％以上の増殖阻害率、あるいは薬剤濃度１０μＭにおける５０％以上の増殖阻害率を示すことを「阻害剤感受性」と定義してもよく；逆に薬剤濃度１００ｎＭにおける１２．５％未満の増殖阻害率、薬剤濃度１μＭにおける２５％未満の増殖阻害率、あるいは薬剤濃度１０μＭにおける５０％未満の増殖阻害率を示すことを「阻害剤非感受性」と定義してもよい。
「ＰＩ３ＫおよびＭＥＫの酵素活性」とは各々のキナーゼがその標的を「リン酸化」する活性をいう。該活性は、その「リン酸化」のリン酸の供給源であるＡＴＰをＡＤＰとリン酸に分解する活性と同義である。
「ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤の効果予測」とは、該阻害剤が癌細胞の増殖を抑制する効果を予測すること意味する。好ましくは、生体内において該阻害剤が、抗癌剤として有効に機能する効果を予測すること意味する。
「組織試料」とはヒト又は非ヒト動物の単離された組織をいう。「組織試料」は単離後、凍結保存などされていてもよい。
「生検」とは診断の際に、顕微鏡などで観察するため病理組織の一部をメスや針などで採取することを意味する。好ましくは、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤が投与される前に行われることが望ましい。乳がんの場合、患者の***より、「切除生検」（組織のしこり全摘出）；「切開生検」（一部を摘出）；「コア生検」（太い針で 組織の一部を摘出）；あるいは「細針穿刺吸引(FNA)生検」（細い針で組織あるいは体液を摘出）ことにより採取される。
「キット」中の「抗ＰＩ３Ｋ抗体」「抗ＭＥＫ抗体」は液体の状態で存在してもよく、乾燥して固体の状態であってもよい。さらにビーズやプレートを含む固層に直接結合していてもよく；ＰｒｏｔｅｉｎＡ、Ｇ、Ｌやその融合たんぱく質或いは「抗ＰＩ３Ｋ抗体」及び「抗ＭＥＫ抗体」を認識する抗体（例えば、「抗ＰＩ３Ｋ抗体」や「抗ＭＥＫ抗体」がマウスＩｇＧ抗体であれば、マウスＩｇＧを認識する抗体）を介して間接的に固定されていてもよい。
「キット」中、各「測定試薬」は試薬成分が溶解している溶液の状態で存在してもよく、乾燥した固体の状態であってもよい。「測定試薬」が固体の状態の場合、「キット」には「測定試薬」を溶かすための「溶媒」を含んでいてもよい。
「抗ＰＩ３Ｋ抗体」とは、天然の活性を有するＰＩ３Ｋを特異的に認識結合する抗体を指す。結合により、ＰＩ３Ｋの活性を阻害しないことが好ましい。ＰＩ３ＫのクラスＩ（ＩＡ・ＩＢ）、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩのＰＩ３Ｋの各々サブユニットを認識する抗体であってよく、それら特異的抗体の組み合わせであってもよい。クラスＩＡのｐ１１０αサブユニットを認識する抗体が望ましい。
「抗ＭＥＫ抗体」とは、天然の活性を有するＭＥＫを特異的に認識結合する抗体を指す。ＭＥＫ１〜７を認識する抗体であってよく、それら特異的抗体の組み合わせであってもよい。ＥＲＫ１／２の活性に関与するＭＥＫ１及びＭＥＫ２を特異的に認識する抗体、あるいはＭＥＫ１を特異的に認識する抗体とＭＥＫ２を特異的に認識する抗体の組み合わせであってもよい。
「抗体」は完全長（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）イムノグロブリンであってもよく、その抗原結合認識領域を含む断片（いわゆる断片抗体（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）であってもよい。また「抗体」はヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ラクダなど哺乳動物由来、魚類（サメを含む）や鳥類（ニワトリ）由来のものであってよい。
「参照標準」とは、ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、又は
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞；あるいは該細胞を含む組織を指す。
「参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比」とは一検体由来の細胞組織から算出される「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比」であっても、複数の患者あるいは健常者由来の組織細胞から算出される「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比」であってもかまわない。あるいは１種又は複数種の培養細胞から算出される「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比」であってもよい。乳がんの場合は、がんを発症していない反対の***より摘出した細胞組織から算出される「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比」であってもよい。
「患者」は哺乳動物であってよく、「ヒト」又は「非ヒト哺乳動物」であってよい。
以下の実施例および比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
培養細胞を用いた細胞増殖試験によるＭＥＫ阻害剤及び感受性ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株の分類
１．方法
培養細胞を種々の濃度のＭＥＫ阻害剤、及びＰＩ３Ｋ阻害剤で処置し、細胞増殖阻害率を算出することでＭＥＫ及びＰＩ３Ｋ感受性株の分類を行った。培養方法、分析方法を以下の通りである。
株化細胞及び細胞培養
本研究に使用した１３種類の細胞、ＨＣＣ３８（ＢＬ１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＳＬ）、ＤＵ４４７５（ＩＭ）、ＨＣＣ１１８７（ＩＭ）、ＨＣＣ１１４３（ＢＬ１）、ＨＣＣ１３９５（ＬＡＲ）、ＨＣＣ１９３７（ＢＬ１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＬＡＲ）、ＨＣＣ７０（ＢＬ２）、ＨＳ５７８Ｔ（ＭＳＬ）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＭＳＬ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＢＬ１）はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＳＵＭ１８５ＰＥ（ＬＡＲ）はＡＳＴＥＲＡＮＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥから入手した。いずれもトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に属し、既存の分類法で６種類（ＢＬ１、ＢＬ２、Ｍ、ＭＳＬ、ＩＭ、ＬＡＲ）のいずれに属するかは公知である。
全ての細胞は、入手先指定の培地中で培養し、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補った。
薬物感受性アッセイ法（細胞増殖試験）
各細胞を９６ウェル・タイタープレートに１×１０４細胞/ウェルで播種し、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブ（ＭｅｄｉｃｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ ; ０．０８, ０．１６, ０．３１, ０．６３, １．２５, ２．５，５，１０，２０μＭ）およびＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニン（和光純薬 ; ０．０８, ０．１６, ０．３１, ０．６３, １．２５, ２．５，５，１０，２０μＭ）の種々の濃度でＤｅｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ［ＤＭＳＯ］（和光純薬）に溶解し処置した。また、 阻害剤７２時間後に、細胞増殖に対する効果をスルホローダミンＢアッセイ法（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）によって検査し、５０μＬ のスルホローダミンＢ溶液をそれぞれのウェルに添加して、細胞を室温において１時間染色した。代謝的に生存可能な細胞の染色の程度を５６５ｎｍの波長でマイクロタイタープレートを使用して吸光度をモニターした。細胞増殖阻害率は、トラメチニブおよびウォルトマンニンで処置されていない細胞（ＤＭＳＯによる処置）の吸光度を対象として１００％と定義することで算出した。
２Ａ．結果
図１Ａに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株（以下ＰＡ）、トラメチニブ感受性株（以下ＭＡ）、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株（以下Ｒ）、その他（以下Ｓ）の４種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度１μＭの阻害率を算出し、Ｘ軸をトラメチニブによる阻害率（％）、Ｙ軸をウォルトマンニンによる阻害率（％）をグラフにプロットした。２５％増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで４種類に分類した。
この方法によって、ＨＣＣ３８（ＢＬ１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＳＬ）、ＤＵ４４７５（ＩＭ）、ＨＣＣ１１８７（ＩＭ）、ＨＣＣ１１４３（ＢＬ１）、をＭＡ、ＨＣＣ１３９５（ＬＡＲ）、ＨＣＣ１９３７（ＢＬ１）、ＨＳ５７８Ｔ（ＭＳＬ）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＭＳＬ）をＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＬＡＲ）、ＨＣＣ７０（ＢＬ２）をＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＢＬ１）、ＳＵＭ１８５ＰＥ（ＬＡＲ）をＰＡと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
２Ｂ．結果
図１Ｂに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株（以下ＰＡ）、トラメチニブ感受性株（以下ＭＡ）、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株（以下Ｒ）、その他（以下Ｓ）の４種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度１００ｎＭの阻害率を算出し、Ｘ軸をトラメチニブによる阻害率（％）、Ｙ軸をウォルトマンニンによる阻害率（％）をグラフにプロットした。１２．５％増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで４種類に分類した。
この方法によって、ＨＣＣ３８（ＢＬ１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＳＬ）、ＤＵ４４７５（ＩＭ）、ＨＣＣ１１８７（ＩＭ）、ＨＣＣ１１４３（ＢＬ１）、をＭＡ、ＨＣＣ１３９５（ＬＡＲ）、ＨＣＣ１９３７（ＢＬ１）、ＨＳ５７８Ｔ（ＭＳＬ）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＭＳＬ）をＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＬＡＲ）、ＨＣＣ７０（ＢＬ２）をＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＢＬ１）、ＳＵＭ１８５ＰＥ（ＬＡＲ）をＰＡと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
２Ｃ．結果
図１Ｃに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株（以下ＰＡ）、トラメチニブ感受性株（以下ＭＡ）、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株（以下Ｒ）、その他（以下Ｓ）の４種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度１０μＭの阻害率を算出し、Ｘ軸をトラメチニブによる阻害率（％）、Ｙ軸をウォルトマンニンによる阻害率（％）をグラフにプロットした。５０％増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで４種類に分類した。
この方法によって、ＨＣＣ３８（ＢＬ１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＳＬ）、ＤＵ４４７５（ＩＭ）、ＨＣＣ１１８７（ＩＭ）、ＨＣＣ１１４３（ＢＬ１）、をＭＡ、ＨＣＣ１３９５（ＬＡＲ）、ＨＣＣ１９３７（ＢＬ１）、ＨＳ５７８Ｔ（ＭＳＬ）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＭＳＬ）をＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＬＡＲ）、ＨＣＣ７０（ＢＬ２）をＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＢＬ１）、ＳＵＭ１８５ＰＥ（ＬＡＲ）をＰＡと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
以上により、上記グリット解析は、薬剤濃度や増殖阻害率の数値限定を伴わなくても極めて再現性よく、各種細胞株の薬剤感受性・薬剤非感受性を分類することが可能である。
＜実施例２＞
培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定
１．方法
培養細胞から細胞可溶物を抽出し、各種キナーゼに対する特異抗体を用いて目的キナーゼを補足した後高速液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］を用いて測定を行った。測定サンプルの調製方法、測定方法は以下に示す。
キナーゼ解析のための細胞可溶物の調製
キナーゼ解析に供される株化細胞の可溶化液は、以下の通りに調製した。細胞を１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む所定の培地中で培養した。細胞数１×１０7程度まで培養した後、細胞を収集して、ＰＢＳで一度洗浄した。次いで、細胞を２４Ｇの針で２０回注射することによって溶解緩衝液（０.１％のＮＰ−４０、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で溶解した。不溶性物質を除去するために５分間の１５０００ｒｐｍの遠心分離を行い細胞可溶物とした。
細胞可溶物中のＭＥＫの捕捉と活性測定
ＭＥＫ活性測定は、ＨＰＬＣを使用して行なった。具体的には、キナーゼ反応により生じる生成物であるＡＤＰの量を測定し、その濃度をキナーゼ活性に換算した。細胞可溶化物は、前項に記載したとおりに調製した。ＭＥＫ分子は、４μｇの対応する抗体（抗ＭＥＫ１／ＭＥＫ２ ; Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び１００μＬのプロテインＧビーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞可溶化液２００μＬから４℃において２時間選択的に沈殿させた。洗浄緩衝液１（０．１％ ＴＸ−１００、５０Ｍｍ トリス−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、その後洗浄緩衝液２（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄後、１μｇのタンパク質基質（ｕｎａｃｔｉｖｅ−ＥＲＫ ; Ｓｉｇｎａｌｃｈｅｍ）、２ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（Ｓｉｇｍａ）、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ ８．５）、７ｍＭの塩化マグネシウムを含む１００μＬの基質混合物をビーズに添加して、３７℃において２時間、連続振盪化でインキュベーションした。反応終了後、基質反応液をＨＰＬＣにアプライし、反応混合液中のＡＤＰ量を測定し活性に換算した。なお、ＡＤＰ量は既知濃度のＡＤＰを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、１ユニット（Ｕ）は、３７℃下１分間に発生する１ｐｍｏｌのＡＤＰを酵素量と規定した。
活性測定方法
測定条件を以下に示す。
ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２２０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ ５μｍ ４．６×１５０ｍｍ、溶離液Ａ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｏｒｉｌ ｗｉｔｈ ０．１％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｆｌｕｋａ）、溶離液Ｂ：Ｗａｔｅｒ ｗｉｔｈ ０．１％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｆｌｕｋａ）、Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ： ２５４ｎｍ
ＰＩ３Ｋ活性測定
ＰＩ３Ｋ活性測定もＭＥＫと同様に、ＨＰＬＣを使用して行なった。細胞可溶化物は、ＭＥＫ活性測定と同様に調製した。ＰＩ３Ｋ分子は、１２μｇの対応する抗体（抗ＰＩ３Ｋ １１０α ; Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び１５０μＬのプロテインＧビーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞可溶化液２００μＬから４℃において２時間選択的に沈殿させた。洗浄緩衝液１（０．１％ ＴＸ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、その後洗浄緩衝液２（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄後、５０ｎＭの基質（Ｌ−ａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ; Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（Ｓｉｇｍａ）、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、７ｍＭの塩化マグネシウムを含む１００μＬの基質混合物をビーズに添加して、３７℃において２時間、連続振盪化でインキュベーションした。反応終了後、反応混合液をＨＰＬＣにアプライし、反応液中のＡＤＰ量を測定し活性に換算した。なお、ＡＤＰ量は既知濃度のＡＤＰを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、１ユニット（Ｕ）は、３７℃下１分間に発生する１ｐｍｏｌのＡＤＰを酵素量と規定した。測定方法は前述と同様である。
２．結果
［表１］に示すように各種細胞株で異なるキナーゼ活性値を示した。
＜実施例３＞
ウェスタンブロットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ発現量及びリン酸化量の測定
１．方法
前述の方法で得た細胞抽出液からウェスタンブロット法にて発現量を測定した。また、細胞数をノーマライズすべく分光光度計にて２８０ｎｍ吸光度の測定を行った。方法は以下に示す。
ウェスタンブロットによるＭＥＫとＰＩ３Ｋの発現量、リン酸化発現量及びリン酸化ＥＲＫ発現量、リン酸化ＡＫＴ発現量の測定
発現量及びリン酸化量解析に供される株化細胞の可溶化液も、活性測定と同様に調製した。ウェスタンブロット法のために、株化細胞の可溶化液をドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜へ転写した。膜をポリクローナル抗ＭＥＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）、ポリクローナル抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２抗体（Ｓｅｒ２１７／２２１）（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）、ポリクローナル抗ＰＩ３Ｋ ｐ１１０α抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）、ポリクローナル抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＩ３Ｋ ｐ８５（Ｔｙｒ４５８）／ｐ５５（Ｔｙｒ１９９）抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）、ポリクローナル抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）、ポリクローナル抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ抗体（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ; １:１０００）と共に室温で１時間（または４℃で一晩）インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベーションした。結果は、化学発光検出系で増強して視覚化した。リコンビナントＭＥＫ及びＰＩ３Ｋを用いて検量線を作成し、ＭＥＫ、リン酸化ＭＥＫ、及びＰＩ３Ｋ、リン酸化ＰＩ３Ｋ量を算出した。
２．結果
［表２］に示すように各種細胞株で異なるキナーゼ発現量及びリン酸化量を示した。
＜実施例４＞
細胞可溶化液中のＬＤＨ活性及びＡ２８０の測定
１．方法
前述の方法で得た細胞抽出液を、試薬としてＮ−アッセイ ＬＤＨ（ニットーボーメディカル）、また測定機器として日立７１８０形自動分析装置を用い、試料４μＬと第一試薬１６０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬４０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させた。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで測定した。濃度既知の標準液を用い吸光度変化量からＬＤＨ活性［Ｕ］を算出した。
また、同様の可溶化液をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ３０００分光光度計にて２８０ｎｍ吸光度を測定し、得られた吸光度をＡＢＳ１．０＝１．０ｍｇ／ｍＬで換算した。
以上の２種の値を細胞数のノーマライズに用いた。
２．結果
［表３］に示すように各種細胞株のＬＤＨ活性及び総タンパク量を得た。
＜実施例５＞
ＭＥＫ阻害剤感受性株及びＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株の判定パラメーターの構築
１．方法
これまで（実施例２〜４）に算出したプロテインキナーゼに関する８つの値、すなわちＩ：ＭＥＫ活性、ＩＩ：ＰＩ３Ｋ活性、ＩＩＩ： ＭＥＫ発現量、ＩＶ：ＭＥＫリン酸化量、Ｖ：ＰＩ３Ｋ発現量、ＶＩ：ＰＩ３Ｋリン酸化量、ＶＩＩ：ＬＤＨ活性、ＶＩＩＩ： 総タンパク量を用い、上記で分類した細胞株の薬剤感受性を予測するパラメーターの構築を行なった。
解析にあたっては、ＨＣＣ３８（ＢＬ１）を細胞株１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＳＬ）を細胞株２、ＤＵ４４７５（ＩＭ）を細胞株３、ＨＣＣ１１８７（ＩＭ）を細胞株４、ＨＣＣ１１４３（ＢＬ１）を細胞株５、ＨＣＣ１３９５（ＬＡＲ）を細胞株６、ＨＣＣ１９３７（ＢＬ１）を細胞株７、ＨＳ５７８Ｔ（ＭＳＬ）を細胞株８、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＭＳＬ）を細胞株９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＬＡＲ）を細胞株１０、ＨＣＣ７０（ＢＬ２）を細胞株１１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＢＬ１）を細胞株１２、ＳＵＭ１８５ＰＥ（ＬＡＲ）を細胞株１３と定義した。
２．結果
鋭意検討した結果、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」というパラメーターを用いることにより、２種の阻害剤感受性株を高確率で予測することが可能になった。具体的には、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が高値、すなわちＰＩ３Ｋ活性がＭＥＫ活性と比較して非常に高い領域に、ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株（ＰＡ）が位置している。上記とは逆にＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が低値、すなわちＭＥＫ活性がＰＩ３Ｋ活性と比較して非常に高い領域に、ＭＥＫ阻害剤感受性株（ＭＡ）が位置している（図２）。
これに対して、類似したパラメーターである、「ＰＩ３Ｋ発現量／ＭＥＫ発現量」（比較例１：図３）、「リン酸化ＰＩ３Ｋ発現量／リン酸化ＭＥＫ発現量」（比較例２：図４）や反応生成物である「リン酸化ＡＫＴ発現量／リン酸化ＥＲＫ発現量」（比較例３：図５）を用いた場合はこのような傾向は確認できず、予測をすることは出来なかった。本結果より、発現量やリン酸化量ではなく、活性を測定することの有効性が示された。
＜実施例６＞
グリッド解析によるＭＥＫ阻害剤感受性株及びＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株の判定
１．方法
実施例５と同様に８つの値、すなわちＩ：ＭＥＫ活性、ＩＩ：ＰＩ３Ｋ活性、ＩＩＩ： ＭＥＫ発現量、ＩＶ：ＭＥＫリン酸化量、Ｖ：ＰＩ３Ｋ発現量、ＶＩ：ＰＩ３Ｋリン酸化量、ＶＩＩ：ＬＤＨ活性、ＶＩＩＩ：総タンパク量を用いて算出したパラメーターを２軸のグラフ上にプロットし、カットオフ条件を含めた検証を行なった。また、グラフ上にプロットするにあたっては、ＭＡを■、ＰＡを▲、その他の細胞株を◆でプロットを行なった。
グリッド解析の評価項目として、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、正確度の５項目を算出した。
感度は本検証においては、「感受性と判断されるべきものを正しく感受性と判定する確率」と定義される。１例を挙げると、解析に用いる全細胞株中にＭＥＫ阻害剤感受性株（ＭＡ）が２個含まれており、解析の結果、ＭＥＫ阻害剤感受性と判定した領域にその感受性細胞株のうち１個がプロットされた場合、感度は、１／２＝５０％となる。
特異度は本検証においては、「非感受性と判断されるべきものを正しく非感受性と判定する確率」と定義される。１例を挙げると、解析に用いる全細胞株中にＭＥＫ阻害剤非感受性株が８個含まれており、解析の結果、ＭＥＫ阻害剤非感受性と判定した領域に非感受性細胞株が４個プロットされた場合、特異度は、４／８＝５０％となる。
陽性的中率は本検証においては、「感受性と判断された場合に、真に感受性である確率」と定義される。１例を挙げると、解析の結果ＭＥＫ阻害剤感受性と判定した領域に細胞株が２個プロットされ、その細胞株のうち１個がＭＥＫ阻害剤感受性である場合、陽性的中率は、１／２＝５０％となる。
陰性的中率は本検証においては、「非感受性と判断された場合に、真に非感受性である確率」と定義される。１例を挙げると、解析の結果ＭＥＫ阻害剤非感受性と判定した領域に細胞株が６個プロットされ、その細胞株のうち5個がＭＥＫ阻害剤非感受性である場合、陽性的中率は、５／６＝８３％となる。
正確度は本検証においては、「真の感受性株と真の非感受性株が全体にしめる割合」と定義される。１例を挙げると、解析に用いる全細胞株数が１０個であり、その内ＭＥＫ阻害剤感受性株が２個、ＭＥＫ阻害剤非感受性株が８個であるとする。解析の結果、ＭＥＫ阻害剤感受性株の内１個を感受性（真陽性）、残り１個を非感受性（偽陰性）と判断し、ＭＥＫ阻害剤非感受性株の内２個を感受性（偽陽性）、残り６個（真陰性）を非感受性と判断した。この場合、正確度は、（１+６）／（１＋２＋１＋６）＝ ７０％となる。
２．結果
種々検討をした結果、数種のパラメーターの組み合わせにてグリッド解析を行った（表４〜９）。そのうち、細胞株の薬剤感受性を予測が可能となった（パラメーターは以下の６通りである図６、１０、１４，１８、２２、２６）。
１）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＬＤＨ活性 Ｙ：ＭＥＫ活性／ＬＤＨ活性（図６）２）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性 Ｙ：ＰＩ３Ｋ活性／ＬＤＨ活性（図１０）
３）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性 Ｙ：ＭＥＫ活性／ＬＤＨ活性（図１４）
４）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／総タンパク量 Ｙ：ＭＥＫ活性／総タンパク量（図１８）
５）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性 Ｙ：ＰＩ３Ｋ活性／総タンパク量（図２２）
６）Ｘ：ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性 Ｙ：ＭＥＫ活性／総タンパク量（図２６）
対して活性値の代わりに発現量（図７、１１、１５，１９，２３、２７）、リン酸化量（図８、１２、１６、２０、２４、２８）もしくは基質のリン酸化量（図９、１３、１７、２１、２５、２９）を用いた場合には感受性予測が不可能であった（比較例４〜２１）。
１）パラメーター比較

２）パラメーター比較
３）パラメーター比較
４）パラメーター比較
５）パラメーター比較
６）パラメーター比較
＜実施例７＞
化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定
１．方法
対照法（ＨＰＬＣ法：実施例２）との相関性を確認した。
試料
乳癌細胞株１６種類を用いた。具体的には、ＨＣＣ３８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＤＵ４４７５、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１３９５、ＨＣＣ１９３７、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＨＣＣ７０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＵＭ１８５ＰＥ、ＢＴ２０、ＢＴ５４９、ＨＣＣ１８０６の１６種類である。
第一試薬
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５（ＳＩＧＭＡ） １００ｍＭ
ＭｇＣｌ２（和光純薬） １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ（同仁化学） ５ｍＭ
ＮａＦ（和光純薬）（脱リン酸化酵素阻害剤） ５０ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４（和光純薬）（脱リン酸化酵素阻害剤） １ｍＭ
Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ
（ナカライテスク） １％
ＮＰ−４０（ナカライテスク） ０.１％
第二試薬
１）ＭＥＫ測定用
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ
（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） １５ｍｇ/ｍＬ
ａｎｔｉ−ＭＥＫ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）
（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ２０μｇ/ｍＬ
ａｎｔｉ−ＭＥＫ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）
（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ２０μｇ/ｍＬ
２）ＰＩ３Ｋ測定用
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ
（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） ２２．５ｍｇ/ｍＬ
ａｎｔｉ−ＰＩ３Ｋ １１０α ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）
（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６０μｇ/ｍＬ
第三試薬
１）ＭＥＫ測定用
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５（ＳＩＧＭＡ） １００ｍＭ
ＮａＣｌ（和光純薬） ３００ｍＭ
ｕｎａｃｔｉｖｅ−ＥＲＫ （Ｓｉｇｎａｌｃｈｅｍ）１００μｇ/ｍＬ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、ＳＩＧＭＡ） １０ｍＭ
２）ＰＩ３Ｋ測定用
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５（ＳＩＧＭＡ） １００ｍＭ
ＮａＣｌ（和光純薬） ３００ｍＭ
Ｌ−ａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｓｏｄｉｕｍ
ｓａｌｔ（Ｓｉｇｎａｌｃｈｅｍ） ０.５ｍＭ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、ＳＩＧＭＡ） １０ｍＭ
第四試薬
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５（ＳＩＧＭＡ） １００ｍＭ
硫酸マグネシウム７水和物（和光純薬） １０ｍＭ
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬） ４０ｍＭ
ＡＤＰ−Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（旭化成） ２０ＫＵ／Ｌ
Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（ロシュ・ダイアグノスティクス） ２０ＫＵ／Ｌ
Ｄｉｐｈｏｒａｓｅ（旭化成） ５ＫＵ／Ｌ
ＮＡＤＰ（ロシュ・ダイアグノスティクス） ３ｍＭ
第五試薬
Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐＨ９．８（和光純薬）１００ｍＭ
Ｌｕｍｉｎｏｌ（和光純薬） １ｍＭ
Ｐ−ｉｏｄｐｈｅｎｏｌ（和光純薬）（増発光剤） ０．３ｍＭ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡） ２０ＫＵ／Ｌ
第六試薬
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５（ＳＩＧＭＡ） １００ｍＭ
ＮａＣｌ（和光純薬） ３００ｍＭ
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
（ナカライテスク） ０．０５％
キナーゼ活性のための細胞可溶物の調製
キナーゼ解析に供される株化細胞の可溶化液は、以下の通りに調製した。細胞を１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む細胞毎に適した培地で培養した。細胞数１×１０7程度まで培養した後、細胞を収集して、ＰＢＳで一度洗浄した。次いで、細胞に第一試薬を０．５ｍＬ添加し、ボルテックスミキサーで撹拌することによって溶解した。不溶性物質を除去するために５分間の１５０００ｒｐｍの遠心分離を行い細胞可溶物とした。
細胞可溶物中のＭＥＫの捕捉とキナーゼ反応
細胞可溶化物０．２ｍＬに対してＭＥＫ測定用第二試薬を０．２ｍＬ添加し、４℃において２時間撹拌することにより、ＭＥＫ分子を選択的に沈殿させた。反応終了後、上清を除去した後、第六試薬を０．５ｍＬ加えてＭＥＫ捕捉磁性粒子を懸濁することによる洗浄操作を３回行なった。洗浄後、ＭＥＫ測定用第三試薬を０．５ｍＬ加え、３７℃において２時間、振盪させながらキナーゼ反応を行なった。反応終了後、反応液を回収し、ＨＰＬＣ法及び化学発光法による活性測定を行なった。ＨＰＬＣ法による活性測定方法は実施例２と同様である。
化学発光法を用いたＭＥＫ活性測定
ＭＥＫ活性測定はキナーゼ反応により生じるＡＤＰを間接的に測定することにより行なった。具体的には、公知の酵素反応を組み合わせることにより行なった。（下図参照）
まず上記３段階の酵素反応を行なうことにより、ＡＤＰを過酸化水素に変換した。具体的な酵素反応は、１）ＡＤＰ依存性Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅによる、ＡＤＰとＧｌｕｃｏｓｅからのＧｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅの生成、２）Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤＨ）による、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅとＮＡＤＰからのＮＡＤＰＨの生成、３）Ｄｉｐｈｏｒａｓｅによる、ＮＡＤＰＨと水素イオンからの過酸化水素の生成、である。さらに、４）過酸化水素をＬｕｍｉｎｏｌ及びＰｅｒｏｘｉｄａｓｅと反応させることにより発光を生じさせ、検出装置で検出した。検出した化学発光強度に基づき、ＡＤＰ濃度を介して、キナーゼ活性に換算した。
具体的な測定プロトコールとしては、上記キナーゼ反応で得た反応液をミリＱで４倍希釈したものを、９６ウェルプレートに２０μＬアプライし、そこに第四試薬を２０μＬ添加し、３７℃において１０分間、振盪させながらインキュベーションし、ＡＤＰの量を依存した過酸化水素を発生させた。反応終了後、プレート測定に対応するルミノメーター（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）にプレートをセットし、各ウェルに第五試薬を３０μＬ添加し、試薬添加により生じる化学発光強度を測定した。測定した化学発光強度に基づき、ＡＤＰ濃度を介して、キナーゼ活性に換算した。
なお、ＡＤＰ濃度は既知濃度のＡＤＰを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、１ユニット（Ｕ）は、３７℃下１分間に発生する１ｐｍｏｌのＡＤＰを酵素量と規定した。
細胞可溶物中のＰＩ３Ｋの捕捉とキナーゼ反応
ＭＥＫと同様に、細胞可溶化物０．２ｍＬに対してＰＩ３Ｋ測定用第二試薬を０．２ｍＬ添加し、４℃において２時間撹拌することにより、ＰＩ３Ｋ分子を選択的に沈殿させた。反応終了後、上清を除去した後、第六試薬を０．５ｍＬ加えてＰＩ３Ｋ捕捉磁性粒子を懸濁することによる洗浄操作を３回行なった。洗浄後、ＰＩ３Ｋ測定用第三試薬を０．５ｍＬ加え、３７℃において２時間、振盪させながらキナーゼ反応を行なった。反応終了後、反応液を回収し、ＨＰＬＣ法及び化学発光法による活性測定を行なった。ＨＰＬＣ法による活性測定方法は実施例２と同様である。
化学発光法を用いたＰＩ３Ｋ活性測定
ＰＩ３Ｋ活性測定もＭＥＫ活性測定と同様に、キナーゼ反応により生じるＡＤＰを間接的に測定することにより行なった。具体的には、公知の酵素反応を組み合わせることにより行なった。（下図参照）
まず上記３段階の酵素反応を行なうことにより、ＡＤＰを過酸化水素に変換した。具体的な酵素反応は、１）ＡＤＰ依存性Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅによる、ＡＤＰとＧｌｕｃｏｓｅからのＧｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅの生成、２）Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤＨ）による、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅとＮＡＤＰからのＮＡＤＰＨの生成、３）Ｄｉｐｈｏｒａｓｅによる、ＮＡＤＰＨと水素イオンからの過酸化水素の生成、である。さらに、４）過酸化水素をＬｕｍｉｎｏｌ及びＰｅｒｏｘｉｄａｓｅと反応させることにより発光を生じさせ、検出装置で検出した。検出した化学発光強度に基づき、ＡＤＰ濃度を介して、キナーゼ活性に換算した。
２．結果
ＭＥＫ活性測定におけるＨＰＬＣ法との相関性を図３０に示す。
ＨＰＬＣ法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図３０に示したように、Ｙ ＝ １．２１６８Ｘ − ０．２８８４、相関係数０．８９６と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト乳癌細胞中のＭＥＫ活性を正確に測定できているといえる。
同様に、ＰI３Ｋ活性測定におけるＨＰＬＣ法との相関性を図３１に示す。
ＨＰＬＣ法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図３１に示したように、Ｙ ＝ ０．９０２７Ｘ − ０．０３３７、相関係数０．９４３と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト乳癌細胞中のＰI３Ｋ活性を正確に測定できているといえる。
＜実施例８＞
培養細胞から作製した担癌マウスより摘出した腫瘍中のキナーゼ活性測定
１．方法
培養したトリプルネガティブ乳癌細胞株をヌードマウスの皮下に注入することで、担癌マウスを作製し、腫瘍組織として生着した後、所定の大きさで摘出した。摘出した腫瘍から目的キナーゼを含む可溶物を抽出し、各種キナーゼに対する特異抗体を用いて目的キナーゼを補足した後化学発光法を用いて測定を行った。測定サンプルの調製方法、測定方法は以下に示す。なお、測定方法及び試薬名称等に関しては、実施例７「化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定」と同様である。
細胞懸濁液及び担癌マウスの作製
ＭＡと分類されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｓと分類されたＨＣＣ７０及びＰＡと分類されたＳＵＭ１８５ＰＥ細胞株を前述の方法によって培養し、トリプシンで剥離後約７×１０６細胞／ｍＬになるようにＭａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス（コーニング社製）にて懸濁し細胞懸濁液を調製した。２７ゲージのシリンジを用い、０．１ｍＬの細胞懸濁液を５週齢メスのヌードマウス（日本クレア社製）の皮下に注入することで担癌マウスを作製し、腫瘍体積を観測した。腫瘍体積は長径×（短径）２／２で算出した。
腫瘍の摘出
腫瘍体積が３００ｍｍ３に達した段階で腫瘍を摘出した。解析にあたっては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いて作製した腫瘍を腫瘍１、ＨＣＣ７０を用いて作製した腫瘍を腫瘍２、ＳＵＭ１８５ＰＥを用いて作製した腫瘍を腫瘍３と定義した。
キナーゼ活性のための腫瘍可溶物の調製
キナーゼ解析に供される腫瘍の可溶化液は、以下の通りに調製した。摘出した腫瘍の重量を測定し、腫瘍１ｇあたり１６ｍＬの第一試薬を添加し、氷冷下において乳棒及び乳鉢を用いてすり潰すことにより、腫瘍組織を破砕した。不溶性物質を除去するために５分間の１５０００ｒｐｍの遠心分離を行い腫瘍可溶物とした。
腫瘍可溶物中のＭＥＫの捕捉とキナーゼ反応
化学発光法を用いたＭＥＫ活性測定
腫瘍可溶物中のＰＩ３Ｋの捕捉とキナーゼ反応
化学発光法を用いたＰＩ３Ｋ活性測定
実施例７「化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定」と同様である。
２．結果
図３２に、３種類の細胞株由来の腫瘍活性測定結果を示す（個体数Ｎ＝３）。ＭＥＫ阻害剤感受性株（ＭＡ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株（ＰＡ）由来の腫瘍からサンプルを調製し「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」を算出した。この場合、例えばＭＡ,ＰＡいずれにも該当しないＨＣＣ７０細胞由来の腫瘍サンプルを参照標準とすれば、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が参照標準より低い腫瘍についてはＭＥＫ阻害剤感受性であり、ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が参照標準より高い腫瘍についてはＰＩ３Ｋ阻害剤感受性であるという示唆を得ることが可能となる。表１０に参照標準に対するＭＥＫ阻害剤感受性株（ＭＡ）またはＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株（ＰＡ）の「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」のｐ値を示す。
＜実施例９＞
培養細胞から作製された担癌マウスを用いた薬剤投与による腫瘍成長抑制試験
１．方法
培養したトリプルネガティブ乳癌細胞株をヌードマウスの皮下に注入することで、担癌マウスを作製し、腫瘍組織として生着した後、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を投与し、腫瘍体積を測定することで抗腫瘍効果を観測した。担癌マウス作製方法、投与方法は以下の通りである。
細胞懸濁液及び担癌マウスの作製
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ７０及びＳＵＭ１８５ＰＥ細胞株を前述の方法によって培養し、トリプシンで剥離後約７×１０６細胞／ｍＬになるようにＭａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス（コーニング社製）にて懸濁し細胞懸濁液を調製した。２７ゲージのシリンジを用い、０．１ｍＬの細胞懸濁液を５週齢メスのヌードマウス（日本クレア社製）の皮下に注入することで担癌マウスを作製した。
投与薬剤溶解液の調製
ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブとＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニンを１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、を含むＰＢＳにて各０．３ｍｇ／ｋｇとなるように溶解し、投与薬剤溶解液とした。また、コントロールとしては１％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳを使用した。
投与方法及び実験デザイン
腫瘍体積が３００ｍｍ３に達した個体を無作為に３群に分け投与を開始した。投与方法は投与薬剤溶解液を１４日間毎日１回経口投与し、腫瘍体積を観測した。腫瘍体積は長径×（短径）２／２で算出した。
２．結果
図３３〜３５に各種阻害剤による各群（コントロール群、トラメチニブ投与群、ウォルトマンニン投与群）個体数Ｎ＝６の腫瘍成長抑制試験の結果を示す（図３３：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担癌マウス、図３４：ＨＣＣ７０担癌マウス、図３５：ＳＵＭ１８５ＰＥ担癌マウス）。また、表１１に１４日間薬剤投与の翌日１５日目の各群の腫瘍体積に関して、コントロール群間での有意差検定を行い算出されたｐ値の結果を示す。検定方法はマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。
実施例７において「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が低値を示した、ＭＥＫ阻害剤感受性株（ＭＡ）であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の腫瘍の増殖は、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブ投与で有意に抑制される一方、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニン投与では有意な抑制効果は得られなかった。
実施例７において「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が高値を示した、ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性株（ＰＡ）であるＳＵＭ１８５ＰＥ由来の腫瘍の増殖は、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニン投与で有意に抑制される一方、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブ投与では有意な増殖抑制効果が得られなかった。
実施例７において「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が中間値を示した、両感受性株（Ｓ）であるＨＣＣ７０由来の腫瘍の増殖は、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニン投与及びＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブ投与にて薬剤間の効果は異なるものの、いずれの薬剤においても有意に増殖抑制効果が観測された。
以上の結果から、癌患者から単離した癌組織細胞のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性の比を測定することにより、癌患者のがん治療に適した薬剤を選定する上で極めて有力な指針となり、選定された薬剤を優先的に投与することにより、効果的な治療を行うことができることが示唆された。すなわち、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が低値を示した場合はＭＥＫ阻害剤を優先的に投与し、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」が高値を示した場合はＰＩ３Ｋ阻害剤優先的に投与するという治療レジメンが成り立つので、「ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性」は癌に対する化学療法のための効果予測因子と使用することが可能である。
とりわけ、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）と診断された患者に対して新たな治療法を提供することも可能である。従来、ＴＮＢＣと診断された患者は、腫瘍組織提出手術後、放射線療法もしくは抗がん剤を用いた化学療法を治療レジメンとして選択する。本願発明に係る方法はその際にどの抗がん剤を用いるべきかの指針（効果予測因子）の１つを提供できる。
２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、癌細胞の新規サブタイプ分類法及び、該サブタイプ分類法に基づくガン細胞の薬剤耐性の判定方法は、生体由来の細胞のプロテインキナーゼの活性測定に基づく、該生体の薬剤効果判定の一助となり、かかる方法は、たとえば癌患者から単離した癌組織細胞を用いて、当該癌細胞の薬剤感受性を判定し、その結果を当該癌患者の薬剤治療の際に用いることなどにも応用できる。
抗がん剤治療はそれ自体患者に対する負担も大きく、患者にあった治療レジメンを治療開始前に決めることは患者のＱＯＬ（ＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅ）を保つ上でも重要である。本願発明の場合、外科手術前の化学治療（術前抗がん剤治療）の治療レジメンに応用できるだけなく、外科手術で腫瘍摘出後の治療レジメンにも応用できる。

Claims (24)

  1. 癌細胞を区別する方法であって、
    １）ＰＩ３Ｋ阻害剤感受性でありＭＥＫ阻害剤に非感受性である癌細胞、及び／又は
    ＭＥＫ阻害剤感受性でありＰＩ３Ｋ阻害剤に非感受性である癌細胞を
    ２）ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に非感受性である、及び／又は
    ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である癌細胞と
    区別する方法であって；
    癌細胞中のＰＩ３ＫおよびＭＥＫの酵素活性の比により区別することを特徴とする方法。
  2. 前記方法が、さらに総タンパク量を用いて補正することにより判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、さらに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性値を用いて補正することにより判定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記酵素活性が、ＰＩ３ＫまたはＭＥＫに特異的に結合する抗体を用いて該酵素を捕捉することにより測定される請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記酵素活性が、ＰＩ３Ｋおよび／またはＭＥＫに特異的な基質を用いることにより測定される請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記酵素活性が、ＡＤＰの生成量を測定することによって行われることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤の効果予測を判定するために使用される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＰＩ３Ｋ阻害剤がウォルトマンニンである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 癌細胞が組織試料である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 組織試料が生検組織試料である、請求項１０に記載の方法。
  12. 生検組織試料が、トリプルネガティブ乳癌患者由来である請求項１１に記載の方法。
  13. 抗ＰＩ３Ｋ抗体と抗ＭＥＫ抗体を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキット。
  14. １）界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤を含む細胞溶解用の第一試薬
    ２Ａ）抗ＭＥＫ抗体を含むＭＥＫ測定用第二試薬
    ２Ｂ）抗ＰＩ３Ｋ抗体を含むＰＩ３Ｋ測定用第二試薬
    ３Ａ）ＭＥＫの基質ならびにＡＴＰを含むＭＥＫ測定用第三試薬
    ３Ｂ）ＰＩ３Ｋの基質ならびにＡＴＰを含むＰＩ３Ｋ測定用第三試薬
    ４） Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ；ＡＤＰ−Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ；Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｄｉｐｈｏｒａｓｅ並びにＮＡＤＰを含む第四試薬
    ５） ＬｕｍｉｎｏｌとＰｅｒｏｘｉｄａｓｅを含む第五試薬
    ならびに
    ６）界面活性剤を含む洗浄用第六試薬
    を含む、ＰＩ３Ｋ活性ならびにＭＥＫ活性測定用キット。
  15. ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比の、抗がん剤の癌に対する効果予測因子としての使用。
  16. 抗がん剤が、ＰＩ３Ｋ阻害剤又は／及びＭＥＫ阻害剤である請求項１５の使用。
  17. 癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１５又は１６に記載の使用。
  18. 活性成分としてＰＩ３Ｋ阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって；
    該癌細胞のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して大きい、上記医薬組成物。
  19. 活性成分としてＭＥＫ阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって；
    該癌細胞のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して小さい、上記医薬組成物。
  20. 参照標準がＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞である、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 癌の診断治療の方法であって、
    １）患者から癌細胞組織を採取し、
    ２）採取された癌細胞のＭＥＫ活性とＰＩ３Ｋ活性を測定し、
    ３）ＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比が、参照標準のＰＩ３Ｋ活性／ＭＥＫ活性比と比較して
    大きい場合は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を該患者に投与し；
    小さい場合は、ＭＥＫ阻害剤を該患者に投与する、
    ことを含む方法。
  23. 参照標準がＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に感受性である細胞である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項２２又は２３に記載の方法。
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