JP6745048B2 - 2種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、薬剤感受性ヒト細胞株の判定方法 - Google Patents
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Description
たとえば、癌細胞の増殖のエストロゲン依存性に関係するエストロゲン受容体(ER)・プロゲステロン受容体(PgR)の発現量による分類や、がん遺伝子でもある受容体型チロシンキナーゼであるHER2(HumanEGFR−Related2)の発現量による分類がそれである。
エストロゲン受容体(ER)・プロゲステロン受容体(PgR)の発現量の大きい癌には、抗エストロゲン薬(タモキシフェンなど)が有効であり、HER2の発現が高い癌には抗HER2モノクローナル抗体である、トラスツズマブなどが有効であり、患者に投与される。
従って、乳がんは、エストロゲン受容体(ER)・プロゲステロン受容体(PgR)の発現量の大きい場合やHER2の発現が高い場合には病理学的完全奏効(pCR)率が高い。すなわち、
1:(ER・PgR陽性、HER2陽性)=(抗エストロゲン薬感受性、抗HER2モノクローナル抗体感受性)(ルミナルB(HER2陽性)型)、
2:(ER・PgR陽性、HER2陰性)=(抗エストロゲン薬感受性、抗HER2モノクローナル抗体非感受性)(ルミナルA型又はルミナルB(HER2陰性)型)、又は
3:(ER・PgR陰性、HER2陽性)=(抗エストロゲン薬非感受性、抗HER2モノクローナル抗体感受性)(非ルミナル型)
の場合は、pCR率が高い。
HER2の場合、一般にIHC法で検査し、その結果が0あるいは1+の場合は陰性、3+の場合は陽性、2+の場合はFISH法(Fluorescence in situ hybridization)によって増幅の有無を調べ、増幅があれば陽性、なければ陰性と判定する。
ERの場合、AllredScoreでは3〜8が陽性とされる一方、染色細胞の比率で判定する場合は10%をカットオフ値とすることが多かったが、1%でも存在する場合は、ER陽性と判定すべきとの意見もある。いずれにせよ、一定のカットオフ値を設定すれば、これらの遺伝子(効果予測因子)が陽性と判断された場合、効果的な治療レジメンの指針となりうる。
トリプルネガティブ乳癌(TNBC)は全乳がん中11〜23%存在し、現在予後不良とされている。上記標的特異的な薬剤だけでなく、その他の一般的な抗がん剤の効き目も患者によって異なっており、さらなるサブタイプ化が必要であることが示唆されている(非特許文献7、8)。
現在TNBCは遺伝子プロファイルにより,アカデミックには少なくとも以下の6種類のサブタイプに分類できることが示されている:
二種類のbasal-like(BL1とBL2)サブタイプ(細胞周期関連遺伝子やDNA傷害応答性遺伝子が高発現);
Immunomodulatory(IM)サブタイプ(免疫反応に関連した遺伝子が高発現);
Mesenchymal(M)サブタイプ (TGF-βやWnt/β-cateninシグナルに関連した遺伝子が高発現);
Mesenchymal-stem like(MSL)サブタイプ(Mタイプ発現+幹細胞関連遺伝子高発現);
Luminal androgen receptor(LAR)サブタイプ(ARやluminal関連遺伝子の高発現)。
しかしながら、このような遺伝子発現プロファイルは、癌細胞の薬剤感受性と関連付けるのは難しく、現在基礎研究が行われる最中である(特許文献1、2、3;非特許文献1、2、9)。
その作業仮説に基づき、本願発明者らは様々な複数のカスケードで癌細胞の分類化ができないか模索した。しかしながら、既存の遺伝子発現量に基づく分類では、本願明細書比較例に示すように、有意な相関関係が得られなかった。
しかしながら、本願発明者らは自らの作業仮説を信じ、さらに鋭意研究を行い、以下に述べる手段により、みずからの作業仮説を立証した。
従って、本願発明の解決すべき課題は、上記作業仮説の立証であり、より具体的には、癌細胞の新規サブタイプ分類法及び、該サブタイプ分類法に基づくガン細胞の薬剤耐性の判定方法を提供することである。かかる方法は、たとえば癌患者から単離した癌組織細胞を用いて、当該癌細胞の薬剤感受性を判定し、その結果を当該癌患者の薬剤治療の際に用いることなどにも応用できる。
リン酸化は通常、真核生物の場合、タンパク質のセリン、トレオニン、そしてチロシンの残基に起こり、その標的により、キナーゼは主としてセリン/トレオニンキナーゼとチロシンキナーゼに分類される。
キナーゼ自身が、膜受容体であったり、他のキナーゼのターゲット分子であったりすることにより、細胞内において複雑なシグナルネットワークを形成する。
たとえば、チロシンキナーゼ(あるいは蛋白質チロシンキナーゼ、Protein Tyrosine Kinase; PTK、EC 2.7.10.)は、細胞の分化、増殖、接着、あるいは免疫反応などに関わるシグナル伝達に関与し、増殖因子が結合することによって活性化する受容体型と、増殖因子が結合しない非受容体型の2型に大別される。チロシンキナーゼが活性化されると、受容体自身、あるいは標的とするタンパクを特異的にリン酸化する。受容体自身の自己リン酸化により、このリン酸化部位を認識するさまざまなシグナル伝達因子が受容体に結合し、シグナル伝達が始まる。また標的タンパクのリン酸化により、細胞内のさまざまなタンパクが次々と活性化し、シグナル伝達が始まる。ヒトのチロシンキナーゼは100種類以上あると報告されており、がん、アテローマ性動脈硬化症や乾癬などでは、過剰に活性化していることが報告されている。
EC番号(酵素番号:Enzyme Commission numbers)は酵素を整理すべく反応形式に従ってECに続く4組の数字で表したものであり、国際生化学連合(現在のNC−IUBMB)の酵素委員会によって規定されたものである。たとえばPI3Kであれば、
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC2/7/1/137.html
にその定義が記載されている。
PI3Kは、構造によりClassI、II、IIIに分類される。
クラスI PI3Kはヘテロ二量体であり、アミノ酸配列の相同性からクラスIAとクラスIBにさらに分けられる。クラスIAは p110α、β およびδからなり、調節サブユニットであるp85α、p55α、p50α、p85βおよびp55γと結合している。p85α、p55α、p50αは同一遺伝子(Pik3r1)のスプライシングバリアントであり、p85βとp55γはそれぞれPik3r2およびPik3r3遺伝子に由来する。クラスIAはPKB(Protein Kinase-B)(セリン・スレオニンキナーゼのAkt(v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene))の活性化に関与している。一方、クラスIB PI3Kであるp110γは哺乳類においてのみ発現が見られ、Gタンパク質のβγサブユニットやp101によってその機能を調節される。クラスIBのPI3キナーゼは主にGタンパク質共役受容体(GPCR)からの刺激により活性化され、PtdIns(3,4)P2のリン酸化により産生されたPtdIns(3,4,5)P3は細胞内情報伝達機構においてセカンドメッセンジャーとして機能する。
クラスIIにはα、βおよびγの4つが存在するが、いずれも調節サブユニットを有さず単量体で酵素活性を示す。
クラスIII PI3KはPtdInsからPtdIns(3)Pを産生し機能的にはクラスIIに近いが、構造的にはクラスIにより類似しておりヘテロ二量体を形成して機能する。クラスIII PI3Kはタンパク質輸送などに関与している。
やLY294002、AS605240やZSTK474、PI3Kδ特異的阻害薬であるIC486068やIC87114などがこれにあたる。
ERK1/2の活性化にはMEK1及びMEK2が、JNKサブファミリーにはMEK4及びMEK7が、p38サブファミリーにはMEK3及びMEK6が、ERK5サブファミリーの活性化にはMEK5が各々関与している。
やSL327、U0126、PD184352、PD−98059などがこれにあたる。
一方、PI3Kは、PI3K−Akt経路(生存シグナル経路)のトリガーとなる遺伝子である。増殖因子による刺激は、同時にアポトーシス誘導を抑制する経路にも伝わり、細胞死を防ぐ。このアポトーシス抑制活性の経路はPI3Kのリン酸化活性から始まり、Aktのリン酸化を通して、細胞の生存やアポトーシス誘導を阻害する(PI3K−Akt経路)。
1)細胞からタンパク質の抽出を行い、試料液中に存在するターゲットキナーゼに特異的な抗体を加えて該キナーゼを捕捉した後、該キナーゼに特異的な基質を加え酵素反応をさせる。
2)その後酵素反応の生成物であるADPを測定し、活性に換算する。
PI3K阻害剤および/またはMEK阻害剤に感受性なヒト癌細胞を判定するための解析方法は、
1)得られたキナーゼの活性値の比(PI3K/MEK)
2)得られたキナーゼの活性値を公知の方法で測定される総タンパク量で補正した値
3)得られたキナーゼの活性値を公知の方法で測定されるLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)で補正した値のいずれかを用い、各阻害剤の各細胞株に対するIC50(50%阻害濃度)との対応関係を解析した。
複数の癌細胞株について、MEKおよびPI3K活性の測定および解析を行うことにより、高確率でPI3Kおよび/またはMEK阻害剤に感受性である細胞株を選び出すことが可能となった。
[1]癌細胞を分類する方法であって、
1)PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、
2)PI3K阻害剤感受性でありMEK阻害剤に非感受性である、
3)MEK阻害剤感受性でありPI3K阻害剤に非感受性である、または
4)PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である、
のいずれかに分類する方法;好ましくは
癌細胞を区別する方法であって、
1)PI3K阻害剤感受性でありMEK阻害剤に非感受性である癌細胞、及び/又は
MEK阻害剤感受性でありPI3K阻害剤に非感受性である癌細胞を
2)PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、及び/又は
PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である癌細胞と
区別する方法;
[2]前記方法が、癌細胞中のPI3KおよびMEKの酵素活性を用いて判定することを特徴とする[1]の方法;
[3]前記方法が、癌細胞中のPI3KおよびMEKの酵素活性の比により判定することを特徴とする[1]または[2]の方法;
[4]前記方法が、さらに総タンパク量を用いて補正することにより判定することを特徴とする[1]または[2]の方法;
[5]前記方法が、さらに乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の活性値を用いて補正することにより判定することを特徴とする[1]または[2]の方法;
[6]前記酵素活性が、PI3KまたはMEKに特異的に結合する抗体を用いて該酵素を捕捉することにより測定される[1]から[5]のいずれかの方法;
[7]前記酵素活性が、PI3Kおよび/またはMEKに特異的な基質を用いることにより測定される[1]から[6]のいずれかの方法;
[8]前記酵素活性が、ADPの生成量を測定することによって行われることを特徴とする[1]から[7]のいずれかの方法;
[9]PI3K阻害剤またはMEK阻害剤の効果予測を判定するために使用される、[1]から[8]のいずれかの方法;
[10]PI3K阻害剤がウォルトマンニンである[1]から[9]のいずれかの方法;
[11]MEK阻害剤がトラメチニブである[1]から[9]のいずれかの方法;
[12]癌細胞が単離された組織試料である、[1]から[11]のいずれかの方法;
[13]組織試料が生検組織試料である、[12]の方法;
[14]生検組織試料が、トリプルネガティブ乳癌患者由来である[13]の方法。
2A)抗MEK抗体を含むMEK測定用第二試薬
2B)抗PI3K抗体を含むPI3K測定用第二試薬
3A)MEKの基質ならびにATPを含むMEK測定用第三試薬
3B)PI3Kの基質ならびにATPを含むPI3K測定用第三試薬
4) D−Glucose;ADP−Hexokinase;Glucose−6−phosphate dehydrogenase;Diphorase並びにNADPを含む第四試薬
5) LuminolとPeroxidaseを含む第五試薬
ならびに
6)界面活性剤を含む洗浄用第六試薬
を含む、PI3K活性ならびにMEK活性測定用キット;
[17]1)対象組織細胞を第一試薬で溶解し;
2A)該溶解物の一部にMEK測定用第二試薬に添加して、対象組織細胞中のMEKを回収し;任意で洗浄用第六試薬で回収したMEKを洗浄後、MEK測定用第三試薬を添加反応後、第四試薬添加反応、第五試薬添加反応して、MEK活性を測定し;
2B)該溶解物の一部にPI3K測定用第二試薬に添加して、対象組織細胞中のMEKを回収し;任意で洗浄用第六試薬で回収したPI3Kを洗浄後、PI3K測定用第三試薬を添加反応後、第四試薬添加反応、第五試薬添加反応して、PI3K活性を測定するための、[16]のキット。
該癌細胞のPI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して大きい、上記医薬組成物。
[19]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して大きい癌細胞を含む癌治療における使用のための、PI3K阻害剤;
[20]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して大きい癌細胞の増殖抑制用医薬の製造における、PI3K阻害剤の使用;
[21]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して大きい癌細胞を含む癌治療の方法であって、癌患者にPI3K阻害剤を投与することを含む、方法;
ここで、参照標準はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、又はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく;
癌細胞は乳癌細胞、好ましくはトリプルネガティブ乳癌細胞であってよい。
該癌細胞のPI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して小さい、上記医薬組成物;
[23]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して小さい癌細胞を含む癌治療における使用のための、MEK阻害剤;
[24]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して小さい癌細胞の増殖抑制用医薬の製造における、MEK阻害剤の使用;
[25]PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して小さい癌細胞を含む癌治療の方法であって、癌患者にMEK阻害剤を投与することを含む、方法;
ここで、参照標準はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、又はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく、
癌細胞は乳癌細胞、好ましくはトリプルネガティブ乳癌細胞であってよい。
1)患者から癌細胞組織を採取し、
2)採取された癌細胞のMEK活性とPI3K活性を測定し、
3)PI3K活性/MEK活性比が、参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して
大きい場合は、PI3K阻害剤を該患者に投与し;
小さい場合は、MEK阻害剤を該患者に投与する
ことを含む方法であって;
ここで、参照標準はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、又はPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である細胞組織であってよく
癌は乳癌、好ましくはトリプルネガティブ乳癌である。
[28]抗がん剤が、PI3K阻害剤又は/及びMEK阻害剤である[27]の使用;
[29]癌がトリプルネガティブ乳癌である、[27]又は[28]の使用。
抗癌剤開発ではキナーゼ活性を直接阻害する薬剤が分子標的薬として様々に開発されている一方で、それらの有効性すなわち、キナーゼ活性の阻害程度を直接評価する診断技術は存在せず、公知のコンパニオン診断技術としては、がん関連遺伝子の発現量、発現パターン、変異パターン、シグナル伝達経路に含まれる分子のリン酸化パターン、リン酸化量等間接的な因子の測定方法に留まっている。それら測定される因子を用いた解析では、各種分子標的薬の効果を予測するのに十分な情報を必ずしも提供できるとは限らない。
かかる状況において本願発明は、新しい研究アプローチ及びそれに基づく新たな癌細胞の分類方法を提供し、キナーゼを阻害する薬剤開発及びそれに関するコンパニオン診断技術の開発の一助となることができる。
1)癌腫(Carcinoma):上皮組織由来の悪性腫瘍
2)肉腫(Sarcoma):非上皮組織由来の悪性腫瘍
3)その他:白血病など
に分類され、本願において「癌細胞」とは癌腫の細胞を意味する。特に限定しないが、頭頸部癌(上顎癌、(上、中、下)咽頭癌、喉頭癌、舌癌、甲状腺癌)、胸部癌(乳癌、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌))、消化器癌(食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌(結腸癌、直腸癌)、肝癌(肝細胞癌、胆管細胞癌)、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、肛門癌、泌尿器の癌(腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣(睾丸)癌)、生殖器癌(子宮癌(子宮頸癌、子宮体癌)、卵巣癌、外陰癌、膣癌)、皮膚癌(基底細胞癌、有棘細胞癌)などの癌細胞がこれにあたる。
「阻害剤非感受性」とは、特に限定しないが細胞が阻害剤により増殖阻害を起こさないことを言う。一例としては、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、HER2陰性癌と認定された癌が抗HER2モノクローナル抗体であるトラスツズマブで増殖阻害を起こさず、pCRを改善しない場合、「阻害剤非感受性」であると定義できる。また、実際の臨床の抗がん剤治療の現場で、非ルミナル型(ER・PgR陰性)癌と認定された癌が、抗エストロゲン薬であるタモキシフェンで増殖阻害を起こさず、pCRを改善しない場合、「阻害剤非感受性」であると定義できる。
あるいは、「阻害剤非感受性」とは実施例で用いた癌細胞株がトリプルネガティブ乳癌であると規定されるのと同様の条件下で、阻害剤添加条件下で細胞増殖阻害を起こさないことを「阻害剤非感受性」と定義してもよい。
さらには、細胞が、阻害剤濃度100nM、1μM、又は10μMにおいて、12.5%、25%又は50%以上の増殖阻害率を示すことを「阻害剤感受性」と定義してもよい。逆に、細胞が、阻害剤濃度100nM、1μM、又は10μMにおいて、12.5%、25%又は50%未満の増殖阻害率を示すことを「阻害剤非感受性」と定義してよい。
より好ましくは薬剤濃度100nMにおける12.5%以上の増殖阻害率、薬剤濃度1μMにおける25%以上の増殖阻害率、あるいは薬剤濃度10μMにおける50%以上の増殖阻害率を示すことを「阻害剤感受性」と定義してもよく;逆に薬剤濃度100nMにおける12.5%未満の増殖阻害率、薬剤濃度1μMにおける25%未満の増殖阻害率、あるいは薬剤濃度10μMにおける50%未満の増殖阻害率を示すことを「阻害剤非感受性」と定義してもよい。
「キット」中、各「測定試薬」は試薬成分が溶解している溶液の状態で存在してもよく、乾燥した固体の状態であってもよい。「測定試薬」が固体の状態の場合、「キット」には「測定試薬」を溶かすための「溶媒」を含んでいてもよい。
「抗MEK抗体」とは、天然の活性を有するMEKを特異的に認識結合する抗体を指す。MEK1〜7を認識する抗体であってよく、それら特異的抗体の組み合わせであってもよい。ERK1/2の活性に関与するMEK1及びMEK2を特異的に認識する抗体、あるいはMEK1を特異的に認識する抗体とMEK2を特異的に認識する抗体の組み合わせであってもよい。
「抗体」は完全長(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)イムノグロブリンであってもよく、その抗原結合認識領域を含む断片(いわゆる断片抗体(Fab、Fab’、F(ab’)2など)であってもよい。また「抗体」はヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ラクダなど哺乳動物由来、魚類(サメを含む)や鳥類(ニワトリ)由来のものであってよい。
PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である細胞;あるいは該細胞を含む組織を指す。
「参照標準のPI3K活性/MEK活性比」とは一検体由来の細胞組織から算出される「PI3K活性/MEK活性比」であっても、複数の患者あるいは健常者由来の組織細胞から算出される「PI3K活性/MEK活性比」であってもかまわない。あるいは1種又は複数種の培養細胞から算出される「PI3K活性/MEK活性比」であってもよい。乳がんの場合は、がんを発症していない反対の***より摘出した細胞組織から算出される「PI3K活性/MEK活性比」であってもよい。
培養細胞を用いた細胞増殖試験によるMEK阻害剤及び感受性PI3K阻害剤感受性株の分類
1.方法
培養細胞を種々の濃度のMEK阻害剤、及びPI3K阻害剤で処置し、細胞増殖阻害率を算出することでMEK及びPI3K感受性株の分類を行った。培養方法、分析方法を以下の通りである。
本研究に使用した13種類の細胞、HCC38(BL1)、MDA−MB−231(MSL)、DU4475(IM)、HCC1187(IM)、HCC1143(BL1)、HCC1395(LAR)、HCC1937(BL1)、MDA−MB−453(LAR)、HCC70(BL2)、HS578T(MSL)、MDA−MB−157(MSL)、MDA−MB−468(BL1)はATCC(American Type Culture Collection)、SUM185PE(LAR)はASTERAND BIOSCIENCEから入手した。いずれもトリプルネガティブ乳癌(TNBC)に属し、既存の分類法で6種類(BL1、BL2、M、MSL、IM、LAR)のいずれに属するかは公知である。
全ての細胞は、入手先指定の培地中で培養し、2mMのL−グルタミン、10%のウシ胎児血清(FBS)を補った。
各細胞を96ウェル・タイタープレートに1×104細胞/ウェルで播種し、MEK阻害剤であるトラメチニブ(MedichemExpress ; 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5,5,10,20μM)およびPI3K阻害剤であるウォルトマンニン(和光純薬 ; 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5,5,10,20μM)の種々の濃度でDemethyl Sulfoxide[DMSO](和光純薬)に溶解し処置した。また、 阻害剤72時間後に、細胞増殖に対する効果をスルホローダミンBアッセイ法(SIGMA−ALDRICH社製)によって検査し、50μL のスルホローダミンB溶液をそれぞれのウェルに添加して、細胞を室温において1時間染色した。代謝的に生存可能な細胞の染色の程度を565nmの波長でマイクロタイタープレートを使用して吸光度をモニターした。細胞増殖阻害率は、トラメチニブおよびウォルトマンニンで処置されていない細胞(DMSOによる処置)の吸光度を対象として100%と定義することで算出した。
図1Aに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株(以下PA)、トラメチニブ感受性株(以下MA)、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株(以下R)、その他(以下S)の4種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度1μMの阻害率を算出し、X軸をトラメチニブによる阻害率(%)、Y軸をウォルトマンニンによる阻害率(%)をグラフにプロットした。25%増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで4種類に分類した。
この方法によって、HCC38(BL1)、MDA−MB−231(MSL)、DU4475(IM)、HCC1187(IM)、HCC1143(BL1)、をMA、HCC1395(LAR)、HCC1937(BL1)、HS578T(MSL)、MDA−MB−157(MSL)をR、MDA−MB−453(LAR)、HCC70(BL2)をS、MDA−MB−468(BL1)、SUM185PE(LAR)をPAと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
図1Bに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株(以下PA)、トラメチニブ感受性株(以下MA)、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株(以下R)、その他(以下S)の4種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度100nMの阻害率を算出し、X軸をトラメチニブによる阻害率(%)、Y軸をウォルトマンニンによる阻害率(%)をグラフにプロットした。12.5%増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで4種類に分類した。
この方法によって、HCC38(BL1)、MDA−MB−231(MSL)、DU4475(IM)、HCC1187(IM)、HCC1143(BL1)、をMA、HCC1395(LAR)、HCC1937(BL1)、HS578T(MSL)、MDA−MB−157(MSL)をR、MDA−MB−453(LAR)、HCC70(BL2)をS、MDA−MB−468(BL1)、SUM185PE(LAR)をPAと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
図1Cに結果を示す。各種細胞株をウォルトマンニン感受性株(以下PA)、トラメチニブ感受性株(以下MA)、ウォルトマンニン及びトラメチニブ耐性株(以下R)、その他(以下S)の4種類に分類した。分類はまず各種薬剤濃度10μMの阻害率を算出し、X軸をトラメチニブによる阻害率(%)、Y軸をウォルトマンニンによる阻害率(%)をグラフにプロットした。50%増殖阻害率を薬剤阻害効果の指標とし、グリッド解析を行うことで4種類に分類した。
この方法によって、HCC38(BL1)、MDA−MB−231(MSL)、DU4475(IM)、HCC1187(IM)、HCC1143(BL1)、をMA、HCC1395(LAR)、HCC1937(BL1)、HS578T(MSL)、MDA−MB−157(MSL)をR、MDA−MB−453(LAR)、HCC70(BL2)をS、MDA−MB−468(BL1)、SUM185PE(LAR)をPAと分類できた。
この結果は既存の分類方法からは予想もつかない結果であった。
培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定
1.方法
培養細胞から細胞可溶物を抽出し、各種キナーゼに対する特異抗体を用いて目的キナーゼを補足した後高速液体クロマトグラフィー[HPLC]を用いて測定を行った。測定サンプルの調製方法、測定方法は以下に示す。
キナーゼ解析に供される株化細胞の可溶化液は、以下の通りに調製した。細胞を10%のFBS(ウシ胎児血清)を含む所定の培地中で培養した。細胞数1×107程度まで培養した後、細胞を収集して、PBSで一度洗浄した。次いで、細胞を24Gの針で20回注射することによって溶解緩衝液(0.1%のNP−40、50mMトリス−HCl [pH 7.4]、150mM NaCl)で溶解した。不溶性物質を除去するために5分間の15000rpmの遠心分離を行い細胞可溶物とした。
MEK活性測定は、HPLCを使用して行なった。具体的には、キナーゼ反応により生じる生成物であるADPの量を測定し、その濃度をキナーゼ活性に換算した。細胞可溶化物は、前項に記載したとおりに調製した。MEK分子は、4μgの対応する抗体(抗MEK1/MEK2 ; Santa Cruz Biotechnology)及び100μLのプロテインGビーズ(Life technologies)で細胞可溶化液200μLから4℃において2時間選択的に沈殿させた。洗浄緩衝液1(0.1% TX−100、50Mm トリス−HCl [pH 7.4]、150mM NaCl)で2回、その後洗浄緩衝液2(50mMトリス−HCl [pH 7.4]、150mM NaCl)で2回洗浄後、1μgのタンパク質基質(unactive−ERK ; Signalchem)、2mM アデノシン三リン酸(ATP)(Sigma)、70mMのトリス−HCl (pH 8.5)、7mMの塩化マグネシウムを含む100μLの基質混合物をビーズに添加して、37℃において2時間、連続振盪化でインキュベーションした。反応終了後、基質反応液をHPLCにアプライし、反応混合液中のADP量を測定し活性に換算した。なお、ADP量は既知濃度のADPを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、1ユニット(U)は、37℃下1分間に発生する1pmolのADPを酵素量と規定した。
測定条件を以下に示す。
AgilentTechnologies1220 Infinity LC、Tosoh TSKgel ODS−100V 5μm 4.6×150mm、溶離液A:Acetonitoril with 0.1% Trifluoro acetic acid(Fluka)、溶離液B:Water with 0.1% Trifluoro acetic acid(Fluka)、Flow rate 0.5mL/min、Wave length : 254nm
PI3K活性測定もMEKと同様に、HPLCを使用して行なった。細胞可溶化物は、MEK活性測定と同様に調製した。PI3K分子は、12μgの対応する抗体(抗PI3K 110α ; Santa Cruz Biotechnology)及び150μLのプロテインGビーズ(Life technologies)で細胞可溶化液200μLから4℃において2時間選択的に沈殿させた。洗浄緩衝液1(0.1% TX−100、50mM トリス−HCl [pH 7.4]、150mM NaCl)で2回、その後洗浄緩衝液2(50mMトリス−HCl [pH 7.4]、150mM NaCl)で2回洗浄後、50nMの基質(L−a−Phosphatidylinositol sodium salt ; Sigma)、2mM アデノシン三リン酸(ATP)(Sigma)、70mMのトリス−HCl (pH 7.5)、7mMの塩化マグネシウムを含む100μLの基質混合物をビーズに添加して、37℃において2時間、連続振盪化でインキュベーションした。反応終了後、反応混合液をHPLCにアプライし、反応液中のADP量を測定し活性に換算した。なお、ADP量は既知濃度のADPを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、1ユニット(U)は、37℃下1分間に発生する1pmolのADPを酵素量と規定した。測定方法は前述と同様である。
[表1]に示すように各種細胞株で異なるキナーゼ活性値を示した。
ウェスタンブロットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ発現量及びリン酸化量の測定
1.方法
前述の方法で得た細胞抽出液からウェスタンブロット法にて発現量を測定した。また、細胞数をノーマライズすべく分光光度計にて280nm吸光度の測定を行った。方法は以下に示す。
発現量及びリン酸化量解析に供される株化細胞の可溶化液も、活性測定と同様に調製した。ウェスタンブロット法のために、株化細胞の可溶化液をドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜へ転写した。膜をポリクローナル抗MEK1/2抗体(Cell signaling ; 1:1000)、ポリクローナル抗Phospho−MEK1/2抗体(Ser217/221)(Cell signaling ; 1:1000)、ポリクローナル抗PI3K p110α抗体(Cell signaling ; 1:1000)、ポリクローナル抗Phospho−PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)抗体(Cell signaling ; 1:1000)、ポリクローナル抗Phospho−ERK1/2抗体(Thr202/Tyr204)(Cell signaling ; 1:1000)、ポリクローナル抗Phospho−AKT抗体(Thr308)(Cell signaling ; 1:1000)と共に室温で1時間(または4℃で一晩)インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベーションした。結果は、化学発光検出系で増強して視覚化した。リコンビナントMEK及びPI3Kを用いて検量線を作成し、MEK、リン酸化MEK、及びPI3K、リン酸化PI3K量を算出した。
[表2]に示すように各種細胞株で異なるキナーゼ発現量及びリン酸化量を示した。
細胞可溶化液中のLDH活性及びA280の測定
1.方法
前述の方法で得た細胞抽出液を、試薬としてN−アッセイ LDH(ニットーボーメディカル)、また測定機器として日立7180形自動分析装置を用い、試料4μLと第一試薬160μLとを37℃、5分間混合した後、得られる液に、第二試薬40μLを加え同温度で5分間、発色反応させた。発色反応開始後の1分間当りの吸光度変化を主波長340nm、副波長405nmで測定した。濃度既知の標準液を用い吸光度変化量からLDH活性[U]を算出した。
また、同様の可溶化液をPharmacia Biotech Ultraspec3000分光光度計にて280nm吸光度を測定し、得られた吸光度をABS1.0=1.0mg/mLで換算した。
以上の2種の値を細胞数のノーマライズに用いた。
[表3]に示すように各種細胞株のLDH活性及び総タンパク量を得た。
MEK阻害剤感受性株及びPI3K阻害剤感受性株の判定パラメーターの構築
1.方法
これまで(実施例2〜4)に算出したプロテインキナーゼに関する8つの値、すなわちI:MEK活性、II:PI3K活性、III: MEK発現量、IV:MEKリン酸化量、V:PI3K発現量、VI:PI3Kリン酸化量、VII:LDH活性、VIII: 総タンパク量を用い、上記で分類した細胞株の薬剤感受性を予測するパラメーターの構築を行なった。
解析にあたっては、HCC38(BL1)を細胞株1、MDA−MB−231(MSL)を細胞株2、DU4475(IM)を細胞株3、HCC1187(IM)を細胞株4、HCC1143(BL1)を細胞株5、HCC1395(LAR)を細胞株6、HCC1937(BL1)を細胞株7、HS578T(MSL)を細胞株8、MDA−MB−157(MSL)を細胞株9、MDA−MB−453(LAR)を細胞株10、HCC70(BL2)を細胞株11、MDA−MB−468(BL1)を細胞株12、SUM185PE(LAR)を細胞株13と定義した。
鋭意検討した結果、「PI3K活性/MEK活性」というパラメーターを用いることにより、2種の阻害剤感受性株を高確率で予測することが可能になった。具体的には、「PI3K活性/MEK活性」が高値、すなわちPI3K活性がMEK活性と比較して非常に高い領域に、PI3K阻害剤感受性株(PA)が位置している。上記とは逆にPI3K活性/MEK活性」が低値、すなわちMEK活性がPI3K活性と比較して非常に高い領域に、MEK阻害剤感受性株(MA)が位置している(図2)。
これに対して、類似したパラメーターである、「PI3K発現量/MEK発現量」(比較例1:図3)、「リン酸化PI3K発現量/リン酸化MEK発現量」(比較例2:図4)や反応生成物である「リン酸化AKT発現量/リン酸化ERK発現量」(比較例3:図5)を用いた場合はこのような傾向は確認できず、予測をすることは出来なかった。本結果より、発現量やリン酸化量ではなく、活性を測定することの有効性が示された。
グリッド解析によるMEK阻害剤感受性株及びPI3K阻害剤感受性株の判定
1.方法
実施例5と同様に8つの値、すなわちI:MEK活性、II:PI3K活性、III: MEK発現量、IV:MEKリン酸化量、V:PI3K発現量、VI:PI3Kリン酸化量、VII:LDH活性、VIII:総タンパク量を用いて算出したパラメーターを2軸のグラフ上にプロットし、カットオフ条件を含めた検証を行なった。また、グラフ上にプロットするにあたっては、MAを■、PAを▲、その他の細胞株を◆でプロットを行なった。
グリッド解析の評価項目として、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、正確度の5項目を算出した。
感度は本検証においては、「感受性と判断されるべきものを正しく感受性と判定する確率」と定義される。1例を挙げると、解析に用いる全細胞株中にMEK阻害剤感受性株(MA)が2個含まれており、解析の結果、MEK阻害剤感受性と判定した領域にその感受性細胞株のうち1個がプロットされた場合、感度は、1/2=50%となる。
特異度は本検証においては、「非感受性と判断されるべきものを正しく非感受性と判定する確率」と定義される。1例を挙げると、解析に用いる全細胞株中にMEK阻害剤非感受性株が8個含まれており、解析の結果、MEK阻害剤非感受性と判定した領域に非感受性細胞株が4個プロットされた場合、特異度は、4/8=50%となる。
陽性的中率は本検証においては、「感受性と判断された場合に、真に感受性である確率」と定義される。1例を挙げると、解析の結果MEK阻害剤感受性と判定した領域に細胞株が2個プロットされ、その細胞株のうち1個がMEK阻害剤感受性である場合、陽性的中率は、1/2=50%となる。
陰性的中率は本検証においては、「非感受性と判断された場合に、真に非感受性である確率」と定義される。1例を挙げると、解析の結果MEK阻害剤非感受性と判定した領域に細胞株が6個プロットされ、その細胞株のうち5個がMEK阻害剤非感受性である場合、陽性的中率は、5/6=83%となる。
正確度は本検証においては、「真の感受性株と真の非感受性株が全体にしめる割合」と定義される。1例を挙げると、解析に用いる全細胞株数が10個であり、その内MEK阻害剤感受性株が2個、MEK阻害剤非感受性株が8個であるとする。解析の結果、MEK阻害剤感受性株の内1個を感受性(真陽性)、残り1個を非感受性(偽陰性)と判断し、MEK阻害剤非感受性株の内2個を感受性(偽陽性)、残り6個(真陰性)を非感受性と判断した。この場合、正確度は、(1+6)/(1+2+1+6)= 70%となる。
種々検討をした結果、数種のパラメーターの組み合わせにてグリッド解析を行った(表4〜9)。そのうち、細胞株の薬剤感受性を予測が可能となった(パラメーターは以下の6通りである図6、10、14,18、22、26)。
1)X:PI3K活性/LDH活性 Y:MEK活性/LDH活性(図6)2)X:PI3K活性/MEK活性 Y:PI3K活性/LDH活性(図10)
3)X:PI3K活性/MEK活性 Y:MEK活性/LDH活性(図14)
4)X:PI3K活性/総タンパク量 Y:MEK活性/総タンパク量(図18)
5)X:PI3K活性/MEK活性 Y:PI3K活性/総タンパク量(図22)
6)X:PI3K活性/MEK活性 Y:MEK活性/総タンパク量(図26)
対して活性値の代わりに発現量(図7、11、15,19,23、27)、リン酸化量(図8、12、16、20、24、28)もしくは基質のリン酸化量(図9、13、17、21、25、29)を用いた場合には感受性予測が不可能であった(比較例4〜21)。
化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定
1.方法
対照法(HPLC法:実施例2)との相関性を確認した。
試料
乳癌細胞株16種類を用いた。具体的には、HCC38、MDA−MB−231、DU4475、HCC1187、HCC1143、HCC1395、HCC1937、HS578T、MDA−MB−157、MDA−MB−453、HCC70、MDA−MB−468、SUM185PE、BT20、BT549、HCC1806の16種類である。
第一試薬
Tris−HCl pH7.5(SIGMA) 100mM
MgCl2(和光純薬) 10mM
EDTA・2Na(同仁化学) 5mM
NaF(和光純薬)(脱リン酸化酵素阻害剤) 50mM
Na3VO4(和光純薬)(脱リン酸化酵素阻害剤) 1mM
Protease inhibitor mixture
(ナカライテスク) 1%
NP−40(ナカライテスク) 0.1%
第二試薬
1)MEK測定用
Dynabeads ProteinG
(Life technologies) 15mg/mL
anti−MEK1 antibody(IgG)
(Santa Cruz Biotechnology) 20μg/mL
anti−MEK2 antibody(IgG)
(Santa Cruz Biotechnology) 20μg/mL
2)PI3K測定用
Dynabeads ProteinG
(Life technologies) 22.5mg/mL
anti−PI3K 110α antibody(IgG)
(Santa Cruz Biotechnology)60μg/mL
第三試薬
1)MEK測定用
Tris−HCl pH7.5(SIGMA) 100mM
NaCl(和光純薬) 300mM
unactive−ERK (Signalchem)100μg/mL
アデノシン三リン酸(ATP、SIGMA) 10mM
2)PI3K測定用
Tris−HCl pH7.5(SIGMA) 100mM
NaCl(和光純薬) 300mM
L−a−Phosphatidylinositol sodium
salt(Signalchem) 0.5mM
アデノシン三リン酸(ATP、SIGMA) 10mM
第四試薬
Tris−HCl pH8.5(SIGMA) 100mM
硫酸マグネシウム7水和物(和光純薬) 10mM
D−Glucose(和光純薬) 40mM
ADP−Hexokinase(旭化成) 20KU/L
Glucose−6−phosphate dehydrogenase
(ロシュ・ダイアグノスティクス) 20KU/L
Diphorase(旭化成) 5KU/L
NADP(ロシュ・ダイアグノスティクス) 3mM
第五試薬
Sodium Carbonate pH9.8(和光純薬)100mM
Luminol(和光純薬) 1mM
P−iodphenol(和光純薬)(増発光剤) 0.3mM
Peroxidase(東洋紡) 20KU/L
第六試薬
Tris−HCl pH7.5(SIGMA) 100mM
NaCl(和光純薬) 300mM
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
(ナカライテスク) 0.05%
キナーゼ解析に供される株化細胞の可溶化液は、以下の通りに調製した。細胞を10%のFBS(ウシ胎児血清)を含む細胞毎に適した培地で培養した。細胞数1×107程度まで培養した後、細胞を収集して、PBSで一度洗浄した。次いで、細胞に第一試薬を0.5mL添加し、ボルテックスミキサーで撹拌することによって溶解した。不溶性物質を除去するために5分間の15000rpmの遠心分離を行い細胞可溶物とした。
細胞可溶化物0.2mLに対してMEK測定用第二試薬を0.2mL添加し、4℃において2時間撹拌することにより、MEK分子を選択的に沈殿させた。反応終了後、上清を除去した後、第六試薬を0.5mL加えてMEK捕捉磁性粒子を懸濁することによる洗浄操作を3回行なった。洗浄後、MEK測定用第三試薬を0.5mL加え、37℃において2時間、振盪させながらキナーゼ反応を行なった。反応終了後、反応液を回収し、HPLC法及び化学発光法による活性測定を行なった。HPLC法による活性測定方法は実施例2と同様である。
MEK活性測定はキナーゼ反応により生じるADPを間接的に測定することにより行なった。具体的には、公知の酵素反応を組み合わせることにより行なった。(下図参照)
具体的な測定プロトコールとしては、上記キナーゼ反応で得た反応液をミリQで4倍希釈したものを、96ウェルプレートに20μLアプライし、そこに第四試薬を20μL添加し、37℃において10分間、振盪させながらインキュベーションし、ADPの量を依存した過酸化水素を発生させた。反応終了後、プレート測定に対応するルミノメーター(サーモフィッシャーサイエンティフィク社製)にプレートをセットし、各ウェルに第五試薬を30μL添加し、試薬添加により生じる化学発光強度を測定した。測定した化学発光強度に基づき、ADP濃度を介して、キナーゼ活性に換算した。
なお、ADP濃度は既知濃度のADPを用い前もって作成した検量線を用いて算出した。また、1ユニット(U)は、37℃下1分間に発生する1pmolのADPを酵素量と規定した。
MEKと同様に、細胞可溶化物0.2mLに対してPI3K測定用第二試薬を0.2mL添加し、4℃において2時間撹拌することにより、PI3K分子を選択的に沈殿させた。反応終了後、上清を除去した後、第六試薬を0.5mL加えてPI3K捕捉磁性粒子を懸濁することによる洗浄操作を3回行なった。洗浄後、PI3K測定用第三試薬を0.5mL加え、37℃において2時間、振盪させながらキナーゼ反応を行なった。反応終了後、反応液を回収し、HPLC法及び化学発光法による活性測定を行なった。HPLC法による活性測定方法は実施例2と同様である。
PI3K活性測定もMEK活性測定と同様に、キナーゼ反応により生じるADPを間接的に測定することにより行なった。具体的には、公知の酵素反応を組み合わせることにより行なった。(下図参照)
MEK活性測定におけるHPLC法との相関性を図30に示す。
HPLC法をX、本法をYとして相関性を確認した。図30に示したように、Y = 1.2168X − 0.2884、相関係数0.896と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト乳癌細胞中のMEK活性を正確に測定できているといえる。
同様に、PI3K活性測定におけるHPLC法との相関性を図31に示す。
HPLC法をX、本法をYとして相関性を確認した。図31に示したように、Y = 0.9027X − 0.0337、相関係数0.943と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト乳癌細胞中のPI3K活性を正確に測定できているといえる。
<実施例8>
培養細胞から作製した担癌マウスより摘出した腫瘍中のキナーゼ活性測定
1.方法
培養したトリプルネガティブ乳癌細胞株をヌードマウスの皮下に注入することで、担癌マウスを作製し、腫瘍組織として生着した後、所定の大きさで摘出した。摘出した腫瘍から目的キナーゼを含む可溶物を抽出し、各種キナーゼに対する特異抗体を用いて目的キナーゼを補足した後化学発光法を用いて測定を行った。測定サンプルの調製方法、測定方法は以下に示す。なお、測定方法及び試薬名称等に関しては、実施例7「化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定」と同様である。
MAと分類されたMDA−MB−231、Sと分類されたHCC70及びPAと分類されたSUM185PE細胞株を前述の方法によって培養し、トリプシンで剥離後約7×106細胞/mLになるようにMatrigel基底膜マトリックス(コーニング社製)にて懸濁し細胞懸濁液を調製した。27ゲージのシリンジを用い、0.1mLの細胞懸濁液を5週齢メスのヌードマウス(日本クレア社製)の皮下に注入することで担癌マウスを作製し、腫瘍体積を観測した。腫瘍体積は長径×(短径)2/2で算出した。
腫瘍体積が300mm3に達した段階で腫瘍を摘出した。解析にあたっては、MDA−MB−231を用いて作製した腫瘍を腫瘍1、HCC70を用いて作製した腫瘍を腫瘍2、SUM185PEを用いて作製した腫瘍を腫瘍3と定義した。
キナーゼ解析に供される腫瘍の可溶化液は、以下の通りに調製した。摘出した腫瘍の重量を測定し、腫瘍1gあたり16mLの第一試薬を添加し、氷冷下において乳棒及び乳鉢を用いてすり潰すことにより、腫瘍組織を破砕した。不溶性物質を除去するために5分間の15000rpmの遠心分離を行い腫瘍可溶物とした。
化学発光法を用いたMEK活性測定
腫瘍可溶物中のPI3Kの捕捉とキナーゼ反応
化学発光法を用いたPI3K活性測定
実施例7「化学発光法を測定原理とするキナーゼ活性測定キットによる培養細胞抽出液中のキナーゼ活性測定」と同様である。
図32に、3種類の細胞株由来の腫瘍活性測定結果を示す(個体数N=3)。MEK阻害剤感受性株(MA)、PI3K阻害剤感受性株(PA)由来の腫瘍からサンプルを調製し「PI3K活性/MEK活性」を算出した。この場合、例えばMA,PAいずれにも該当しないHCC70細胞由来の腫瘍サンプルを参照標準とすれば、「PI3K活性/MEK活性」が参照標準より低い腫瘍についてはMEK阻害剤感受性であり、PI3K活性/MEK活性」が参照標準より高い腫瘍についてはPI3K阻害剤感受性であるという示唆を得ることが可能となる。表10に参照標準に対するMEK阻害剤感受性株(MA)またはPI3K阻害剤感受性株(PA)の「PI3K活性/MEK活性」のp値を示す。
培養細胞から作製された担癌マウスを用いた薬剤投与による腫瘍成長抑制試験
1.方法
培養したトリプルネガティブ乳癌細胞株をヌードマウスの皮下に注入することで、担癌マウスを作製し、腫瘍組織として生着した後、PI3K阻害剤、及びMEK阻害剤を投与し、腫瘍体積を測定することで抗腫瘍効果を観測した。担癌マウス作製方法、投与方法は以下の通りである。
MDA−MB−231、HCC70及びSUM185PE細胞株を前述の方法によって培養し、トリプシンで剥離後約7×106細胞/mLになるようにMatrigel基底膜マトリックス(コーニング社製)にて懸濁し細胞懸濁液を調製した。27ゲージのシリンジを用い、0.1mLの細胞懸濁液を5週齢メスのヌードマウス(日本クレア社製)の皮下に注入することで担癌マウスを作製した。
MEK阻害剤であるトラメチニブとPI3K阻害剤であるウォルトマンニンを1%ジメチルスルホキシド(DMSO)、を含むPBSにて各0.3mg/kgとなるように溶解し、投与薬剤溶解液とした。また、コントロールとしては1%DMSO含有PBSを使用した。
腫瘍体積が300mm3に達した個体を無作為に3群に分け投与を開始した。投与方法は投与薬剤溶解液を14日間毎日1回経口投与し、腫瘍体積を観測した。腫瘍体積は長径×(短径)2/2で算出した。
図33〜35に各種阻害剤による各群(コントロール群、トラメチニブ投与群、ウォルトマンニン投与群)個体数N=6の腫瘍成長抑制試験の結果を示す(図33:MDA−MB−231担癌マウス、図34:HCC70担癌マウス、図35:SUM185PE担癌マウス)。また、表11に14日間薬剤投与の翌日15日目の各群の腫瘍体積に関して、コントロール群間での有意差検定を行い算出されたp値の結果を示す。検定方法はマン・ホイットニーのU検定を用いた。
実施例7において「PI3K活性/MEK活性」が高値を示した、PI3K阻害剤感受性株(PA)であるSUM185PE由来の腫瘍の増殖は、PI3K阻害剤であるウォルトマンニン投与で有意に抑制される一方、MEK阻害剤であるトラメチニブ投与では有意な増殖抑制効果が得られなかった。
実施例7において「PI3K活性/MEK活性」が中間値を示した、両感受性株(S)であるHCC70由来の腫瘍の増殖は、PI3K阻害剤であるウォルトマンニン投与及びMEK阻害剤であるトラメチニブ投与にて薬剤間の効果は異なるものの、いずれの薬剤においても有意に増殖抑制効果が観測された。
とりわけ、トリプルネガティブ乳癌(TNBC)と診断された患者に対して新たな治療法を提供することも可能である。従来、TNBCと診断された患者は、腫瘍組織提出手術後、放射線療法もしくは抗がん剤を用いた化学療法を治療レジメンとして選択する。本願発明に係る方法はその際にどの抗がん剤を用いるべきかの指針(効果予測因子)の1つを提供できる。
Claims (21)
- 癌細胞を区別する方法であって、
1)PI3K阻害剤感受性でありMEK阻害剤に非感受性である癌細胞、及び/又は
MEK阻害剤感受性でありPI3K阻害剤に非感受性である癌細胞を
2)PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に非感受性である、及び/又は
PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である癌細胞と
区別する方法であって;
癌細胞中のPI3KおよびMEKの酵素活性の比により区別することを特徴とする方法。 - 前記方法が、さらに総タンパク量を用いて補正することにより判定することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、さらに乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の活性値を用いて補正することにより判定することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記酵素活性が、PI3KまたはMEKに特異的に結合する抗体を用いて該酵素を捕捉することにより測定される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素活性が、PI3Kおよび/またはMEKに特異的な基質を用いることにより測定される請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素活性が、ADPの生成量を測定することによって行われることを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- PI3K阻害剤またはMEK阻害剤の効果予測を判定するために使用される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- PI3K阻害剤がウォルトマンニンである請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- MEK阻害剤がトラメチニブである請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 癌細胞が組織試料である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 組織試料が生検組織試料である、請求項10に記載の方法。
- 生検組織試料が、トリプルネガティブ乳癌患者由来である請求項11に記載の方法。
- 抗PI3K抗体と抗MEK抗体を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであって、
該方法は癌細胞中のPI3KおよびMEKの酵素活性の比を参照標準と比較することを含む方法であり、以下を含むキット:
2A)前記抗MEK抗体を含むMEK測定用試薬
2B)前記抗PI3K抗体を含むPI3K測定用試薬
3A)MEKの基質ならびにATPを含むMEK測定用試薬
3B)PI3Kの基質ならびにATPを含むPI3K測定用試薬。 - 1)界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤を含む細胞溶解用の第一試薬
2A)抗MEK抗体を含むMEK測定用第二試薬
2B)抗PI3K抗体を含むPI3K測定用第二試薬
3A)MEKの基質ならびにATPを含むMEK測定用第三試薬
3B)PI3Kの基質ならびにATPを含むPI3K測定用第三試薬
4) D−Glucose;ADP−Hexokinase;Glucose−6−phosphate dehydrogenase;Diphorase並びにNADPを含む第四試薬
5) LuminolとPeroxidaseを含む第五試薬
ならびに
6)界面活性剤を含む洗浄用第六試薬
を含む、PI3K活性ならびにMEK活性測定用キット。 - PI3K活性/MEK活性比の、抗がん剤の癌に対する効果予測因子としての使用。
- 抗がん剤が、PI3K阻害剤又は/及びMEK阻害剤である請求項15の使用。
- 癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項15又は16に記載の使用。
- 活性成分としてPI3K阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって;
該癌細胞は、PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して大きいPI3K阻害剤に感受性であることが、請求項1に記載の方法により、区別された癌細胞である、上記医薬組成物。 - 活性成分としてMEK阻害剤を含む、癌細胞増殖抑制用医薬組成物であって;
該癌細胞は、PI3K活性/MEK活性比が参照標準のPI3K活性/MEK活性比と比較して小さいMEK阻害剤に感受性であることが、請求項1に記載の方法により、区別された癌細胞である、上記医薬組成物。 - 参照標準がPI3K阻害剤およびMEK阻害剤の両方に感受性である細胞である、請求項18又は19に記載の医薬組成物。
- 前記癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項18から20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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