JPWO2011108454A1 - 細胞の検出方法及び細胞検出システム - Google Patents
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Abstract
検出感度を低下させずに、効率よく稀少細胞を検出することを目的とする。そのための検出方法は、血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、前記第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第２工程と、前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、を備える。
Description
本願は、血液中における細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Circulating tumor cell）を検出する細胞の検出方法及び細胞検出システムに関する。
癌患者の血液中においては腫瘍細胞が存在する。循環する血液中の腫瘍細胞の有無を検出することにより、癌に罹っているか否かあるいは、癌患者に対する治療の効果を判断することができる。
腫瘍細胞の濃度は非常に低く、１０７〜１０８個の細胞中にわずか数個の低濃度で存在する。例えば血液１０ｍｌのサンプルに対して含まれる腫瘍細胞は数個程度である。
特許文献１に開示されている方法では循環腫瘍細胞等の稀な細胞（rare cell）と特異的に反応する生物学的に特異的なリガンドにカップリングされた磁性粒子を用いることにより、稀な細胞を血液中から分離し、分離した稀な細胞を標識させ、標識した稀な細胞を観察することにより、稀な細胞の存在及び個数を検出している。
特許文献２に開示されている装置では、蛍光物質で処理された血液を透明なスライドに塗りつけ、該スライドを放射線ビームでスキャンすることによって得られた光信号を処理することにより、微少物体の検出を行っている。
特許文献１では、磁気粒子を用いて稀な細胞を血液から分離しているので、その工程において本来的には対象となる稀な細胞を全て分離できるとは限らず、細胞の性質によっては取りこぼしが発生する可能性がある。
また特許文献２では、蛍光物質により標識をつけた細胞を透明なスライドに塗りつたスミア標本を観察している。
特許文献１、２では観察の対象とする細胞を抽出あるいは限定して稀少細胞の検出を行っている過程で、取りこぼしが発生し、その結果、検出感度が低下するおそれがある。
取りこぼしが生じないようにするには、対象となる希少細胞及び白血球の細胞をすべて観察すればよい。全ての細部を観察する場合、観察領域に対象となる細胞同士が重ならないように展開しなくてはならないが、単純にまばらに広げただけでは、観察領域を広くしなくてはならず、検出機器のサイズが大きくなり現実的ではない。
本願発明はこのような問題に鑑み、検出感度を低下させずに、効率よく稀少細胞を検出することが可能となる細胞の検出方法及び細胞検出システ提供することを目的とする。
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
１．血液中の稀少細胞を検出する細胞の検出方法であって、
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
前記第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
前記第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
２．前記観察領域に設けられた前記複数の穴は所定のピッチで配置されたウェルにより形成されており、
前記第２工程は、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記１に記載の細胞の検出方法。
前記第２工程は、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記１に記載の細胞の検出方法。
３．前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の２倍未満であることを特徴とする前記２に記載の細胞の検出方法。
４．前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の２倍以上の大きさであることを特徴とする前記２に記載の細胞の検出方法。
５．前記観察領域に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、
前記第２工程は、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記１に記載の細胞の検出方法。
前記第２工程は、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記１に記載の細胞の検出方法。
６．血液中の稀少細胞を検出する細胞の検出方法であって、
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、該細胞の最大径の２倍未満の厚みの薄層に伸ばすことにより観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、該細胞の最大径の２倍未満の厚みの薄層に伸ばすことにより観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
７．前記第２工程は、スピンコート方式により前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記観察領域に展開することを特徴とする前記６に記載の細胞の検出方法。
８．前記第２工程は、バーコート方式により前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記観察領域に展開することを特徴とする前記６に記載の細胞の検出方法。
９．複数の穴が設けられ、血液から赤血球を除く前処理をすることにより得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開する観察部と、
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定ピッチで配置されたウェルにより形成されており、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定ピッチで配置されたウェルにより形成されており、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
１０．前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の２倍未満であることを特徴とする前記９に記載の細胞検出システム。
１１．前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の２倍以上の大きさであることを特徴とする前記９に記載の細胞検出システム。
１２．複数の穴が設けられ、血液から赤血球を除く前処理をすることにより得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開する観察部と、
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
本願発明によれば、血液から赤血球を除く前処理を行って得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を複数の穴が設けられた観察領域に展開する工程、或いは該細胞の最大径の２倍未満の厚みの薄層に伸ばすことにより該細胞を観察領域に展開する工程を備えることにより、全部の細胞同士を重なりを抑制して狭い面積に展開できるので、検出感度を低下させずに稀少細胞を検出することが可能となる。
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
図１は、本実施の形態に係る細胞検出システムの概略の構成を示す図である。
同図に示す細胞検出システムは、不図示のモータにより回転移動させられるエンドレスベルト４０上に観察部３０が配置されている。観察部３０の上方には、所定の波長の照射光（レーザ光）Ｌを発する光源１１と、照射光Ｌを反射偏向させる回転多面鏡１２と、この回転多面鏡１２を回転させるモータ１３と走査光学系１４が配置されている。走査光学系１４は、回転多面鏡１２で反射偏向された照射光Ｌを観察部３０上に収束させ、かつ等速度で走査させるものである。
照射光Ｌが走査される観察部３０の直上には、照射光Ｌを照射させることにより観察部３０の上面から発せられる反射光Ｍを上方より集光する光ガイド２１が近接配置されている。光ガイド２１には、受光部２２が接続されている。また、受光部２２と光ガイド２１の間には、反射光Ｍ以外の不要な光が受光部２２に入射しないよう照射光の波長以外の光をカットする光学フィルタ２３が配置されている。
受光部２２には撮影部２４が接続されている。撮影部２４では受光部２２から出力されるデジタル信号を処理してデジタル画像データに変換し、後段の解析部２５に出力する。
以下、同図に示す細胞検出システムの動作概略について簡単に説明する。
観察部３０は、ガラス等の材料で形成された表面が平滑な板状のものであり、その表面には後述する前処理を行った血液中の細胞が展開されている。観察部３０はエンドレスベルト４０上の所定の位置にセットされ、エンドレスベルト４０が可動することにより、矢印Ｙ方向に搬送（副走査）される。
一方、光源１１から発せられた照射光（レーザ光）Ｌは、モータ１３により高速回転する回転多面鏡１２によって反射偏向される。この反射偏向された照射光Ｌは走査光学系１４により観察部３０の表面上で収束され、かつ等速度で観察部３０の表面を矢印Ｘ方向に主走査する。照射光Ｌの主走査と観察部３０の矢印Ｙ方向への副走査とにより、観察部３０は全面に亘って照射光Ｌが照射される。観察部３０の表面全面が観察領域となる。
観察部３０の、照射光Ｌが照射された部分から順次発せられる反射光Ｍは観察部３０の上面に近接して配された光ガイド２１によって受光部２２に導かれる。
受光部２２は入射した反射光Ｍを検出し、検出した反射光Ｍの光量に対応した画像信号に変換し、撮影部２４に出力する。撮影部２４は、照射光Ｌの走査に同期して所定のサンプリング間隔でサンプリングされ、量子化により画素ごとのデジタル画像データに変換される。撮影した画像は、解析部２５に送られる。解析部２５では後述するように、細胞の抽出及び、抽出した細胞の中から、白血球細胞及び腫瘍細胞その他の稀少細胞（rare cell）の選別を行う。
［検出方法］
図２は、本実施形態にかかる稀少細胞の検出方法を説明するフロー図である。
図２は、本実施形態にかかる稀少細胞の検出方法を説明するフロー図である。
ステップＳ１の前処理工程（第１工程）では、被験者から採取した血液に前処理を行う。前処理としては血液に対して、少なくとも赤血球と血小板等を除く処理を行う。これに加えて安定化剤を入れたり、所定の濃度に希釈したりしても良い。例えば採取した血液を安定化剤と混ぜ合わせて、その後に１５００ｒｐｍで５分間遠心後に、上澄みを取り除いて、残った白血球層（バフィーコート）を用いる。血液を白血球と赤血球との中間の比重の液体に加えてから遠心分離後に白血球層を含む上澄みを用いる様にしても良い。これにより用いる上澄みから白血球（及び稀少細胞）が取りこぼれる虞は低くなる。以下、前処理した血液を細胞懸濁液と称する。なお当該細胞懸濁液には少なくとも白血球細胞（場合によっては白血球細胞及び稀少細胞）が含まれている。
ステップＳ２の展開工程（第２工程）では、ステップＳ１で生成した細胞懸濁液を複数の穴が設けられた観察部３０に展開する。当該展開工程により観察部３０には全ての細胞が概ね単層で、かつ狭い面積で効率よく配置されることになる。展開方法についての詳細は後述する。
ステップＳ３の撮影工程（第３工程）では、撮影部２４により観察部３０に展開した細胞（主に白血球細胞）の撮影を行い、画像データを得る。
ステップＳ４の検出工程（第４工程）では、ステップＳ３で得られた画像データに対して解析部２５により画像処理を行うことにより、腫瘍細胞その他の稀少細胞の有無あるいはその個数の検出を行う。検出方法の例としては、得られた画像データに対してコントラスト調整、２値化処理、エッジ抽出、を行うことにより複数（１０７〜１０８個）の細胞の検出及びその形態情報を得る。形状から特徴の抽出を行い、正常な白血球細胞の形態とは異なる場合には稀少細胞と判断する。このときにステップＳ２の展開工程では、複数の細胞を重ならないように単層で、かつ狭い面積に効率よく観察部３０に配置させている。続くステップＳ４での検出工程では、全ての細胞に対して正常な白血球細胞であるか、それ以外の稀少細胞であるかを判断することができる。全ての細胞を、撮影を行う高さ方向では細胞同士の重なりが少なく、平面方向では高密度の最密充填に近い状態で充填することにより狭い面積に効率よく配置させているので、大面積の観察部３０を必要とせず、結果として検出装置を大型化せずにすむ。
［他の検出方法］
更に以下に説明する細胞の固定と染色を行うことにより、より正確に細胞を観察することができる。細胞の固定方法としては、例えばホルマリン法、メタノール法などが行われる。細胞の染色方法としては、例えば核内のＤＮＡを染色するＤＡＰＩ染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色が行われる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原CD45、腫瘍マーカーCK（サイトケラチン）が行われる。
更に以下に説明する細胞の固定と染色を行うことにより、より正確に細胞を観察することができる。細胞の固定方法としては、例えばホルマリン法、メタノール法などが行われる。細胞の染色方法としては、例えば核内のＤＮＡを染色するＤＡＰＩ染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色が行われる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原CD45、腫瘍マーカーCK（サイトケラチン）が行われる。
これらの固定、染色作業を行う場合はステップＳ１とステップＳ２の間でステップＳ１の２として、ステップＳ１で得られた沈殿物に対して行う。または、ステップＳ２とステップＳ３の間でステップＳ２の２として、ステップＳ２で展開した細胞に対して観察部３０において行う。
［展開方法］
細胞懸濁液の観察部３０への展開方法としては大別すると２つある。（１）極少量の細胞懸濁液を所定のピッチで展開する方法と、（２）所定量の細胞懸濁液を平面方向に広げて薄層に伸ばす方法である。
細胞懸濁液の観察部３０への展開方法としては大別すると２つある。（１）極少量の細胞懸濁液を所定のピッチで展開する方法と、（２）所定量の細胞懸濁液を平面方向に広げて薄層に伸ばす方法である。
（１）所定のピッチで展開する方法としては、ＭＷＣ方式、貫通穴フィルタ方式、がある。ＭＷＣ方式、貫通穴フィルタ方式についての詳細は後述する。ここでピッチとはそれぞれの隣接する対象物の中心間の（平均）距離のことであり、例えば後述のウェル、フィルタ孔の中心間の距離である。
いずれの方法においても、白血球細胞のサイズ（直径５〜３０μｍ）よりも同等以上のピッチ、例えば０〜５０μｍのピッチで細胞懸濁液の塗布（配置）を行う。また採取した血液が１０ｍｌであれば展開する細胞数は１０７〜１０８となるので観察部３０の面積としては１０ｃｍ四方（３２μｍピッチで１０７個の場合）〜Ａ４判サイズ（５０μｍピッチで５×１０７個の場合）となる。
（２）薄層に伸ばす方法としては、大別するとスピンコート方式及びバーコート方式の二つがある。更にバーコート方式としてはギャップコート方式とワイヤーバー方式に分けられる。
「スピンコート方式」は、スピナー（Spinner）と呼ばれる装置により真空吸引等により観察部３０を固定し、その上面に細胞懸濁液を滴下した後、高速で一定時間回転させることで観察部３０に一定の薄層を得るものである。スピナーの回転数は、細胞懸濁液の濃度（粘度）にもよるが、１００〜５０００ｒｐｍで均一に伸ばすことができる。
「バーコート方式」では、観察部３０上に滴下された細胞懸濁液を、観察部３０の上面に対して一定のギャップ（塗布ギャップ）をあけたバー状のものをスライドさせる（ギャップコート方式）。または、丸棒にある太さのワイヤーを巻き付けたワイヤーバーを観察部３０の上面に接触させた状態でスライドさせる（ワイヤーバー方式）。このようにすることにより、観察部３０に一定の膜厚の薄膜を得るものである。ギャップコート方式における塗布ギャップとしては細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の数倍未満が好ましい。本実施形態では対象となる細胞は白血球及び稀少細胞（特に腫瘍細胞）であり、その細胞の最大径としては２０〜１００μｍ程度である。塗布ギャップとしてはその数倍の５０〜３００μｍとしている。ワイヤーバーに巻き付けるワイヤーの径としては１００〜数百μｍが好ましい。
いずれの方法においても、諸条件を適正化することにより、観察部３０上において細胞同士が重ならないように、対象となる白血球細胞（直径１０〜３０μｍ）の最大径（概ね３０μｍ）の２倍未満の厚みとした薄膜を得ることができる。
［ＭＷＣ（マイクロウェルチャンバー：micro well chamber）方式］
（第１の例）
図３は、展開方法の一つとしてＭＷＣ方式を用いた観察部３０の第１の例である。図３（ａ）は観察部３０の上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）の３ａ枠の拡大図、図３（ｃ）は図３（ｂ）の３ｂ枠の拡大図であり、図３（ｄ）は、図３（ｃ）の断面図である。これらの図に示すように、ＭＷＣ方式の観察部３０においては多数のウェルｗｅが均等のピッチで平面状に配置されている。
（第１の例）
図３は、展開方法の一つとしてＭＷＣ方式を用いた観察部３０の第１の例である。図３（ａ）は観察部３０の上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）の３ａ枠の拡大図、図３（ｃ）は図３（ｂ）の３ｂ枠の拡大図であり、図３（ｄ）は、図３（ｃ）の断面図である。これらの図に示すように、ＭＷＣ方式の観察部３０においては多数のウェルｗｅが均等のピッチで平面状に配置されている。
図３に示す例においては各々のウェルｗｅは半球状の形状である。ウェルｗｅの上部穴径（上面視の直径）は、展開する細胞の直径よりも大径にしている。その大きさは白血球細胞ｗｂｃ（及び稀少細胞）を１個ずつ入れることができる程度であり好ましくは、白血球細胞その他の細胞の最大径の２倍未満である。例えば深さ（中心部の高さ）は５〜３０μｍ、直径（上部穴径）は１０〜３５μｍとしている。隣接するウェルｗｅの間隔は０〜２０μｍとして、その配置のピッチはウェルｗｅの直径よりも大きく１０〜５０μｍ程度で０．０１ｍ２の面積に渡って配置されている。
細胞懸濁液を観察部３０の上面全面に広げ、自然沈降あるいは微少振動させることにより、細胞懸濁液に含まれる全部の細胞をそれぞれのウェルｗｅに入れることができるＭＷＣ方式の観察部３０を用いることにより、全部の細胞を細胞同士が重ならないように展開させることが可能となる。
（第２の例）
図４は、展開方法の一つとしてＭＷＣ方式を用いた観察部３０の第２の例である。図４（ａ）は観察部３０の上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）の４ａ枠の拡大図、図４（ｃ）は図４（ｂ）の４ｂ枠の拡大図であり、図４（ｄ）は、図４（ｃ）の断面図である。それぞれ図３（ａ）〜図３（ｄ）に対応している。
図４は、展開方法の一つとしてＭＷＣ方式を用いた観察部３０の第２の例である。図４（ａ）は観察部３０の上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）の４ａ枠の拡大図、図４（ｃ）は図４（ｂ）の４ｂ枠の拡大図であり、図４（ｄ）は、図４（ｃ）の断面図である。それぞれ図３（ａ）〜図３（ｄ）に対応している。
図３に示す例と事なり図４に示す例では、それぞれのウェルｗｅは、数十から数百個程度の複数個の細胞を入れることが可能な大きさである。各ウェルｗｅの大きさの例としては、直径（上部穴径）で数百μｍである。観察領域に展開される細胞に対してその最大径の２倍以上の大きさとしている。高さ（深さ）としては最も深い中心部において細胞の最大径の数倍以下が好ましく、より好ましくは２倍未満である。このように直径に比べて高さが低い扁平形状が、細胞同士を重ならずに展開するためには好ましい。
図４の図３（ｃ）、図３（ｄ）に示すように、ひとつのウェルｗｅには、十数個の細胞を入れている。ひとつのウェルｗｅに複数個の細胞を入れることにより、デッドスペースが減少するので、図３の第１の例に比べてより高密度で、より狭い面積に展開できるので観察領域を狭くすることができる。
なお、図４の各ウェルｗｅへの細胞懸濁液の展開として、インクジェット方式やディスペンサー方式により、各ウェルｗｅの略中心に細胞懸濁液を供給するようにすることが好ましい。これにより、細胞懸濁液を供給した時点で細部を分散して展開することになるので、細胞同士の重なりを早期に防ぐことができる。インクジェット方式としては、サーマルヘッドあるいは圧電ヘッドを用いる方式がある。ディスペンサー方式としてはマイクロピペットやマイクロディスペンサーを用いる方式がある。いずれも液滴の突出口を一定の速度で被塗布物の表面を走査させることにより、所定のピッチで微量の液滴を塗布させるものである。各ウェルｗｅに供給する液滴の液量としては数百ｎｌ以下が好ましい。
なお図３、図５に示す実施形態においてはウェルｗｅ形状としては上面視で円状のものを示しているが、これに限られず、上面視形状（断面形状）がハニカム形状の角柱とし、これを平面方向に隙間無く配置させたものであってもよい。例えばＮｕｎｃライブセルアレイ（ナルジュ ヌンク インターナショナル（株）製）である。この場合の直径（平面方向）は、ハニカムに外接する外接円の直径となり、当該直径が細胞の直径よりも大径であればよい。
［貫通穴フィルタ方式］
図５は、展開方法の一つとして貫通穴フィルタ方式を用いた観察部３０の例である。図５（ａ）は観察部３０の一部拡大図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のＡ−Ａ断面図。図５（ｃ）は、白血球細胞ｗｂｃがフィルタの穴ｈにせき止められている状態を示す図である。
図５は、展開方法の一つとして貫通穴フィルタ方式を用いた観察部３０の例である。図５（ａ）は観察部３０の一部拡大図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のＡ−Ａ断面図。図５（ｃ）は、白血球細胞ｗｂｃがフィルタの穴ｈにせき止められている状態を示す図である。
図５の示す、貫通穴フィルタ方式を用いた観察部３０では、多数の穴ｈが、図３と同様に所定の孔密度で０．０１ｍ２の面積に渡って配置されている。孔密度としては例えば、１×１０７／ｃｍ２〜６×１０８／ｃｍ２である。それぞれの穴ｈは貫通穴であり、穴ｈの直径は、白血球細胞ｗｂｃ及び稀少細胞の直径よりも小さく、例えば０．５μｍである。なお図５に示す実施形態においてはフィルタの貫通穴を平面方向で均等配置としているが特にこれに限定されず、ランダムな配置であってもよい。例えばニュークリポア（Nuclepore）メンブレン（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）販売元）である。
観察部３０の外縁は突起壁部ｅにより囲まれている。細胞懸濁液の中の細胞を展開するには、細胞懸濁液を観察部３０の上面に流し込めばよい。細胞懸濁液に含まれる液体及び微少な血小板等の混合物は、穴ｈから下方に流れ落ちて排出され、穴ｈよりも大きな細胞のみが、穴ｈの上流側つまり観察部３０の上面（フィルタ上）に残ることになる（図５（ｃ））。なお、下方へ液体等を排出する際に、処理を促進するために穴ｈの上流側と下流側で圧力差を設けるようにしてもよい。このような貫通穴フィルタ方式の観察部３０を用いることによっても、全部の細胞を細胞同士が重ならないように穴ｈの配置で展開させることが可能となる。
次にＭＷＣ方式と貫通穴フィルタ方式を用いた観察部３０の実施例について説明する。図６は、ＭＷＣ方式の観察部３０に細胞懸濁液中の細胞を展開（沈殿）した状態を示した図である。観察部３０としてＮｕｎｃライブセルアレイを用いている。それぞれのウェルｗｅの断面形状はハニカム形状であり、ウェルｗｅの直径（外接円の直径）は２０μｍである。観察部３０のそれぞれのウェルｗｅには、それぞれ１個ずつの細胞が、細胞同士が重ならずに展開されていることがわかる。
図７は、図６と同様にＭＷＣ方式の観察部３０に細胞懸濁液中の細胞を展開（沈殿）した状態を示した図である。観察部３０としてＮｕｎｃライブセルアレイを用いている。それぞれのウェルｗｅの断面形状はハニカム形状であり、ウェルｗｅの直径（外接円の直径）は２５０μｍである。同図においては視野範囲としては略１５００μｍ（直径）であり、縦横にそれぞれ６個ずつのウェルが配置されており、それぞれのウェルｗｅには、百数十個の細胞が、細胞同士が重ならずに展開されていることがわかる。
図８は、貫通穴フィルタ方式の観察部３０に細胞懸濁液中の細胞を展開した状態を示した図である。観察部３０としてニュークリポアメンブレンのフィルタを用いている。カタログ値としては貫通穴の直径は０．４μｍ以下である。図８の淡い６箇所の白丸部が細胞を示し、コの字状の引き出し線（１６．０３μｍ）はその内のひとつの細胞の直径を示している。同図から明らかなように観察部３０のフィルタ上には、細胞同士が重ならずに展開されていることがわかる。
［細胞染色等の実施条件］
ステップＳ２で展開した細胞に対して前述したステップＳ２の２で観察部３０（Ｎｕｎｃライブセルアレイまたはニュークリポアメンブレン）において細胞の固定と染色を行う。なおこの手順に替えてステップＳ１の沈殿物に対してステップＳ１の２で固定と染色（以下の（１）〜（６））を行った後、観察部に展開しても良い。また、観察を容易に行う工夫として、２時間静置による自然乾燥接着を行うようにしてもよい。
ステップＳ２で展開した細胞に対して前述したステップＳ２の２で観察部３０（Ｎｕｎｃライブセルアレイまたはニュークリポアメンブレン）において細胞の固定と染色を行う。なおこの手順に替えてステップＳ１の沈殿物に対してステップＳ１の２で固定と染色（以下の（１）〜（６））を行った後、観察部に展開しても良い。また、観察を容易に行う工夫として、２時間静置による自然乾燥接着を行うようにしてもよい。
培養により調整した懸濁液Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、ＭＣＦ−７細胞（約１０２ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を等量混合し、混合した混合液を３００ｇ５分間遠心分離した後、上清を廃棄、ＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline、例えばインビトロジェン）を添加する。
（１）細胞の固定
上記により調整したＪｕｒｋａｔ細胞とＭＣＦ−７細胞の混合液を観察部３０に滴下し、毛細管現象または吸引を利用して排液した後に、３％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド、例えば和光純薬）を添加して２０分静置して懸濁。
（２）ＰＦＡの洗浄除去
ＰＢＳを添加し、（１）と同様に排液。
（３）ブロッキング
３％ＢＳＡ（例えばｐｉｅｒｃｅ）−ＰＢＳ滴下、４５分静置によりブロッキングを行い、ＰＢＳで洗浄除去。
（４）一次抗体反応
抗ＣＫ（マウスＣｏｎｅＡ４５−Ｂ／Ｂ３）、抗ＣＤ４５（ラビットｓｃ−２５５９０）（抗ＣＫ、抗ＣＤ４５共に例えばＡＳ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）を原液１００倍希釈にて４５分静置により反応。
（５）二次抗体反応
Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ５５５標識抗ラビットＩｇＧ（共に例えばインビトロジェン）を原液１０００倍希釈にて４５分静置により反応。
（６）核染色
ＤＡＰＩ液（原液４０万倍希釈、例えばインビトロジェン）を添加、４５分静置により染色。
（７）封入
退色防止剤ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（例えばインビトロジェン）と共に細胞をカバーガラスにて封入。
（８）ＣＴＣカウント
蛍光顕微鏡下３８ＨＥフィルタ（Ａｌｅｘａ４８８（ＣＫ）に対応）にて緑色の蛍光像を示す細胞をカウント。
（１）細胞の固定
上記により調整したＪｕｒｋａｔ細胞とＭＣＦ−７細胞の混合液を観察部３０に滴下し、毛細管現象または吸引を利用して排液した後に、３％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド、例えば和光純薬）を添加して２０分静置して懸濁。
（２）ＰＦＡの洗浄除去
ＰＢＳを添加し、（１）と同様に排液。
（３）ブロッキング
３％ＢＳＡ（例えばｐｉｅｒｃｅ）−ＰＢＳ滴下、４５分静置によりブロッキングを行い、ＰＢＳで洗浄除去。
（４）一次抗体反応
抗ＣＫ（マウスＣｏｎｅＡ４５−Ｂ／Ｂ３）、抗ＣＤ４５（ラビットｓｃ−２５５９０）（抗ＣＫ、抗ＣＤ４５共に例えばＡＳ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）を原液１００倍希釈にて４５分静置により反応。
（５）二次抗体反応
Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ５５５標識抗ラビットＩｇＧ（共に例えばインビトロジェン）を原液１０００倍希釈にて４５分静置により反応。
（６）核染色
ＤＡＰＩ液（原液４０万倍希釈、例えばインビトロジェン）を添加、４５分静置により染色。
（７）封入
退色防止剤ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（例えばインビトロジェン）と共に細胞をカバーガラスにて封入。
（８）ＣＴＣカウント
蛍光顕微鏡下３８ＨＥフィルタ（Ａｌｅｘａ４８８（ＣＫ）に対応）にて緑色の蛍光像を示す細胞をカウント。
１１ 光源
１２ 回転多面鏡
１３ モータ
１４ 走査光学系
２１ 光ガイド
２２ 受光部
２３ 光学フィルタ
２４ 撮影部
２５ 解析部
３０ 観察部
ｗｅ ウェル
ｈ 穴
４０ エンドレスベルト
１２ 回転多面鏡
１３ モータ
１４ 走査光学系
２１ 光ガイド
２２ 受光部
２３ 光学フィルタ
２４ 撮影部
２５ 解析部
３０ 観察部
ｗｅ ウェル
ｈ 穴
４０ エンドレスベルト
Claims (12)
- 血液中の稀少細胞を検出する細胞の検出方法であって、
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
前記第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。 - 前記観察領域に設けられた前記複数の穴は所定のピッチで配置されたウェルにより形成されており、
前記第２工程は、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする請求項１に記載の細胞の検出方法。 - 前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の２倍未満であることを特徴とする請求項２に記載の細胞の検出方法。
- 前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の２倍以上の大きさであることを特徴とする請求項２に記載の細胞の検出方法。
- 前記観察領域に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、
前記第２工程は、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする請求項１に記載の細胞の検出方法。 - 血液中の稀少細胞を検出する細胞の検出方法であって、
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第１工程と、
第１工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、該細胞の最大径の２倍未満の厚みの薄層に伸ばすことにより観察領域に展開する第２工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第３工程と、
前記第３工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第４工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。 - 前記第２工程は、スピンコート方式により前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記観察領域に展開することを特徴とする請求項６に記載の細胞の検出方法。
- 前記第２工程は、バーコート方式により前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記観察領域に展開することを特徴とする請求項６に記載の細胞の検出方法。
- 複数の穴が設けられ、血液から赤血球を除く前処理をすることにより得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開する観察部と、
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定ピッチで配置されたウェルにより形成されており、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。 - 前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の２倍未満であることを特徴とする請求項９に記載の細胞検出システム。
- 前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の２倍以上の大きさであることを特徴とする請求項９に記載の細胞検出システム。
- 複数の穴が設けられ、血液から赤血球を除く前処理をすることにより得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開する観察部と、
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
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