JPS6361954A

JPS6361954A - 分析用試料液の調製方法及び装置

Info

Publication number: JPS6361954A
Application number: JP20701086A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Akamatsu; 赤松　繁樹; Kenichi Iwase; 健一岩瀬; Yoshikazu Furuya; 古谷　義和; Hisashi Motokawa; 久志本川
Original assignee: KOKUSAI SHIYAKU KK; Teramecs Co Ltd
Current assignee: KOKUSAI SHIYAKU KK; Teramecs Co Ltd
Priority date: 1986-09-03
Filing date: 1986-09-03
Publication date: 1988-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、例えばウィルス感染症や悪性腫瘍の診断の為
の赤血球凝集反応に基づく検査とか、ラテックスやマイ
クロパーティクルを用いる凝集反応を利用した各種臨床
検査に供するために、希釈系列化した試料液を正確且つ
簡便に調製する方法及び装置に関する。

〔技術的背景〕

内外における人的交流や輸血・血液製剤注射の機会増大
等によるウィルス感染症の増加９人口の高齢化に伴う癌
腫瘍の発生率増加に対処するために、臨床的にこれらを
効率よく検査する技術の発展が望まれている。ところで
、これらに罹病しているか否かの判断のひとつに、ウィ
ルスや腫瘍に起因するある種の血中微量成分の抗原・抗
体反応による検出がある。

例えば、急性ウィルス感染症の一種であるＢ型肝炎は多
くのウィルス保有者がおり悪化すれば肝硬変や肝臓ガン
になる危険性があるが、現在では該ウィルスに関連する
抗原、抗体系（ＨＢｓ、ＨＢｃ、ＨＢｅの各抗原、抗体
）が良く知られており、その検出は臨床検査分野におい
て重要な位置を占めつつある。

この分析はＰＨＡ法（受身赤血球凝集反応）とかＲＰＨ
Ａ法（逆受身赤血球凝集反応）により行なわれるもので
、被検液を希釈液（通常リン酸緩衝液を用いる）で段階
的に希釈（通常２のｎ乗倍列）した各試料液に或種の感
作赤血球を加え、或希釈段階（通常１６倍或いは３２倍
）での凝集の有無（スクリーニングテスト）とか、全希
釈系列での凝集程度を試薬を加えた系列の凝集程度と比
較する（確認試験）方法で行なわれ、感染の有無及び感
染患者の予後経過等を調べるものである。

〔従来技術及びその問題点〕現在、上記試料液（希釈系列）の作成については、Ｌｌ
ｌＩＸ１２個のウェルを持つ規格化されたマイクロプレ
ートを用い、該ウェルにドロンパーやマイクロピペット
で希釈液を分注（通常２５μｌ又は５０μＬ）シ、被検
液の採取（通常２５μ又は５０μｌ）と攪拌混合及び希
釈を第５図に示す如きグイリュータ−（イ）を用いて行
なっている。

（従来技術の欠点）しかし、従来法には種々な欠点がある。まず第一に、希
釈液の分注と被検液の採取、攪拌・希釈が異なった用具
（ドロンパーとグイリュータ−）により行なわれるため
、誤差を生じ易い。

またグイリュータ−（イ）は、棒状本体（ロ）の先端に
切込み部（ハ）を設けたもので、この切込み部（ハ）に
毛管現象で被検液或いは混合希釈液を保持する構成をと
る。切込み部（ハ）に溜った液は、攪拌時の回転により
飛び出す。従って、■使用に熟練が必要で、持込量と持
ち出し量が一定になりにり＜、個人差も大きいとか、■
血清は希釈液に比べて粘度が高いため希釈により粘度が
変化し希釈倍率が上がる程算定希釈率との差が大になる
とか、０表面や切込み部の汚れにより濡れの程度が異な
るため保持量が経時的に変化するので、定期的に不純物
を焼却除去する必要があるし、プレウエッテングや使用
後の洗浄・濾紙による水分除去等の手入れ作業が必要で
手間がかかるとか、■チタン合金性故高価であるし、極
めて硬くウェル壁を疵付けて凝集反応に影響を与えると
か、■容量一定故、希釈率は当初の緩衝液と被検液の割
合により決り変更できない等、多くの問題点を有してい
る。

Ｃ本発明の目的〕本発明は上記に鑑み、被検液の性状や検査者の熟練程度
等により影響を受けず、簡単、確実且つ正確に被検液の
希釈系列を完成することを目的とする。また、希釈倍率
を簡単に変更できる試料液の調製方法を提供することを
目的とする。更に、操作や手入れが簡単で確実に作動し
、構造が簡単で安価に得られる試料液の調製装置を提供
することを目的とする。

これらの目的は、ドロンパーとグイリュータ−の組合せ
に代えて、希釈液の分注とミキシング及びグイリュージ
ョンを同一の用具即ちノズルで行なうことにより達成さ
れる。このノズルはチューブを介してプランジャーポン
プやチューブポンプ等微小量を正確に吸排するポンプに
連結されており、マイクロコンピュータ−で制御される
。

〔実施例〕

以下、本発明をＰＨＡ法を例にとり図面に示す実施例に
基づいて詳細に説明する。

第１図〜第３図は、本発明方法を具現化した試材部調製
装置の一例で、第１図は機械的主要部分の構成図、第２
図は全体のブロック図、第３図は流路図である。

（構造）この装置は、スライドベース部（１）、ノズル部（２）
。

吸排ポンプ部（３）、操作部（４）２表示部（５）及び
記憶・制御部（６）から構成される。

スライドベース部（１）は、マイクロプレート（７）や
緩ｔＥ液容器（８）を所定位置に載置するスライドベー
ス（９）と、該スライドベース（９）を所定位置間で往
復動させる駆動源としてのパルスモータ（１０）、伝達
手段としてのベル）（１１）及び位置検出手段（１２）
からなる。位置検出手段（１２）は、例えばホトカプラ
ーと邪魔板よりなる。スライドベース（９）上には被検
液や血球試薬（共に図示路）を載置するスペースを設け
てもよいし、ベルト（１１）の代わりにラックとピニオ
ンを用いてもよい。

ノズル部（２）は、ノズル（１３）を上下動させるとと
もに液体の吸引・吐出を行わせるもので、本例で（ま８
（固くまたは１２（固、マイクロプレートト（７）の構
造によっては１０個）のノズル（１３）・・・をノズル
ホルダー（１４）で１列状態に支持し、該ノズルホルダ
ー（１４）を支えるノズルアーム（１５）をモータ（１
６）で回転する偏心カム（１７）により上下動させる構
成をとる。尚、図中符号（４２）は該偏心カムの定位置
を検出するための位置検出手段である。偏心カム（１７
）に替えて、油圧シリンダーその他の手段でノズル（Ｉ
３）の上下動を行ってもよい。ノズル部（２）の作用に
より、マイクロプレート（７）の各ウェル（７１）・・
・に希釈液（８１）を分注したり、別途滴下する被検液
と緩衝液（８１）の攪拌・希釈を行なう。被検液や血球
試薬の採取・滴下を行わせることもできる。

吸排ポンプ部（３）は、上記各ノズル（１３）・・・に
ノズルチューブ（１８）を介して連結される複数のプラ
ンジャーポンプ（１９）・・・と、該プランジャーポン
プ（１９）を駆動するモータ（パルスモータ’）　（２
０）及びラック・ピニオンからなる伝達子ｌ２（２１）
よりなる。プランジャーポンプ（１９）に代えてチュー
ブポンプを用いてもよいし、ランク・ピニオンに代えて
ベルトで駆動してもよい。図中、符号（４３）はラック
ひいてはプランジャーポンプ（Ｉ９）の定位置を検出す
るための位置検出手段である。

操作部（４）は、各工程（緩衝液の吸入・滴下、被検液
滴下後の攪拌・希釈、ノズル（１３）の洗浄等）の作動
を指示するモード指定用のキー（２２）・（２３）・（
２４）・（２５）や、項目（希釈段数指定、初期倍率指
定等）選定のためのキー（２６）・（２７）・（２８）
・（２９）・（３０）及びメインスイッチ（３１）等を
備えており、この操作が表示部（５）に確認表示される
。符号（３２）〜（４０）が確認表示のためのＬＥＤで
ある。

記１、α・制御部（６）は、希釈その他のプログラムや
クロックを含むＣＰＵ（４１）からなり、操作部（４）
からの入力指示を受けて各部（１）・（２）・（３）・
（５）に作動指令を出力する。本例では、ノズル（１３
）による液体の吸引量（２５μ乏、５０μに）や希釈段
数（４段。

８段、１２段）、初期倍率（２倍、４倍）等は予め定め
であるが、これらを任意に変更設定できるようにプログ
ラムを組むこともできる。

尚、上記例ではマイクロプレート（７）を載置するスラ
イドベース（９）を移動させる構造を採っているが、ノ
ズル部（２）をスライドベース等で支持し、マイクロプ
レート（７）等を固定する構造としてもよい。

（作動）次に、図示の装置による試料液の調製方法を説明する。

まず、測定目的に合わせて操作部（４）で設定を行なう
。例えば、ＰＨＡ法（受身赤血球凝集反応によるＢ型肝
炎のＨＢ、ｅ抗体測定）のスクリーニングテストでは、
８Ｘ１２（固（１０Ｘ１２のものもある）のウェル（７
１）・・・を持つマイクロプレート（７）を睡或いは横
方向にセントし、１個の被検液に対し１列４個のウェル
（７１）を使用する。これは、被検液を１６倍（第１段
目ウェルでの希釈倍率２）或いは３２倍（第１段目ウェ
ルでの希釈倍率４）に希釈した試料液が凝集するか否か
で陽性か陰性かを判断するものである。

そして、メインスイッチ（３１）を入れ選定キー（３０
）で４段使用（ＬＥＤ（３３）点灯）１選定キー（２７
）で１〜４番目のウェル（７１）使用（Ｌ　Ｅ　Ｄ　（
３５）点灯）。

選定キー（２６）で初期倍率２（ＬＥＤ（３２）点灯）
を夫々選定する。次いで新しいマイクロプレート（７）
をスライドベース（９）の所定位置に位置固定し、モー
ド指定キー（ドロッパー・緩衝液注入）（２２）を押す
。するとスライドベース（９）がノズル部（２）方向に
移動し、ノズル（１３）の翼下に緩衝液容器（８）の緩
衝液（８１）がくる位置で一時停止する。この停止位置
は、位置検出手段（Ｉ２）で検出される定位置からのパ
ルス数で制御する。この状態でノズル（１３）先端が下
がって所定量（２５μ）の緩衝液（８１）を吸入して上
昇する。次いで、第１段目のウェル（７Ｉ）の位置にノ
ズル（１３）が来るようにスライドベース（９）が反対
方向に移動して停止した後ノズル（１３）が下降し、同
−段にある全てのウェル（７Ｉ）内にＢｔＥ液（８１）
を吐出（分注）する。同様の操作を繰り返し第２〜第４
段目の各ウェル（７Ｉ）にも緩衝液（８１）を２５μ乏
ずつ分注する。緩衝液（８１）としては通常リン酸緩衝
液を用いる。

次いで、第１段目の各ウェル（７１）に夫々異なる被検
液を、別途マイクロピペット等で２５誠ずつ注入した後
、モード指定キー（２３）　　（攪拌・希釈用）を押す
。すると、ノズル（１３）が第１段目のウェル（７１）
の位置で上下動しつつ吸入・吐出を数回繰り返す。この
操作により被検液と緩衝液（８１）が均一に攪拌される
。（この際の吸入量を２５μｌにしておくと作動指令が
簡単？こなる。）この状態で確実に２倍希釈された第１
の試料液が５０ｐｌ得られる。

最後にこの希釈された液を２５μｌ吸引したまま上昇し
、第２段目のウェル（７１）をノズル（１３）の真下に
移動させ、ここで該希釈された２５μ夕の液を吐出し、
同様に吸入・吐出を繰り返して攪拌し４倍希釈の試料液
を得る。同様にして、第４段目のウェル（７１）では１
６倍に希釈された試料液が５０μｌ得られる。その内２
５バを吸引し、緩衝液容器（８）の廃液入れ（８４）に
排出する。

以上で、各４個のウェルに４′＠に希釈された試料液が
２５μｉずつ充虜されたことになり、希釈操作（試料液
調整）が完了する。

その後、非特異反応吸収のため３７度で１時間程度イン
キュベートし、次いで第４段目のウェル（７Ｉ）に、Ｈ
ＢｅＡｇ感作ヒツジ赤血球（商品名：ｅ−セル、国際試
薬側製）にリン酸緩衝液を加えた懸濁液の２５μえをマ
イクロピペットで採取して加え、１０秒程度震盪混和す
る。しかる後、３７度で３時間以上インキュベートし、
凝集像を観察する。判定は、陰性コントロールの凝集像
と比較して行なう。陰性コントロールは通常緩衝液を用
い、マイクロプレート（７）のいずれかの１列４個のウ
ェル（７１）に２５μｌずつ入れておき、同様に血球試
薬（感作血球懸濁液）を加えたものである。

任意の時点でモード指定キー（２５）　（洗浄用）を押
すと、ノズル（１３）の真下に緩衝液容器（８）の洗浄
液入れ（８２）または（８３）がくるので、ここで洗浄
液を吸引し廃液入れ（８４）に排出してノズルチップの
洗浄を行なう。尚、他のモードの最後の段階でも自動的
にノズル（Ｉ３）の洗浄を行なう。またモード指定キー
（２４）は被検液採取のためのもので、このキーを備え
ておくと、別途スライドベース（９）上に多穴の？、！
！！検液容器（図示略）を載置し、手動に替えて各被検
液をノズル（１３）で吸引して第１段目のウェル（７１
）に注入することができる。

また前記例では、１〜４段目のウェル（７１）のみを用
いたが、被検液の数によっては選定キー（２８）及び（
２９）を操作して、５〜８段目（Ｌ　Ｅ　Ｄ　（３６）
点灯）、９〜１２段目（ＬＥＤ（３７）点灯）を同様に
用いることもできる。この場合も、選定キー（３０）を
押して４段使用（ＬＥＤ（３８）点灯）とする。ノズル
部（２）やスライドベース部（１）等の動きは１段目・
５段目・９段目が同じ動きになる。更に、各機の採取量
を５０μｔにする場合は、選定キー（２６）を操作して
５０μ乏法（ＬＥＤ（３４）点灯：第１段目は２倍希釈
）を採用するとよい。

測定を３２倍希釈した試料液で行なうには、選定キー（
２Ｇ）を操作してＬ　Ｅ　Ｄ　（３３）を点灯させる。

かくすると、第１段目のウェル（７１）に緩衝液（８１
）を７５μ之、他のウェル（７１）には２５度ずつ分注
する指令をだす。上記７５成は、２５μｌずつ３回行な
うようにしてもよいが、−度で行なわせることもできる
。被検液は同じ（２５μｌ故、第１段目で４倍に希釈さ
れたものが１００成得られるので、その半分の５０μｔ
を廃棄するとその後は前記例同様に扱える。

次に、同様にＰＨＡ法による確認試験について説明する
。確認試験は、スクリーニングで陽性或いは擬陽性と判
定された被検液についてより精細に行なうもので、１被
検液について８段（８穴）のウェル（７１）を２系列使
用する。陽性及び陰性コントロールも同様に各８段１系
列使用する。８段目の希釈倍率を２５６にするには１段
目を２倍、５１２倍にするには１段目を４倍希釈する。

この場合、選定キー（２７）・（２８）を押して１〜４
及び５〜８段目の使用（ＬＥＤ（３５）及び（３６）点
灯）と、選定キー（３０）を押して８段の指定（ＬＥＤ
（３９）点灯）を行う。

その他は、前記別間様にして２，４．・・・、２５６倍
或いは４，８．・・・５１２倍に希釈された２５μｔの
試料液の系列ができる。この全てについて、１列目は緩
衝液、２列目はＨＢｅＡｇ試薬を各２５μ之ずつ加え、
１０秒間程度震盪混和後３７度で１時間インキュベート
する。続いて、ＨＢｅＡｇ感作ヒツジ赤血球懸濁液を２
５μｌずつ加え、１０秒間程度震盪混和後３７度で３時
間以上インキユベートシ、凝集像を観察する。判定は、
緩衝液を加えた系列とＨＢｅＡｇ試薬を加えた系列に於
ける凝集の阻止の有無を観察し、両者に器差がなければ
陰性、２管差以上有れば陽性、１管差の場合は再検して
再現性が有れば陽性とする。

（変形例）以上は、赤血球凝集反応を利用したＰＨＡ法によるＨＢ
ｅ抗体測定を例にとり説明したが、本発明は同様に赤血
球凝集反応に基づ＜ＲＰＨＡ法によるＨＢｅ抗原の測定
や、ＨＢｃ、ＨＢｄ、ＨＢｓの抗原・抗体、瘍マーカー
（腫瘍特異蛋白質）の測定を行なうに際しても試薬を替
えて同様に用いることができるものである。更に、ラテ
ックスやマイクロパーティクルを用いる凝集反応を利用
した各種臨床検査にも利用できるものである。

また、少ない試料液の数で広い範囲の希釈倍率の測定を
するために３のｎ乗倍の希釈列を作ったり、より狭い希
釈倍率の範囲でより精密に測定するために２／３のｎ乗
倍の希釈系列を作ることも自在にできる。

装置としては、スライドベース部（１）に被検液入れ更
には感作血球試薬入れを載置し、これらを同じノズル（
１３）でウェル（７１）に分注するようにしてもよい。

また実施例の場合、ノズル（１３）はノズルチップを交
換するディスポーザルタイプのものであり、検体数が少
ない場合チップをセントしないでおくこともできる。勿
論、固定式ノズルでもよい。ノズル（Ｉ３）の駆動は、
ノズルホルダー（ＩＩＯ及びノズルアーム（Ｉ５）をノ
ズル（１３）ごとに設け、個々に上下動させる構成を採
ってもよい。

〔効果〕

以上詳述したように本発明方法は、抗原・抗体反応を利
用した分析に用いる段階的に希釈した試料液の系列を、
１本のノズルを用いて調整するものである。従って、希
釈液の吸入・吐出、被検液との攪拌混合による希釈、採
取等が同一のノズルで同−量出し入れされるので、従来
法のようにマイクロピペットとダイリュータ−を用いる
ものに比して個人差、器差がなく、極めて正確な測定を
担保する。また吸引・吐出をプランジャーポンプ等で行
なうので、希釈液や被検液の採取、混合割合は自由に選
定でき、自由度が増す。更にダイリュータ−のように手
入れする必要もなく、作業効率が大幅に向上する。また
、ダイリュータ−を用いる攪拌のようにマイクロプレー
トのウェル内壁を疵付けることによる反応促進や試料液
の飛散による誤差もない等極めて優れたものである。

本発明装置は上記方法を具現化したもので、構造が極め
て簡単でありながら緩衝液の分注、被検液との攪拌・混
合、希釈を容易・正確且つ迅速に行なうものである。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は本発明装置の一例を示し、第１図は
主要部の概略正面図、第２図はブロック図、第３図は流
路図である。また第４図はマイクロプレートの平面図、
第５図はダイリュータ−の斜視図である。１・・・・・・スライドベース部２・・・・・・ノズル部３・・・・・・吸排ポンプ部４・・・・・・操作部５・・・・・・表示部６・・・・・・記憶・制御部７・・・・・・マイクロプレート７１・・・ウェル８・・・・・・緩衝液容器８１・・・緩衝液９・・・・・・スライドベース１３・・・・・・ノズル１９・・・・・・プランジャーポンプ特　許　出　願　人　　国際試薬株式会社特　許　出　
願　人　　テラメックス株式会社第３０第４図第５図

Claims

【特許請求の範囲】１、吸排ポンプに連結されるノズルでマイクロプレート
の各列の必要個数のウェルに夫々所定量の希釈液を分注
した後、該ノズル或いは他の手段で各列の第一ウェルに
所定量の被検液を分注し続いて該ノズルで数回吸排を繰
り返すことにより希釈液と被検液の攪拌混合を行い、次
いで該混合液の所定量を吸引して第二ウェルに注入し同
様に攪拌混合することにより希釈し、以下同様に各ウェ
ルについて順次吸入・混合・希釈を行なって希釈系列を
作ることを特徴とする分析用試料液の調製方法。２、マイクロプレートと共に希釈液等の容器を載置して
所定位置間を間欠移動させるスライドベース部と、液体
の吸引・吐出によりマイクロプレートの各ウェルに各液
の分注と攪拌・希釈を行なうノズル部と、ノズルに吸引
・吐出させる吸排ポンプ部と、各工程の作動指示や項目
選択のためのキーを備えた操作部と、操作部からの入力
信号に基づき表示部に確認表示を出力するとともに該指
示により各部に作動指令を出力する記憶・制御部とから
構成されることを特徴とする分析用試料液の調製装置。