JPWO2010110346A1 - 白血病幹細胞マーカー - Google Patents
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Abstract
ヒト白血病幹細胞(LSC)に特異的な分子標的を見出し、急性骨髄性白血病(AML)の根治につながる治療手段などの提供。AMLの初発又は再発を予測するための試験方法であって、(1)被験者から採取した生体試料におけるLSCマーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物又は翻訳産物を対象として測定する工程、および(2)測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程を含み、当該LSCマーカー遺伝子は、2〜218の遺伝子から構成される試験方法、LSCマーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、LSCを標的化したAMLの治療剤、並びにAML患者に対する自家移植又は同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法であって、少なくとも1種のLSCマーカーを指標として、LSCがパージングされた試料を得る工程を含む製造方法。LSCマーカー遺伝子は、明細書中に定義した通りである。
Description
本発明は、白血病幹細胞マーカーに関し、急性骨髄性白血病の治療分野に関するものである。
急性骨髄性白血病(AML)は、最も一般的な頻度(発症率)の高い成人白血病であり、稀な白血病幹細胞(LSC)から始まる未熟な骨髄芽球のクローン性の増殖によって特徴付けられる(非特許文献1〜3)。ヒトLSCの機能的特徴および分子的特徴は、大部分が不明である。従来の化学療法剤はAMLを一時的に寛解し得るものの、後になって再発することが患者を救うことができない困難な問題となっており、有効な治療剤および治療方法の開発のためには、これまでに知られていない白血病の性質を明らかにすることによる再発メカニズムの解明が強く望まれている。
最近の研究は、白血病ならびに癌の一定の割合が不均一な細胞画分からなり、クローン性に増殖可能な均一な細胞集団から構成されていないことを明らかにした。LapidotとDickは、急性骨髄性白血病(AML)でそのような不均一性を同定し、CB17−scidおよびNOD/SCIDマウスでCD34+CD38−細胞が選択的に移植することを報告した(非特許文献4)。
本発明者らは、マウスでなくヒトのAML、特に細胞株でない個々の患者のAMLの特徴を再現することができ、長期間評価にたえ得る動物モデルの開発に成功した(非特許文献5、特許出願PCT/JP2008/068892)。最も高感度のヒト幹細胞アッセイの1つである新生NOD/SCID/IL2rgKOマウスモデルを用いて、本発明者らは、CD34+CD38−AML細胞がアメリカ癌学会(American Association for Cancer Research)が推奨する癌幹細胞のすべての基準に合致することをさらに同定した(非特許文献6)。具体的には、CD34+CD38−AML細胞は自己複製し、非幹白血病細胞を発生させ、生体内でAMLを発症させる独占的能力を有する。NOD/SCID/IL2rgKOマウスで原発性ヒトAMLを繰り返すことにより、本発明者らは、本疾患の実体において最も重大な問題である化学療法耐性および再発の根底にあるメカニズムを探求し、ヒトAML幹細胞に関して下記2つの必須の特性を同定した。第一に、AML幹細胞は骨髄の骨内膜領域に優先的に存在し、ヒトAML移植マウスを化学療法剤で処置した場合、化学療法耐性AML細胞の大多数が骨芽細胞ニッチ内に見いだされた。第二に、AML幹細胞(CD34+CD38+およびCD34−AML細胞ではない)は静止しており、それ故、細胞周期依存性の化学療法剤に対して耐性を示す。これらの組織学的実験および細胞周期解析は、多数のAML患者が化学療法誘導を介して寛解を獲得するが最終的には再発を経験するという臨床的経験と一致する。LSCを根絶させるように設計された新規治療戦略の開発は、AMLの再発を克服する厳密なステップであると思われる。
Passegue, E., Jamieson, C.H., Ailles, L.E. & Weissman, I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11842−11849 (2003).
Hope, K.J., Jin, L. & Dick, J.E. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self−renewal capacity. Nat Immunol 5, 738−743 (2004).
Jordan, C.T. & Guzman, M.L. Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells. Oncogene 23, 7178−7187 (2004).
Lapidot, T. et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367, 645−648 (1994).
Ishikawa, F. et al. Chemotherapy−resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone marrow endosteal region. Nature Biotechnol 25:1315−1321 (2007).
Clarke, M.F. et al. Cancer stem cells−−perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res 66, 9339−9344 (2006).
解決しようとする課題は、ヒト白血病幹細胞(LSC)に特異的な分子標的を見出し、急性骨髄性白血病(AML)の根治につながる治療手段などの提供である。
本発明者らは、LSCと非幹細胞との間で示差的に発現する遺伝子群を見出し、これらの遺伝子がAMLの治療標的となる可能性を提案してきた(Ishikawa F. et al.Nature Biotechnol 25:1315−1321, 2007およびPCT/JP2008/068892)が、同時に正常の造血幹細胞(HSC)においても示差的に発現している可能性を排除しきれていなかった。すなわち、LSCと非幹細胞との比較のみならず、LSCとHSCとの間で示差的に発現する遺伝子群を標的として同定することにより、初めて副作用の少ないAMLの治療剤ならびに治療方法が実現されるのである。本発明者らは、ヒトAMLが再現できるモデルマウス(NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒトAML患者由来の白血病幹細胞含有物を移植したマウス)を開発し、少量のAML患者由来の骨髄細胞を移植し、当該モデル動物内でAMLの病態を再構築することに成功した。そしてAML患者由来およびAML移植マウス由来のLSCならびに健常ドナー由来の骨髄試料および臍帯血試料(HSCが含まれる)を準備して網羅的に解析を進め、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
[1]急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法であって、
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
(2)測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
を含み、当該白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる群より選ばれる2〜218の遺伝子であり、被験者における2以上の白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現が基準値に比べて有意に高い場合、採取した生体試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される、試験方法。
[2]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる2〜58の遺伝子である、[1]に記載の試験方法。
[3]下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤。
[4]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[5]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCGR2A、GPR84、HCST、HOMER3、ITGB2、LGALS1、LRG1、PTH2R、RNASE2、TNF、TNFSF13B、TYROBPおよびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;NEK6からなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCDおよびRAB20からなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1からなる転写因子遺伝子;ならびにCTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[6]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の幹細胞に発現するマーカーであって、AK5、BIK、DOK2、FCGR2A、IL2RA、LRG1、SUCNR1およびWT1からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[7]遺伝子の発現を抑制し得る物質がアンチセンス核酸またはRNAi誘導性核酸である、[3]〜[6]のいずれか一に記載の治療剤。
[8]翻訳産物の活性を抑制し得る物質がアプタマーまたは抗体である、[3]〜[6]のいずれか一に記載の治療剤。
[9]抗体が抗体と抗癌物質とのイムノコンジュゲートである、[8]に記載の治療剤。
[10]急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法であって、
a)当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
b)採取した試料と、下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
から選ばれる少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む、製造方法。
[11]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカー遺伝子である、[10]に記載の製造方法。
[12]下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質の有効量を対象に投与することを含む、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の予防または治療方法。
[1]急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法であって、
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
(2)測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
を含み、当該白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる群より選ばれる2〜218の遺伝子であり、被験者における2以上の白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現が基準値に比べて有意に高い場合、採取した生体試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される、試験方法。
[2]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる2〜58の遺伝子である、[1]に記載の試験方法。
[3]下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤。
[4]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[5]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCGR2A、GPR84、HCST、HOMER3、ITGB2、LGALS1、LRG1、PTH2R、RNASE2、TNF、TNFSF13B、TYROBPおよびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;NEK6からなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCDおよびRAB20からなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1からなる転写因子遺伝子;ならびにCTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[6]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の幹細胞に発現するマーカーであって、AK5、BIK、DOK2、FCGR2A、IL2RA、LRG1、SUCNR1およびWT1からなる群より選ばれる、[3]に記載の治療剤。
[7]遺伝子の発現を抑制し得る物質がアンチセンス核酸またはRNAi誘導性核酸である、[3]〜[6]のいずれか一に記載の治療剤。
[8]翻訳産物の活性を抑制し得る物質がアプタマーまたは抗体である、[3]〜[6]のいずれか一に記載の治療剤。
[9]抗体が抗体と抗癌物質とのイムノコンジュゲートである、[8]に記載の治療剤。
[10]急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法であって、
a)当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
b)採取した試料と、下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
から選ばれる少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む、製造方法。
[11]白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカー遺伝子である、[10]に記載の製造方法。
[12]下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質の有効量を対象に投与することを含む、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の予防または治療方法。
本発明は、ヒト原発性AML由来の白血病幹細胞(LSC)の網羅的発現プロファイリングを解析し、HSCからLSCを分離するLSC特異的標的の同定に成功したことにより、完成したものである。したがって、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーは、非幹細胞とLSCとの識別のみならず、これまで識別が困難とされてきた正常の造血幹細胞(HSC)とLSCとの識別を可能ならしめるものである。本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを分子標的とすることにより、AMLの発症源または再発源であるLSCに特異的に作用する治療剤を提供することができる。
また、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標としてFACS等の細胞選別装置を用いて、患者またはドナーの骨髄細胞からLSCを特異的に除去することができる。これにより、AMLの真の発症源または再発源を有効に除去することにつながる。したがって、AMLの再発を有意に防止することができる。
さらに、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標として、採取した生体試料中または生体内でLSCの存否を測定することができ、これにより急性骨髄性白血病の再発または初発を予測することもできる。
また、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標としてFACS等の細胞選別装置を用いて、患者またはドナーの骨髄細胞からLSCを特異的に除去することができる。これにより、AMLの真の発症源または再発源を有効に除去することにつながる。したがって、AMLの再発を有意に防止することができる。
さらに、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標として、採取した生体試料中または生体内でLSCの存否を測定することができ、これにより急性骨髄性白血病の再発または初発を予測することもできる。
(定義)
本発明において、白血病の初発とは、白血病を初めて発症した、または発症が見込まれる状態をいい、白血病の再発とは、初発白血病の治療後または寛解後に再び発症した、または発症が見込まれる状態をいう。再発する組織または再発が見込まれる組織は、初発組織に限定されるものではなく、別の組織であってもよい。したがって、再発という概念には浸潤または転移も含まれる。
本発明において、白血病の初発とは、白血病を初めて発症した、または発症が見込まれる状態をいい、白血病の再発とは、初発白血病の治療後または寛解後に再び発症した、または発症が見込まれる状態をいう。再発する組織または再発が見込まれる組織は、初発組織に限定されるものではなく、別の組織であってもよい。したがって、再発という概念には浸潤または転移も含まれる。
本発明において、白血病の治療とは、抗癌剤投与、放射線療法、骨髄移植を始めとしたあらゆる治療を包含する。
本発明において、白血病幹細胞(LSC)とは、骨髄由来のCD34+細胞画分であってよく、CD34+CD38−細胞画分が好ましい。粗LSC含有物は常法により被験者または患者の骨髄より採取することができ、LSCを含む細胞画分は、CD34およびCD38の細胞表面マーカー分子を用いたフローサイトメトリーなどにより得ることができる。さらに、本発明により見出された白血病幹細胞マーカーから選択した別の細胞表面マーカー分子を指標にして、LSCをさらに選別することも可能である。
(試験方法)
本発明は、急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法を提供する。本発明の試験方法は、
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
(2)測定工程で得られた発現レベルを健常人の発現レベルと比較する工程を含む。
本発明は、急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法を提供する。本発明の試験方法は、
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
(2)測定工程で得られた発現レベルを健常人の発現レベルと比較する工程を含む。
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程
本発明が標的とする白血病幹細胞マーカー遺伝子とは、CD34+CD38+細胞画分に比べてCD34+CD38−細胞画分で示差的に発現される遺伝子群の中から本発明者らが独自の視点に基づいて選別した、白血病幹細胞特異的マーカーであり、下記白血病幹細胞マーカー遺伝子(以下、単に「マーカー遺伝子」または「マーカー」と省略する場合がある)(1)から選ばれる2〜218の遺伝子から構成される。マーカー遺伝子(1)は、好ましくは3以上、5以上、10以上、15以上、20以上または25以上の遺伝子から構成される。
マーカー遺伝子(1):
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子。
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子。
前記白血病幹細胞マーカー遺伝子を構成する個々の遺伝子は公知であり、その塩基配列およびアミノ酸配列も既知である。IL2RAを除くマーカー遺伝子のシンボル名、Gene ID、位置する染色体およびその特徴などを表1に示す。IL2RAは、CD25とも称し、Gene ID:3559、第10染色体に位置し、インターロイキン2受容体アルファをコードする。IL2RAタンパク質は、細胞膜に局在する膜貫通型受容体である。
本発明の試験方法がLSCとHSCとをより明確に識別することを目的とする場合、上記マーカー遺伝子(1)の中から、例えば、下記マーカー遺伝子(2)を指標とすることが好ましい。この実施態様において、マーカー遺伝子(2)は2〜58の遺伝子から構成され、より好ましくは3以上、5以上、10以上、15以上、20以上または25以上の遺伝子から構成される。また、LSCとHSCとをさらにより明確に識別することを目的とする場合、マーカー遺伝子(2)の中から、下記マーカー遺伝子(3)を指標とすることが好ましい。マーカー遺伝子(3)は、HSCに比べてLSCにおいて、通常5倍以上の示差的発現が観察されるのでより好ましい。この実施態様において、マーカー遺伝子(3)は2〜35の遺伝子から構成され、より好ましくは3以上、5以上、10以上、15以上、20以上または25以上の遺伝子から構成される。
マーカー遺伝子(2):
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子。
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子。
マーカー遺伝子(3):
ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCGR2A、GPR84、HCST、HOMER3、ITGB2、LGALS1、LRG1、PTH2R、RNASE2、TNF、TNFSF13B、TYROBPおよびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;NEK6からなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCDおよびRAB20からなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1からなる転写因子遺伝子;ならびにCTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子。
ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCGR2A、GPR84、HCST、HOMER3、ITGB2、LGALS1、LRG1、PTH2R、RNASE2、TNF、TNFSF13B、TYROBPおよびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;NEK6からなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCDおよびRAB20からなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1からなる転写因子遺伝子;ならびにCTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子。
本発明の試験方法における被験者は、ヒトを始めとする哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、白血病の初発または再発が疑われるヒトが好ましい。
本発明の試験方法が測定対象とする生体試料は、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、骨髄液、リンパ液などの体液試料、リンパ節、血管、骨髄、脳、脾臓、皮膚などの固形試料があげられる。
本発明の試験方法において、マーカー遺伝子の発現レベルは、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する。転写産物を対象とする場合、常法に従い、RNAを生体試料から単離することができる。RNAを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley and Sons (1997)など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。具体的には、Qiagenなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってRNA単離を行うことができる。
転写産物を対象とするマーカー遺伝子の発現レベルの測定方法としては、特に限定されるものではないが、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション(Parker & Barnes,Methods in Molecular Biology 106:247−283(1999));RNaseプロテクション・アッセイ法(Hod,Biotechniques 13:852−854(1992));逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)(Weis et al.,Trends in Genetics 8:263−264(1992));リアルタイム定量的RT−PCR(Held et al.,Genome Research 6:986−994(1996));ならびにマイクロアレイ解析法などがある。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Affymetrix GeneChip技術、Agilent Technologiesのマイクロアレイ技術またはIncyteのマイクロアレイ技術を用いるなどして、市販されている装置によって実施することができる。リアルタイム定量的RT−PCRの詳細は、後述する実施例に記載されている。リアルタイム定量的RT−PCRに好適に用いられるプライマーおよびプローブの塩基配列の例は、表3および配列表にリストされている。
マーカー遺伝子の翻訳産物を対象とする場合、常法に従い、タンパク質を生体試料から単離することができる。タンパク質を抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley and Sons(1997)など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。なお、製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質の単離を行うことができる。
翻訳産物を対象とするマーカー遺伝子の発現レベルの測定方法としては、特に限定されるものではないが、免疫組織化学法、プロテオミクス法などがあげられる。免疫組織化学法は、各マーカー遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて発現を検出する。免疫組織化学法のプロトコールおよびキットは、当技術分野において周知されていて市販されている。プロテオミクス法は、あるサンプルにおけるタンパク質発現の全体的な変化を調べることを含む。プロテオミクス法は、一般的に以下の工程を含む:(1)2−Dゲル電気泳動(2−D PAGE)によるサンプル中の各タンパク質の分離、(2)このゲルから回収された各タンパク質の同定、例えば、質量分析またはN−末端配列決定法、および(3)バイオインフォマティクスを用いたデータ解析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の有用な補助法であり、本発明のマーカー遺伝子の産物を検出するために単独または他の方法と組み合わせて使用することができる。また、細胞表面マーカーを標的とする場合、フローサイトメトリーを用いた測定方法が可能である。
(2)測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
生体試料中のマーカー遺伝子の2〜218種類の発現レベルを測定した結果、それらの2種以上の発現レベルが基準値と比べて有意に高い(遺伝子の発現に約2倍以上、好ましくは約4倍以上、より好ましくは約6倍以上、最も好ましくは約10倍以上の違いがある)場合、当該試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される。ここで、基準値としては、健常人の発現レベルの平均値あるいは被験者の発症前の平均値など比較対照となる値が用いられる。白血病幹細胞の存在可能性の示唆は、被験対象において白血病の初発または再発の予想につながる。白血病の初発または再発の有無を、さらに別の検査によって確認することが好ましい。
生体試料中のマーカー遺伝子の2〜218種類の発現レベルを測定した結果、それらの2種以上の発現レベルが基準値と比べて有意に高い(遺伝子の発現に約2倍以上、好ましくは約4倍以上、より好ましくは約6倍以上、最も好ましくは約10倍以上の違いがある)場合、当該試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される。ここで、基準値としては、健常人の発現レベルの平均値あるいは被験者の発症前の平均値など比較対照となる値が用いられる。白血病幹細胞の存在可能性の示唆は、被験対象において白血病の初発または再発の予想につながる。白血病の初発または再発の有無を、さらに別の検査によって確認することが好ましい。
本発明の試験方法において、生体試料中のマーカー遺伝子の2〜218種類の発現レベルを測定した結果、それらの2種以上の発現レベルが基準値と比べて有意に高い(遺伝子の発現に約2倍以上、好ましくは約4倍以上、より好ましくは約6倍以上、最も好ましくは約10倍以上の違いがある)場合、当該試料中または試料の採取元の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される。ここで、基準値としては、健常人の発現レベルの平均値あるいは被験者の発症前の発現レベルなど比較対照となる値が用いられる。この場合、白血病幹細胞の存在可能性は、白血病患者において癌の治療効果が完全に奏していないとの予測につながる。逆に、前記2種以上の発現レベルが有意に低い(例えば、実質的にゼロ)場合、当該試料中に白血病幹細胞が存在しないと予測することができる。この場合、白血病の治療によって白血病幹細胞が消失し、治療が奏効していると考えられる。さらに、その他の検査と組み合わせて、白血病の治療効果を多面的に確認することが好ましい。
このように、本発明の試験方法を適用することにより、生体内に存在する白血病幹細胞を白血病が初発または再発する前に検出して、発症を予測することが可能である。あるいは、白血病の発症を初期のステージで検出して癌患者の早期治療に導くことも可能である。さらに、白血病患者に対する治療効果を白血病幹細胞の存否を指標にして評価することも可能である。
(治療剤)
また、本発明は、白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤を提供する。
また、本発明は、白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤を提供する。
本発明の治療剤の分子標的は、前述した白血病幹細胞マーカー遺伝子であり、治療目的に応じてどのマーカーを選択してもよい。本発明の治療剤が、白血病幹細胞の中でも、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性を示す幹細胞を標的とする場合、AK5、BIK、DOK2、FCGR2A、IL2RA、LRG1、SUCNR1およびWT1からなる群より選ばれる遺伝子(以下、マーカー遺伝子(4)とも称する)の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を選択することが推奨される。マーカー遺伝子(4)を構成する8の遺伝子から2〜8(好ましくは2〜5)を選択して分子標的とすることにより、多数の症例の白血病幹細胞を駆逐できる可能性が高い。したがって、本発明の治療剤に含まれる有効成分は、少なくとも1つであり、治療目的に応じて2以上を組み合わせることが好ましい。2以上の有効成分は、1つの医薬製剤に含まれていてもよく、別々の医薬製剤に含まれていてもよい。
以下、有効成分について説明する。
以下、有効成分について説明する。
白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現を抑制し得る物質としては、例えば、アンチセンス核酸またはRNAi誘導性核酸などがあげられる。
白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質としては、例えば、アプタマーまたは抗体などがあげられる。当該物質は、各マーカーに直接または間接に作用する阻害物質であってもよい。
以下、本発明の治療剤の有効成分について説明する。
1.アンチセンス核酸
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型(リン酸結合のP=OをP=Sに置換)や2’−O−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等があげられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約15個のヌクレオチド程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約15個以上のヌクレオチド、好ましくは約15個〜約100個のヌクレオチド、より好ましくは約18個〜約50個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAと結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型(リン酸結合のP=OをP=Sに置換)や2’−O−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等があげられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約15個のヌクレオチド程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約15個以上のヌクレオチド、好ましくは約15個〜約100個のヌクレオチド、より好ましくは約18個〜約50個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAと結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。
2.RNAi誘導性核酸
RNAi誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、RNA干渉(RNAi)効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはRNAである。RNAi効果とは、mRNAと同一の核酸配列またはその部分配列を含む2本鎖構造のRNAが、当該mRNAの発現を抑制する現象をいう。RNAi効果を得るには、例えば、少なくとも19の連続する標的mRNAと同一の核酸配列(またはその部分配列)を有する2本鎖構造のRNAを用いることが好ましい。2本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのRNAのステムループ構造によって与えられる2本鎖であってもよい。RNAi誘導性核酸としては、例えばsiRNA、miRNAなどがあげられるが、siRNAが好ましい。siRNAは、RNAiを誘導できる限り特に制限されないが、例えば19〜27塩基長、好ましくは21〜25塩基長である。
RNAi誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、RNA干渉(RNAi)効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはRNAである。RNAi効果とは、mRNAと同一の核酸配列またはその部分配列を含む2本鎖構造のRNAが、当該mRNAの発現を抑制する現象をいう。RNAi効果を得るには、例えば、少なくとも19の連続する標的mRNAと同一の核酸配列(またはその部分配列)を有する2本鎖構造のRNAを用いることが好ましい。2本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのRNAのステムループ構造によって与えられる2本鎖であってもよい。RNAi誘導性核酸としては、例えばsiRNA、miRNAなどがあげられるが、siRNAが好ましい。siRNAは、RNAiを誘導できる限り特に制限されないが、例えば19〜27塩基長、好ましくは21〜25塩基長である。
3.アプタマー
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性(または阻害活性)を有するポリヌクレオチドをいう。アプタマーは、RNA、DNA、修飾ヌクレオチドまたはそれらの混合物である。アプタマーはまた、直鎖状または環状の形態であってもよい。アプタマーの長さは特に限定されず、通常、約16〜約200個のヌクレオチドであるが、例えば約100個のヌクレオチド以下であり、好ましくは約50個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは約40個のヌクレオチド以下である。また、アプタマーの長さは、例えば約18個、約20個、約25個または約30個ヌクレオチド以上であってもよい。アプタマーは、結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基(例、リボース)が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位および/または4’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどがあげられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、O−アルキル化、O−アリル化、S−アルキル化、S−アリル化およびアミノ化があげられる(例、Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733−738;Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629−2635参照)。アプタマーはまた、プリン、ピリミジンが改変されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、8位プリン改変、環外アミンでの改変、4−チオウリジンでの置換、5−ブロモまたは5−ヨード−ウラシルでの置換があげられる。また、ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基が、チオエート、ジチオエートまたはアミデートで置換されていてもよい。アプタマーは、既報(例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818−822;Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505−510)に従って作製できる。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性(または阻害活性)を有するポリヌクレオチドをいう。アプタマーは、RNA、DNA、修飾ヌクレオチドまたはそれらの混合物である。アプタマーはまた、直鎖状または環状の形態であってもよい。アプタマーの長さは特に限定されず、通常、約16〜約200個のヌクレオチドであるが、例えば約100個のヌクレオチド以下であり、好ましくは約50個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは約40個のヌクレオチド以下である。また、アプタマーの長さは、例えば約18個、約20個、約25個または約30個ヌクレオチド以上であってもよい。アプタマーは、結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基(例、リボース)が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位および/または4’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどがあげられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、O−アルキル化、O−アリル化、S−アルキル化、S−アリル化およびアミノ化があげられる(例、Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733−738;Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629−2635参照)。アプタマーはまた、プリン、ピリミジンが改変されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、8位プリン改変、環外アミンでの改変、4−チオウリジンでの置換、5−ブロモまたは5−ヨード−ウラシルでの置換があげられる。また、ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基が、チオエート、ジチオエートまたはアミデートで置換されていてもよい。アプタマーは、既報(例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818−822;Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505−510)に従って作製できる。
4.抗体
抗体は、ポリクローナル抗体(抗血清)、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。モノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはIgGまたはIgMである。
抗体は、ポリクローナル抗体(抗血清)、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。モノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはIgGまたはIgMである。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原(必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる)を、市販のアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し(部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく)、最終免疫から約3〜10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物があげられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例えば、NS−1、P3X63Ag8など)を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
キメラ抗体は、その可変領域および定常領域が互いに異なる動物種のイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であるマウス/ヒトキメラモノクローナル抗体であり得る。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常領域である。
キメラ抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウス/ヒトキメラモノクローナル抗体は、既報(例、実験医学(臨時増刊号), Vol. 6, No.10, 1988および特公平3−73280号公報)に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするDNAから取得した活性なVH遺伝子(H鎖可変領域をコードする再配列されたVDJ遺伝子)の下流に、ヒトイムノグロブリンをコードするDNAから取得したCH遺伝子(H鎖定常領域をコードするC遺伝子)を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするDNAから取得した活性なVL遺伝子(L鎖可変領域をコードする再配列されたVJ遺伝子)の下流にヒトイムノグロブリンをコードするDNAから取得したCL遺伝子(L鎖定常領域をコードするC遺伝子)を、各々発現可能なように配列して1つまたは別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
ヒト化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクローナル抗体に由来し、その可変領域の枠組領域およびその定常領域がヒトイムノグロブリンに由来するヒト型モノクローナル抗体を意味する。超可変領域の相補性決定領域は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である3つの領域(Complementarity−determining region;CDR1、CDR2、CDR3)であり、可変領域の枠組領域は、該3つの相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された4つの領域(Framework;FR1、FR2、FR3、FR4)である。換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒト化抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換えヒト化抗体は、既報(例、特表平4−506458号公報および特開昭62−296890号公報)に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも1つのマウスH鎖CDR遺伝子と該マウスH鎖CDR遺伝子に対応する少なくとも1つのマウスL鎖CDR遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスH鎖CDRに対応するヒトH鎖CDR以外の全領域をコードするヒトH鎖遺伝子と、マウスL鎖CDRに対応するヒトL鎖CDR以外の全領域をコードするヒトL鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスH鎖CDR遺伝子と該ヒトH鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスL鎖CDR遺伝子と該ヒトL鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう1つの発現ベクターに導入する。または、該マウスH鎖CDR遺伝子/ヒトH鎖遺伝子とマウスL鎖CDR遺伝子/ヒトL鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト化抗体産生細胞を得、該細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト化抗体を得ることができる。
ヒト抗体は、イムノグロブリンを構成するH鎖およびL鎖の可変領域および定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体を意味する。
ヒト抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ヒト抗体は、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Nature Genetics, Vol.15, p.146−156, 1997;Nature Genetics, Vol.7, p.13−21, 1994;特表平4−504365号公報;国際出願公開WO94/25585号公報;Nature, Vol.368, p.856−859, 1994;および特表平6−500233号公報)に従って作製できる。
抗体はまた、前述の抗体(例、モノクローナル抗体)の一部であり得る。このような抗体としては、例えば、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv等のフラグメント、scFv、scFv−Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
前記抗体は、種々の抗癌物質などを常法により結合したイムノコンジュゲートの形態であってもよい。この場合、抗体は、LSCに抗癌剤を送達するための薬物送達システムとして機能する。組み合わせる抗癌物質としては、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、メルファラン、カルムスリン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、シタラビン(AraC)、メルカプトプリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、チオグアニン、アザシチジン、アムサクリン、ドキソルビシン、トレチノイン、アロプリノール、プレドニゾン(プレドニゾロン)、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン(アクチノマイシン)、マイトマイシンC、タキソール、L−アスパラギナーゼ、エトポシド、コルヒチン、デフェロキサミンメシレート、カンプトテシンなどがあげられるが、これに限定されるものではない。さらに、放射線核種、毒素等とのイムノコンジュゲートであってもよい。
本発明の剤は、白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどがあげられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
非経口的な投与(例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤があげられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式(例、経口、非経口)、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.001mg〜約5.0gである。
本発明の剤の投与対象としては造血組織(骨髄)を有し、急性骨髄性白血病に羅患する可能性がある動物種であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
(製造方法)
また、本発明は、急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、
a)当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
b)採取した試料と、少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む。すなわち、本発明は、自家移植または同種移植用の造血細胞を含む試料から白血病幹細胞を実質的に除去し、再発の懸念のない移植用試料を提供することができる。
また、本発明は、急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、
a)当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
b)採取した試料と、少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む。すなわち、本発明は、自家移植または同種移植用の造血細胞を含む試料から白血病幹細胞を実質的に除去し、再発の懸念のない移植用試料を提供することができる。
白血病幹細胞マーカー遺伝子は、前述の通りであるが、パージング目的のためには、下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカー遺伝子を標的とすることが好ましい。
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカー遺伝子を標的とすることが好ましい。
a)急性骨髄性白血病患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程
試料は、通常、骨髄穿刺または末梢血採取により行われる。骨髄穿刺は、例えば、S. E. Haynesworth et al. Bone, 13, 81 (1992)に記載された方法等に基づき胸骨または腸骨から骨髄穿刺を行う。具体的には、骨髄穿刺を行う場所の皮膚面を消毒し、局所麻酔を行う。特に骨膜下を充分に麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、5000単位のヘパリンを入れた10mL注射器を装着して必要量の骨髄液を速やかに吸引する。平均的には10 mL〜20 mLの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、10分間程圧迫止血する。取得した骨髄液を1,000×gの遠心分離により骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をPBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄する。洗浄工程を数回繰り返した後、造血細胞を含む試料を得ることができる。
試料は、通常、骨髄穿刺または末梢血採取により行われる。骨髄穿刺は、例えば、S. E. Haynesworth et al. Bone, 13, 81 (1992)に記載された方法等に基づき胸骨または腸骨から骨髄穿刺を行う。具体的には、骨髄穿刺を行う場所の皮膚面を消毒し、局所麻酔を行う。特に骨膜下を充分に麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、5000単位のヘパリンを入れた10mL注射器を装着して必要量の骨髄液を速やかに吸引する。平均的には10 mL〜20 mLの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、10分間程圧迫止血する。取得した骨髄液を1,000×gの遠心分離により骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をPBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄する。洗浄工程を数回繰り返した後、造血細胞を含む試料を得ることができる。
末梢血の場合は、静脈から採取を行う。具体的には、末梢血採取を行う場所の皮膚面を消毒する。注射針の内筒を抜き、5000単位のヘパリンを入れた10mL注射器を装着して必要量の末梢血を速やかに吸引する。平均的には10mL〜20mLの末梢血を吸引する。注射針を取り外し、10分間程圧迫止血する。取得した末梢血を1,000×gの遠心分離により末梢血細胞を回収した後、該末梢血細胞をPBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄する。洗浄工程を数回繰り返した後、造血細胞を含む試料を得ることができる。
b)採取した試料と、少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程
本工程で用いるマーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質は、前述した抗体があげられ、特に、ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカーに対する抗体が好ましい。抗体は蛍光標識されていることが好ましく、標識に用いる蛍光色素はフローサイトメトリーに一般的に用いられている蛍光物質であることが好ましい。蛍光色素の具体例としては、FITC(フルオレッセインイソチオシアネート)、PE(フィコエリトリン)、PerCP(ペリジニンクロロフィルタンパク質)、PerCP−Cy5.5、PE−Cy5、PE−Cy7、PE−TR(PE−テキサスレッド)、APC(アロフィコシアニン)およびAPC−Cy7などがあげられる。接触は、前記細胞表面マーカー(抗原)と抗体との結合が達成される条件であれば特に限定されない。
本工程で用いるマーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質は、前述した抗体があげられ、特に、ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカーに対する抗体が好ましい。抗体は蛍光標識されていることが好ましく、標識に用いる蛍光色素はフローサイトメトリーに一般的に用いられている蛍光物質であることが好ましい。蛍光色素の具体例としては、FITC(フルオレッセインイソチオシアネート)、PE(フィコエリトリン)、PerCP(ペリジニンクロロフィルタンパク質)、PerCP−Cy5.5、PE−Cy5、PE−Cy7、PE−TR(PE−テキサスレッド)、APC(アロフィコシアニン)およびAPC−Cy7などがあげられる。接触は、前記細胞表面マーカー(抗原)と抗体との結合が達成される条件であれば特に限定されない。
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程
本工程において、細胞の選別は、フローサイトメトリーと組み合わせることで容易に達成することができる。蛍光標識した抗体と接触させた試料をフローサイトメーターにセットし、抗体と結合した細胞を選別し、当該試料から白血病幹細胞を分離することができる。
本工程において、細胞の選別は、フローサイトメトリーと組み合わせることで容易に達成することができる。蛍光標識した抗体と接触させた試料をフローサイトメーターにセットし、抗体と結合した細胞を選別し、当該試料から白血病幹細胞を分離することができる。
このようにして得られたLSCがパージングされた試料は、LSCが効率的に除去され、HSCは除去されずに逆に濃縮されることによって、再発の懸念なくAMLの患者の治療に用いることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
ヒト試料
すべての実験は、理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センターのInstitutional Review Board for Human Researchからの承認により実施した。AML患者由来の白血病細胞は、書面によるインフォームドコンセントにより収集した。健常ドナー由来のCB(臍帯血)は、書面によるインフォームドコンセントとともにTokyo Cord Blood Bankにより収集した。健常ドナー由来のBMMNC(骨髄単核球細胞)は、Cambrex(Walkerville, MD)から入手した。AML患者由来のBMMNCおよびCBMNC(臍帯血単核球細胞)は、密度勾配遠心分離を使用して単離した。
すべての実験は、理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センターのInstitutional Review Board for Human Researchからの承認により実施した。AML患者由来の白血病細胞は、書面によるインフォームドコンセントにより収集した。健常ドナー由来のCB(臍帯血)は、書面によるインフォームドコンセントとともにTokyo Cord Blood Bankにより収集した。健常ドナー由来のBMMNC(骨髄単核球細胞)は、Cambrex(Walkerville, MD)から入手した。AML患者由来のBMMNCおよびCBMNC(臍帯血単核球細胞)は、密度勾配遠心分離を使用して単離した。
FACSおよびフローサイトメトリーによる解析
蛍光活性化セルソーティング(FACS)のため、AML患者のBMMNC細胞を、蛍光色素結合マウス抗hCD3、抗hCD4、抗hCD8、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体(BD Biosciences,San Jose, CA)で標識し、レシピエントBMMNC細胞を、マウス抗hCD45、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体(BD Biosciences)で標識し、FACSAria (BD Biosciences)を用いて細胞をソーティングした。FSC/SSC高さおよびFSC/SSC幅の分析によって、ダブレットを排除した。ソーティング後のhCD34+hCD38−およびhCD34+細胞の純度は、98%よりも高かった。フローサイトメトリー解析のため、AML患者のBMMNC、レシピエント末梢血またはレシピエントBMを、上述した蛍光色素結合マウス抗hCD3、抗hCD4、抗hCD8、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体またはマウス抗hCD45、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体で標識した。
蛍光活性化セルソーティング(FACS)のため、AML患者のBMMNC細胞を、蛍光色素結合マウス抗hCD3、抗hCD4、抗hCD8、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体(BD Biosciences,San Jose, CA)で標識し、レシピエントBMMNC細胞を、マウス抗hCD45、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体(BD Biosciences)で標識し、FACSAria (BD Biosciences)を用いて細胞をソーティングした。FSC/SSC高さおよびFSC/SSC幅の分析によって、ダブレットを排除した。ソーティング後のhCD34+hCD38−およびhCD34+細胞の純度は、98%よりも高かった。フローサイトメトリー解析のため、AML患者のBMMNC、レシピエント末梢血またはレシピエントBMを、上述した蛍光色素結合マウス抗hCD3、抗hCD4、抗hCD8、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体またはマウス抗hCD45、抗hCD34および抗hCD38モノクローナル抗体で標識した。
マイクロアレイ解析
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen)を用いて抽出し、Agilent Bioanalyzerを用いて当該RNAの完全性を評価した。Human Genome U133 plus 2.0ジーンチップ(Affymetrix)に対して、Two−Cycle Target Labelingキット(Affymetrix)を用いてビオチン化cRNAを合成した。Human Gene 1.0STジーンチップ(Affymetrix)に対して、第1ラウンドのcDNA合成およびcRNA増幅を、MessageAmp Premier RNA Amplificationキット(Applied Biosystems)を用いて行い、続く第2ラウンドのcDNA合成、ビオチン化および断片化を、WT cDNA合成およびTerminal Labelingキット(Affymetrix)を用いて行った。ハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびスキャニングを、製造業者の指示書に従って行った。まず、各プラットフォームについて、Bioconductorパッケージ(http://www.bioconductor.org/)を用いて、マイクロアレイデータを別々に解析した。マイクロアレイプラットフォーム上のプローブセットのシグナル強度を、GC−RMAプログラム(Zhijin et al., J. Am. Stat. Assoc., 99, 909−917, 2004)を用いて正規化した。各プラットフォームに対して、正規化したデータをRankProdプログラム(Hong et al., Bioinformatics, 22, 2825−2827, 2006)により解析し、カットオフp値0.01かつ擬陽性推定0.05%として、LSCとHSCとの間で示差的に発現した遺伝子を選択した。HSCに比べてLSCで有意に高いレベルの発現が両方のマイクロアレイプラットフォームで共通して観察された場合、当該遺伝子を顕著なLSCマーカーの遺伝子候補として選択した(図5、表1)。さらに、Human Gene 1.0STジーンチップにおいて高率にヒットした遺伝子IL2RAも、タンパク質レベルでの解析結果がよく、後述する抗癌剤抵抗性の幹細胞で発現しているという観点から、マーカー遺伝子候補として選択した(表1)。候補の局在および生物学的機能は、Ingenuity Pathway Analysisデータベース(Ingenuity Systems)およびジーンオントロジーアノテーションデータベース(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)の情報に基づいてアノテーションした。
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen)を用いて抽出し、Agilent Bioanalyzerを用いて当該RNAの完全性を評価した。Human Genome U133 plus 2.0ジーンチップ(Affymetrix)に対して、Two−Cycle Target Labelingキット(Affymetrix)を用いてビオチン化cRNAを合成した。Human Gene 1.0STジーンチップ(Affymetrix)に対して、第1ラウンドのcDNA合成およびcRNA増幅を、MessageAmp Premier RNA Amplificationキット(Applied Biosystems)を用いて行い、続く第2ラウンドのcDNA合成、ビオチン化および断片化を、WT cDNA合成およびTerminal Labelingキット(Affymetrix)を用いて行った。ハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびスキャニングを、製造業者の指示書に従って行った。まず、各プラットフォームについて、Bioconductorパッケージ(http://www.bioconductor.org/)を用いて、マイクロアレイデータを別々に解析した。マイクロアレイプラットフォーム上のプローブセットのシグナル強度を、GC−RMAプログラム(Zhijin et al., J. Am. Stat. Assoc., 99, 909−917, 2004)を用いて正規化した。各プラットフォームに対して、正規化したデータをRankProdプログラム(Hong et al., Bioinformatics, 22, 2825−2827, 2006)により解析し、カットオフp値0.01かつ擬陽性推定0.05%として、LSCとHSCとの間で示差的に発現した遺伝子を選択した。HSCに比べてLSCで有意に高いレベルの発現が両方のマイクロアレイプラットフォームで共通して観察された場合、当該遺伝子を顕著なLSCマーカーの遺伝子候補として選択した(図5、表1)。さらに、Human Gene 1.0STジーンチップにおいて高率にヒットした遺伝子IL2RAも、タンパク質レベルでの解析結果がよく、後述する抗癌剤抵抗性の幹細胞で発現しているという観点から、マーカー遺伝子候補として選択した(表1)。候補の局在および生物学的機能は、Ingenuity Pathway Analysisデータベース(Ingenuity Systems)およびジーンオントロジーアノテーションデータベース(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)の情報に基づいてアノテーションした。
定量PCR(qPCR)解析
HSCおよびLSCから10ngの全RNAを、WT−Ovation RNA増幅システム(Nugen)を用いるcDNA増幅に供した。cDNA産物をTEで1:7.5に希釈し、25μlのqPCR反応あたり1μlの希釈産物を使用した。二重標識した蛍光プローブおよび遺伝子特異的プライマー(Sigma−Aldrich)の配列を、表3に記載した。PCR反応は、LightCycler 480(Roche Applied Science)を使用して、Platinum Quantitative PCR SuperMix−UDG(Invitrogen)で行った。各転写物の存在量は、標準曲線法(Methods, 25, 386−401, 2001)により計算した。Kaleida Graphソフトウェアパッケージ中のKruskal−Wallis、Wilcoxon−Mann−Whitney、Student’s t−検定のいずれかがP<0.05を示した場合、LSCとHSCとの間で発現レベルが有意に異なるとみなした。
HSCおよびLSCから10ngの全RNAを、WT−Ovation RNA増幅システム(Nugen)を用いるcDNA増幅に供した。cDNA産物をTEで1:7.5に希釈し、25μlのqPCR反応あたり1μlの希釈産物を使用した。二重標識した蛍光プローブおよび遺伝子特異的プライマー(Sigma−Aldrich)の配列を、表3に記載した。PCR反応は、LightCycler 480(Roche Applied Science)を使用して、Platinum Quantitative PCR SuperMix−UDG(Invitrogen)で行った。各転写物の存在量は、標準曲線法(Methods, 25, 386−401, 2001)により計算した。Kaleida Graphソフトウェアパッケージ中のKruskal−Wallis、Wilcoxon−Mann−Whitney、Student’s t−検定のいずれかがP<0.05を示した場合、LSCとHSCとの間で発現レベルが有意に異なるとみなした。
動物
NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtmlWjl/Sz(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異をNOD.Cg−Prkdcscid(NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)で開発された(Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz−scid mice. J Immunol 154, 180−191 (1995))。マウスを、理研およびThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物および酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。
NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtmlWjl/Sz(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異をNOD.Cg−Prkdcscid(NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)で開発された(Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz−scid mice. J Immunol 154, 180−191 (1995))。マウスを、理研およびThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物および酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。
異種移植
新生仔(誕生後2日以内) NOD/SCID/IL2rgnullマウスに、137Cs源照射器を使用して、150cGyの全身照射を与え、その後2時間以内にAML細胞の静脈内注射を行なった。レシピエントは、3〜4週間毎に後眼窩から採血し、末梢血ヒトAML移植キメリズムを調べた。
新生仔(誕生後2日以内) NOD/SCID/IL2rgnullマウスに、137Cs源照射器を使用して、150cGyの全身照射を与え、その後2時間以内にAML細胞の静脈内注射を行なった。レシピエントは、3〜4週間毎に後眼窩から採血し、末梢血ヒトAML移植キメリズムを調べた。
免疫蛍光標識およびイメージング
原発AML移植レシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製した。標識に使用した一次抗体は、マウス抗ヒトCD45モノクローナル抗体(DAKO, Denmark)およびウサギ抗CD32モノクローナル抗体(Abcam, UK)であった。Zeiss LSM ExciterおよびLSM 710 (Carl Zeiss)を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た。
原発AML移植レシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製した。標識に使用した一次抗体は、マウス抗ヒトCD45モノクローナル抗体(DAKO, Denmark)およびウサギ抗CD32モノクローナル抗体(Abcam, UK)であった。Zeiss LSM ExciterおよびLSM 710 (Carl Zeiss)を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た。
免疫蛍光標識およびイメージング(2)
原発AMLを移植し、抗癌剤処置したレシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製し、DAPI(核染色:青);各マーカー(FCGR2A, AK5, DOK2, LRG1, BIK, IL2RA, WT1, SUCNR1:赤);静止細胞マーカー(緑:CD34(FCGR2A, AK5, DOK2, LRG1, BIK)またはKi67(IL2RA, WT1, SUCNR1)に対する抗体で標識した。Zeiss LSM ExciterおよびLSM 710 (Carl Zeiss)を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た(図7)。
原発AMLを移植し、抗癌剤処置したレシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製し、DAPI(核染色:青);各マーカー(FCGR2A, AK5, DOK2, LRG1, BIK, IL2RA, WT1, SUCNR1:赤);静止細胞マーカー(緑:CD34(FCGR2A, AK5, DOK2, LRG1, BIK)またはKi67(IL2RA, WT1, SUCNR1)に対する抗体で標識した。Zeiss LSM ExciterおよびLSM 710 (Carl Zeiss)を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た(図7)。
表2:正常CD34+CD38−HSCsよりもAML CD34+CD38−LSCsで転写物が大量に発現している遺伝子のリスト
表3:qRT−PCRで用いたプライマー、プローブおよびPCR産物のリスト
マイクロアレイ実験で同定された217遺伝子の中から、次なるqPCR解析のため、以下のカテゴリー中の分子をコードする121遺伝子を選択した:
1)細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
2)サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写制御分子、および/またはシグナル伝達分子、ならびに
3)免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および/または細胞接着に関与するもの。
1)細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
2)サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写制御分子、および/またはシグナル伝達分子、ならびに
3)免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および/または細胞接着に関与するもの。
リストは57遺伝子を含み、当該遺伝子のmRNAレベルは、HSCよりもLSCにおいて有意に(P<0.05 ;Kruskal−Wallis、Wilcoxon−Mann−WhitneyまたはStudent’s t−検定による)高かった。表2中の左欄から順に、Entrez Gene ID(Column A)、HUGO Gene Symbol(Column B)、局在(Column C)、分子の機能(Column D)、生物学的プロセス(Column E)、各統計学的検定のP−value(Columns F−H)、mRNAレベルのメジアン値の比(Column I)およびHSC試料のmRNAレベルよりも高い発現レベルを示すLSC試料の数(Column J)を示す。
本発明者らは、以前、AML患者起源の骨髄(BM)由来のLSCおよびAML患者BMを移植したマウスのBM由来のLSCが類似した転写プロファイルを共有することを報告した(Nature Biotechnology, 2007、上述)。この知見に基づき、本発明者らは、2つのアレイプラットフォーム:Human Genome U133 plus 2.0 GeneChips(16名のAML患者由来および5つのAML移植マウス由来のBMを2名の健常ドナー由来のBMおよび5名の健常ドナー由来の臍帯血(CB)と比較)およびHuman Gene 1.0ST GeneChips(1名のAML患者由来BMおよび5つのAML移植マウス由来のBMを健常ドナー1名のCBおよび4名のBMと比較)を用いて、LSCと正常造血幹細胞(HSC)とを比較する網羅的トランスクリプトーム解析を行った。以前の研究によりAML幹細胞が独占的にCD34+CD38−画分内に存在することが見出されていたので、>1.2x104個のCD34+CD38−細胞を>98%の純度で回収した(図1)。また、同様の方法で、正常BMおよびCB試料からCD34+CD38−HSCも精製した(図1)。新生NOD/SCID/IL2rgKOマウスに前記精製したHSCおよびLSCを静脈内注射することにより、LSCによるAMLの発症および正常免疫再構成の欠如を確認し、HSCによる長期移植および多系統(T/B/骨髄)分化を確認した(図1)。AML移植マウスに由来するCD34+CD38+細胞またはCD34−細胞ではなく、CD34+CD38−骨髄細胞が、二次レシピエントにおいて白血病を引き起こした。これらのデータは、移植したCD34+CD38−細胞はHSCによって混入したのではなくLSCの性質を保持していることを示唆する。得られた発現データセットを解析するため、Bioconductorパッケージに実装されたRankProd(Bioinformatics 22, 2825, 2006)を用いて、両方のマイクロアレイプラットフォームでHSCよりもLSCにおいて有意に高い(p値<0.01、擬陽性のパーセント<0.05)アレイシグナルを示す遺伝子を抽出した。全部で217遺伝子候補がこの基準に適合し(図5、表1)、さらにIL2Rを追加し、218遺伝子候補とした。
次に、LSCとHSCとを分離する候補の発現レベルを実証するため、5名のAML患者起源のBM由来のLSCおよび4名のBM由来のHSCを用いて、各候補遺伝子について定量PCR(qPCR)を行った(表3)。同定した217遺伝子の中から、医薬の開発に最も適する候補として、以下のカテゴリーの中の分子をコードする121遺伝子を選んでその後の解析を行った。前記カテゴリーは、以下の3つである:
1)細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
2)サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写調節分子、および/またはシグナル伝達分子、ならびに
3)免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および/または細胞接着に関与するもの。
1)細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
2)サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写調節分子、および/またはシグナル伝達分子、ならびに
3)免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および/または細胞接着に関与するもの。
表2に示すように、121遺伝子のうちの57遺伝子に関するmRNA含量はHSCに比べてLSCにおいて統計学的に高かった。前記57遺伝子のうち、35遺伝子を優れたLSCマーカーとして同定した。その理由は、1)LSCにおいて、それらの遺伝子のメジアン発現レベルが5倍よりも高かったこと、および2)試験したすべてのLSC試料において、それらのmRNA含量が試験した各HSC集団のものよりも高かったことである(図2)。
これらのLSC特異的候補分子の発現をタンパク質レベルで確認するために、35候補分子のそれぞれに対する利用可能なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の品質を検証し、有効性を確認した抗体および32のAML患者試料を用いてフローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリー解析を通じて、各候補分子における以下の側面を調べた:1)局在(細胞表面または細胞内)、2)陽性細胞の頻度および3)発現強度。このように評価した57の候補分子の中から、FCGR2A(CD32)、ITGB2(CD18)、CD93、CD33、CD3DおよびTNF(TNFa)がLSC特異的マーカー/標的として最も有望な発現レベル/パターンを有していることを見出した。特に、FCGR2A(CD32)発現は、試験したAML症例の有意な割合でLSCとの強い相関を示し、さらなる機能解析のために選択した。試験した32のAML症例のうちの9つの症例で、AML幹細胞の大多数(>80%)がこの抗原を発現する(図3)。CD32発現が機能と排他的に相関することを確認するため、AMLの3症例由来の精製LSCを用いて、インビボNOD/SCID/IL2rgKO移植アッセイを行った。精製したCD34+CD38−CD32+およびCD34+CD38−CD32−細胞を亜致死的に照射したレシピエントに移植した場合、CD32+画分からAMLが独占的に発症した(図4)。LSCを標的とするいかなる治療も非LSC AML細胞を除去するのに有効な慣用の化学療法剤ともに最良に使用されると考えられるので、化学療法後でも標的分子が連続して発現されることを確認することが重要である。したがって、本発明者らは、CD32の発現が化学療法後に維持されるかどうかを調べ、AraC処置後のAML移植マウスのBM、脾臓および末梢血(PB)のCD32の発現を確認した(図6)。また、CD32発現細胞は、免疫蛍光標識により、骨髄の骨髄膜領域および中央領域内の両方に見出された(図4)。本知見は、化学療法耐性LSCがBM骨芽細胞ニッチ内に存在するという本発明者らの以前の報告に照らし合わせて、LSC標的療法の候補としてCD32をさらに支持する(Ishikawa F. et al. Nature Biotechnol 25:1315−1321, 2007およびPCT/JP2008/068892)。
次に、正常ヒトHSC中のCD32の発現を評価した。原始ヒトCB CD34+CD38−集団内で、CD32+細胞の頻度は、9.8% +/− SDであった(図4A)。本画分内のCD133の発現を解析したとき、CD34+CD38−CD133−画分内にCD32+細胞を独占的に検出した(図4a)。異種移植アッセイにより、CD34+CD38−CD32+画分ではなくCD34+CD38−CD133+CD32−画分がHSCを含むことを見出した(図4B)。さらに、インビトロコロニー形成細胞(CFC)アッセイにより、CD34+CD38−CD32+細胞ではなくCD34+CD38−CD32−細胞が骨髄系および赤血球系造血コロニーを生じる能力を有することが示唆された。CD32+正常HSCにおけるインビボ長期免疫造血再構成能の欠如は、CD32発現細胞を標的とする治療剤がHSCに危害を与えず、正常な造血および免疫系に関する重大な副作用の回避を助長する可能性を示唆する。
LSCがCD32を発現しないAML患者試料において、本発明者らは、新生NOD/SCID/IL2rgKOマウス移植アッセイにより、CD34+CD38−細胞がLSC機能を保有することを最初に確認し(図1)、次に、フローサイトメトリーによりITGB2(CD18)、CD93、(その他に、CD25、CD132、OX41、CD97)、CD33、CD3DおよびTNFαの発現を調べた。抗原CD32、ITGB2、CD93、97および33の併用は、47症例の中の31症例において正常HSCからLSCを良好に分離することが可能である。
2つのセットのマイクロアレイおよび定量PCRにより同定されたLSC特異的遺伝子リスト(表2)は、骨髄後代で優先的に発現される遺伝子を含むが、HSCでは発現が限定されている。例えば、FCGR2A、HCKおよびNCF4は成熟骨髄細胞で高度に発現し、免疫複合体の食作用およびその後のスーパーオキシド産生に関与する(Prot Natl Acad Sci USA, 97, 1725;2000;J Exp Med 191, 669, 2000;Nat Cell Biol, 3, 679, 2001;J Biol Chem 279, 1415, 2004)。他方、CD3複合体の構成成分であるCD3Dは、成熟Tリンパ球において、そのITAMモチーフを介するT細胞受容体シグナルを伝達する。したがって、AMLの少なくとも一定の割合は幹細胞ステージで分化の異常調節を介して発症する可能性がある。
リストの別の特徴は、癌細胞および白血病細胞で顕著に発現された遺伝子の関与である。例えば、CD33はAML細胞のよく認識された免疫学的マーカーであり、ゲムツズマブ オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin)等の抗体医薬の標的である(Leukemia 19: 176, 2005)。さらに、CD97はリンパ管内に浸潤する結腸直腸癌に蓄積されることが報告されている(Am J Pathol 161, 1657, 2002)。LSCにおけるこれらの分子の過剰発現は、これらの分子を標的にする治療法がLSCばかりでなく成熟AML細胞にも有効であるかもしれない。BIK、HOMER3、WT1(Genes Chromosomes Cancer 47, 8−20, 2008)およびCLEC12A (encoding CLL−1)(Blood 110, 2659−2666, 2007)などの遺伝子産物はLSC/AMLブラスト(blasts)に対するマーカー分子として提案されてきたことに注目すべきであり、このことは、本発明の知見が既報と一致することを示している。
発現レベル/パターンの解析により、候補遺伝子が以下のセットに分類された:
1)RNAおよびタンパク質レベルでLSCの有意な割合で発現するが、HSCの少ない割合でしか発現しない(または無発現)分子をコードする遺伝子群、ならびに
2)LSCおよびHSCにおいてタンパク質レベルで発現するが、フローサイトメトリーによる発現強度がHSCからLSCの分離を可能にする遺伝子群。
1)RNAおよびタンパク質レベルでLSCの有意な割合で発現するが、HSCの少ない割合でしか発現しない(または無発現)分子をコードする遺伝子群、ならびに
2)LSCおよびHSCにおいてタンパク質レベルで発現するが、フローサイトメトリーによる発現強度がHSCからLSCの分離を可能にする遺伝子群。
遺伝子セット1は、LSCを特異的に標的化し、HSCに危害を加えない、例えば、正常HSCに前記候補が欠如していることに基づく抗体医薬などの治療剤の開発にとって有力な候補を含む。遺伝子セット2に含まれる遺伝子(最も有望な候補としてCD33)は、自家造血幹細胞移植の背景で、HSCからLSCを分離するLSCのエクスビボパージング等での適用に有力な利用可能性をもつバイオマーカーをコードする。
図7では、各マーカー(FCGR2A,AK5,DOK2,LRG1,BIK,IL2RA,WT1及びSUCNR1)に対する抗体と静止細胞特異的マーカーを用いて、場所と細胞周期をイメージングにて同定することで、抗がん剤抵抗性を示す幹細胞の存在する骨内膜(ニッチ)にこれらの分子が多く存在すること、さらに、細胞周期の静止期にある白血病幹細胞に発現していることが判明した。したがって、これらの各マーカー分子を標的とすることが、白血病の再発克服に大きく貢献すると考えられる。
尚、WT1は、白血病をはじめ、多くの腫瘍にて発現が確認されている。しかし、この分子が再発や抗がん剤抵抗性を示す幹細胞レベルに発現しているかどうかについては、知られていなかった。本発明者らは、細胞周期が静止した、ニッチに存在する白血病幹細胞に発現することを見出したことから、これまでの化学療法や放射線治療では死滅させることができなかった白血病幹細胞を殺すための標的分子として意義があることを示している。
尚、WT1は、白血病をはじめ、多くの腫瘍にて発現が確認されている。しかし、この分子が再発や抗がん剤抵抗性を示す幹細胞レベルに発現しているかどうかについては、知られていなかった。本発明者らは、細胞周期が静止した、ニッチに存在する白血病幹細胞に発現することを見出したことから、これまでの化学療法や放射線治療では死滅させることができなかった白血病幹細胞を殺すための標的分子として意義があることを示している。
また、47名の様々なステージのAMLの症例から末梢血を採取して造血細胞を含む試料を調製し、試料中に含まれる白血病幹細胞でのFCGR2A(CD32a),FCGR2B(CD32b),IL2RA(CD25),ITGB2(CD18)およびCD93の陽性率を調べた。結果を表4に示す。
表4より、FCGR2A(CD32a),IL2RA(CD25),ITGB2(CD18)およびCD93の4種類のマーカーを組み合わせることにより、高率に白血病幹細胞を識別でき、これら4種類の遺伝子を標的とする医薬を組み合わせることにより、60%を超える白血病細胞が駆逐できることが示された。
本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを分子標的とすることにより、AMLの発症源または再発源であるLSCに特異的に作用する治療剤を提供することができる。本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標としてFACS等の細胞選別装置を用いて、患者またはドナーの骨髄細胞からLSCを特異的に除去することができる。これにより、自家または同種骨髄移植の際のパージングの効率が高くなり、急性骨髄性白血病の再発または初発を有意に防止することができる。さらに、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標として、採取した生体試料中または生体内でLSCの存否を測定することができ、これにより急性骨髄性白血病の再発または初発を予測することもできる。
本出願は、日本で出願された特願2009−072400(出願日:平成21年3月24日)を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。
Claims (12)
- 急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法であって、
(1)被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
(2)測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
を含み、当該白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる群より選ばれる2〜218の遺伝子であり、被験者における2以上の白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現が基準値に比べて有意に高い場合、採取した生体試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される、試験方法。 - 白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる2〜58の遺伝子である、請求項1に記載の試験方法。 - 下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤。 - 白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR34、GPR84、HCST、HGF、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MGAT4A、P2RY5、PRSS21、PTH2R、RNASE2、SLC43A3、SUCNR1、TIMP1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;ZWINT、NEK6およびTXNL4Bからなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、ARHGAP18、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCD、RAB20、RAB8AおよびRABIFからなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1およびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびにCYBB、CTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、請求項3に記載の治療剤。 - 白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ALOX5AP、CACNB4、CCL5、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCGR2A、GPR84、HCST、HOMER3、ITGB2、LGALS1、LRG1、PTH2R、RNASE2、TNF、TNFSF13B、TYROBPおよびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;NEK6からなる細胞周期関連遺伝子;BIKからなるアポトーシス関連遺伝子;AK5、FYB、HCK、LPXN、PDE9A、PDK1、PRKCDおよびRAB20からなるシグナル伝達関連遺伝子;WT1からなる転写因子遺伝子;ならびにCTSCおよびNCF4からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、請求項3に記載の治療剤。 - 白血病幹細胞マーカー遺伝子が、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の幹細胞に発現するマーカーであって、AK5、BIK、DOK2、FCGR2A、IL2RA、LRG1、SUCNR1およびWT1からなる群より選ばれる、請求項3に記載の治療剤。
- 遺伝子の発現を抑制し得る物質がアンチセンス核酸またはRNAi誘導性核酸である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の治療剤。
- 翻訳産物の活性を抑制し得る物質がアプタマーまたは抗体である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の治療剤。
- 抗体が抗体と抗癌物質とのイムノコンジュゲートである、請求項8に記載の治療剤。
- 急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法であって、
a)当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
b)採取した試料と、下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
から選ばれる少なくとも1種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
c)前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む、製造方法。 - 白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ADFP、ALOX5AP、CACNB4、CD33、CD3D、CD93、CD97、CLEC12A、DOK2、FCER1G、FCGR2A、GPR34、GPR84、HCST、HOMER3、IL2RA、IL2RG、IL3RA、ITGB2、LY86、P2RY5、PTH2R、SUCNR1、TNFRSF4、TYROBPおよびVNN1から選ばれる少なくとも1種の細胞表面マーカー遺伝子である、請求項10に記載の製造方法。 - 下記遺伝子群:
ADFP、ALOX5AP、AZU1、C3AR1、CACNB4、CALCRL、CCL4、CCL5、CD33、CD36、CD3D、CD86、CD9、CD93、CD96、CD97、CFD、CHI3L1、CLEC12A、CLECL1、COCH、CST7、CXCL1、DOK2、EMR2、FCER1G、FCGR2A、FUCA2、GPR109B、GPR160、GPR34、GPR84、HAVCR2、HBEGF、HCST、HGF、HLA−DOB、HOMER3、IFI30、IL13RA1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、INHBA、ITGB2、LGALS1、LRG1、LY86、MAMDC2、MGAT4A、P2RY14、P2RY5、PLAUR、PPBP、PRG2、PRSS21、PTH2R、PTX3、REEP5、RNASE2、RXFP1、SLC31A2、SLC43A3、SLC6A6、SLC7A6、STX7、SUCNR1、TACSTD2、TIMP1、TM4SF1、TM9SF1、TNF、TNFRSF4、TNFSF13B、TYROBP、UTS2およびVNN1からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子;
AURKA、C13orf34、CCNA1、DSCC1、FAM33A、HPGD、NEK6、PYHIN1、RASSF4、TXNL4BおよびZWINTからなる細胞周期関連遺伝子;
MPO、IER3、BIK、TXNDC1、GADD45BおよびNAIPからなるアポトーシス関連遺伝子;
AK5、ARHGAP18、ARRB1、DUSP6、FYB、HCK、LPXN、MS4A3、PAK1IP1、PDE9A、PDK1、PRKAR1A、PRKCD、PXK、RAB20、RAB8A、RABIF、RASGRP3、RGS18およびS100A11からなるシグナル伝達関連遺伝子;
WT1、MYCおよびHLXからなる転写因子遺伝子;ならびに
ACTR2、ALOX5、ANXA2P2、ATL3、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1D、C12orf5、C17orf60、C18orf19、C1GALT1C1、C1orf135、C1orf163、C1orf186、C6orf150、CALML4、CCT5、CLC、COMMD8、COTL1、COX17、CRIP1、CSTA、CTSA、CTSC、CTSG、CYBB、CYP2E1、DENND3、DHRS3、DLAT、DLEU2、DPH3、EFHD2、ENC1、EXOSC3、FAM107B、FAM129A、FAM38B、FBXO22、FLJ14213、FNDC3B、GNPDA1、GRPEL1、GTSF1、HIG2、HN1、HVCN1、IDH1、IDH3A、IKIP、KIF2C、KYNU、LCMT2、ME1、MIRN21、MKKS、MNDA、MTHFD2、MYO1B、MYO1F、NAGA、NCF2、NCF4、NDUFAF1、NP、NRIP3、OBFC2A、PARP8、PDLIM1、PDSS1、PGM2、PIGK、PIWIL4、PPCDC、PPIF、PRAME、PUS7、RPP40、RRM2、S100A16、S100A8、S100P、S100Z、SAMHD1、SH2D1A、SPCS2、SPPL2A、TESC、THEX1、TMEM30A、TMEM33、TRIP13、TUBB6、UBASH3B、UGCG、VSTM1、WDR4、WIT1、WSB2およびZNF253からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質の有効量を対象に投与することを含む、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の予防または治療方法。
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