JPWO2010032698A1 - 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 - Google Patents
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Abstract
Description
但しいずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。
また、安価な糖原料であるスクロースから高選択的にD−乳酸を生産する大腸菌も知られている(Biotechnolohy Letters,Vol.27,pp.1891−1896(2005)参照)。しかし、スクロースからD−乳酸を生産する大腸菌は生産性が低く、また、スクロースの資化に非常に時間がかかり、工業化において課題となっていた。
L−乳酸については、グルコースを原料としてL−乳酸を高い選択性で高生産する大腸菌は知られているものの(特開2007−49993号公報)、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌はなかった。
[2] 前記スクロース非PTS遺伝子群の中で、スクロース加水分解酵素遺伝子のみを有し、且つ遺伝子組み換えによる乳酸生産強化系を備えている[1]記載の乳酸生産大腸菌。
[3] 前記乳酸生産大腸菌が、フルクトースの代謝能力向上系を更に有する[1]又は[2]記載の乳酸生産大腸菌。
[4] 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む[1]〜[3]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[5] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[6] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[7] 前記乳酸生産強化系が、L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[8] 前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化またはフルクトース取り込み能力の強化である[3]〜[7]のいずれかにに記載の乳酸生産大腸菌。
[9] 前記フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化が、フルクトース−1−リン酸キナーゼ活性に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[10] 前記フルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化が、該大腸菌が本来有しているFruR活性の不活化あるいは低減化に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[11] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する[1]〜[10]のいずれかにに記載の乳酸生産大腸菌。
[12] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリO157細菌由来の蛋白質である[1]〜[10]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[13] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する[9]〜[12]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[14] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリMG1655由来の蛋白質である[9]〜[12]のいずれかにに記載の乳酸生産大腸菌。
[15] 大腸菌K12由来株である[1]〜[14]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[16] [1]〜[15]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。
本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法である。
本発明は、スクロース非PTS遺伝子群を全てではなく不完全な状態で、即ち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子を、乳酸生産大腸菌に導入することによって、スクロース由来フルクトースが高効率に資化されること、更には従来よりも著しく生産性が高まることを見出したものである。この結果、植物に由来し、安価で工業的に価値の高いスクロースから、効率よく短時間で乳酸を得ることができる。
一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。また、糖代謝は生物にとって基本的な機能である。このため、フルクトース代謝経路のリン酸化活性又はフルクトース取り込み能力を強化することで、細菌の生育が阻害されず、またグルコースによる代謝抑制(カタボライトリプレッション)の影響を受けずに、効率よく乳酸の生産を行うことができたことは、驚くべきことである。
なかでも、乳酸を更に効率よく生産するという観点から、cscAをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
この酵素は、K12株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送体、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非PTS代謝経路の酵素の1つである(Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照)。本発明においてこのCscAを付与することにより、特にcscAのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースを細胞膜上でグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースPTS及びフルクトースPTSを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。
本発明におけるフルクトースの代謝能力が向上しているとは、フルクトースの菌体内への取り込みが増加している状態を指す。フルクトースの代謝能力向上系とは、フルクトースの代謝能力を向上させるための構造を意味する。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明の乳酸生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書中で示された数値範囲は、記載された数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
なお、本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
本発明における「低減化」とは、当該酵素又は転写因子であるFruRをコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素又はFruRの活性が低下している状態を指す。ここでいうFruRの活性とは、FruRによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。
本発明において乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強とは、LdhA又はLdh2をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意にLdhA又はLdh2をコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状態を指す。
本発明におけるDld活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはPfl活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはLdhA活性が増強されていることを特徴とする微生物として、WO2005/033324号に記載のエシェリヒア・コリMT−10994(FERM BP−10058)株が例示できる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
エシェリヒア・コリMT−10994株は、ldhA遺伝子をゲノム上においてGAPDHプロモーターと機能的に連結することで発現させており、また遺伝子破壊によりPflB、Dldが不活化している。該菌株は、FERM BP−10058の寄託番号で、茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成16年3月19日より寄託されている。
本発明におけるフルクトース取り込み能力の強化とは、FruRが制御する酵素活性が、FruRをコードする遺伝子の遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意に当該酵素活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。
また各種遺伝子を不活性化させるための手段としては、この目的で通常用いられる手段であれば特に制限されずに用いることができ、例えば相同組換え等による遺伝子破壊を挙げることができる。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。
<エシェリヒア・コリMG1655株dld遺伝子欠失株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのFAD依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下dldと略すことがある)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M10038)。
なおエシェリヒア・コリMG1655株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
実施例1で得られたプラスミドpTHΔdldをMG1655株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
<エシェリヒア・コリMG1655pflB、dld遺伝子欠失株作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子(pflB)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X08035)。pflB遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、GCACGAAAGCTTTGATTACG(配列番号5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(配列番号6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(配列番号7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(配列番号8)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
得られたクローンから、実施例2と同様の方法に従ってpfl遺伝子が破壊されたMG1655Δdld株を得、MG1655ΔpflΔdld株と命名した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdh株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M24777)。mdh遺伝子(939bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(配列番号9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(配列番号10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(配列番号11)及びAAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(配列番号12)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのaspA遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X04066)。aspA遺伝子(1,482bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(配列番号13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(配列番号14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(配列番号15)及びTTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(配列番号16)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株のゲノム上ldhAプロモーターのGAPDHプロモーターへの置換>
エシェリヒア・コリのldhA遺伝子の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number U36928)。グリセルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてAACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(配列番号17)、及びACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号18)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにD−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ldhA)を取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてGGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(配列番号19)、及びCCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(配列番号20)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで約1.0kbpのD−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)遺伝子フラグメントを得た。上記の2つのDNAフラグメントとプラスミドpUC18を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−ldhAを回収した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655のfruR遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、fruR遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の88028〜89032に記載されている。
<エシェリヒア・コリO157由来スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリO157のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子(cscA)はGenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383〜3275816に記載されている。上記遺伝子がコードする蛋白質のN末端側には、アミノ酸一文字表記でMTQSRLHAA(配列番号35)で表記される、疎水性が高くシグナルペプチダーゼで切断されるアミノ酸配列と同様な配列が存在する。上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
また実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株を得た。
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリMG1655由来フルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリMG1655のフルクトース−1−リン酸キナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、フルクトース−1−リン酸キナーゼをコードする遺伝子(fruK)はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2260387〜2259449に記載されている。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株によるD−乳酸生産>
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)25mlを入れた500ml容バッフル付三角フラスコ3本に、実施例8で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株(以下、「fruR破壊株」又は「ΔfruR株」)、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株(以下、「cscA株」)、実施例9で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株(以下、「fruK強化株」又は「+fruK株」)を各々植菌し、一晩35℃、120rpmで攪拌培養を行った。その後、3台の1L容培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に、表1に示す培地475gを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。
カラム:ULTRON PS−80H(信和化工社製)
溶離液:過塩素酸水溶液(pH2.1)
流速:1.0mL/min
検出器:UV検出器
測定波長:280nm
このとき、全ての株において培養開始時に投入されたスクロースは完全になくなっていた。また、fruK遺伝子を導入またはfruR遺伝子を破壊することによって、スクロースの分解によって得られるフルクトースが、遺伝子の導入または破壊のない株に比べて早く資化されることが明らかとなった。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株によるD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株のD−乳酸生産を調べた。本菌株は、導入したプラスミドにcscA遺伝子が含まれていないだけで、基本的にMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株と同等である。培地組成も実施例10と同じであるが、スクロースはフィルターろ過滅菌をして用いた。48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、0g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトースの濃度も0g/Lだった。
この結果より、cscA遺伝子を欠失するとスクロースを資化して乳酸を生産できないことが確認された。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株による廃糖蜜からのD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株の廃糖蜜からのD−乳酸生産を調べた。
下記の表3に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様の前培養したフラスコ内容物全量(25ml)を植菌した。
48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、96.47g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトース、スクロースの濃度は0g/Lだった。
この結果より、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料として乳酸を生産できることが確認された。
<ビフィドバクテリウム由来ldh2遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株の構築>
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)のL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
<MG1655Δpfl/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例10と同様に、実施例12で得られたMG1655Δpfl/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
下記の表4に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様に前培養したフラスコ内容物25mlを植菌した。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、97.02g/Lだった。
この結果より、ビフィドバクテリウム由来のL−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコースからL−乳酸を生産できることを確認した。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株の構築>
実施例12で作成したpGAP-ldh2プラスミドを実施例6で構築したD−乳酸生産株に導入した形質転換体を作成した。具体的には以下のように行った。
プラスミドpGAP-ldh2を実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株を得た。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例13と同様に、実施例14で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養温度35℃、pH7.5(24% NaOHで調整)で18時間行った。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、116.84g/Lだった。
この結果より、D−乳酸生産用大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてL−乳酸を生産できることを確認した。L−乳酸が生産されたことは、F−キット D−/L−乳酸(ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号1112821)に従い、L−乳酸量、及びD−乳酸量を測定することで確認した。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株の構築>
実施例6で用いたD−乳酸生産用大腸菌株(MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株)のldhA遺伝子をldh2遺伝子に置き換え、更にL−乳酸の分解を触媒する酵素の遺伝子lldDを破壊して、L−乳酸生産用大腸菌株を構築した。更にfruR遺伝子を破壊し、L−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株を構築した。具体的には、以下のようにして行った。
MG1655ゲノムDNAのldhA遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(配列番号21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(配列番号22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(配列番号38)及びAACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(配列番号39)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔldhAを構築した。更に、pTHΔldhAをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてldhA欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
大腸菌MG1655ゲノムDNAのdld遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、CAACACCAAGCTTTCGCG(配列番号40)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(配列番号41)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用い、大腸菌MG1655のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素HindIII、XbaIで切断した。さらにプラスミドpTH18cs1を制限酵素HindIII、XbaIで切断し、上記dld断片と混合した後、リガーゼで結合し、プラスミドpTHDLDを構築した。更に、pTHDLDをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてdld復帰株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
MG1655株ゲノムDNAのlldD遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(配列番号42)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(配列番号43)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(配列番号44)及びCGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(配列番号45)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔlldDを構築した。更に、pTHΔlldDをMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてlldD欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムのL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)を取得する為にビフィドバクテリウム・ロンガム(ATCC15707)のゲノムDNAをテンプレートに用いてAAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(配列番号46)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(配列番号47)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用いてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素EcoRI、及びXbaIで切断した。
得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
実施例7で作成したプラスミドpTHΔfruRをMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株に形質転換し、実施例2と同様の方法に従って、fruR遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株を取得した。本株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株とL−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株のそれぞれに、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターを導入し、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株に、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)及びフルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターを導入し、L−乳酸生産大腸菌fruK強化株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株によるL−乳酸生産>
MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の廃糖蜜からのL−乳酸生産を調べた。
24時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(cscA)が75.12g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(fruR破壊株)が83.79g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株(fruK強化株)が84.32g/Lだった。
これにより、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料としてL−乳酸を生産できることが確認された。また、乳酸生産大腸菌のfruR遺伝子を破壊することによりL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。更に、乳酸生産大腸菌のfruK遺伝子を強化することによってもL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、ザイモモナス菌由来グルコース輸送促進蛋白質(glf)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのGAPDH遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するため、CCAAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCCGAGCTCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (配列番号50)の塩基配列を有するプライマーを合成した。エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いて配列番号29との組み合わせによりPCR法でDNA断片を増幅した。配列番号29のプライマーはその5´末端側にNdeI認識部位を、配列番号50のプライマーはその5´末端側から順にHindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI認識部位を有している。得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIとHindIIIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のDNAフラグメントと、NdeI、HindIIIで消化した大腸菌用クローニングベクターpBR322(GenBank accession number J01749)を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをpGAPと命名した。
このプラスミドpGAP−cscA−glfを実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を得た。
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)3mlを入れた試験管に、上記記載のMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を植菌し、30℃、200rpmで9時間攪拌培養を行った。
その後、10gのCaCO3(純正化学1級)を予め加え滅菌した100mlバッフル付き三角フラスコ4本に表7に示す培地20mlそれぞれ加えたものに、前培養液を各々100マイクロリットル植菌し、35℃、90rpm、培養時間48時間で攪拌培養を行った。コントロールとして実施例10に記載のcscAMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株を用いて同様の培養を行い、培養終了後、実施例10に記載の方法により、得られた培養液中の乳酸濃度を定量した。
48時間後の培養液中のD−乳酸濃度は、cscAが48.9g/L、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株が9.3g/Lだった。
この結果より、cscAと同様に糖代謝系に関連する遺伝子であるグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)を利用して糖の取り込みを強化しても、乳酸生産性の向上効果はみられないことが分かった。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (16)
- スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース非PTS遺伝子群の中で、スクロース加水分解酵素遺伝子のみを有し、且つ遺伝子組み換えによる乳酸生産強化系を備えている請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産大腸菌が、フルクトースの代謝能力向上系を更に有する請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、
D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、
を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。 - 前記乳酸生産強化系が、
L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
該大腸菌が本来有しているD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、
を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。 - 前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化またはフルクトース取り込み能力の強化である請求項3記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化が、フルクトース−1−リン酸キナーゼ活性に由来する請求項8に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化が、該大腸菌が本来有しているFruR活性の不活化あるいは低減化に由来する請求項8に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリO157細菌由来の蛋白質である請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する請求項9記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリMG1655由来の蛋白質である請求項9に記載の乳酸生産大腸菌。
- 大腸菌K12由来株である請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 請求項1〜請求項15のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。
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