TWI486453B

TWI486453B - 乳酸生產細菌及乳酸生產方法

Info

Publication number: TWI486453B
Application number: TW098131189A
Authority: TW
Inventors: Mitsufumi Wada; Katsuyuki Takahashi; Takashi Morishige; Daisuke Miyazawa; Hitoshi Takahashi; Daisuke Mochizuki; Tadashi Araki
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2015-06-01
Also published as: CN102159702A; TW201016855A; CA2737428A1; JPWO2010032697A1; JP5210391B2; US20110171703A1; CN102159702B; EP2338979A4; US8614076B2; CA2737428C; BRPI0919219A2; WO2010032697A1; EP2338979A1

Description

乳酸生產細菌及乳酸生產方法

本發明係關於乳酸生產細菌及乳酸生產方法。

乳酸有L-乳酸及D-乳酸，L-乳酸為工業化生產的聚乳酸的原料，另一方面，關於D-乳酸，作為聚合物原料或農藥、醫藥的中間體，近年也逐漸受到重視。但，事實上，上述任一用途當中均為對作為原料的乳酸要求高光學純度。

自然界存在以良好效率生產乳酸的微生物，一部分乳酸製造法係使用此等微生物進行，但是也會生產副生物例如乙酸、乙醇、乙醯甲基甲醇、丙酮酸這些化合物，有時會與最終產物乳酸之品質降低有關。又，由於光學異構物之混入，造成光學純度降低，也成為重大問題。

為了避免如此種乳酸之純度降低，近年來，利用發展的基因重組技術將微生物之特定基因破壞，而專一性地妨礙目標副生物之生產的方法已有人開發。尤其，相較於應用乳酸菌或絲狀菌等原本能以高生產量生產乳酸之微生物，有人嘗試開發以基因體資訊豐富且作為基因重組寄主的實績充足的E.coli、酵母等生產高光學純度之乳酸生產技術。

例如，依照Biotechnol Lett.2006 Oct；28(19)：1527-1535(Grabar等人的文獻)，藉由破壞從大腸菌之丙酮酸往D-乳酸之代謝路徑之基因D-乳酸去氫酶基因(ldhA)、及從甲基乙二醛往D-乳酸之代謝路徑之基因msgA基因，以由含有1mM甜菜鹼之礦物質構成之合成培養基培養生產源自Pediococcus acidilactici之L-乳酸脫水素酵素的大腸菌，成功生產高光學純度之L-乳酸。

依照該文獻，msgA基因未破壞之大腸菌，於甜菜鹼存在下，即使已破壞D-乳酸去氫酶基因(ldhA)，由於會生產源自大腸菌生合成之甲基乙二醛的D-乳酸，因此，顯示即使原料中未混入D-乳酸，也僅能得到約96%e.e.之光學純度。

又，該文獻中之大腸菌中，存在用於分解D-乳酸之FAD依存型D-乳酸去氫酶基因(dld)，但是，若未破壞msgA基因，則於甜菜鹼存在下呈現光學純度為約95~96%。亦即，僅以大腸菌內在的dld基因的表現，連大腸菌合成之少量D-乳酸也無法充分分解，得不到高光學純度。又，不存在甜菜鹼之培養基，若原料中不含有D-乳酸，能生產99%以上之高光學純度之乳酸，但是，顯示所望乳酸之生產速度會降低至約一半。

由此等顯示若msgA基因未破壞及不添加甜菜鹼，難以兼顧高L-乳酸之生產性及高光學純度。

又，該文獻係抑制大腸菌所生產之D-乳酸之生產，並使用不含D-乳酸之培養基生產高光學純度之L-乳酸，並不是記載於培養基成分含有D-乳酸時提高光學純度之方法。

於日本特開2004-187643號公報，揭示為了得到高光學純度，使乳酸消旋酶的活性降低的方法。此方法於乳酸生產菌本身製造DL-乳酸時為有效，但是於培養基中含有DL-乳酸時無法期待效果。

又，於Biotech.Bioeng.,Vol.73(1),pp80-82(2001)，揭示使用L-乳酸去氫酶使DL-乳酸混合液成為D-乳酸溶液的方法，但是報告中之實驗為1mL的小規模，乳酸濃度為約10mM的低，在一般1000mM以上的使用乳酸生產菌的工業化生產不認為有效。

另一方面，依照WO2005/033324號小冊，使用dld基因經破壞的大腸菌，成功地從含有玉米浸液之培養基生產高光學純度的D-乳酸。於玉米浸液含有DL-乳酸，dld基因經破壞之大腸菌，抑制於微好氣條件之D-乳酸之分解，並藉由一面分解L-乳酸一面生產D-乳酸，藉此成功地生產高光學純度之D-乳酸。依照該文獻，通氣對於糖代謝速度或光學異構物之分解速度、雜質之生產速度造成影響，若通氣過剩，糖代謝速度下降，因此，顯示乳酸的生產速度下降。因此，當以乳酸生產為目的時，通氣量有其上限，顯示需要求取最適通氣量。亦即，為了係好氣性代謝反應之L-乳酸分解而能供給的氧量，係最多至不使D-乳酸之生產速度降低的量。

而，工業上希望使乳酸生產速度高，且希望使會帶來光學純度降低的光學異構物儘可能快速分解。使L-乳酸或D-乳酸分解為丙酮酸的酵素，係利用FMN(黃素單核苷酸(flavin mononucleotide))或FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide))等輔酶，或直接利用氧而將乳酸轉換為丙酮酸。利用輔酶之酵素，因為其輔酶再生之呼吸，亦即利用氧為有效率的，結果任一酵素均為酵素活性受限於可供給之氧量。

但是，若使氧供給量增加，則使光學純度降低之乳酸會迅速分解，但是糖代謝速度會下降，所望之乳酸生產速度大幅降低。因此，欲不論氧量使細胞外之原料來源的乳酸的分解速度提高，以更短時間使所望之乳酸之光學純度提升極為困難。

[解決課題之方式]

因此，本發明提供以更短時間生產高光學純度之乳酸的乳酸生產大腸菌及乳酸生產方法。

本發明如以下所示。

[1]一種乳酸生產大腸菌，係1種以上之NAD依存型乳酸去氫酶及1種以上之非NAD依存型乳酸氧化還原酶之各酵素活性同時強化，以將D-乳酸及L-乳酸其中之一分解而生產另一者。

[2]如[1]之乳酸生產大腸菌，其中，前述NAD依存型乳酸去氫酶之活性強化，係從丙酮酸生產D-乳酸及L-乳酸其中任一者，且前述非NAD依存型乳酸氧化還原酶之活性強化，係以前述D-乳酸及L-乳酸其中另一者為基質進行分解。

[3]如[1]或[2]之乳酸生產大腸菌，其中，前述NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化係LdhA之活性強化，能生產前述D-乳酸。

[4]如[3]之乳酸生產大腸菌，前述非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係LldD之活性強化，L-乳酸氧化酶之活性強化係LldR之不活或減低化，或此等的一個以上之組合，能生產前述D-乳酸。

[5]如[4]之乳酸生產大腸菌，其中，前述L-乳酸氧化酶為Lox及LctO其中至少之一。

[6]如[4]或[5]之乳酸生產大腸菌，其中，前述非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化，係利用編碼為LldD之基因之ORF中的33位具有靜默變異之變異體lldD基因而得。

[7]如[6]之乳酸生產大腸菌，其中，前述變異體LldD係以序列號碼41之鹼基序列表示。

[8]如[3]~[7]中任一項之乳酸生產大腸菌，係將選自由Dld活性及Pfl活性構成之族群中至少其中之一失活或減低化。

[9]如[1]或[2]之乳酸生產大腸菌，其中，前述NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化，係NAD依存型L-乳酸去氫酶之活性強化，能生產前述L-乳酸。

[10]如[9]之乳酸生產大腸菌，其中，前述非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係Dld之活性強化，能生產前述L-乳酸。

[11]如[9]或[10]之乳酸生產大腸菌，其中，前述L-乳酸去氫酶係源自於雙叉桿菌屬菌。

[12]如[10]或[11]之乳酸生產大腸菌，其中，前述Dld具有Lact deh memb分域。

[13]如[10]~[12]中任一項之乳酸生產大腸菌，其中，前述Dld源自於選自由大腸菌、發酵單胞菌屬及棒狀桿菌屬構成之族群中至少1種。

[14]如[9]~[13]中任一項之乳酸生產大腸菌，其中，LdhA活性、LldD活性、Pfl活性至少1種以上經失活或減低化。

[15]如[1]~[14]中任一項之乳酸生產大腸菌，其中，選自由Mdh及AspA之活性構成之族群之至少1種經失活或減低化。

[16]如[1]~[15]中任一項之乳酸生產大腸菌，其中，選自由蔗糖非PTS基因群及FruK構成之族群中至少1種經強化。

[17]如[1]~[16]中任一項之乳酸生產大腸菌，其中，FruR活性經失活或減低化。

[18]一種乳酸生產方法，係使用[1]~[17]中任一項之乳酸生產大腸菌而生產乳酸。

[19]一種D-乳酸生產方法，係使用[3]~[8]中任一項之乳酸生產大腸菌而生產D-乳酸。

[20]一種L-乳酸生產方法，係使用[9]~[14]中任一項之乳酸生產大腸菌而生產L-乳酸。

[實施發明之形態]

本發明之乳酸生產大腸菌，係1種以上之NAD依存型乳酸去氫酶酵素及1種以上之非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之各酵素活性一同強化，使得分解D-乳酸及L-乳酸其中之一而生產另一者。

本發明之大腸菌，由於乳酸代謝系中之1種以上之NAD依存型乳酸去氫酶酵素及1種以上之非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之各酵素活性一同強化，而為了生成D-乳酸及L-乳酸其中任一者可分解另一者，因此在生產D-乳酸及L-乳酸其中任一者的同時，可同時進行僅光學純度降低之光學異構物的快速分解。

其結果，可提供以更短時間生產高光學純度乳酸之乳酸生產大腸菌及乳酸生產方法。

本發明中，酵素活性之「強化」，係將編碼為酵素之基因從寄主細菌之菌體外導入到菌體內，除此以外，也包含將寄主細菌保有於基因體上之酵素基因之起動子活性強化或取代為其他起動子，藉此使酵素基因強表現者，或使該酵素基因之抑制子活性減低化或失活，結果使該酵素活性強化者。

本發明中，酵素活性之「減低化」，係指藉由編碼為該酵素之基因之基因重組，使該酵素之活性較進行此等處理前之狀態更顯著降低的狀態。

本發明中，酵素活性之「失活」，係指即使利用現存的任一測定系，測定對象之該酵素之活性為檢測界限以下之狀態。

又，本發明中，「寄主」係指，接受1個以上之基因從菌體外導入之結果，成為本發明之乳酸生產大腸菌之該大腸菌。

本說明書中所示數值範圍，顯示記載之數值各包含為最小值及最大值之範圍。

以下詳細說明本發明。

本發明之乳酸生產大腸菌中，為了生成D-乳酸及L-乳酸其中之一，將另一者分解而生產該其中之一的乳酸，可將1種以上之NAD依存型乳酸去氫酶及1種以上之非NAD依存型乳酸氧化還原酶的各酵素活性一同強化即可。具體而言，前述NAD依存型乳酸去氫酶之活性強化，係從丙酮酸生產D-乳酸及L-乳酸其中任一者，且前述非NAD依存型乳酸氧化還原酶，係以前述D-乳酸及L-乳酸中另一者為基質分解者較佳。其結果，可從丙酮酸確實生成D-乳酸或L-乳酸，並促進另一者的分解，故能以具體良好效率得到高光學純度之乳酸。

如此種NAD依存型乳酸去氫酶酵素，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼1.1.1.27或分類為酵素號碼1.1.1.28之以NAD作為輔酶之乳酸去氫酶。此酵素，於乳酸代謝系中，以NAD作為輔酶在L-乳酸或D-乳酸與丙酮酸之間進行氧化還原反應。具有因應基質量及NAD之量等而進行氧化還原反應的功能，但是，從生產高光學純度之乳酸的觀點，宜強化從丙酮酸生成D-乳酸或L-乳酸之NAD依存型乳酸去氫酶之活性。

可將NAD依存型乳酸去氫酶酵素活性導入到寄主細菌之基因，可利用具有編碼為從保有此酵素之生物得到之NAD依存型乳酸去氫酶之基因之鹼基序列的DNA，或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞屬菌(Pseudomonas)、氣桿菌屬菌菌(Aerobacter)、梭狀桿菌屬菌(Clostridium)、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)來源者，尤其埃希氏菌屬菌(Escherichia)、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)來源者，例如具有源自E.coli MG1655株之基因、源自長雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)之基因之鹼基序列的DNA。

又，本發明中，非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素，係指以NAD以外作為輔酶之乳酸去氫酶、或直接利用氧將乳酸氧化之乳酸氧化酶。此等酵素，係在乳酸代謝系中，以FAD或FMN等作為輔酶，或直接利用氧，在L-乳酸或D-乳酸與丙酮酸之間進行氧化還原反應之酵素。具有因應於基質量及輔酶量等而進行氧化還原反應之功能的酵素，在本發明中，宜為以D-乳酸及L-乳酸其中之一作為基質，而強化可分解至丙酮酸之功能之酵素。

就可將非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素活性導入於寄主細菌之基因而言，可利用具有從保有該酵素之生物得到之編碼為非NAD依存型乳酸氧化還原酶之基因之鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如：埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞屬菌(Pseudomonas)、氣桿菌屬菌菌(Aerobacter)、梭狀桿菌屬菌(Clostridium)、腸球菌屬菌(Enterococcus)、鏈球菌屬菌(Streptococcus)、足球菌屬菌(Pediococcus)、乳酸球菌屬菌(Lactococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)屬菌、棒狀桿菌屬菌(Corynebacterium)、發酵單胞菌屬菌(Zymomonas)來源者，尤其埃希氏菌屬菌(Escherichia)、腸球菌屬菌(Enterococcus)、棒狀桿菌屬菌(Corynebacterium)、發酵單胞菌屬菌(Zymomonas)來源者，例如具有源自E.coli MG1655株、腸球菌(Enterococcus)sp.ATCC9625株、谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)NBRC12168株、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC31821株之基因之鹼基序列的DNA。

如此方式，藉由組合非NAD依存型乳酸氧化還原酶及NAD依存型乳酸去氫酶且強化各自的活性，生成其中之一之光學異構物，另一方面，將使光學純度降低之另一光學異構物分解，因此能將乳酸以高光學純度迅速生產。

本發明之乳酸生產大腸菌，可為將有助於上述各酵素活性強化之任一基因強化者，從D-乳酸或L-乳酸各自的光學純度及生產效率的觀點，宜於後述各基因強化者。

以下。分成生產D-乳酸之D-乳酸生產菌及生產L-乳酸之L-乳酸生產菌加以說明。

<D-乳酸生產菌>

本發明之D-乳酸生產菌中，宜強化LdhA之活性作為NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化。

本發明中，就NAD依存型乳酸去氫酶而言活性經強化之D-乳酸去氫酶(LdhA)，係指從丙酮酸及NADH生成D-乳酸及NAD的酵素。又，一般而言，LdhA生產L-乳酸者及生產D-乳酸者均為已知，但是本發明為避免混亂，僅將生產D-乳酸者標示為LdhA。

ldhA基因，可為具有從保有該酵素活性之生物得到之基因之鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列所合成之合成DNA序列。

適當的ldhA基因的例子，例如源自關於上述NAD依存型乳酸去氫酶記述之菌者，具體而言，例如Bunch等人(Microbiologyl,43(Pt 1),pp.187-195(1997))取得之基因，或帶有以E.coli之基因體DNA為模板利用後述序列號碼19及序列號碼20以PCR放大之DNA片段所含之序列的基因。

本發明中，增強LdhA活性之一方法，以將編碼為LdhA之基因，與主掌解糖系、核酸生合成系或胺基酸生合成系相關蛋白質之表現之基因之起動子連結之狀態嵌入表現質體，並將其導入所望細菌之方法為有效。此時主掌解糖系、核酸生合成系或胺基酸生合成系相關的蛋白質之表現之基因之起動子，係指持續於細菌內，較佳為E.coli內作用的強力起動子，且即使於葡萄糖存在下，表現亦不易受抑制之起動子，具體而言，例如甘油醛-3磷酸去氫酶之起動子或絲胺酸羥基甲基轉移酶起動子。以此方式得到之大腸菌，相較於於通氣條件下生產D-乳酸時，ldhA之表現未經增強者，D-乳酸的蓄積量提高，可提升D-乳酸之光學純度。

又，本發明之D-乳酸生產菌中，非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係LldD之活性強化，宜為L-乳酸氧化酶之活性強化、LldR之不活或減低化、或此等的1個以上的組合。

藉此，能以良好效率將L-乳酸分解為丙酮酸，當生產D-乳酸時，可將光學純度迅速提高。

本發明中，就非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素而言，活性經強化之非NAD依存型L-乳酸去氫酶(LldD)，係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼1.1.2.3，指從L-乳酸及FMN生成丙酮酸與FMNH的酵素。此lldD基因，可為具有從保有此酵素活性之生物得到之基因之鹼基序列之DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。

適當者，例如源自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞屬菌(Pseudomonas)、志賀菌屬菌(Shigella)、檸檬酸桿菌屬菌(Citrobacter)、沙門菌屬菌(Salmonella)者，尤其源自埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如具有源自E.coli MG1655株之基因之鹼基序列之DNA。

又，LldD從達成L-乳酸更迅速分解的觀點，宜為lldD基因之編碼為ORF之序列之第33位發生靜默變異之變異體lldD基因所表現的LldD，更佳為第33位之鹼基從C變成T之變異體lldD(C33T變異體lldD)(序列號碼41)。藉由將C33T變異體lldD基因以公知之基因重組技術導入大腸菌，可輕易地得到高活性大腸菌株。利用此高活性株，可更高速分解L-乳酸，可使D-乳酸之光學純度提升。

又，就非NAD依存型乳酸去氫酶酵素而言，活性經強化之L-乳酸氧化酶，係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼1.13.12.--，指於L-乳酸及氧存在下，生成丙酮酸及過氧化氫之酵素。此等基因lox、lctO，可為具有從保有此酵素活性之生物得到之基因之鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。

適當者，例如源自腸球菌屬菌(Enterococcus)、鏈球菌屬菌(Streptococcus)、足球菌屬菌(Pediococcus)、乳酸球菌屬菌(Lactococcus)、氣球菌屬屬菌(Aerococcus)者，其中，尤佳為從腸球菌(Enterococcus)sp.ATCC9625及乳酸乳球菌(Lactococcus．lactis)ATCC 19435單離者。

本發明中，增加LldD、L-乳酸氧化酶活性之一方法，將編碼為LldD或上述L-乳酸氧化酶之基因，以與主掌關於解糖系、核酸生合成系或胺基酸生合成系之蛋白質表現之基因起動子連結之狀態，嵌入表現質體，並導入於所望大腸菌之方法為有效。此情形中，主掌關於解糖系、核酸生合成系或胺基酸生合成系之蛋白質之表現的基因的起動子，係持續在細菌內，較佳為E.coli內作用的強力起動子，且指即使於葡萄糖存在下表現亦不易受抑制之起動子，具體而言，例如：甘油醛-3磷酸去氫酶之起動子或絲胺酸羥基甲基轉移酶起動子。以此方式得到之大腸菌，相較於通氣條件下使D-乳酸生產時，LldD或L-乳酸氧化酶之表現未增強者，D-乳酸之蓄積量提高，且D-乳酸之光學純度可提高。

又，LldD及L-乳酸氧化酶，可各自使用直接使用公知序列，又，視情形，可為無損及各自之酵素活性的變異體。如此的變異體，例如：胺基酸加成、刪除、轉換等。關於如此之無損於活性的變異體，可藉由該技術領域中具有通常知識者公知的方法得到。

又，就非NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化而言，經失活或減低化之LldR，為抑制上述L-乳酸去氫酶(LldD)之轉錄的控制因子。藉由將LldR之活性減低化或失活，可阻止LldD活性之抑制，或可有效強化LldD活性。

又，本發明之D-乳酸生產菌，宜為選自由Dld活性及Pfl活性構成之族群中至少之一經失活或減低化者。

本發明中，Dld(FAD依存型D-乳酸去氫酶)，係指於輔酶氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸存在下，催化從D-乳酸生成丙酮酸之反應的酵素的總稱。藉由將該Dld之活性失活或減低化，可抑制生產物D-乳酸之分解。

又，本發明中，Pfl(丙酮酸甲酸裂解酶)，係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼2.3.1.54，也稱為甲酸乙醯基轉移酶的酵素。本酵素係指可逆性催化從丙酮酸生成甲酸之反應的酵素總稱。藉由將此Pfl之活性失活或減低化，可抑制係D-乳酸生成原料之丙酮酸之分解。

本發明中，就LdhA活性強化之同時，Dld活性或Pfl活性或此等兩者失活或減低化的微生物而言，例如：WO2005/033324號記載之E.coli MT-10994(FERM BP-10058)株。

又，本發明之D-乳酸生產菌，在上述之外，再加上選自由Mdh及AspA之活性構成之族群的至少其中之一失活或減低化者，從抑制副生物之生產量的觀點，為較佳。

Mdh(蘋果酸去氫酶)，係指分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼1.1.1.37，於輔酶氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸之存在下，可逆性催化從蘋果酸生產草醯乙酸之反應的酵素的總稱。因此，藉由使Mdh之活性失活或減低化，可抑制琥珀酸之副生。

又，AspA(天冬胺酸氨裂解酶)係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼4.3.1.1.，也稱為天冬胺酸酶(aspartase)之酵素。本酵素，係指可逆性催化從L-天冬胺酸生成富馬酸之反應的酵素的總稱。因此，藉由使AspA之活性失活或減低化，可抑制富馬酸之副生。

本發明之D-乳酸生產菌，能以葡萄糖等糖作為原料生產D-乳酸，但是為了能以其他糖作為原料生產D-乳酸，可為將選自由蔗糖非PTS基因群及FruK構成之族群中至少之一強化者，蔗糖非PTS基因群及FruK兩者經強化者更佳，蔗糖非PTS基因群之中僅cscA及FruK均強化者更佳。

本發明中，蔗糖非PTS基因群係指微生物之蔗糖資化路徑當中涉及非PTS系之基因群。詳言之，係以抑制子蛋白質(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透過酵素(cscB)構成之基因群。本發明中，選擇蔗糖非PTS基因群之基因時，可選擇蔗糖非PTS基因群當中1種或2種以上之基因，例如，僅cscA；cscA及cscK之組合；cscA及cscB之組合；cscA及cscR之組合；cscA與cscB與cscR之組合；cscA與cscK與cscR之組合等。其中，從以更良好效率生產乳酸之觀點，僅選擇cscA基因較佳。又，本發明之某特定態樣中，「蔗糖非PTS基因群當中1種或2種以上之基因」中，排除抑制子蛋白質(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過酵素(cscB)之組合及排除蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過酵素(cscB)之組合較佳。

本發明中，蔗糖水解酶(轉化酶、CscA)，係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼3.2.1.26，指催化從蔗糖生成D-葡萄糖及D-果糖之反應的酵素的總稱。

此酵素，係K12株等大腸菌原本未保有的酵素，係包含質子共輸送移送系、轉化酶、果糖激酶及蔗糖專一性抑制子之非PTS代謝路徑之酵素之一(參照Canadian Journal of Microbiology,(1991)vol.45,pp418-422)。本發明中，藉由僅賦予此cscA，將菌體外之蔗糖於胞外質分解為葡萄糖及果糖並放出到細胞外，且介由葡萄糖PTS及果糖PTS磷酸化並攝入到細胞質內。其結果，可將果糖供給到細菌中之果糖代謝系，可進行利用解糖系之資化。

導入於本發明之寄主細菌之蔗糖水解酶(轉化酶、CscA)之基因，可利用具有從保有該酵素之生物得到之編碼為蔗糖水解酶(轉化酶、CscA)之基因之鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如源自於歐文菌屬菌(Erwinia)、變形菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibtio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，雙叉桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列的DNA。尤佳為，具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列的DNA。又，CscA宜附加使CscA移動到菌體之胞外質的信息序列。

本發明之導入到寄主細菌之抑制子蛋白質(CscR)之基因，可利用具有從保有此酵素之生物得到之編碼為抑制子蛋白質(CscR)之基因之鹼基序列的DNA，或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如：源自於歐文菌屬菌(Erwinia)、變形菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，雙叉桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如源自於E.coli O157株之基因之鹼基序列之DNA。尤佳為，具有源自於E.coli O157株之基因之鹼基序列之DNA。

本發明之導入於寄主細菌之果糖激酶(CscK)之基因，可利用具有從保有此酵素之生物得到之編碼為果糖激酶(CscK)之基因之鹼基序列的DNA，或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如源自於歐文菌屬菌(Erwinia)、變形菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，雙叉桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列的DNA。尤佳為，具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列的DNA。

本發明之導入到寄主細菌之蔗糖透過酵素(CscB)之基因，可利用從保有此酵素之生物得到之具有編碼為蔗糖透過酵素(CscB)之基因之鹼基序列之DNA，或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如源自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，雙叉桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列之DNA。尤佳為，具有源自E.coli O157株之基因之鹼基序列之DNA。

本發明中，果糖-1-磷酸激酶(FruK)係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼2.7.1.56，也稱為磷酸果糖激酶1之酵素。細菌類例如大腸菌中，於葡萄糖存在下一般果糖攝入係受抑制，相對於此，FruK之表現強化，即便是葡萄糖存在下，促進果糖攝入並有助於D-乳酸生產細菌中之D-乳酸生產性提升的見解，至今為止尚無人觀察到。又，藉由上述CscA，將從蔗糖得到的果糖攝入到細胞內並代謝為果糖-1-磷酸後，於一連串果糖代謝系僅強化FruK表現即提高乳酸生產性，亦為預測之外的。

本發明之導入於寄主大腸菌之果糖-1-磷酸激酶(FruK)之基因，可利用從保有此酵素之生物得到之具有編碼為果糖-1-磷酸激酶之基因(fruK)之鹼基序列之DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。適當者，例如源自於埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞屬菌(Pseudomonas)、氣桿菌屬菌菌(Aerobacter)、梭狀桿菌屬菌(Clostridium)者，尤其源自於埃希氏菌屬菌(Escherichia)者，例如具有源自E.coli MG1655株之基因之鹼基序列的DNA。尤其佳，具有源自E.coli MG1655株之基因之鹼基序列之DNA。

本發明中，更佳為，蔗糖水解酶(CscA)及果糖磷酸激酶均為，藉由導入編碼為E.coli O157細菌或E.coli MG1655來源之各蛋白質之基因得到者。藉由成為源自此等細菌之基因，可確實表現功能。

又，本發明之D-乳酸生產菌，於進一步使FruR活性失活或減低化者，從能促進果糖攝入之觀點為較佳。

本發明中，活性經減低之FruR之基因，只要是寄主細菌原本保有者即可，也可為具有編碼為寄主細菌原本具有之FruR之基因之鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列嵌入之合成DNA序列。

藉由將如此的D-乳酸生產菌使用後述生產方法，能以高光學純度且迅速地生產D-乳酸。

<L-乳酸生產菌>

本發明中，L-乳酸生產菌中，就NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化而言，宜強化NAD依存型L-乳酸去氫酶之活性。

本發明中，就NAD依存型乳酸去氫酶活性經強化之L-乳酸去氫酶，係指從丙酮酸及NADH生成L-乳酸及NAD之酵素。NAD依存型L-乳酸去氫酶之基因，也可為具有從保有此酵素活性之生物得到之基因之鹼基序列之DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。

適當的NAD依存型L-乳酸去氫酶基因，只要是編碼為能在大腸菌表現且能生產L-乳酸之NAD依存型L-乳酸去氫酶之基因，即不特別限定，例如，源自雙叉桿菌屬、腸桿菌屬、乳酸球菌屬、乳酸桿菌(Lactobacillus)屬之NAD依存型L-乳酸去氫酶，尤其，從乳酸生產性之觀點，宜為源自長雙叉桿菌之NAD依存型L-乳酸去氫酶(Ldh2)。

又，增強NAD依存型L-乳酸去氫酶活性之一方法，例如：於關於D-乳酸生產大腸菌中之ldhA說明過之起動子之使用等，可將前述事項直接應用。如此種L-乳酸去氫酶活性經增強之細菌，與通氣條件下使L-乳酸生產時，L-乳酸去氫酶之表現未增強者相較，可使L-乳酸之蓄積量提高，且L-乳酸之光學純度提高。

本發明中，L-乳酸生產菌就非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素而言，為Dld之活性經強化者，從光學純度提高的觀點為較佳。

本發明中，Dld(FAD依存型D-乳酸去氫酶)，係分類為依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素號碼1.1.2.4，意指於輔酶氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸存在下，催化從D-乳酸生成丙酮酸之反應之酵素總稱。

為了Dld之活性強化可導入到寄主菌之dld基因，可為各種微生物來源者，例如源自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、棒狀桿菌屬菌(Corynebacterium)、發酵單胞菌屬菌(Zymomonas)者。

其中，選自由共通具有Lact deh memb分域之大腸菌、發酵單胞菌屬及棒狀桿菌屬構成之族群中至少1個dld基因，從光學純度提高的觀點為更佳，各源自大腸菌、谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)之dld基因尤佳。又，發酵單胞菌屬及棒狀桿菌屬之dld基因，尚共通具有FAD氧化酶分域。此Lact deh memb分域，係配位於細胞膜之乳酸去氫酶共通具有之高類似性的胺基酸序列。

關於Lact deh memb分域或FAD氧化酶分域之序列有無的資訊，可藉由將酵素之胺基酸序列使用Pfam database(Nucleic Acids Research(2008)Database Issue 36：D281-D288)等輸入、檢索得到。例如，於http：//pfam.sanger.ac.uk/search輸入胺基酸序列，藉由以起始狀態檢索，可知道於所望胺基酸序列中是否存在Lact deh memb分域或FAD氧化酶分域之序列。

非NAD依存型乳酸去氫酶酵素之活性強化，於有抑制此酵素基因之轉錄的控制因子時，亦可使其減低化或失活。

又，增強Dld活性之一方法，例如關於D-乳酸生產大腸菌中之ldhA說明過之起動子之使用等，可直接應用前述事項。

又，本發明之L-乳酸生產菌中，宜為選自於LdhA活性、LldD活性及Pfl活性構成之族群中至少1種經失活或減低化。

在此，關於成為活性失活或減低化對象之LdhA、LldD及Pfl之事項，可直接應用前述事項。

藉由LdhA活性之失活或減低化，可抑制成為生成L-乳酸之原料的丙酮酸的分解。

藉由LldD活性之失活或減低化，可抑制生產物L-乳酸之消耗。

又，本發明中，L-乳酸生產菌中，與前述D-乳酸生產菌同樣，上述以外再加上選自由Mdh及AspA之活性構成之族群之至少之一失活或減低化，從抑制副生物之生產量之觀點為較佳。

又，本發明中，L-乳酸生產菌中，與前述D-乳酸生產菌同樣，為了能以其他糖作為原料生產L-乳酸，可強化選自由CscA及FruK構成之族群中至少之一，更佳為強化CscA及FruK兩者。又，本發明之L-乳酸生產菌中，將FruR活性失活或減低化，從能促進果糖攝入之觀點，為較佳。

關於成為失活或減低化、或強化之對象的Mdh及AspA，及蔗糖非PTS基因群、FruK及FruR之事項，可直接應用前述事項。

<乳酸生產方法>

其次說明本發明之乳酸生產方法。

本發明之乳酸生產方法，係使用上述乳酸生產菌生產乳酸之方法。

尤其，藉由使用上述D-乳酸生產菌進行培養，能以高光學純度且良好效率生產D-乳酸。同樣，藉由使用上述L-乳酸生產菌培養，能以高光學純度且良好效率生產L-乳酸。

本發明之此等乳酸生產方法，具體而言，包含將上述各乳酸生產菌以培養液培養，及將從前述培養得到之培養物回生乳酸生產菌生成之特定乳酸。

本發明之乳酸生產方法中，乳酸製造之原料可使用通常使用的植物來源原料。植物來源原料，只要是可從植物得到之碳源即可。具體而言，係指根、莖、幹、枝、葉、花或種子等器官、包含此等的植物體、此等植物器官之分解產物，又，植物體、植物器官、或從此等的分解產物得到的碳源之中，在培養微生物時可作為碳源利用者，也包含於植物來源原料。

包含於如此種植物來源原料之碳源，例如一般者有：澱粉、葡萄糖、果糖、木糖、***糖等糖類、或含有多量此等成分之草木質分解產物或纖維素水解物等、或此等之組合，又，植物油來源之甘油或脂肪酸，也可在本發明包含於碳源中。

尤其，本發明中，乳酸生產大腸菌具有CscA活性時，具備蔗糖資化能力，即使是含有蔗糖之植物原料也能良好地資化而生產乳酸。

本發明中，植物來源原料之例示，例如：穀物等農作物、玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉等，或此等之組合，其作為原料之使用形態，為未加工品、搾汁、粉碎物等，不特別限定。又，也可為僅上述碳源之形態。

植物來源原料與乳酸生產細菌之混合，視乳酸生產細菌之活性而異，一般而言，就培養基中之植物來源原料濃度而言，以葡萄糖換算，初始之糖濃度可定為相對於混合物總質量的20質量%以下，從細菌之耐糖性的觀點，較佳為將初始糖濃度定為15質量%以下。其他各成分，可添加通常添加於微生物之培養基中之量，不特別限制。

又，培養基中之乳酸生產細菌之含量，視細菌種類及活性不同，但是一般而言，將初始菌濃度定為相對於培養液為0.1質量%~30質量%，從培養條件控制之觀點，較佳為1質量%~10質量%。

本發明之培養，係指使用培養基培養本發明之微生物。此時，使用之培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子、及為了生產乳酸，微生物要求之有機微量元素、核酸、維生素類等之培養基，即不特別限制。

其中，以添加2種以上之胺基酸的培養基培養者，從生產速度之觀點為較佳。本發明中，添加有2種以上之胺基酸的培養基，係指含有天然存在之各種胺基酸當中至少2種以上之培養基，包含酵母萃取物、酪蛋白水解物(casamino acid)、蛋白腖、乳清、廢糖蜜、玉米浸液等天然物或天然物萃取物之水解物的培養基。為得到更佳結果，宜為包含選自酵母萃取物、蛋白腖、乳清、廢糖蜜及玉米浸液當中至少1種，或此等之混合物為0.5質量%至20質量%的培養基，更佳為2質量%至15質量%。尤其，添加玉米浸液可得大的效果，此時，有時不添加硫酸銨等鹽反而會得到好的結果。培養基通常為液體培養基。

培養條件會視作成的菌體、培養裝置而變動，但是，一般而言，培養溫度於20℃至40℃、較佳為25℃至35℃培養，pH宜以NaOH、NH₃ 等調整為6.0~8.0，較佳為7.0~7.6培養較佳。培養時間不特別限定，為菌體充分增殖且生成乳酸所需要的時間。

培養時，通常一般使用可控制溫度、pH、通氣條件、攪拌速度的培養槽，但是本發明之培養時，不限定使用培養槽。使用培養槽培養時，可視需要預先進行種培養作為前培養，並將其以需要量接種在預先調製的培養槽內的培養基。

本發明中之培養物，係指以上述方法生產之菌體、培養液、及此等的處理物。

從以如上方式得到之培養液等培養物回收乳酸的方法，例如若從培養液，可利用通常已知的方法，例如可採用：酸性化後直接蒸餾之方法、使形成乳酸交酯並蒸餾之方法、加入醇及觸媒，酯化後蒸餾之方法、萃取至有機溶劑中之方法、以離子交換管柱分離之方法、以電透析濃縮分離之方法等，或組合此等之方法。又，由本發明之方法生產的菌體，係生產適於乳酸生產之酵素群，故利用此等進一步生產乳酸並回收，也視為從培養物回收乳酸的方法的一部分。

本發明之乳酸生產方法，由於能生產高光學純度之乳酸，因此若回收培養物所含之乳酸，能以良好純度得到D-乳酸或L-乳酸。

培養本發明得到之微生物使生產乳酸時，即使完全不進行通氣亦可，但為得到更好的結果，進行通氣為宜。在此所指於通氣條件下，並不一定要使空氣通過培養液中，也包含視培養槽形狀，適度地一面攪拌培養液一面使培養液上之空氣層換氣之頂面通氣，意指使含氧氣體流入培養槽之內部。液中通氣時，由於視內壓、攪拌翼位置、攪拌翼形狀、攪拌速度之組合，溶存氧濃度會變化，因此，能以乳酸之生產性及乳酸以外之有機酸量等作為指標，以如下方式求取最適條件。

例如，以ABLE公司製培養裝置BMJ-01等較小型培養槽進行培養時，當使用500g培養液時，使可達成空氣為常壓且0.01vvm~1vvm、攪拌速度50rpm~500rpm，更較佳為於常壓且0.1vvm~0.5vvm、攪拌速度100rpm~400rpm之通氣條件，可得較佳結果。此條件係通氣攪拌條件為以溫度30℃之水作為對象時，於常壓，氧移動速度係數kLa成為1/h以上400/h以下之條件可達成之氧供給的條件。

又，最適通氣條件的另一指標，為pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株以嫌氣培養生產之甲酸、乙酸、琥珀酸或乙醇或此等之組合以總量計，為5.0g/L以下，較佳為1.0g/L以下且能生產乳酸之通氣量、攪拌速度所達成之通氣條件。

又，最適通氣條件之另一指標，係以含有0.3%光學異構物L-乳酸之培養基培養pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株時，於10~100小時以內，L-乳酸濃度下降至0.02質量%以下之通氣量、攪拌速度。

上述通氣條件，不需要從培養初期至結束為止一貫進行，即使進行培養步驟的一部分也能得到較佳結果。如上述方式藉由進行通氣，也能達成乳酸生產性提高、光學異構物削減。

依照本發明之乳酸生產方法，能以高光學純度得到L-乳酸或D-乳酸，即使於生產原料含有使光學純度降低的另一種光學異構物，也可藉由將非為目的之光學異構物分解，生產目的光學異構物。

本發明之乳酸生產方法中，可使用定法之HPLC或F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)確認光學純度。尤其依照上述F-套組，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求得之方法測定，能以98%e.e.以上之光學純度得到目的L-或D-乳酸，較佳為能得到99.5%e.e.以上之光學純度的目的L-或D-乳酸。

光學純度(%e.e.)=100×(D乳酸濃度-L乳酸濃度)/(D乳酸濃度+L乳酸濃度)

上述式中，乳酸濃度係質量基準。

又，依照本發明之乳酸生產方法，與使用未將NAD依存型乳酸去氫酶及非NAD依存型乳酸氧化還原酶兩者一同強化之大腸菌製造D-乳酸或L-乳酸之情形相較，可迅速生產如上述高光學純度之光學異構物。

【實施例】

以下，對於本發明以實施例詳細說明。但是，本發明不限於此等實施例。又，若無特別指明，「%」及「份」係質量基準。

--D-乳酸生產菌--

[實施例1] <E.coli MG1655株dld基因缺失株之製作>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession number U00096)、編碼為E.coli之FAD依存型D-乳酸去氫酶(以下有時簡稱為Dld)之基因之鹼基序列也有人報告(Genbank accession number M10038)。

依據E.coli MG1655株基因體DNA之dld基因附近區域之基因資訊，合成以下4種寡核苷酸引子：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列號碼1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列號碼2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列號碼3)及TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列號碼4)。

以Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley & Sons)記載之方法製備E.coli MG1655株之基因體DNA，以得到的基因體DNA作為模板，使用序列號碼1及序列號碼2之引子，於通常條件以PCR放大約1.4kbp之DNA片段(以下有時稱為dld-L片段)，並使用序列號碼3及序列號碼4之引子，於通常條件進行PCR，藉此放大約1.2kbp之DNA片段(以下有時稱為dld-R片段)。將得到的dld-L片段、dld-R片段，各以限制酶Hi ndIII與PstI、PstI與XbaI消化。將此片段，與將溫度感受性質體pTH18cs1(Hashimoto-Gotoh,T.,et.al.,Gene,Vol.241(1),pp185-191(2000))以HindIII、XbaI消化得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃生長之轉形體。將得到的菌落於含有氯黴素10μg/ml之LB液體培養基於30℃培養一晚，從得到之菌體回收質體。得到的質體命名為pTH△dld。

又，E.coli MG1655株可從係細胞．微生物．基因庫之美國菌種保存中心(American type culture collection)取得。

[實施例2]

將實施例1得到之質體pTH△dld對MG1655株於30℃轉形，得到於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的轉形體塗佈於瓊脂平板，於30℃培養一晚。其次，以得到此等培養菌體之方式，塗佈在含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。

又，再度重複得到於42℃生長之單一菌落的操作，選擇藉由相同重組，質體全體嵌入染色體之選殖體。本選殖體確認在細胞質中不具質體。

其次，將上述選殖體塗佈於LB瓊脂平板，於30℃培養一晚後，接種於LB液體培養基(3ml/試管)，於42℃振盪培養3~4小時。為得到單一菌落，將其適當稀釋(約10^-2 ~10^-6 )，塗佈於LB瓊脂平板，於42℃培養一晚，得到菌落。從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂平板及含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板生長，選取僅在LB瓊脂平板生長之氯黴素感受性選殖體。又，從該等之目的選殖體之染色體DNA以PCR放大包含dld之約2.0kb片段，選拔dld基因區域缺失之菌株，以滿足以上之選殖體作為dld缺失株，將得到之菌株命名為MG1655△dld株。

[實施例3] <E.coli MG1655pfl、dld基因缺失株製作>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession number U00096)、編碼為E.coli之丙酮酸甲酸裂解酶(以下有時稱為Pfl)之基因之鹼基序列也有人報告(Genbank accession number AE000192)。為了選殖編碼為Pfl之基因之鹼基序列附近區域，合成以下4種寡核苷酸引子：GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列號碼5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAAATCG(序列號碼6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(序列號碼7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列號碼8)。

以E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，使用序列號碼5及序列號碼6之引子，於通常條件藉由PCR放大約1.8kbp之DNA片段(以下有時稱為pflB-L片段)，又，使用序列號碼7與序列號碼8之引子，於通常條件進行PCR，藉此放大約1.3kbp之DNA片段(以下有時稱為pflB-R片段)。將此DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將pflB-L片段以HindIII及SphI消化，並將pflB-R片段以SphI及PstI消化。將此2種消化片段，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之HindlII及PstI消化物，以T4DNA接合酶反應後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到含有編碼為PflB之基因之5’上游附近片段及3’下游附近片段之2個片段的質體，命名為pTH△pfl。

將得到的質體pTH△pfl對實施例2得到之MG1655△dld株轉形，得到於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃生長之轉形體。將得到的轉形體塗佈於瓊脂平板，於30℃培養一晚。其次，以得到此等之培養菌體之方式，塗佈於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。

從得到的選殖體，得到依照與實施例2同樣之方法使pfl基因破壞之MG1655△dld株，命名為MG1655△pfl△dld株。

[實施例4] <E.coli MG1655△pfl△dld△mdh株之製作>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession number U00096)，E.coli之mdh基因之鹼基序列也有人報告(Genbank accession number AE000403)。為了選殖編碼為Mdh之基因(939bp)之鹼基序列附近區域，合成以下4種寡核苷酸引子：AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(序列號碼9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(序列號碼10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(序列號碼11)及AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(序列號碼12)。

以E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，以序列號碼9與序列號碼10、序列號碼11與序列號碼12之組合，於通常條件進行PCR，藉此各放大約800bp(以下有時稱為mdh-L片段)之DNA片段，及約1,000bp(以下有時稱為mdh-R片段)之DNA片段。將此DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將mdh-L片段以KpnI及BamHI消化，將mdh-R片段以BamHI及XbaI消化。將此2種消化片段，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之KpnI及XbaI消化物，以T4DNA接合酶反應後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到含有編碼為mdh之基因之5’上游附近片段及3’下游附近片段之2個片段的質體，將本質體命名為pTH△mdh。

將質體pTH△mdh轉形到實施例3得到之E.coli MG1655△pfl△dld株，依照與實施例2同樣之方法，取得mdh基因經破壞之MG1655△pfl△dld株。本株命名為MG1655△pfl△dld△mdh株。

[實施例5] <E.coli MG1655△pfl△dld△mdh△asp株之製作>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession number U00096)，E.coli之aspA基因之鹼基序列亦有人報告(Genbank accession number AE000486)。為了選殖編碼為AspA之基因(1,482bp)之鹼基序列附近區域，合成以下所示4種寡核苷酸引子：TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(序列號碼13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(序列號碼14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(序列號碼15)及TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(序列號碼16)。

以E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，以序列號碼13與序列號碼14、序列號碼15與序列號碼16之組合，使用上述引子，以通常條件進行PCR，藉此放大約910bp(以下有時稱為aspA-L片段)之DNA片段，及約1,100bp(以下有時稱為aspA-R片段)之DNA片段。將此DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將aspA-L片段及aspA-R片段兩者均以DNA Blunting Kit(Takarabio)將末端平滑化後，使用T4聚核苷酸激酶以定法將5’末端磷酸化。又，將溫度感受性質體pTH18cs1以SmaI消化後，以鹼性磷解酶進行脫磷酸化處理。將經上述磷酸化之2種片段，與經脫磷酸化之質體，以T4DNA接合酶反應後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到含有編碼為AspA之基因之5’上游附近片段及3’下游附近片段之2個片段的質體，將此質體命名為pTH△asp。

將質體pTH△asp轉形到實施例4得到之E.coli MG1655△pfl△dld△mdh株，最終得到aspA基因經破壞之MG1655△pfl△dld△mdh株，命名為MG1655△pfl△dld△mdh△asp株。得到本株之詳細方法，依據本發明之實施例2記載之方法。

[實施例6] <E.coli MG1655△pfl△dld△mdh△asp株之基因體上ldhA起動子取代為GAPDH起動子>

E.coli之ldhA基因之鹼基序列已有人報告(GenBank accession number U36928)。為了取得甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)起動子，以E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，利用AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列號碼17)、及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號碼18)以PCR法放大，將得到之DNA片段以限制酶EcoRI消化，藉此得到約100bp之編碼為GAPDH起動子之片段。又，為取得D-乳酸去氫酶基因(ldhA)，使用E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列號碼19)、及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列號碼20)以PCR法放大，將得到的DNA片段以限制酶EcoRI及HindIII消化，藉此得到約1.0kbp之D-乳酸去氫酶基因(ldhA)片段。將上述2個DNA片段及將質體pUC18以限制酶EcoRI及HindIII消化所得到之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落以含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於30℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-ldhA。

又，使用依據E.coli MG1655株之ldhA基因5’附近區域之基因資訊製作之AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號碼21)及GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列號碼22)，以E.coli基因體DNA作為模板進行PCR，藉此放大約1000bp之DNA片段。

又，使用依據E.coli MG1655株之甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)起動子之序列資訊製作之GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列號碼23)及依據E.coli MG1655株之ldhA基因之序列資訊製作之AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列號碼24)，以先前製作之質體pGAPldhA作為模板進行PCR，得到由GAPDH起動子及ldhA基因之起始密碼子附近區域構成之約850bp之DNA片段。

將上述得到之片段，各以限制酶KpnI與XbaI、XbaI與PstI消化。將得到之片段，與將溫度感受性質體pTH18cs1以KpnI及PstI消化得到之片段混合，使用接合酶結合，之後，於30℃轉形到DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有氯黴素10μg/ml之LB液體培養基於30℃培養一晚，從得到之菌體回收質體，命名為pTH-GAPldhA。

將得到的質體pTH-GAPldhA轉形到實施例5得到之E.coli MG1655△pfl△dld△mdh△asp株，於30℃於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板培養一晚，得到轉形體。將得到的轉形體接種於含有氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次，以得到此等之培養菌體之方式，塗佈於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。將得到的菌落於不含氯黴素之LB液體培養基於30℃培養一晚，再塗佈於不含氯黴素之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。

從出現之菌落當中隨機挑取100個菌落，各使於不含氯黴素之LB瓊脂平板及含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板生長，選擇氯黴素感受性選殖體。又，從該等之目的選殖體之染色體DNA利用PCR放大含有GAPDH起動子與ldhA基因之約800bp片段，選拔ldhA起動子區域取代為GAPDH起動子之菌株，將滿足以上之選殖體命名為MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。

<lldR破壞株之製作>破壞lldR基因之質體以下列方法製作。

E.coli之lldR基因之鹼基序列已有人報告(GenBank accession number U00096 3777077~3777853)。

為了選殖編碼為lldR之基因之鹼基序列附近區域，使用GGGAATTCGACATCATTCGCTCGTCTATTCTTTCGATA(序列號碼25)、GGGTACCTTAAGGAATCATCCACGTTAAGACAT(序列號碼26)，以E.coli基因體DNA作為模板進行PCR，藉此放大lldR上游之DNA片段，並以限制酶EcoRI、KpnI切斷。其次，以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼28)作為引子，以E.coli基因體DNA作為模板進行PCR，藉此放大lldR下游之DNA片段，以限制酶KpnI、SalI切斷。將此2種消化片段，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之EcoRI及SalI消化物，以T4DNA接合酶反應後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到含有編碼為LldD之基因之5’上游附近片段及3’下游附近片段之2個片段的質體，將本質體命名為pTH△lldR。

將得到的質體轉形到MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。並於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃培養一晚，得到轉形體。將得到的轉形體接種於含有氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次，以得到該等之培養菌體之方式，塗佈於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。將得到的菌落以不含有氯黴素之LB液體培養基於30℃培養一晚，再塗佈於不含氯黴素之LB瓊脂平板，得到於42℃生長之菌落。

從出現之菌落當中隨機挑取100個菌落，各使於不含氯黴素之LB瓊脂平板及含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板生長，選擇氯黴素感受性選殖體。又，從此等目的選殖體之染色體DNA利用PCR放大lldR周邊，選拔lldR區域缺損的菌株，將滿足以上之選殖體，命名為MG1655△pfl△dld△mdh△asp△lldR/GAPldhA基因體***株。

[實施例7] <E.coli MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株之製作>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession number U00096)，E.coli MG1655之fruR基因之鹼基序列已有人報告。亦即，fruR基因記載於GenBank accession number U00096記載之E.coli MG1655株基因體序列之88028~89032。

為了選殖編碼為fruR之基因(1005bp)之鹼基序列附近區域，合成以下所示4種寡核苷酸引子：TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG(序列號碼29)、GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG(序列號碼30)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC(序列號碼31)及CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(序列號碼32)。

以E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，以序列號碼29及序列號碼30、序列號碼31及序列號碼32之組合，使用上述引子，以通常條件進行PCR，藉此放大約950bp(以下有時稱為fruR-L片段)及約880bp(以下有時稱為fruR-R片段)之DNA片段。將此DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將fruR-L片段以PstI及XbaI消化，將fruR-R片段以XbaI及EcoRI消化。將此2種消化片段，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之PstI及EcoRI消化物，以T4DNA接合酶反應後，轉形到E.coli DH5α勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到含有編碼為FruR之基因之5’上游附近片段及3’下游附近片段之2個片段的質體，命名本質體為pTH△fruR。

將質體pTH△fruR轉形到實施例6得到之E.coli MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株，依照與實施例2同樣之方法，取得fruR基因經破壞之MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。將本株命名為MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株。

[實施例8] <源自E.coli O157之蔗糖水解酶(轉化酶)基因表現載體及該表現載體轉形體之構建>

E.coli O157之轉化酶之胺基酸序列及基因之鹼基序列已有人報告。亦即，編碼為轉化酶之基因(cscA)，記載於GenBank accession number AE005174記載之E.coli O157株基因體序列之3274383~3275816。就為了表現上述基因所必要之起動子之鹼基序列，可使用於GenBank accession number X02662之鹼基序列資訊中，記為397-440之E.coli來源的甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之起動子序列。

為了取得GAPDH起動子，使用E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，藉由CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號碼33)、及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號碼34)以PCR法放大，將得到之DNA片段以限制酶NdeI消化，藉此得到約110bp之相當於GAPDH起動子之DNA片段。將得到之DNA片段與將質體pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酶NdeI及PvuII消化得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到的菌體回收質體pBRgapP。

為了取得轉化酶基因，使用E.coli O157之基因體DNA(SIGMA-ALDRICH：IRMM449)作為模板，藉由GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列號碼35)、及ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列號碼36)，以PCR法放大，將得到的DNA片段以限制酶XbaI消化，得到約1.4 kbp之轉化酶基因片段。將得到之DNA片段，與將先前作成之質體pBRgapP以限制酶XbaI及PshAI消化得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA。

將此質體pGAP-cscA轉形到實施例7作成之MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株勝任細胞，於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基、Miller瓊脂平板於37℃培養一晚，藉此，得到MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株/pGAP-cscA株。

又，轉形到實施例6作成之MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株勝任細胞，於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基、Miller瓊脂平板，於37℃培養一晚，藉此得到MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株/pGAP-cscA株。

[實施例9] <lox基因之單離>

依據日本特開平10-248574揭示之L-乳酸氧化酶之鹼基序列，設計以下ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG(序列號碼37)、CAGGTACCTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列號碼38)所示2種寡核苷酸引子並合成。序列號碼37之引子於5’末端側具有XbaI認識部位及ldhA之SD序列。序列號碼38之引子於5’末端具有KpnI認識部位。從腸球菌(Enterococcus)sp.ATCC9625(日本特開平10-248574中，記述為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(subsp.Cremoris IFO3427)將染色體DNA單離，以此為模板進行PCR，將放大的DNA片段單離。將經放大之DNA片段精製，以XbaI消化。將實施例8得到之pBRgapP以限制酶XbaI及PshAI消化，將得到之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到的菌體回收質體pGAP-lox。

利用DNA定序儀，定序經單離之lox基因之鹼基序列。

[實施例10] <lldD之單離>

E.coli之基因體DNA之全部鹼基序列為公知，編碼為E.coli之FMN依存型L-乳酸脫水素酵素之基因(lldD)之鹼基序列亦有人報告。(Genbank accession number U00096、3777850~3779040)。為了選殖lldD，設計以下所示2種寡核苷酸引子：ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼39)、GATGGTACCCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼40)，並合成。

將E.coli K12株之基因體DNA以通常之方法單離，以得到的DNA作為模板，進行PCR。將經放大之DNA片段精製，以XbaI消化。將實施例8得到之pBRgapP以限制酶XbaI及PshAI消化，將得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到之菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到的菌體回收質體pGAP-lldD。利用DNA定序儀，定序單離之lldD之鹼基序列。

<變異lldD之製作>

為了製作變異lldD，使用上述使用之序列號碼39、序列號碼40所示寡核苷酸引子，以pGAP-lldD作為模板，依照GeneMorph(註冊商標)II Random Mutagenesis Kit(Stratagene)的實驗步驟，使用PCR製作lldD之變異基因。將經放大之DNA片段精製，以XbaI消化。將實施例8得到之將pBRgapP以限制酶XbaI及PshAI消化得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落植菌在於1井2ml容量之96孔深井盤添加有300μL培養基(1%葡萄糖，1.2%蛋白腖，2%酵母萃取物、(pH7.5))者，於33度攪拌培養24小時。培養終了後，收集菌體，除去上清後，加入200μl溶菌酵素液(0.285mg/mlLysozyme、1.5U/mlDNaseI、2mMMgC12)，以35次滴吸液混合。於35℃溫育15分鐘後，再以35次滴吸液混合，以目視確認已溶菌後，取10μl，添加於190μl反應液(20mg/ml phenazine methosulfate、3mg/ml 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide 0.5MKPB(pH7.0))。其次，添加40μl之100mM L-乳酸鈉(pH7.0)，觀察570nm之吸光度之增加速度。

從與控制組比較顯示1.5倍以上之增加速度的菌落萃取質體，以DNA定序儀，定序經單離之變異lldD之鹼基序列。序列如序列號碼41所示。得到的質體作為pGAP-變異lldD。

<Lox，LldD同時強化質體之構建>

將以pGAP-變異lldD作為模板，以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼28)為引子並利用PCR得到之lldD片段以限制酶SalI切斷，將經精製之片段與將pGAP-lox以限制酶SalI切斷的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。從得到之轉形體，得到質體pGAP-lox-變異lldD。以序列確認變異lldD之***方向。

[實施例11] <lctO之單離>

編碼為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)IL1403之L-乳酸氧化酶的基因之鹼基序列已公開。為了依據此(Genbank accession number AE006357、4813~3662)鹼基序列資訊，從L.lactis subsp.lactis ATCC 19435將L-乳酸氧化酶基因單離，設計以下AATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA(序列號碼43)、ACAGGTACCTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT(序列號碼44)所示2種寡核苷酸引子並合成。序列號碼43之引子於5’末端側具有XbaI認識部位及ldh之SD序列。序列號碼44之引子於5’末端具有KpnI認識部位。

將L.lactis subsp.lactis ATCC 19435之基因體DNA單離，以此作為模板，使用序列號碼43、44所示寡核苷酸引子，以通常條件進行PCR。將放大的DNA片段精製，以XbaI消化。將實施例8得到之pBRgapP以限制酶XbaI及PshAI消化，將藉此得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將得到的菌落以含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體得到含有lctO之質體，命名為pGAP-lctO。

以DNA定序儀，決定經單離之lctO之鹼基序列。

[實施例12] <乳酸生產用質體之構建>

將實施例8得到之pGAP-cscA以限制酶KpnI、SalI切斷，得到經精製之片段。將以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG(序列號碼45)、CAGTCGACTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列號碼46)作為引子，與實施例9同樣進行PCR後的lox的片段、以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼28)作為引子，與實施例10同樣進行PCR後的lldD的片段，及以AATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA(序列號碼47)、ACAGTCGACTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT(序列號碼48)作為引子，與實施例11同樣進行PCR後的lctO的片段，各以限制酶KpnI、SalI切斷，將上述得到的pGAP-cscA的片段與各片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。由得到的轉形體得到pGAP-cscA-lox、pGAP-cscA-lldD、pGAP-cscA-lctO。又，以大腸菌之基因體DNA作為模板，將以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼28)作為引子，利用PCR得到的lldD片段以限制酶SalI切斷，將經精製之片段與將pGAP-cscA-lox以限制酶SalI切斷的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。由得到的轉形體得到質體pGAP-cscA-lox-lldD。***方向以進行定序確認。又，將以大腸菌之基因體DNA作為模板，以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列號碼42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號碼28)作為引子，利用PCR得到的lldD片段以限制酶SalI切斷，將經精製的片段與將pGAP-cscA-lctO以限制酶SalI切斷的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。由得到之轉形體得到質體pGAP-cscA-lctO-lldD。將此等質體轉形到實施例7得到之MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株，得到pGAP-cscA-lox/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株、pGAP-cscA-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株，pGAP-cscA-lctO/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株、pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株、pGAP-cscA-lctO-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株。

[實施例13] <LldD強化之效果>

將質體pBRgapP、及pGAP-lldD轉形到於實施例6製作之MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株，製作pBRgapP/MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株及pGAP-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。

就前培養而言，於500ml容量之附擋板之三角燒瓶中放入100ml之含有50μg/ml濃度安皮西林之LB培養基(Difco cat.244620)，將上述D-乳酸生產菌各別植菌，於35℃、120rpm攪拌培養一晚後，各以0.5%植菌於在1L容量之培養槽(ABLE公司製培養裝置BMJ-01)中放有培養基(12%葡萄糖、3%玉米浸液：日本食品化工製Lot(190718C)以下同)500mL者。培養於大氣壓下、通氣量0.5vvm、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.2進行48小時。得到之培養液中之乳酸測定，以HPLC依定法測定。又，得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入次式求取。

結果如表1所示。如表1所示可明白：藉由強化lldD，得到之乳酸之光學純度提高。

<利用變異lldD得到之LldD強化之效果>

將實施例10得到之pGAP-變異lldD轉形到實施例6製作之MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株，製作pGAP-變異lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。就前培養而言，於500ml容量之附擋板之三角燒瓶中，放入100ml之含有50μg/ml濃度安皮西林之LB培養基(Difco cat.244620)，各植菌上述D-乳酸生產菌，於35℃、120rpm攪拌培養一晚後，植菌0.5%於在1L容量培養槽(APLE公司製培養裝置BMJ-01)中放有培養基(12%葡萄糖、5%玉米浸液)500mL者。培養於大氣壓下、通氣量0.5vvm、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.5進行30小時。得到之培養液中之乳酸測定，以HPLC依照定法測定。又，關於得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入次式並求取。

光學純度(%e.e.)=100×(D乳酸濃度-L乳酸濃度)/(D乳酸濃度+L乳酸濃度)。

為了比較，以同樣方式培養上述製作之變異導入前之pGAP-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。

結果如表2所示。如表2所示，藉由使用變異體lldD，可明白：與變異導入前之lldD比較，得到之乳酸之光學純度提高。

<lldR破壞之效果>

將實施例10得到之pGAP-lldD轉形到實施例6得到之lldR破壞株、MG1655△pfl△dld△mdh△asp△lldR/GAPldhA基因體***株，將得到菌落作為前培養，將上述D-乳酸生產菌植菌在500ml容量之附擋板之三角燒瓶中放入100ml之含有50μg/ml濃度安皮西林之LB培養基(Difco cat.244620)。於35℃、120rpm攪拌培養一晚後，各植菌0.5%於1L容量培養槽(ABLE公司製培養裝置BMJ-01)中放有培養基(12%葡萄糖、5%玉米浸液)500mL者。於大氣壓下、通氣量0.5vvm、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.5進行30小時培養。得到之培養液中之乳酸濃度之測定，係以HPLC依照定法測定。又，關於得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入次式並求取。

為了比較，以同樣方式培養lldR未經破壞之pGAP-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株。

結果如表3所示。如表3所示可明白：lldR之破壞，相較於lldR破壞前，得到之乳酸之光學純度提高。

<Lox強化之效果>

將實施例9得到之pGAP-lox及實施例10得到之pGAP-lox-變異lldD轉形到實施例6得到之lldR破壞株、MG1655△pfl△dld△mdh△asp△lldR/GAPldhA基因體***株，將得到之菌落作為前培養，各將上述D-乳酸生產菌植菌於500ml容量之附擋板之三角燒瓶中放入100ml之含有50μg/ml濃度安皮西林之LB培養基(Difco cat.244620)，。於35℃、120rpm攪拌培養一晚後，各植菌0.5%於在1L容量培養槽(ABLE公司製培養裝置BMJ-01)放有培養基(12%葡萄糖、5%玉米浸液)500mL者。於大氣壓下、通氣量0.5vvm、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.4進行24小時培養。得到之培養液中之乳酸濃度測定，以HPLC依照定法測定。又，關於得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入次式求取。

為了比較，以同樣方式培養上述得到之變異lldD強化株，即pGAP-變異lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△lldR/GAPldhA基因體***株。結果如表4所示。如表4所示可明白：Lox之強化具有利用變異lldD基因之強化以上之使光學純度提高的效果。明白：Lox與變異lldD之同時強化，使得到之乳酸之光學純度進一步提高。

<從糖蜜生產D-乳酸>

以實施例12得到之pGAP-cscA-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株、pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株作為前培養，各植菌放有於如表5所示前培養培養基20ml之100ml容量附擋板之三角燒瓶，於35℃、120rpm攪拌培養一晚。各植菌0.5%於放有如表6所示培養基500mL之1L容量培養槽(ABLE公司製培養裝置BMJ-01)。於大氣壓下、通氣量0.5vvm、攪拌速度350rpm、培養溫度35℃、pH7.5進行48小時培養。得到之培養液中之乳酸濃度測定，係以HPLC依照定法測定。又，關於得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，並代入次式求取。

高溫高壓滅菌後，pH7.8(以24%NaOH調整)

高溫高壓滅菌後，pH7.5(以24%NaOH調整)

作為比較，也以同樣方式培養將實施例8得到之pGAP-cscA重組到實施例7得到之MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株而成的pGAP-cscA/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株。

結果如表7所示。如表7所示可明白：以糖蜜為原料之情形亦為，藉由LldD、Lox之強化，得到之乳酸之光學純度提高。

<LctO強化之效果>

將實施例12得到之pGAP-cscA-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株，及pGAP-cscA-lctO-lldD/MG1655△pfl△dld△mdh△asp△fruR/GAPldhA基因體***株作為前培養，放入10g碳酸鈣(純正化學1級)，各植菌於在預先殺菌過之100ml容量附擋板之三角燒瓶已放入表8所示培養基20ml之燒瓶，於35℃、120rpm攪拌培養一晚。之後，放入10g碳酸鈣(純正化學1級)，於預先經殺菌之100ml容量附擋板之三角燒瓶中放有表8所示培養基20ml之燒瓶中，加入前培養液1ml，於35℃、100rpm攪拌培養24小時。

高溫高壓滅菌後，pH8.0(以24%NaOH調整)

培養終了時，得到之培養液中之乳酸測定以HPLC依照定法測定。又，關於得到之乳酸之光學純度，依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，代入次式求取。

結果如表9所示。如表9所示，確認：藉由lctO強化，得到之乳酸之光學純度提高。

--L-乳酸生產菌--

[實施例14] <源自雙叉桿菌屬之ldh2基因表現載體及該表現載體轉形體MG1655△pfl/pGAP-ldh2株之構建>

長雙叉桿菌(Bifidobacterium．longum)之NAD依存型L-乳酸去氫酶之胺基酸序列及基因之鹼基序列已有人報告。亦即，編碼為NAD依存型L-乳酸去氫酶之基因(ldh2)，係記載於GenBank accession number M33585記載之雙叉桿菌屬基因體序列之555~1517。

就為了使上述基因表現為必要之起動子之鹼基序列，於GenBank accession number X02662之鹼基序列資訊，可使用記為397-440之源自E.coli之甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之起動子序列。

為了取得GAPDH起動子，使用E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號碼33)、及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號碼34)以PCR法放大，將得到之DNA片段以限制酶NdeI消化，得到約110bp之相當於GAPDH起動子之DNA片段。將得到之DNA片段與將質體pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酶NdeI及PvuII消化得到之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到的菌體回收質體pBRgapP。

為了取得NAD依存型L-乳酸去氫酶基因，使用長雙叉桿菌(ATCC 15707)作為模板，利用AATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列號碼49)、及CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列號碼50)以PCR法放大，將得到的DNA片段以限制酶XbaI消化，得到約1.0kbp之L-乳酸去氫酶基因片段。將得到之DNA片段與將先前作成之質體pBRgapP以限制酶XbaI消化得到之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-ldh2。

將此質體pGAP-ldh2使用實施例3作成之pTH△pfl，與實施例2以同樣手法轉形到使pfl基因缺失之MG1655株(稱為MG1655△pfl株)之勝任細胞，藉由於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基、Miller瓊脂平板於37℃培養一晚，得到MG1655△pfl/pGAP-ldh2株。

[實施例15] <利用MG1655△pfl/pGAP-ldh2株生產L-乳酸>

與實施例13以同樣方式，檢查MG1655△pfl/pGAP-ldh2株從葡萄糖生產L-乳酸。

與實施例13以同樣方法，將經前培養之燒瓶內容物25ml植菌於放有下列表10所示培養基475g者。

於大氣壓下、通氣量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.5(以24%NaOH調整)進行18小時培養。

培養18小時後，培養液中之L-乳酸濃度為97.02g/L。

由此結果，確認使用源自雙叉桿菌屬之NAD依存型L-乳酸去氫酶，能從葡萄糖生產L-乳酸。

[實施例16] <MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株/pGAP-ldh2株之構建>

製作將實施例14作成之pGAP-ldh2質體導入於實施例6構建之D-乳酸生產株而成的轉形體。具體而言如以下方式進行。

將質體pGAP-ldh2轉形到於實施例6作成之MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株之勝任細胞。藉由於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基，Miller瓊脂平板於37℃培養一晚，得到MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株/pGAP-ldh2株。

[實施例17] <利用MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株/pGAP-ldh2株生產L-乳酸>

與實施例13以同樣方式，檢查MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株/pGAP-ldh2株從葡萄糖生產L-乳酸生產。

培養，係於大氣壓下、通氣量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養溫度35℃、pH7.5(以24%NaOH調整)進行18小時。

培養18小時後，培養液中之L-乳酸濃度為116.84g/L。

由此結果，確認藉由在D-乳酸生產大腸菌株嵌入質體pGAP-ldh2，能以葡萄糖作為原料生產L-乳酸。已生產L-乳酸，可依照F-套組D-/L-乳酸(J．K International製品號碼1112821)，測定L-乳酸量、及D-乳酸量以確認。

[實施例18] <MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△ldhA/GAPldh2基因體***株之構建>

將實施例15使用之D-乳酸生產用大腸菌株(MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株)之ldhA基因取代為ldh2基因，再破壞催化L-乳酸之分解之酵素之基因lldD，構建L-乳酸生產用大腸菌株。具體而言，以下列方式進行。

(ldhA基因破壞株之製作)

依據MG1655基因體DNA之ldhA基因附近區域之基因資訊，合成以下4種寡核苷酸引子：AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號碼21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列號碼22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(序列號碼51)及AACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(序列號碼52)。使用此等引子，與實施例1以同樣手法構建基因破壞用質體pTH△ldhA。又，將pTH△ldhA轉形到MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株勝任細胞，使用與實施例2同樣手法，選擇ldhA缺失株。將得到之菌株命名為MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***△ldhA株。

(dld基因回復株之製作)

依據大腸菌MG1655基因體DNA之dld基因附近區域之基因資訊，合成以下2種寡核苷酸引子：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列號碼1)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列號碼4)。使用此等引子，以大腸菌MG1655之基因體DNA作為模板，實施PCR，並將得到之DNA片段以限制酶HindIII、XbaI切斷。又，將質體pTH18cs1以限制酶HindIII、XbaI切斷，並與上述dld片段混合後，以接合酶結合，構建質體pTHDLD。又，將pTHDLD轉形到MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因體***株勝任細胞，使用與實施例2同樣手法，選擇dld回復株。將得到之菌株命名為MG1655△pfl△mdh△asp/GAPldhA基因體***△ldhA株。

(lldD基因破壞株之製作)

依據MG1655株基因體DNA之lldD基因附近區域之基因資訊，合成以下4種寡核苷酸引子：GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(序列號碼53)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(序列號碼54)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(序列號碼55)及CGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(序列號碼56)。使用此等引子，與實施例1以同樣手法構建基因破壞用質體pTH△lldD。又，將pTH△lldD轉形到MG1655△pfl△mdh△asp/GAPldhA基因體***△ldhA株勝任細胞，使用與實施例2同樣手法，選擇lldD缺失株。將得到之菌株命名為MG1655△pfl△mdh△asp△lldD/GAPldhA基因體***△ldhA株。

(ldh2基因基因體***株之製作)

長雙叉桿菌之NAD依存型L-乳酸去氫酶之胺基酸序列與基因之鹼基序列已有人報告。亦即，編碼為NAD依存型L-乳酸去氫酶之基因(ldh2)記載於GenBank accession number M33585記載之雙叉桿菌屬基因體序列之555~1517。

為了取得編碼為L-乳酸去氫酶之基因(ldh2)，使用長雙叉桿菌(ATCC15707)之基因體DNA作為模板，合成以下2種寡核苷酸引子：AAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列號碼57)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列號碼50)。使用此等引子，實施PCR，將得到之DNA片段以限制酶EcoRI、及XbaI切斷。

為了取得GAPDH起動子，使用E.coli MG1655株之基因體DNA作為模板，合成2種寡核苷酸引子：GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號碼58)、CGGAATTCCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAG(序列號碼59)。將得到的DNA片段以限制酶EcoRI、及XbaI切斷。

將實施例15得到之pTH△ldhA以XbaI切斷得到之質體、上述得到之源自長雙叉桿菌之ldh2之EcoRI-XbaI片段、及源自大腸菌之GAPDH起動子之EcoRI-XbaI片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pTH△ldhA：：GAPldh2。將得到的質體轉形到MG1655△pfl△mdh△asp△lldD/GAPldhA基因體***△ldhA株，與實施例2使用同樣方法，以ldh2藉由PCR放大而選擇ldh2基因體***株。

得到之菌株命名為MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△ldhA/GAPldh2基因體***株。

[實施例19] <MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△ldhA/GAPldh2基因體***/pGAP-cscA株之構建>

將蔗糖水解酶(轉化酶)基因表現載體導入到實施例16構建之L-乳酸生產用大腸菌株，構建從蔗糖生產L-乳酸之大腸菌株。具體而言，如以下方式進行。

將實施例8構建之質體pGAP-cscA轉形到實施例16作成之MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△ldhA/GAPldh2基因體***株勝任細胞，於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基、Miller瓊脂平板於37℃培養一晚，藉此得到MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△ldhA/GAPldh2基因體***/pGAP-cscA株。

[實施例20] <源自大腸菌之FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌之構建>

依據MG1655株基因體DNA之dld基因附近區域之基因資訊，合成以下2種寡核苷酸引子：CGGGTACCTTCGCCACCACAAGGAGTGGA(序列號碼60)、GGTCTAGAGTCGACTTACTCCACTTCCTGCCAGTT(序列號碼61)。使用此等引子實施PCR，將得到的DNA片段以限制酶KpnI、及SalI切斷，將此片段與將實施例8製作之pGAP-cscA以KpnI、SalI切斷得到的片段混合，使用接合酶結合後，轉形為E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA-dld(EC)。

[實施例21] <源自谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)之FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌之構建>

源自谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)之FAD依存型D-乳酸去氫酶之胺基酸序列及基因之鹼基序列，記載於GenBank accession number BX927150記載之谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)基因體序列之261009~259294。

為了取得編碼為FAD依存型D-乳酸去氫酶之基因(dld)，使用谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(NBRC12168)之基因體DNA作為模板，合成2種寡核苷酸引子：GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGACGCAACCAGGACAG(序列號碼62)、TGGGTACCTTAGGCCCAGTCCTTGTGCGGCGACGTGC(序列號碼63)。谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(NBRC12168)可從NITE生物資源中心(NITE Biological Resource Center)取得。使用此等引子而實施PCR，將得到之DNA片段以限制酶KpnI切斷。將此片段與將實施例8製作之pGAP-cscA以KpnI切斷之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到之菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA-dld(CG)。

[實施例22] <源自運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)之FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌之構建>

源自運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)之FAD依存型D-乳酸去氫酶之胺基酸序列與基因之鹼基序列，記載於GenBank accession number AE008692記載之運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)基因體序列之256658~258382。

為了取得編碼為FAD依存型D-乳酸去氫酶之基因(dld)，使用運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)(ATCC 31821)之基因體DNA作為模板，合成以下2種寡核苷酸引子：GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGTGCAGCTTCCTTC(序列號碼64)、GTGGTACCCTATCTCCAATAAGCGGCCTTGCTGGTATG(序列號碼65)，並實施PCR。將得到的DNA片段以限制酶KpnI切斷。將此片段與將實施例8製作之pGAP-cscA以KpnI切斷之片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到之菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA-dld(ZM)。

[實施例23] <源自野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)之FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌之構建>

源自野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)之FAD依存型D-乳酸去氫酶之胺基酸序列與基因之鹼基序列，記載於GenBank accession number AE012169記載之野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)基因體序列之10284~8890。

為了取得編碼為FAD依存型D-乳酸去氫酶之基因(dld)，使用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)(ATCC 33913)之基因體DNA作為模板，合成以下2種寡核苷酸引子：AACCCGGGCGGAGAAAGTCTTATGACTGATGGACTTCCCACCGC(序列號碼66)、ATCCCGGGTCACTCTGCGGGCGATGTGGGCAGCACCTTGCCCGGATTC(序列號碼67)，並實施PCR。將得到之DNA片段以限制酶SmaI切斷。將此片段與將實施例8製作之pGAP-cscA以KpnI切斷並使用DNA Blunting Kit(TAKARA Cat.6025)將限制酶切斷處平滑化後的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA-dld(XC)。

[實施例24] <源自水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae)之FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌之構建>

源自水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae)之FAD依存型D-乳酸去氫酶之胺基酸序列與基因之鹼基序列，記載於GenBank accession number AE013598記載之水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae)基因體序列之4098235~4099662。

為了取得編碼為FAD依存型D-乳酸去氫酶之基因(dld)，使用水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae)(JCM 20241)之基因體DNA作為模板，合成以下2種寡核苷酸引子：TTGGTACCGGAGAAAGTCTTATGACCGATGTACTTCCCACCGCAC(序列號碼68)、TTGGTACCTAGGCGGGCGGCAACACCTTGCCAGGATTCAAGATCCCA(序列號碼69)，並實施PCR。將得到的DNA片段以限制酶KpnI切斷。將此片段與將實施例8製作之pGAP-cscA以Kpn I切斷後的片段混合，使用接合酶結合後，轉形到E.coli DH5α株勝任細胞(東洋紡績(股)公司DNA-903)，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將得到的菌落於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到之菌體回收質體pGAP-cscA-dld(XO)。

JCM 20241可從日本微生物菌種中心(Japan Collection of Microorganisms)取得。

[實施例25] <由D-lactate dehydrogenase,membrane binding domein保有/非保有FAD依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌生產之L-乳酸之光學純度>

將實施例18構建之MG1655△pfl△mdh△asp△lldD△fruR△ldhA/GAPldh2基因體***株轉形到以下各質體，並製作來源不同之FA D依存型D-乳酸去氫酶表現大腸菌。

(A)：實施例8得到之pGAP-cscA

(B)：實施例20得到之pGAP-cscA-dld(EC)

(C)：實施例21得到之pGAP-cscA-dld(CG)

(D)：實施例22得到之pGAP-cscA-dld(ZM)

(E)：實施例23得到之pGAP-cscA-dld(XC)

(F)：實施例24得到之pGAP-cscA-dld(XO)

於放有表11所示前培養培養基20ml之100ml容量附擋板之三角燒瓶，植菌各FAD依存型D-乳酸去氫酶表現株作為前培養，於35℃、120rpm攪拌培養一晚。之後，放入10g碳酸鈣(純正化學 1級)，將前培養液1ml放入放有表12所示培養基20ml 之預先經殺菌之100ml容量附擋板之三角燒瓶，於35℃、100rpm攪拌培養24小時。

培養終了後，以離心分離得上清。光學純度，可依照F-套組D-/L-乳酸(J‧K International製品號碼1112821)，測定得到之上清中之L-乳酸量、及D-乳酸量，並代入次式求取。

光學純度(%e.e.)=100×(L乳酸濃度-D乳酸濃度)/(L乳酸濃度+D乳酸濃度)。

結果如表13所示。如表13所示可明白：具有Lact-deh-memb分域，且表現源自大腸菌、谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glut amicum)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)之dld的大腸菌，可於短時間達成尤高光學純度。

2008年9月16日提申之日本申請號碼第2008-237177號、2009年2月13日提申之日本申請號碼第2009-32042號及2009年2月13日提申之日本申請號碼第2009-32043號的揭示，其全體納入本說明書作為參照。

本說明書記載之所有文獻、專利申請案、及技術規格，以各文獻、專利申請案、及技術規格作為參照納入，係與具體分別記載時以同程度納入本說明書中作為參照。

<110> Mitsui Chemicals,Inc.

<120> Lactate-producing bacteria and method for producing lactate using the same

<130> MT-F03071-00

<150> JP2008-237177

<151> 2008-09-16

<150> JP2009-32042

<151> 2009-02-13

<150> JP2009-32043

<151> 2009-02-13

<160> 69

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims

一種乳酸生產大腸菌，係將1種以上之NAD依存型乳酸去氫酶及1種以上之非NAD依存型乳酸氧化還原酶之各酵素活性一同強化，以使得D-乳酸及L-乳酸其中之一分解而生產其中另一者；為D-乳酸生產的情形時，該NAD依存型乳酸去氫酶之活性強化係LdhA之活性強化，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶之活性強化係LldD之活性強化、Lox之活性強化、LctO之活性強化、LldR之失活或減低化、或此等的2者以上的組合；為L-乳酸生產的情形時，該NAD依存型乳酸去氫酶之活性強化係NAD依存型L-乳酸去氫酶之活性強化，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶之活性強化係利用具Lact deh memb分域之Dld所為之Dld之活性強化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為D-乳酸生產的情形，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係LldD之活性強化、與選自於由LldR之失活或減低化、Lox之活性強化及LctO之活性強化構成之群組中之1者以上的組合，或者，LldR之失活或減低化與Lox之活性強化之組合。
如申請專利範圍第2項之乳酸生產大腸菌，其中，為D-乳酸生產的情形，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化，係利用於編碼為LldD之基因之ORF中之33位具有靜默變異之變異體lldD基因的表現，變異體LldD，係以序列號碼41之鹼基序列表示。
如申請專利範圍第3項之乳酸生產大腸菌，其中，為D-乳酸生產的情形，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係LldD之活性強化與LldR之失活或減低化與Lox之活性強化之組合，或者，LldD之活性強化與Lox之活性強化之組合。
如申請專利範圍第3項之乳酸生產大腸菌，其中，為D-乳酸生產的情形，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶酵素之活性強化係LldD之活性強化與LldR之失活或減低化與Lox之活性強化之組合，或者，LldD之活性強化與Lox之活性強化之組合。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為D-乳酸生產的情形，選自由Dld活性及Pfl活性構成之族群中至少其中之一係失活或減低化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為L-乳酸生產的情形，該非NAD依存型乳酸氧化還原酶之活性強化係利用具Lact deh memb分域及FAD-Oxidase C分域之Dld所為之Dld之活性強化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為L-乳酸生產的情形，該L-乳酸去氫酶，係源自雙叉桿菌屬菌。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為L-乳酸生產的情形，該Dld係源自由大腸菌、發酵單胞菌屬及棒狀桿菌屬構成之族群中至少1種。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，為L-乳酸生產的情形，LdhA活性、LldD活性及Pfl活性其中至少1種係失活或減低化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，由選自Mdh及AspA之活性構成之族群中至少1種係失活或減低化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，選自蔗糖非PTS基因群及FruK構成之族群中至少1種係經強化。
如申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌，其中，FruR活性係經失活或減低化。
一種乳酸生產方法，係使用申請專利範圍第1項之乳酸生產大腸菌而生產乳酸。
一種D-乳酸生產方法，係使用申請專利範圍第3項之乳酸生產大腸菌而生產D-乳酸。
一種L-乳酸生產方法，係使用申請專利範圍第7項之乳酸生產大腸菌而生產L-乳酸。