JPWO2005024430A1

JPWO2005024430A1 - タンパク質の分析方法およびそれに用いるタンパク質分析試薬

Info

Publication number: JPWO2005024430A1
Application number: JP2005513631A
Authority: JP
Inventors: 進西野; 雅司岡本
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2003-09-03
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-11-02
Also published as: EP1662260A1; CN1777811A; EP1662260A4; US20060177938A1; WO2005024430A1

Abstract

高濃度のタンパク質試料であっても、タンパク質の凝集が防止され、それに起因する反応液の粘性の高まりが防止された、Ｂｉｕｒｅｔ反応によるタンパク質の分析方法を提供する。タンパク質を含む試料を、水酸化ナトリウム溶液等を添加することによってアルカリ性にし、これにカオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を加えてＢｉｕｒｅｔ反応を起こし、その着色程度を測定することによりタンパク質の分析を行う。前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ３イオン、ＣｌＯ４イオン、ＢｒイオンおよびＣｌイオンがある。

Description

本発明は、タンパク質の分析方法およびそれに使用するタンパク質分析試薬に関する。

医学、薬学、生物学、農学等のさまざまな分野において、試料中のタンパク質の分析が行われている。タンパク質の分析方法としては、例えば、乾燥重量法、Ｋｊｅｄａｈｌ法、Ｂｉｕｒｅｔ法、Ｌｏｗｒｙ法、ビジンコニン酸法、紫外線吸収法、色素結合法および比濁法等がある。これらの中でも、Ｂｉｕｒｅｔ法は、操作が簡便であること、試料中のタンパク質の種類が異なった場合においても単位重量あたりの発色率にあまり差異がないこと等から汎用されている。

Ｂｉｕｒｅｔ法とは、タンパク質と銅イオンとが反応することにより、錯体を形成し、それによって紫色に呈色することを利用したタンパク質の分析方法である。この呈色反応を、吸光度や反射率として光学的に測定することで、タンパク質の濃度が測定できる（例えば、非特許文献１参照。）。前記銅イオン源としては、硫酸銅が使用される。
「新生化学実験講座タンパク質Ｉ分離・精製・性質」（社）日本生化学会（株）東京化学同人１９９０年９１頁

しかしながら、Ｂｉｕｒｅｔ法では、タンパク質の凝集に起因して反応液の粘性が高まるという問題がある。この粘性が高まるという問題は、高濃度のタンパク質試料において深刻な問題である。例えば、臨床検査で使用される検体分析用具（以下、試験片ともいう）は、ろ紙等の担体にＢｉｕｒｅｔ試薬を乾燥状態で担持させ、ここに、尿や血液等の生体試料をそのまま供給し、反応させることから、反応液中のタンパク質濃度は高濃度である。したがって、粘性が高い状態でＢｉｕｒｅｔ反応の呈色を光学的に分析すると、その分析精度に問題が生じる。

そこで、本発明の目的は、分析精度に優れるタンパク質の分析方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の分析方法は、試料中のタンパク質の分析方法であって、前記試料がアルカリ性であり、これにカオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を加えてＢｉｕｒｅｔ反応を起こし、このＢｉｕｒｅｔ反応を光学的に分析する方法である。

本発明のタンパク質の分析方法は、タンパク質の凝集が防止され、これに起因する粘性の高まりも防止されるため、分析精度に優れる。本発明によれば、特に、高濃度のタンパク質試料であっても、反応液の粘性の高まりが防止でき、高精度でタンパク質濃度を分析できる。

［図１］実施例１と比較例１との相関関係を示すグラフである。

本発明者らは、前記目的を達成するために、タンパク質凝集の原因解明を中心に、一連の研究を重ねた。その過程で、従来からＢｉｕｒｅｔ法で使用される硫酸銅が、タンパク質の凝集の原因であることを突き止めた。そして、さらに研究を重ねたところ、カオトロピックイオンを含む塩類を使用すれば、タンパク質の凝集を防止することを見出し、本発明に到達した。

カオトロピックイオンがタンパク質の凝集を防止する理由は、次のように推察される。すなわち、タンパク質の凝集は、疎水結合が大きく寄与している。一方、カオトロピックイオンは、水中において疎水性分子の水溶性を高め、疎水結合を弱める作用がある。したがって、カオトロピックイオンがタンパク質の疎水結合を弱めることによって、タンパク質の凝集が防止されると考えられる。

本発明のタンパク質の分析方法において、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類として、カオトロピックイオンの２価銅塩類を使用することが好ましい。

本発明の分析方法において、前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオン、Ｂｒイオン、Ｃｌイオン等がある。この中で好ましいのは、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオン、Ｂｒイオンであり、より好ましいのは、ＳＣＮイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオンである。

本発明の分析方法において、前記２価銅塩類としては、ＣｕＳＯ_４、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、ＣｕＢｒ_２、ＣｕＣｌ_２およびＣｕ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２等がある。この中で好ましいのはＣｕ（ＣｌＯ_４）_２、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、ＣｕＢｒ_２、ＣｕＣｌ_２であり、より好ましいのは、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２である。

本発明の分析方法において、前記カオトロピックイオンの２価銅塩類としては、例えば、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、ＣｕＢｒ_２およびＣｕＣｌ_２等がある。この中で好ましいのは、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、ＣｕＢｒ_２であり、より好ましいのは、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２である。

本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合、前記カオトロピックイオンの添加量は、例えば、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。

本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合、前記２価銅塩類の添加量は、例えば、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。

本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合、前記カオトロピックイオンの２価銅塩類の添加量は、例えば、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。

なお、前記試料の希釈濃度としては、例えば、１／５０希釈があげられる。また、本発明において、液系分析においても、試料を希釈せずに用いる場合もあるし、ドライ系分析においても、試料を希釈して用いる場合もある。液系分析とは、試薬液を用いた分析手法であり、例えば、一般の実験等で使用される。ドライ系分析とは、試薬等を乾燥状態で使用する分析手法であり、例えば、臨床検査等で用いる検体分析用具（若しくは試験片）に適用される分析手法である。

本発明の分析方法において、ドライ系分析の場合若しくは試料を希釈することなく用いる場合、前記カオトロピックイオンの添加量は、例えば、１００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲であり、好ましくは５００ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲である。

本発明の分析方法において、ドライ系分析の場合若しくは試料を希釈することなく用いる場合、前記２価銅塩類の添加量は、例えば、１００ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲であり、好ましくは２００ｍＭ〜５００ｍＭの範囲である。

本発明の分析方法において、ドライ系分析若しくは試料を希釈することなく用いる場合、前記カオトロピックイオンの２価銅塩類の添加量は、例えば、１００ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲であり、好ましくは２００ｍＭ〜５００ｍＭの範囲である。

本発明において、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類、もしくはカオトロピックイオンの２価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を用いてもよい。前記アルカリ性剤としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２等がある。このうちどれでも好ましく使用できるが、分析用具へ加工する際に特に有用なのは、ＬｉＯＨである。

本発明の分析方法において、前記試料が、カオトロピックイオンおよび２価の銅イオンと試料中のタンパク質との反応時にアルカリ性であればよく、例えば、試料を予めアルカリ性に調整しておいても、カオトロピックイオンおよび２価の銅イオンと試料との混合時に、前述のようなアルカリ性剤を混合してもよい。本発明の分析方法において、前記アルカリ性試料の反応時のｐＨは、例えば、ｐＨ９以上の範囲であり、好ましくはｐＨ１１以上の範囲である。

本発明の分析方法において、前記試料中のタンパク質濃度は、例えば、０〜１５ｇ／ｄＬ（１００ｍＬ）の範囲である。通常のＢｉｕｒｅｔ反応でタンパク質測定を行う濃度範囲と同等の範囲である。

また、本発明において、タンパク質という語は、ポリペプチドを含む趣旨である。

本発明の分析方法において、前記光学的に分析する方法としては、例えば、Ｂｉｕｒｅｔ反応による前記試料の着色程度の分析がある。また、前記試料の着色程度の分析は、目視判定でもよいし、装置による吸光度測定若しくは反射率測定であってもよい。また、前記光学的に分析する方法は、定性分析若しくは定量分析のいずれであってもよい。

つぎに、本発明の試薬は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬であって、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を含む試薬である。

本発明の試薬において、前記カオトロピックイオンおよび前記２価銅塩類としては前述のものがあげられる。また、前記試薬は、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。

さらに、本発明の試薬は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬であって、カオトロピックイオンの２価銅塩類を含む試薬である。

本発明の試薬において、前記カオトロピックイオンの２価銅塩類としては、例えば、前述のものがあげられる。また、前記試薬は、カオトロピックイオンの２価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。

本発明の試薬は、例えば、試料に滴下することや、マイクロプレート上で凍結乾燥させてドライ化すること、後述するように検体分析用具に配置すること等により使用できる。

つぎに、本発明の検体分析用具は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するものであって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を含む検体分析用具である。

本発明の検体分析用具において、前記カオトロピックイオンおよび前記２価銅塩類としては、前述のものがあげられる。また、本発明の検体分析用具は、前記試薬が、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。

さらに、本発明の検体分析用具は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するものであって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンの２価銅塩類を含む検体分析用具である。

本発明の検体分析用具において、前記カオトロピックイオンの２価銅塩類としては、前述のものがあげられる。また、本発明の検体分析用具は、前記試薬が、カオトロピックイオンの２価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。

つぎに、本発明によるタンパク質の分析方法は、例えば、以下のようにして実施できる。

まず、本発明の分析方法を液系分析に適用した例を説明する。例えば、血液等のタンパク質を含む試料を、必要に応じて水に懸濁し、さらにアルカリ性剤を添加し、ｐＨを前記所定の範囲に調整する。前記試料溶液に、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を含む試薬を添加し、撹拌すると、前記試料中のタンパク質と銅イオンとが錯体を形成し、前記試薬添加後、例えば、１０秒〜１５分間で発色する。この変化は、目視で確認してもよいし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。この発色の程度を測定することにより、タンパク質の定性若しくは定量分析が可能である。例えば、予め検量線を作成しておけば、Ｂｉｕｒｅｔ反応の着色程度からタンパク質の濃度を決定することができる。反応温度は、例えば、一般の分析装置における通常の調節温度である、室温から３７℃前後までの範囲があげられる。

つぎに、本発明の分析方法を検体分析用具に適用した例を説明する。例えば、カオトロピックイオンの２価銅塩類をアルカリ性の水に溶解して試薬溶液を調製する。この試薬溶液のｐＨは、試料を添加した時に前記所定のｐＨになるような範囲に調整しておく。そして、ろ紙等の多孔質の担体に、前記試薬溶液を含浸させ、その後乾燥させる。前記担体としては、特に制限されないが、ろ紙の他に、例えば、プラスチック製の多孔質シートを使用してもよい。このように前記試薬を担持した担体を、そのまま検体分析用具としてよいし、この担体をさらに別の基板シート等に担持させて検体分析用具としてもよい。このような検体分析用具の担体に、血液等のタンパク質を含む試料を供給すると、試料供給後、例えば、１０秒〜１５分間で発色する。この発色の程度を、目視で確認したり、反射率計等で測定したりすることにより、タンパク質の定性若しくは定量分析が可能である。例えば、予め検量線を作成しておけば、Ｂｉｕｒｅｔ反応の着色程度からタンパク質の濃度を決定することができる。
また、前記担体は、例えば、光透過性物質で形成された試料溶液の流路を有する物であってもよく、この場合、前記溶液の流路に、カオトロピックイオンの２価銅塩類を含む試薬を配置すればよい。

以下に示すようにして、試薬を調製し、タンパク質分析を行った。

ヒト血清アルブミン（シグマ社製）を添加したヒト血清および無添加のヒト血清（１２０例）を検体として用いた。

下記マイクロプレート試薬を調製し、ついで、９６ウェルマイクロプレートに５０μＬずつ分注して凍結乾燥させた。

（マイクロプレート試薬）
酒石酸９．０ｇ
水酸化リチウム１２．６ｇ
過塩素酸銅１４．８ｇ
蒸留水１００．０ｇ

つぎに、凍結乾燥させたぞれぞれの試薬に、前記検体５０μＬを加え、室温で８分間反応させ、ついで、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定には、マイクロプレート吸光測定装置（サーモラボシステムズ社製：商品名マルチスキャンアセン）を使用した。

（比較例１）
実施例１と同様の検体５μＬと下記溶液系試薬３５０μＬとを混合して、室温で１０分間反応させ、ついで、波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定には、自動分析装置（日立社製：商品名７０７０形）を使用した。

（溶液系試薬）
酒石酸９．０ｇ
水酸化ナトリウム１２．６ｇ
硫酸銅１４．８ｇ
ヨウ化カリウム０．１ｇ
蒸留水１００．０ｇ

つぎに、既知濃度のウシ血清アルブミン溶液および蒸留水から検量線を求め、タンパク質濃度を算出した。

図１は、実施例１と比較例１とを比較した相関性の結果を示すグラフであり、図中の式は前記相関関係を表す式を示し、Ｒ^２は相関係数を示す。なお、図１において、実施例１がドライ法であり、比較例１が溶液法である。

図１に示すように、実施例１と比較例１との間には高い相関性がみられた。

以下に示すように、試薬と試料溶液とを調製し、タンパク質分析を行った。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（シグマ社製）の濃度を３０ｇ／ｄＬ（１００ｍＬ）に調製し、それを用いて、後述する濃度のＨＳＡ溶液を作製した。

まず、下記試薬溶液Ａを調製し、前記試薬溶液Ａ２００μＬと、試料４００μＬとを室温で８分間反応させた。そして、その反応液をセル長１ｍｍの透明セルに分注し、波長５５０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（日本分光株式会社製：商品名Ｖ−５５０）により吸光度測定を行った。その結果を下記表１に示す。

（試薬溶液Ａ）
酒石酸１．３５ｇ（２．０００Ｍ）
水酸化リチウム１．８９ｇ（１０．０００Ｍ）
過塩素酸銅２．２２ｇ（１．３３３Ｍ）
蒸留水５．００ｇ

（比較例２）
試薬溶液として下記試薬溶液Ｂを使用した以外は、実施例２と同様にして吸光度測定を行った。その結果を下記表１に示す。

（試薬溶液Ｂ）
酒石酸１．３５ｇ（２．０００Ｍ）
水酸化リチウム１．８９ｇ（１０．０００Ｍ）
硫酸銅１．５０ｇ（１．３３３Ｍ）
蒸留水５．００ｇ

前記表１において、○は、反応液をセルに分注可能であったことを示し、×は、反応液の粘性が高かったため、セルに分注できなかったことを示し、−は、セルに分注できなかったため、吸光度が測定できなかったことを示す。なお、反応液がセル内を移動できなかった状態およびピペットにより反応液を吸引できなかった状態を、分注できなかったとした。

前記表１に示すように、比較例２（従来法）では、ＨＳＡ（タンパク質）終濃度が１１ｇ／ｄＬ以上であると、セルに分注できない程度にまで粘性が高まった。これに対し、実施例２に示すように、ＨＳＡ（タンパク質）終濃度が１０ｇ／ｄＬを超える高濃度の試料においても、高い分析精度で測定できた。これにより、本発明によれば、ドライ試薬が仕込まれた分析用具においても、ドライ試薬が完全に溶解し、試料と試薬とをムラなく均一に混和できた。

本発明のタンパク質の分析方法は、タンパク質の凝集が防止され、これに起因する粘性の高まりも防止されるため、分析精度に優れる。したがって、本発明の分析方法によれば、医学、薬学、生化学などのあらゆる分野におけるタンパク質分析の精度を向上させることができ、特に、高濃度のタンパク質を分析する必要がある分野、例えば、臨床検査における検体分析用具を用いたタンパク質分析に有用である。

Claims

試料中のタンパク質の分析方法であって、前記試料がアルカリ性であり、これにカオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を加えてＢｉｕｒｅｔ反応を起こし、このＢｉｕｒｅｔ反応を光学的に分析する方法。
前記カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類として、カオトロピックイオンの２価銅塩類を使用する請求の範囲第１項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンが、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオン、ＢｒイオンおよびＣｌイオンからなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第１項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンの２価銅塩類が、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、ＣｕＢｒ_２およびＣｕＣｌ_２からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第２項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンの添加量が、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンの添加量が、１００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記２価銅塩類の添加量が、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記２価銅塩類の添加量が、１００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンの２価銅塩類の添加量が、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である請求の範囲第２項に記載の方法。
前記カオトロピックイオンの２価銅塩類の添加量が、１００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲である請求の範囲第２項に記載の方法。
前記アルカリ性の試料のｐＨが、ｐＨ９以上の範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記試料中のタンパク質濃度が、０〜１５ｇ／１００ｍＬの範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記光学的に分析する方法が、前記試料の着色程度の分析である請求の範囲第１項に記載の方法。
前記試料の着色程度の分析が、目視判定または装置による吸光度測定若しくは反射率測定である請求の範囲第１３項に記載の方法。
前記光学的に分析する方法が、定性分析若しくは定量分析である請求の範囲第１項に記載の方法。
請求の範囲第１項に記載のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬であって、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を含む試薬。
請求の範囲第２項に記載のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬であって、カオトロピックイオンの２価銅塩類を含む試薬。
前記カオトロピックイオンが、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオン、ＢｒイオンおよびＣｌイオンからなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第１６項に記載の試薬。
前記カオトロピックイオンの２価銅塩類が、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、ＣｕＢｒ_２およびＣｕＣｌ_２からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第１７項に記載の試薬。
請求の範囲第１項に記載のタンパク質分析方法に使用する検体分析用具であって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を含む検体分析用具。
請求の範囲第２項に記載のタンパク質分析方法に使用する検体分析用具であって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンの２価銅塩類を含む検体分析用具。
前記カオトロピックイオンが、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ_３イオン、ＣｌＯ_４イオン、ＢｒイオンおよびＣｌイオンからなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第２０項に記載の検体分析用具。
前記カオトロピックイオンの２価銅塩類が、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２、Ｃｕ（ＣｌＯ_４）_２、ＣｕＢｒ_２およびＣｕＣｌ_２からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲第２１項に記載の検体分析用具。