CZ30831U1

CZ30831U1 - Diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu, kreatininu a peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku

Info

Publication number: CZ30831U1
Application number: CZ2017-33695U
Authority: CZ
Inventors: Dagmar Uhlířová; Michaela Dočekalová; Martina Staňková; Lukáš Melichar; Josef Růžička; René Kizek
Original assignee: Prevention Medicals s.r.o.
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2017-07-11

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká diagnostického proužku pro enzymatický test na stanovení množství sarkosinu a kreatininu na základě vzniklého peroxidu vodíku v biologickém vzorku nebo v environmentálním vzorku.

Dosavadní stav techniky

Rychlý rozvoj analytických metod umožnil vývoj přenosných způsobů identifikace vybraných analytů (látek) jak v prostředí, tak v biologickém vzorku [1-3]. Pro měření koncentrace jednotlivých analytů v biologických tekutinách byla vyvinuta celá řada testovacích zařízení. Taková zařízení byla navržena pro měření například hladiny glukosy, cholesterolu, proteinů, ketonů, fenylalaninu nebo enzymů v krvi, moči, spermatu, slinách. Suché reagenční proužky se používají v klinických laboratořích, ordinacích a domácnostech pro stanovení uvedených analytů ve vzorcích tělesných tekutin. Analýza pomocí enzymatických testů je jednoduchá, časově nenáročná, nevyžadující specializovanou obsluhu. Metodu kvantitativní detekce sarkosinu ve vzorku moči pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie uvádí spis CN102662013 nebo CN 1026800599. Detekci sarkosinu pomocí zařízení na bázi elektroforézy- elektrochemiluminiscence popisuje například dokument CN 101718746. Kvantitativní rutinní stanovení sarkosinu je však stále náročné na přístrojové vybavení, často vyžaduje chemickou úpravu biologického vzorku a není dostatečně citlivé a přesné.

Byly popsány detekční proužky z plastického materiálu, které obsahují více zón (část s mobilizovaným enzymem, chromogenní substrát, srovnávací etalon). Významné postavení mají detektory inhibice acetylcholinesterázy pro zachycení bojové chemické látky, pesticidů, organofosfátů. Diagnostické testovací proužky slouží pro rychlou semikvantitativní analýzu moči, séra, krve. Uvedená technologie je široce využívána pro stanovení především glukózy [4]. Umožňují snadno a rychle testovat klinicky významné analyty v moči, séru, krvi a vyvodit tak určité závěry o přítomnosti různých onemocnění [5]. Navržené testy mají zpravidla dlouhou dobu trvanlivosti a nevyžadují další technické vybavení.

Dosud však chybí proužkový test k rychlé a snadné diagnostice látek, majících vztah k nádorovým onemocněním (sarkosin, hemoglobin), infekčním chorobám (sarkosin a peroxid) nebo funkci ledvin (kreatinin) nebo test využitelný v detekci nebezpečných látek z prostředí.

Podstata technického řešení

Výše uvedený nedostatek řeší proužkový enzymatický test na vybrané markéry pro posouzení zdravotního stavu (funkce ledvin, infekce, nádorová onemocnění) nebo přítomnosti nebezpečné látky v prostředí, umožňující provedení s plnou krví, sérem, plazmou, močí, spermatem, případně vodou. Technické řešení se týká proužkového testu k in vitro detekci hemoglobinu, sarkosinu, kreatininu, peroxidu vodíku v biologickém vzorku nebo environmentálním vzorku s vizuálním vyhodnocením intenzity barevného produktu reakce, ale též s možností elektronického vyhodnocení jak pomocí počítače, tak pomocí chytrého telefonu.

Předmětem technického řešení je diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu. Proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužkuje aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje první reakční zóna délky 1,0 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 20 KU/1, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 2,0 mM a fenol o koncentraci 1 až 20 mM. Na první reakční zónu navazuje druhá reakční zóna délky 0,7 cm obsahující peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) o koncentraci 0,1 až 2,0 mM. Druhá reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm a detekční zóna pak přechází v zónu včelího vosku délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku.

Předmětem technického řešení je také diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu stejného provedení, jak je uvedeno výše, kde proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužku je aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 20 KU/1, 3,3 diamínobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM, peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 20 mM. Reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm, která pak přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 0,7 cm, která tvoří druhy konec diagnostického proužku.

Předmětem technického řešení je i diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu stejného provedení, jak je uvedeno výše, kde proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužkuje aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 20 KU/1, o-fenyldiamin (OPD) o koncentraci 5 až 25 mM, peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 20 mM. Reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm, která pak přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 0,7 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku.

Předmětem technického řešení je navíc diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu stejného provedení, jak je uvedeno výše, kde proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužku je aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 20 KU/1, amonnou sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny o koncentraci 1 až 6 mM, peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 20 mM. Reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm, která pak přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 0,7 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku.

Předmětem technického řešení je dále diagnostický proužek pro stanovení množství kreatininu v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu. Proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužkuje aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje první reakční zóna délky 1,0 cm, obsahující kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidázu o aktivitě 5 až 12 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1, sodnou sůl 3-(N-elhyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,3 až 1,2 mM a fenol o koncentraci 1 až 15 mM. Na první reakční zónu navazuje druhá reakční zóna délky 0,7 cm obsahující kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidázu o aktivitě 20 až 100 KU/1 a 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) o koncentraci 0,5 až 4,0 mM. Druhá reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm a detekční zóna přechází v zónu včelího vosku délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku.

První reakční zóna diagnostického proužku pro stanovení kreatininu podle jiného výhodného provedení obsahuje kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidázu o aktivitě 5 až 12 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 15 mM a druhá reakční zóna obsahuje kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidázu o aktivitě 20 až 100 KU/1 a 3,3 diamínobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM.

První reakční zóna diagnostického proužku pro stanovení kreatininu podle dalšího výhodného provedení obsahuje kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidázu o aktivitě 5 až 12 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 15 mM a druhá reakční zóna obsahuje kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidázu o aktivitě 20 až 100 KU/1 peroxidázu o aktivitě 20 až 100 KU/1 a o-fenyldiamin (OPD) o koncentraci 5 až 25 mM.

Předmětem technického řešení je také diagnostický proužek pro stanovení množství peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu. Proužek má šířku 0,4 cm a délku 4,0 cm. Na jednom konci proužku je aplikována vzorková zóna délky 0,5 cm, na kterou navazuje první reakční zóna délky 1,0 cm, obsahující sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové

CZ 30831 Ul kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 2,0 mM a druhá reakční zóna o délce 0,7 cm obsahuje 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) o koncentraci 0,1 až 2,0 mM a peroxidázu o aktivitě 3 až 10 KU/1. Druhá reakční zóna přechází v detekční zónu délky 0,3 cm a detekční zóna přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku.

Diagnostický proužek pro stanovení množství peroxidu vodíku stejného provedení, jak je uvedeno výše, může obsahovat jednu reakční zónu délky 2,5 cm, která obsahuje peroxidázu o aktivitě 3 až 100 KU/1, 3,3 diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM.

Jiný výhodný diagnostický proužek pro stanovení množství peroxidu vodíku stejného provedení, jak je uvedeno výše, může obsahovat jednu reakční zónu délky 2,5 cm, která obsahuje peroxidázu o aktivitě 3 až 100 KU/1, o-fenyldiamin (OPD) o koncentraci 5 až 25 mM.

Další výhodný diagnostický proužek pro stanovení množství peroxidu vodíku stejného provedení, jak je uvedeno výše, může obsahovat jednu reakční zónu, která obsahuje peroxidázu o aktivitě 3 až 100 KU/1, amonnou sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny (ABTS) o koncentraci 1 až 6 mM.

Podložka diagnostického proužkuje výhodně provedena z plastové fólie, papírového nebo kovového materiálu. Savým materiálem je nejčastěji filtrační papír, celulózový nebo plastový materiál. Savý nosič se napouští známým způsobem napouštěcími roztoky. Napuštěné a usušené savé nosiče se upraví na čtvercová nebo obdélníková pole, která se upevní na podložku proužku [7].

Biologickým vzorkem vhodným pro detekci diagnostickým proužkem podle technického řešení je například lidská moč, sérum, plazma nebo sperma; environmentálním vzorkem muže být například přírodní nebo bazénová voda.

Ke každému typu diagnostického proužku přísluší stupnice intenzity barvy určující intenzitu proběhlé reakce a množství analytu (Obr. 4 až 6). Při vizuálním hodnocení kvantitativního množství analytu se porovnává intenzita vzniklého produktu barevné reakce v detekční zóně s intenzitou zbarvení jednotlivých detekčních zón s kontrolní stupnicí intenzit dané barvy určující množství zkoumané látky ve vzorku. Typický proužkový test zahrnuje negativní a pozitivní kontrolu (Obr. 2) [6]. Kromě kontrolních stupnic intenzit dané barvy pro určitý analyt obsahuje testovací systém zpravidla dále testovací zkumavky, testovací stojánek, pipety pro jedno použití a vhodné detekční substráty, jako je 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol (AAP), sodná sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS), 3,3 diaminobenzidin (DAB) a o-fenylidiamin (OPD) a amonná sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyselin (ABTS).

Technické řešení umožňuje snadnou detekci analytů využití určení množství sarkosinu, kreatininu, hemoglobinu, peroxidu vodíku v biologickém vzorku u hospitalizovaných pacientů nebo domácí testování určení přítomnosti dané látky v analyzovaném vzorku nebo toxické látky v environmentálním vzorku.

Objasnění výkresů

Obr. 1: (A) Metodou 3D tisku připravené šablony pro přípravu a zpracování jednotlivých zón papírových detekčních proužků. (B) Návrh jednoduchého 3D tiskem připraveného držáku pro jednotlivé proužky; zleva: spodní díl·, vrchní díl; a - celková délka; b vnitřní část, c - šířka, d - prostor pro nasátí vzorku, e - detekční okénko, f - délka nad detekčním okénkem, g - délka pod detekčním okénkem, h - šířka k nasávací části.

Obr. 2: (A) Konstrukční schéma proužkového detekčního testu s jednotlivými zónami. Možnosti použití materiálu pro jednotlivé zóny. (B) Uspořádání vlastního testovacího systému do podoby KDN, kde K je kontrolní diagnostický proužek, D je detekční proužek, N je negativní proužek.

Obr. 3: Detekční proužek s uspořádáním jednotlivých zón, (A) obsahující dvě reakční zóny; (B) obsahující jednu reakční zónu; A = 0,4 cm; B = 4,0 cm, V = 0,5 cm; R1 = 1,0 cm; R2 = 0,7 cm; D = 0,3 cm; Z = 1,5 cm.

CZ 30831 Ul

Obr. 4: Srovnávací proužek pro stanovení množství vzniklého peroxidu vodíku ve vzorku pro určení množství sarkosinu. (A) detekční škála intenzity barvy použitá pro vyhodnocení množství sarkosinu ve vzorku; (B) Závislost denzity barevné reakce na množství sarkosinu; v insetu lineární část závislosti (R² = 0,99); (C) Známé množství v testovacích vzorcích artificiální moči šrafovaný graf, v porovnání se stanovením koncentrace sarkosinu v těchto vzorcích pomocí detekčního proužku, jako aplikované koncentrace sarkosinu. Průměrná chyba stanovení 10%.

Obr. 5: Detekční proužek pro stanovení množství vzniklého peroxidu vodíku ve vzorku. (A) barevná detekční škála použitá pro vyhodnocení množství peroxidu vodíku ve vzorku; (B) Závislost denzity barevné reakce na množství peroxidu vodíku; v insetu lineární část závislosti (R² = 0,99); (C) Známé množství v testovacích vzorcích artificiální moči - šrafovaný graf, v porovnání se stanovením koncentrace peroxidu vodíku v těchto vzorcích pomocí detekčního proužku, jako aplikované koncentrace peroxidu vodíku. Průměrná chyba stanovení 8%.

Obr. 6: Detekční proužek pro stanovení množství vzniklého peroxidu vodíku ve vzorku pro určení hladiny kreatininu. (A) Barevná detekční škála použitá pro vyhodnocení množství kreatininu ve vzorku; (B) Závislost denzity barevné reakce na množství kreatininu; v insetu lineární část závislosti (R² = 0,95); (C) Aplikace detekčního proužku pro určení množství kreatininu v biologickém vzorku (moči), šrafovaný graf, v porovnání s fotometrickou detekcí (pikrát). Průměrná chyba stanovení 15%.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příprava diagnostického proužku pro enzymatické stanovení sarkosinu, kreatininu nebo peroxidu vodíku ve vzorku

Sestavení testu probíhalo následovně. Připravil se diagnostický proužek 1 z oboustranně lepicí podložky odstřihnutím z lepicí pásky (Tesá, Budapešť, Maďarsko) o délce 4,0 cm a šířce 1,9 cm. Na straně, kde je ochranná fólie, se vyřezal nožem pruh o délce 2,5 cm a šířce 0,4 cm. Takto připravená podložka se vložila do plastové šablony na výrobu proužků (Obr. 1A). Po odstranění ochranné fólie mimo vymezený pruh se nanesla tenká vrstva včelího vosku. Po zaschnutí vosku se odstranila i zbylá ochranná fólie z vymezeného pruhu. Poté se připravily obdélníky jednotlivých zón z filtračního papíru Whatman 1 (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Spojené království) o šířce 0,4 cm; pro vzorkovou zónu V o délce 0,5 cm a pro detekční zónu D o délce 0,3 cm. Dále se připravil obdélník z filtračního papíru o šířce 0,4 cm a délce 1,0 cm pro první reakční zónu Rl, obdélník z filtračního papíru o šířce 0,4 cm a délce 0,7 cm pro druhou reakční zónu R2 nebo případně obdélník z filtračního papíru o šířce 0,4 cm a délce 2,5 cm pro první reakční zónu Rl pro typ detekčního proužku pouze s jednou reakční zónou (Obr. 3B).

Na reakční zóny pro určený typ testu se nanesla příslušná reakční činidla dle složení a postupu uvedeného v jednotlivých příkladech. Reakční činidla se nechala zaschnout. Poté se všechny obdélníky z filtračního papíru postupně nalepily na lepicí podložku v pořadí dle Obr. 3 (A) nebo Obr. 3 (B). Pro větší stálost a delší trvanlivost je lépe obdélníková pole po nanesení reakčního činidla lyofilizovat. Před samotným testováním vzorku se připravené diagnostické proužky i vložily vzorkovou zónou V do nádobek nejprve s několika standardy sarkosinu, kreatininu nebo peroxidu vodíku o známém množství a v nádobce se ponechaly 5 až 10 minut. Alternativně lze použít držák na test (Obr. 1B). Během této doby došlo ke vzlínání vzorku, reakcím v reakčních zónách a barevné reakci v detekční zóně D. Reakce se zastavila včelím voskem na konci proužku v zóně Z. Za 15 minut se vyhodnotil výsledek změřením intenzity zbarvení detekční zóny metodou Qinslab (Color test) (Obr. 4 až 6).

Příklad 1

Stanoveni sarkosinu ve vzorku moče

Pro testování se použije vzorek čerstvé, nejlépe ranní moče, která musí být promíchána a diagnostický proužek i se dvěma reakčními zónami Rl a R2 (Obr. 3A) připravený dle postupu uvedeného výše.

CZ 30831 Ul

Připraví se také reakční činidlo (10 μΐ) pro reakční zónu Rl dle složení a koncentrací uvedených v tabulce 1:

Tabulka 1

Složka	Koncentrace
Sarkosin oxidáza	1-20 KU/1
Sodná sůl 3-(N-ethyl-3methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS)	0,1-2,0 mM
Fenol	1-20 mM

Dále se připraví reakční činidlo (5 μΐ) pro reakční zónu R2 dle složení a koncentrací uvedených v tabulce 2:

Tabulka 2

Složka	Koncentrace
Peroxidáza	1-100 KU/1
4-amino-2,3-dimethyl-lfenyl-3-pyrazol (AAP)	0,1-2,0 mM

Připravené obdélníky z filtračního papíru dle postupu uvedeného výše pro reakční zónu Rl a reakční zónu R2 se vloží do petriho misky. Na obdélník pro reakční zónu Rl se napipetuje 10 μΐ reakčního činidla pro zónu Rl a na obdélník pro reakční zónu R2 se napipetuje 5 μΐ činidla pro reakční zónu R2. Reakční činidla se nechají zaschnout. Poté se všechny obdélníky z filtračního papíru postupně nalepí na lepicí podložku v pořadí dle Obr. 3 (A). Pro větší stálost a delší trvanlivost je lépe obdélníková pole po nanesení reakčního činidla lyofilizovat.

Připravený diagnostický proužek s nanesenými reakčními činidly se vloží vzorkovou zónou V do nádobky se vzorkem, kde dojde k rychlému vzlínání. Doba vzlínání je 5 až 10 minut. Během této doby dochází k enzymatickým reakcím v reakčních zónách Rl a R2 a barevné reakci v detekční zóně. Enzymatická reakce se zastaví v zóně Z včelího vosku na druhém konci proužku. V reakčních zónách Rl a R2 probíhají následující enzymatické reakce:

Sarkosin oxidáza

Sarkosin + O₂ + H₂O <-> Glycin + HCHO + H₂O₂Peroxidáza

H₂O₂ + AAP + TOPS + Fenol <-> Chinonimin + 4 H₂O

Enzym sarkosin oxidáza rozloží sarkosin na glycin, HCHO a H₂O₂. Vzniklý H₂O₂ reaguje se substrátem 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol(AAP), sodnou solí 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) a enzymem peroxidáza. Vytvoří se fialově zbarvený produkt chinonimin, jehož intenzita zbarvení je přímo úměmá koncentraci sarkosinu ve vzorku. Množství sarkosinu je úměrné množství vznikajícího H₂O₂. Následně se zbarvení detekční zóny naskenuje a po té vyhodnotí pomocí programu Qinslab (color test).

Alternativně lze místo 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) a sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) použít:

CZ 30831 Ul

a) 3,3 diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM, který tvoří hnědě zbarvený produkt. K testování se pak použije diagnostický proužek 1 jen s první reakční zónou R1 délky 2,5 cm, kde probíhají následující enzymatické reakce:

Sarkosin oxidáza

Sarkosin + O₂ + H₂O Glycin + HCHO + H₂O₂Peroxidáza

H₂O₂ + Fenol + DAB ♦-> ox. DAB + 4 H₂O

b) o-fenyldiamin (OPD), o koncentraci 5 až 25 mM, který tvoří žlutě zbarvený produkt. K testování se pak použije diagnostický proužek 1 jen s první reakční zónou R1 délky 2,5 cm, kde probíhají následující enzymatické reakce:

Sarkosin oxidáza

Sarkosin + O₂ + H₂O <* Glycin + HCHO + H₂O₂Peroxidáza

H₂O₂ + Fenol + OPD θ ox. OPD + 4 H₂O

c) amonná sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny (ABTS) o koncentraci 1 až 6 mM, která tvoří zeleně zbarvený produkt. K testování se pak použije diagnostický proužek jen s první reakční zónou Rl, délky 2,5 cm, kde probíhají následující enzymatické reakce:

Sarkosin oxidáza

Sarkosin + O₂ + H₂O Glycin + HCHO + H₂O₂Peroxidáza

H₂O₂ + Fenol + ABTS <-»· ox. ABTS + 4 H₂O

Příklad 2

Stanovení peroxidu vodíku ve vzorku bazénové vody

Pro testování se použije vzorek bazénové vody a detekční proužek 1 s jednou reakční zónou Rl připravený dle postupu uvedeného výše.

Tabulka 1:

Složka	Koncentrace
Peroxidáza	3-100 KU/I
4-amino-2,3-dimethyl-1-íenyl-3pyrazol (AAP)	0.1-2.0 mM
Sodná sůl 3-(N-ethyl-3-methylanílin) propansul tónové kyseliny (TOPS)	UJ-2.U mM

Připravený obdélník z filtračního papíru, dle postupu uvedeného výše, pro reakční zónu Rl se vloží do petriho misky. Na obdélník pro reakční zónu Rl se napipetuje 10 μΐ reakčního činidla Rl. Reakční činidlo se nechá zaschnout. Všechny obdélníky z filtračního papíru se postupně nalepí na lepicí podložku v pořadí dle Obr. 3 (B).

Připravený diagnostický proužek I s naneseným reakčním činidlem se vloží vzorkovou zónou V do nádobky se vzorkem, kde dojde k rychlému vzlínání. Doba vzlínání je 5 až 10 minut. Během této doby dochází k enzymatickým reakcím v reakčních zónách Rl a R2 a barevné reakci v deCZ 30831 Ul tekční zóně D. V reakční zóně Rl probíhá následující enzymatická reakce:

Peroxidáza

Η₂Ο₂ + AAP + TOPS *-* Chinonimin + 4 H₂O

V této reakci je důležitý enzym peroxidáza, který rozkládá peroxid vodíků za přítomnosti substrátu 4-amino-2,3-dimetbyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) a sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS). Po reakci enzymu peroxidázy a substrátu se vytvoří fialově zbarvený chinonimin, jehož intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci H₂O₂. Enzymatická reakce se zastaví v zóně Z včelího vosku na druhém konci proužku i. Následně se zbarvení detekční zóny naskenuje a po té vyhodnotí pomocí programu Qinslab (color test).

a) 3,3-diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM, který tvoří hnědě zbarvený produkt.

V reakční zóně Rl proužku pak kde probíhá následující enzymatická reakce:

Peroxidáza

H₂O₂ + DAB <-► ox. DAB + 4 H₂O

b) o-fenyldiamin (OPD), o koncentraci 5 až 25 mM. který tvoří žlutě zbarvený produkt.

V reakční zóně Rl, kde probíhá následující enzymatické reakce:

Peroxidáza

H₂O₂ + OPD θ ox. OPD + 4 H₂O

c) amonná sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny (ABTS) o koncentraci 1 až 6 mM, která tvoří zeleně zbarvený produkt. V reakční zóně Rl, kde probíhá následující enzymatické reakce:

Peroxidáza

H₂O₂ + ABTS <-> ox. ABTS + 4 H₂O

Příklad 3

Stanovení kreatininu ve vzorku plazmy

Pro testování se použije vzorek čerstvé plazmy a diagnostický proužek I se dvěma reakčními zónami Rl a R2 připravený dle postupu uvedeného výše.

Tabulka 1

Složka	Koncentrace
Kreatináza	6-15 KU/1
Sarkosin oxidáza	5-12 KU/1
Askorbát oxidáza	1-5 KU/1
Kataláza	100-400 KU/1
Sodná sůl kyseliny 3-(N-ethyl-3- methylanilino)-2-hydroxypropansulfonové (TOPS)	0,3-1,2 mM
Fenol	l-15mM

CZ 30831 Ul

Připraví se dále reakční činidlo (5 μΐ) pro reakční zónu R2 dle složení a koncentrací uvedených v tabulce 2:

Tabulka 2

Složka	Koncentrace
Kreatinináza	50-300 KU/1
Peroxidáza	20-100 KU/1
4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol (AAP)	0,5-4,0 mM

Připraví se reakční zóny Rl a R2 s reakčními činidly a kompletní diagnostický proužek I tak, jak je uvedeno v příkladu 1.

Připravený diagnostický proužek I s nanesenými reakčními činidly se vloží vzorkovou zónou V do nádobky se vzorkem. Během vzlínání v reakčních zónách Rl a R2 probíhají následující enzy-

matické reakce:	Kreatinináza
Kreatinin + H₂O	Kreatináza	Kreatin
Kreatin + H₂O	Sarkosin oxidáza	* Sarkosin + Močovina
Sarkosin -t- O₂ + lí₂O 2 H₂O₂ + AAP + TOPS ·	Peroxidáza	* Ulycin + HCHO + H₂t -► Chinonimin +4 H₂O

Pro stanovení kreatininu ve vzorku moči a plazmě jsou důležité enzymy kreatinináza, který je potřebný pro rozklad kreatininu, dále enzym kreatináza, který rozloží vzniklý kreatin na sarkosin a močovinu. Sarkosin rozštěpí přítomný enzym sarkosin oxidáza za vzniku peroxidu, glycinu a formaldehydu. Množství kreatininu je úměrné množství vznikajícího H2O2. Η₂Ο₂ se substrátem 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol (AAP), sodnou solí 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) a enzymem peroxidáza, vytvoří fialově zbarvený produkt chinonimin, jehož intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci kreatininu ve vzorku. Enzymatická reakce se zastaví včelím voskem na druhém konci proužku. Alternativně lze použít i substrát DAB (3,3 diaminobenzidin) nebo OPD (o-fenyldiamin), který se přidá do reakčního činidla pro reakční zónu R2 jak je uvedeno v předchozích příkladech.

Průmyslová využitelnost

Test je vhodný pro stanovení sarkosinu, kreatininu, peroxidu vodíku v biologickém vzorku, plazmě, vodě a především v moči. Oproti běžným postupům (spektrofotometrickému stanovení) je doba stanovení výrazně zkrácena bez požadavků na nákladné přístrojové vybavení s minimální úpravou. Výsledek testu se projeví za 10 až 15 minut. Informace získaná tímto testem umožní normalizování dalších klinických testů a stanovení diagnóz.

Literatura:

1. Wang, W., et al., Enzymatic hydrolysis device for zero-trans fatty acid, has liquid feeding mechanism whose liquid outlet is connected with liquid inlet of coil pipe, and tank chassis provided with water outlet connected with liquid outlet of coil pipe, GUANGZHOU AOJIAN FENGZE BIOTECHNOLOGY CO (GUAN-Non-standard).

2. Cao, C., et al., Method for qualitative and quantitative detection of protein in dairy product for detecting protein content in food, involves testing pure milk sample and testing electrophoresis fingerprints followed by performing enzymatic hydrolysis, Univ Shanghai Jiaotong (Usjt-C).

CZ 30831 Ul

3. Ehrenkranz, J.R.L., System for performing enzyme-based diagnostic test to sample e.g. human, has interpretive algorithm to convert detectable signál from detectable label to numerical value for quantification of amount oř activity of enzyme in sample, EHRENKRANZ J R L (EHRE-Individual) EHRENKRANZ J R L (EHRE-lndividual).

4. Douglas, J., et al., Multilayer reacting testing strip and method for measuring concentration of analyte in sample. 1. LIFESCAN, Milpitas, CA, US Editor 1997: USA.

5. Apparatus for testing biological sample e.g. saliva sample for detection of cancer, has test pads arranged side by side, so thal outer surface of housing defmes window through which portions of front surface of test areas are visible, VIGILANT BIOSCIENCES INC (VIGINon-standard).

6. Burg, B., et al., Computer-implemented method for quantifying color change of test medium on diagnostic instrument involves identifying reference samples for medium in the instrument, determining dominant camera-captured color of reference sample/test medium, SCANADU INC (SCAN-Non-standard) SCANADU INC (SCAN-Non- standard) BURG B (BURG-Individual) ZIZI M (ΖΙΖΙ-Individual) ROWE A A (ROWE- Individual) SMART A (SMAR-Individual) DE BROUWER W (DBRO-Individual) SCANADU INC (SCAN-Nonstandard).

7. Wahl, R., O. Cromwell, and H. Fiebig, esting strip for diagnosis of allergies in vitro and use thereof D. MERCK PATENT GMBH, DE, Editor 1997: Německo.

8. TALALAK, Kwanrutai, Julaluk NOIPHUNG, Temsiri SONGJAROEN, Orawon CHAELAPAKUL a Wanida LAIWATTANAPAISAL. A facile low-cost enzymatic paper-based assay for the determination of urine creatinine. Talanta. 2015,144, 915-921.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4cm, délku (B) 4,0 cm, přičemž na jednom konci proužku je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) délky 1,0 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 20 KU/1, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 2,0 mM a fenol o koncentraci 1,0 až 20,0 mM, na reakční zónu (Rl) navazuje reakční zóna (R2) délky 0,7 cm, obsahující peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu o koncentraci 0,1 až 2,0 mM, reakční zóna (R2) přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
2. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství sarkosinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4 cm, délku (B) 4,0 cm, přičemž na jednom konci proužku (1) je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1,0 až 20,0 KU/1, 3,3-diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1,0 až 15,0 mM, peroxidázu o aktivitě 1 až 100 KU/1 a fenol o koncentraci 1,0 až 20,0 mM, reakční zóna (Rl) přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu (Z) včelího vosku délky 0,7 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
3. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství sarkosinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4 cm, délku (B) 4,0 cm, přičemž na jednom konci proužku (1) je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1,0 až 20,0 KU/1, o-fenyldiamin

CZ 30831 Ul (OPD) o koncentraci 5,0 až 25,0 mM, peroxidázu o aktivitě 1,0 až 100,0 KU/1 a fenol o koncentraci 1,0 až 20,0 mM, reakční zóna (Rl) přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu (Z) včelího vosku délky 0,7 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
4. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství sarkosinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4 cm, délku (B) 4 cm, přičemž na jednom konci proužku (1) je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) délky 2,5 cm, obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1,0 až 20,0 KU/1, amonnou sůl 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny o koncentraci 1,0 až 6,0 mM, peroxidáza o aktivitě 1 až 100 KU/1 a fenol o koncentraci 1,0 až 20,0 mM, reakční zóna (Rl) přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu (Z) včelího vosku délky 0,7 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
5. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství kreatininu v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4cm, délku (B) 4,0 cm, přičemž na jednom konci proužku (1) je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) délky 1,0 cm, obsahující kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidáza o aktivitě 5 až 12 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1, sodnou sůl 3-(N-elhyl-3-methylanilin) propansulfonové kyseliny o koncentraci 0,3 až 1,2 mM a fenol o koncentraci 1 až 15 mM, na reakční zónu (Rl) navazuje reakční zóna (R2) délky 0,7 cm obsahující kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidáza o aktivitě 20 až 100 KU/1 a 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) o koncentraci 0,5 až 4,0 mM, reakční zóna (R2) přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu včelího vosku (Z) délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
6. Diagnostický proužek (1) podle nároku 5, vyznačující se tím, že reakční zóna (Rl) obsahuje kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidázu o aktivitě 5,0 až 12,0 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 15 mM a reakční zóna (R2) obsahuje kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidázu o aktivitě 20 až 100 KU/1 a 3,3 diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM.
7. Diagnostický proužek (1) podle nároku 5, vyznačující se tím, že reakční zóna (Rl) obsahuje kreatinázu o aktivitě 6 až 15 KU/1, sarkosin oxidázu o aktivitě 5 až 12 KU/1, askorbát oxidázu o aktivitě 1 až 5 KU/1, katalázu o aktivitě 100 až 400 KU/1 a fenol o koncentraci 1 až 15 mM, na reakční zónu (Rl) navazuje reakční zóna (R2) obsahující kreatininázu o aktivitě 50 až 300 KU/1, peroxidázu o aklivitě 20 až 100 KU/1 a o-fenyldiamin (OPD) o koncentraci 5 až 25 mM.
8. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku, který sestává z podložky, na které jsou aplikovány zóny ze savé matrice pro provedení testu, vyznačující se tím, že proužek (1) má šířku (A) 0,4cm, délku (B) 4,0 cm, přičemž na jednom konci proužku (1) je aplikována vzorková zóna (V) délky 0,5 cm, na kterou navazuje reakční zóna (Rl) o délce 1,0 cm obsahující sodnou sůl 3-(N-ethyl-3methylanilin) propansulfonové kyseliny o koncentraci 0,1 až 2,0 mM, reakční zóna (Rl) přechází v druhou reakční zónu (R2), která je dlouhá 0,7 cm a obsahuje peroxidázu o aktivitě 3 až 100 KU/1 a4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu o koncentraci 0,1 až 2,0 mM (R2), dále přechází v detekční zónu (D) délky 0,3 cm a detekční zóna (D) přechází v zónu (Z) včelího vosku délky 1,5 cm, která tvoří druhý konec diagnostického proužku (1).
9. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství peroxidu vodíku, vyznačující se tím, že reakční zóna (Rl) obsahuje peroxidázu o aktivitě 3,0 až 100,0 KU/1 a 3,3-diaminobenzidin (DAB) o koncentraci 1 až 15 mM.
10. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství peroxidu vodíku, vyznačující se

CZ 30831 Ul tím, že reakční zóna (Rl) obsahuje peroxidázu o aktivitě 3,0 až 100,0 KU/1 a o-fenyldiamin (OPD) o koncentraci 5 až 25 mM.
11. Diagnostický proužek (1) pro stanovení množství peroxidu vodíku, vyznačující se tím, že reakční zóna (Rl) obsahuje peroxidázu o aklivitě 3 až 100KU/1 a amonnou sůl

5 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6) sulfonové kyseliny o koncentraci 1 až 6 mM.
12. Diagnostický proužek (1) podle nároků 1 až 11, vyznačující se t í m , že podložkou diagnostického proužkuje plastová fólie, papírový nebo kovový materiál.
13. Diagnostický proužek (1) podle nároků lažl2, vyznačující se tím, že savým materiálem je filtrační papír, celulózový nebo plastový materiál.

ío
14. Diagnostický proužek (1) podle nároků lažl3, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je lidská moč, sérum, plazma nebo sperma.
15. Diagnostický proužek (1) podle nároku 1 až 13, vyznačující se tím, že environmentálním vzorkem je bazénová voda.