JPS6387982A - ＢａｍＨＩ制限修飾系のクローニング - Google Patents
ＢａｍＨＩ制限修飾系のクローニングInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、制限修飾系をクローニングするための方法、
該方法により作製されたクローン、並びに該クローンか
ら制限及び／又は修飾酵素を産生するための方法に係る
。本発明は更に、Ｄｄｅ ｌ及びＢａｍＨＩ制限エンド
ヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼのクローン、及びこれ
らのクローン及び酵素を産生ずるための関連方法に係る
。
該方法により作製されたクローン、並びに該クローンか
ら制限及び／又は修飾酵素を産生するための方法に係る
。本発明は更に、Ｄｄｅ ｌ及びＢａｍＨＩ制限エンド
ヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼのクローン、及びこれ
らのクローン及び酵素を産生ずるための関連方法に係る
。
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在している
酵素の一類である。他の細菌成分不純物から精製された
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子を厳密なフラグメ
ントに分断するために実験室で使用することができる。
酵素の一類である。他の細菌成分不純物から精製された
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子を厳密なフラグメ
ントに分断するために実験室で使用することができる。
この特性によりＤＮＡ分子を個々に同定することができ
、構成遺伝子に断片化することができる。制限エンドヌ
クレアーゼは、最近の遺伝子研究で不可欠な手段である
ことが立証された。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工
学及び分析に用いられる生化学的「はさみ」（ｓｃｉｓ
ｓｏｒｓ）である。
、構成遺伝子に断片化することができる。制限エンドヌ
クレアーゼは、最近の遺伝子研究で不可欠な手段である
ことが立証された。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工
学及び分析に用いられる生化学的「はさみ」（ｓｃｉｓ
ｓｏｒｓ）である。
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿って特定のヌ
クレオチド配列（「認識配列」）を認識し且つ該配列に
結合する機能を有する。制限エンドヌクレアーゼはいっ
たん結合すると、該配列の範囲内又はその片側で分子を
開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼは夫々異なる
認識配列に対して親和性を有している。今日までに試験
されている数百種類の細菌種のうちで、１００種類に近
い制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
クレオチド配列（「認識配列」）を認識し且つ該配列に
結合する機能を有する。制限エンドヌクレアーゼはいっ
たん結合すると、該配列の範囲内又はその片側で分子を
開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼは夫々異なる
認識配列に対して親和性を有している。今日までに試験
されている数百種類の細菌種のうちで、１００種類に近
い制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
細菌は、多くても稲光たり非常に少数の制限エンドヌク
レアーゼしか保有しないという傾向がある。エンドヌク
レアーゼは典型的には起源となる細菌に従って命名され
ている。セｄユ ｍ土り２種は例えば３種類の異なる制限エンドヌクレア
ーゼ、Ｈａｅ Ｉ 、 ＨａｅＩ［及びＨａｅ ｍを合
成する。
レアーゼしか保有しないという傾向がある。エンドヌク
レアーゼは典型的には起源となる細菌に従って命名され
ている。セｄユ ｍ土り２種は例えば３種類の異なる制限エンドヌクレア
ーゼ、Ｈａｅ Ｉ 、 ＨａｅＩ［及びＨａｅ ｍを合
成する。
これらの酵素は夫々配列（＾Ｔ）にＧＣＣ（八Ｔ）、Ｐ
ｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し、開裂する。他方
、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＲＹ
１３は、配列Ｇ＾＾ＴＴＣを認識するただ１種類の酵素
ＥｃｏＲＩＬか合成しない。
ｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し、開裂する。他方
、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＲＹ
１３は、配列Ｇ＾＾ＴＴＣを認識するただ１種類の酵素
ＥｃｏＲＩＬか合成しない。
天然には、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄に
おいて保護の役割を果たす。制限エンドヌクレアーゼは
、細菌を殺すか又はこれに寄生するウィルス及びプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に対する耐性を
細菌に与える。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ
分子の長さを走査し、認識配列が出現する毎にこの長さ
を切断することにより耐性を与える。切断が生じると、
感染遺伝子の多くは不能になり、そのＤＮＡは非特異的
エンドヌクレアーゼにより更に分解される。
おいて保護の役割を果たす。制限エンドヌクレアーゼは
、細菌を殺すか又はこれに寄生するウィルス及びプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に対する耐性を
細菌に与える。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ
分子の長さを走査し、認識配列が出現する毎にこの長さ
を切断することにより耐性を与える。切断が生じると、
感染遺伝子の多くは不能になり、そのＤＮＡは非特異的
エンドヌクレアーゼにより更に分解される。
細菌保護系の第２の成分は修飾メチラーゼである。これ
らの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細
菌に自己のＤＮＡを認識させ、外来感染ＤＮＡから区別
させる手段を構成する。修飾メチラーゼは、対応する制
限エンドヌクレアーゼと同一のヌクレオチド認識配列を
認識し、これに結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに
、メチル基を加えることにより該配列内で所定のヌクレ
オチドを化学的に修飾する。このメチル化の結果、認識
配列はもはや制限エンドヌクレアーゼにより結合又は開
裂されない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼに
より常に完全に修飾されており、従って、内因性制限エ
ンドヌクレアーゼの存在に対して無感応である。制限エ
ンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して悪巧性を有す
るのは、未修飾、従って外来性と判断されるＤＮＡに限
られる。
らの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細
菌に自己のＤＮＡを認識させ、外来感染ＤＮＡから区別
させる手段を構成する。修飾メチラーゼは、対応する制
限エンドヌクレアーゼと同一のヌクレオチド認識配列を
認識し、これに結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに
、メチル基を加えることにより該配列内で所定のヌクレ
オチドを化学的に修飾する。このメチル化の結果、認識
配列はもはや制限エンドヌクレアーゼにより結合又は開
裂されない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼに
より常に完全に修飾されており、従って、内因性制限エ
ンドヌクレアーゼの存在に対して無感応である。制限エ
ンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して悪巧性を有す
るのは、未修飾、従って外来性と判断されるＤＮＡに限
られる。
遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングし
、遺伝子によりコードされるタンパク質及び酵素を従来
の精製技術で得られるよりも大量に生産することが今日
では可能である。制限エンドヌクレアーゼクローンを単
離するための鍵は、１０−４〜１０−３程度の低い頻度
で発生する場合、複合「ライブラリー」、即ち「ショッ
トガンｊ法により得られるクローン集団内でこのような
りローンを同定するための簡単で信頼できる方法を開発
することにある。好ましくは該方法は、不要な大多数の
クローンが破壊され且つ数少ない所望のクローンが生存
できるように選択的とすべきである。
、遺伝子によりコードされるタンパク質及び酵素を従来
の精製技術で得られるよりも大量に生産することが今日
では可能である。制限エンドヌクレアーゼクローンを単
離するための鍵は、１０−４〜１０−３程度の低い頻度
で発生する場合、複合「ライブラリー」、即ち「ショッ
トガンｊ法により得られるクローン集団内でこのような
りローンを同定するための簡単で信頼できる方法を開発
することにある。好ましくは該方法は、不要な大多数の
クローンが破壊され且つ数少ない所望のクローンが生存
できるように選択的とすべきである。
■型の制限修飾系のクローニングは非常な勢いでされつ
つある。最初にクローニングされた系では、制限エンド
ヌクレアーゼクローンを選択的に単離する手段としてバ
クテリオファージ感染を使用した（Ｐｓｔ Ｉ Ｗａ
ｌｄｅｒ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、７
４−１５０３−１５０７（１９８１）、 ＨｈａＩＩ
Ｍａｎｎ他、 Ｇｅｎｅ ％： ９フー１１２（１
９８１））。細菌中に制限修飾系が存在していることに
より、鎖糸はバクテリオファージによる感染に抵抗し得
るので、クローニングされた制限修飾遺伝子をもってい
る細胞は、゛原則としてファージにさらされたライブラ
リーから生存体として選択的に単離され得る。しかしな
がら、この方法の価値は限られたものであることがわか
った。具体的にいうと、クローニングされた制限修飾遺
伝子は選択的な生存をもたらすに十分なファージ耐性を
常に示すとは限らないことがわかった。別のクローニン
グのアプローチは、プラスミド耐性として初期に特徴付
けられた系を大腸菌クローニングプラスミドに形質転換
するものである（ＥｃｏＲＶ、 Ｂｏｕ−ｇｕｅｌｅｒ
ｅｔ他、Ｎｕｃ ｌ 、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、１２９：３
６５９−３６）６ １９８４；ＰａｅＲ７、Ｇｉｎｇｅ
ｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ、 Ｐｒｏｅ、Ｎａ１．＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ。
つある。最初にクローニングされた系では、制限エンド
ヌクレアーゼクローンを選択的に単離する手段としてバ
クテリオファージ感染を使用した（Ｐｓｔ Ｉ Ｗａ
ｌｄｅｒ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、７
４−１５０３−１５０７（１９８１）、 ＨｈａＩＩ
Ｍａｎｎ他、 Ｇｅｎｅ ％： ９フー１１２（１
９８１））。細菌中に制限修飾系が存在していることに
より、鎖糸はバクテリオファージによる感染に抵抗し得
るので、クローニングされた制限修飾遺伝子をもってい
る細胞は、゛原則としてファージにさらされたライブラ
リーから生存体として選択的に単離され得る。しかしな
がら、この方法の価値は限られたものであることがわか
った。具体的にいうと、クローニングされた制限修飾遺
伝子は選択的な生存をもたらすに十分なファージ耐性を
常に示すとは限らないことがわかった。別のクローニン
グのアプローチは、プラスミド耐性として初期に特徴付
けられた系を大腸菌クローニングプラスミドに形質転換
するものである（ＥｃｏＲＶ、 Ｂｏｕ−ｇｕｅｌｅｒ
ｅｔ他、Ｎｕｃ ｌ 、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、１２９：３
６５９−３６）６ １９８４；ＰａｅＲ７、Ｇｉｎｇｅ
ｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ、 Ｐｒｏｅ、Ｎａ１．＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ。
ｕｓ八へ０：４０２−４０６１９８３． Ｔｈｅｒｉａ
ｕｌｔ及びＲａｙ、 １９８２；ＰｖｕＩ［、Ｂｌｕｍ
ｅｎｔｈａｌ他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１６４：
５０１−５０９１９８５） 、更に、今日では活性メチ
ラーゼ遺伝子を選択することによりクローニングされる
系の数が増しつつある（ＢｓｕＲＩ 、 Ｋ１５ｓ他、
Ｎｕｃ ｌ 、＾ａｉｄ、 Ｒｅｓ。
ｕｌｔ及びＲａｙ、 １９８２；ＰｖｕＩ［、Ｂｌｕｍ
ｅｎｔｈａｌ他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１６４：
５０１−５０９１９８５） 、更に、今日では活性メチ
ラーゼ遺伝子を選択することによりクローニングされる
系の数が増しつつある（ＢｓｕＲＩ 、 Ｋ１５ｓ他、
Ｎｕｃ ｌ 、＾ａｉｄ、 Ｒｅｓ。
１３：６４０３−６４２１１９８６；Ｔａｑ Ｉ ）。
２つの遺伝子は多くの場合近接して連結しているので、
同時にクローニングされる。しかしながら、メチラーゼ
選択は必ずしも完全な制限系をもたらさない（ＢｓｐＲ
Ｉ。
同時にクローニングされる。しかしながら、メチラーゼ
選択は必ずしも完全な制限系をもたらさない（ＢｓｐＲ
Ｉ。
Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ他、 Ｇｅｎｅ ｌｏ：２１９
−２２５ １９８０； Ｍｓｐ Ｉ 。
−２２５ １９８０； Ｍｓｐ Ｉ 。
Ｗａｌｄｅｒ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１
２３５−１２４１１９８３＞。
２３５−１２４１１９８３＞。
メチラーゼ遺伝子に隣接するより大きい領域をクローニ
ングしても、活性なエンドヌクレアーゼ遺伝子を作製す
ることはできるとは限らない。
ングしても、活性なエンドヌクレアーゼ遺伝子を作製す
ることはできるとは限らない。
所定の系では、メチル化により十分に保護されていない
宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際
にクローニングの開題が生じ得る。
宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際
にクローニングの開題が生じ得る。
メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが共通
のＤＮＡフラグメントに導入される場合、メチラーゼ遺
伝子生成物はエンドヌクレアーゼ遺伝子生成物が宿主ゲ
ノムを開裂する前に宿主を修飾しなければならない。
のＤＮＡフラグメントに導入される場合、メチラーゼ遺
伝子生成物はエンドヌクレアーゼ遺伝子生成物が宿主ゲ
ノムを開裂する前に宿主を修飾しなければならない。
各種のメチラーゼをクローニングする過程で、これらの
系を大腸菌中にクローニングする際の別の障害が発見さ
れた。多くの大腸菌株（一般にクローニングで使用され
ているものを含む）は、異種メチル化シトシンを含むＤ
ＮＡが細胞に導入されるのを阻止する系を有している（
Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ）。従って、どの大腸
菌株をクローニングに使用すべきかについて入念に検討
することも必要である。
系を大腸菌中にクローニングする際の別の障害が発見さ
れた。多くの大腸菌株（一般にクローニングで使用され
ているものを含む）は、異種メチル化シトシンを含むＤ
ＮＡが細胞に導入されるのを阻止する系を有している（
Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ）。従って、どの大腸
菌株をクローニングに使用すべきかについて入念に検討
することも必要である。
精製された制限エンドヌクレアーゼ、及び修飾メチラー
ゼについても、これらは実験室でＤＮＡを特徴付は及び
再配列するための有用な手段であるので、これらの酵素
を大量に合成する細菌株を得る方法を開発することは産
業上奨励されている。
ゼについても、これらは実験室でＤＮＡを特徴付は及び
再配列するための有用な手段であるので、これらの酵素
を大量に合成する細菌株を得る方法を開発することは産
業上奨励されている。
このような菌株は精製作業を単純化すると共に産業上有
効な量を産生する手段を提供するという点で有用である
。
効な量を産生する手段を提供するという点で有用である
。
本発明によると、制限酵素及び／又は対応する修飾酵素
をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子を高いレ
ベルで発現できるようにすることにより、制限酵素及び
／又は対応する修飾酵素を産生する新規アプローチが提
供される。より特定的には、これらの酵素をクローニン
グする新規方法、こうして作製されたクローン、及び酵
素自体の産生方法が提供され、この産生方法は、メチル
化により宿主を十分に保護するように適当な宿主内でメ
チラーゼ遺伝子をクローニング及び発現させ、第２段階
として、メチラーゼ遺伝子に比較して低いレベルでエン
ドヌクレアーゼを発現するベクター上のエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を、メチラーゼクローンを含む宿主にクロー
ニング及び導入することから成る。
をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子を高いレ
ベルで発現できるようにすることにより、制限酵素及び
／又は対応する修飾酵素を産生する新規アプローチが提
供される。より特定的には、これらの酵素をクローニン
グする新規方法、こうして作製されたクローン、及び酵
素自体の産生方法が提供され、この産生方法は、メチル
化により宿主を十分に保護するように適当な宿主内でメ
チラーゼ遺伝子をクローニング及び発現させ、第２段階
として、メチラーゼ遺伝子に比較して低いレベルでエン
ドヌクレアーゼを発現するベクター上のエンドヌクレア
ーゼ遺伝子を、メチラーゼクローンを含む宿主にクロー
ニング及び導入することから成る。
以下、夫々Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆ
ｕｒｉｃａｎｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａ＋＊ ｌｏｉ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓのＯｄｅ ｒ及びＢａ＋ａＨｌ制
限及び修飾遺伝子にこの方法を適用する例、及びこの方
法により作製され、Ｄｄｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ制限及び
修飾酵素を精製するための新規で有益な方法の基礎とな
るクローンについて詳細に説明する。
ｕｒｉｃａｎｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａ＋＊ ｌｏｉ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓのＯｄｅ ｒ及びＢａ＋ａＨｌ制
限及び修飾遺伝子にこの方法を適用する例、及びこの方
法により作製され、Ｄｄｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ制限及び
修飾酵素を精製するための新規で有益な方法の基礎とな
るクローンについて詳細に説明する。
本発明は、２段階法を使用する制限修飾系をクローニン
グし、該方法によって産生された制限酵素を採取するた
めの新規アプローチを提供するものである。このアプロ
ーチは、対応する制限遺伝子の認識配列がクローン又は
宿主内に存在している場合、このような修飾遺伝子を含
んでいるクローンを含んでいる宿主が対応する制限遺伝
子の認識配列内でそれ自体のＤＮＡをメチル化するとい
う事実を利用するものである。従って、このようなりロ
ーンは対応する制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの消化に耐性である。従って、これらのクロ
ーンを含んでいる宿主に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
を導入すると、メチラーゼで保護された宿主が選択的に
生存する。
グし、該方法によって産生された制限酵素を採取するた
めの新規アプローチを提供するものである。このアプロ
ーチは、対応する制限遺伝子の認識配列がクローン又は
宿主内に存在している場合、このような修飾遺伝子を含
んでいるクローンを含んでいる宿主が対応する制限遺伝
子の認識配列内でそれ自体のＤＮＡをメチル化するとい
う事実を利用するものである。従って、このようなりロ
ーンは対応する制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの消化に耐性である。従って、これらのクロ
ーンを含んでいる宿主に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
を導入すると、メチラーゼで保護された宿主が選択的に
生存する。
第１段階で所望の制限遺伝子に対応するメチラーゼ遺伝
子はクローニングされ、好ましくは高レベルのメチラー
ゼを発現する誘導体が構成される。
子はクローニングされ、好ましくは高レベルのメチラー
ゼを発現する誘導体が構成される。
次に第２段階で制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子を含んで
いる宿主にクローニングされ、エンドヌクレアーゼ活性
をスクリーニングされる。対応するメチラーゼ遺伝子に
より十分保護された宿主内でエンドヌクレアーゼ遺伝子
は発現される。
いる宿主にクローニングされ、エンドヌクレアーゼ活性
をスクリーニングされる。対応するメチラーゼ遺伝子に
より十分保護された宿主内でエンドヌクレアーゼ遺伝子
は発現される。
理論に拘束されるつもりはないが、発明者らの確信する
処では、従来のクローニングシステムは共通のＤＮＡフ
ラグメント上のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を宿主に導入しなければならず、クローン及び
その宿主のメチル化が不十分であるので、対応するエン
ドヌクレアーゼが宿主ゲノムを開裂することを許すので
、しばしば、活性エンドヌクレアーゼ遺伝子を産生ずる
ことができなかった。本発明によるとこのような問題は
、まずメチラーゼ遺伝子を導入及び発現させるか又はそ
の発現の程度を増加させ、次にメチラーゼに比較して低
いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するベクター上に
エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることによ
り克服される。
処では、従来のクローニングシステムは共通のＤＮＡフ
ラグメント上のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を宿主に導入しなければならず、クローン及び
その宿主のメチル化が不十分であるので、対応するエン
ドヌクレアーゼが宿主ゲノムを開裂することを許すので
、しばしば、活性エンドヌクレアーゼ遺伝子を産生ずる
ことができなかった。本発明によるとこのような問題は
、まずメチラーゼ遺伝子を導入及び発現させるか又はそ
の発現の程度を増加させ、次にメチラーゼに比較して低
いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するベクター上に
エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることによ
り克服される。
制限遺伝子を好適にクローニング及び発現させる本発明
の方法は、以下の段階を含んでいる。
の方法は、以下の段階を含んでいる。
＾、メ −−ゼ゛ −のクローニン
１、クローニングすべき細菌種のＤＮＡを精製する。
ウィルスも制限修飾系を含んでおり、従って原料として
使用してもよいことが最近になって発見された。
使用してもよいことが最近になって発見された。
２０）ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的
又は完全に消化させる。
又は完全に消化させる。
３、得られたフラグメントを、ｐＢＲ３２２０）ｐＵＣ
８，９，１８もしくは１９又はｐＢＲ３２８のようなり
ローニング用ベクター、あるいは例えばリンカ−を含む
これらの誘導体に連結反応させ、混合物を使用して大腸
菌細胞のような適当な宿主細胞を形質転換させる。
８，９，１８もしくは１９又はｐＢＲ３２８のようなり
ローニング用ベクター、あるいは例えばリンカ−を含む
これらの誘導体に連結反応させ、混合物を使用して大腸
菌細胞のような適当な宿主細胞を形質転換させる。
４、ＯＮ＾／細胞混合物を形質転換細胞に選択的な抗生
物質培地で平板培養する。インキュベーション後、形質
転換細胞コロニーを集め、懸濁させ、飽和に達するまで
増殖させて一次細胞ライブラリーを形成する。
物質培地で平板培養する。インキュベーション後、形質
転換細胞コロニーを集め、懸濁させ、飽和に達するまで
増殖させて一次細胞ライブラリーを形成する。
５、−次細胞ライブラリーから組換体プラスミドを完全
に精製し、−次ブラスミドライブラリーを形成する。
に精製し、−次ブラスミドライブラリーを形成する。
６、次に、所望のメチラーゼ遺伝子に対応する制限酵素
でプラスミドライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に
消化させる。エキソヌクレアーゼ及び／又はフォスファ
ターゼを消化物に加えて非メチラーゼクローンの破壊を
助長してもよい。
でプラスミドライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に
消化させる。エキソヌクレアーゼ及び／又はフォスファ
ターゼを消化物に加えて非メチラーゼクローンの破壊を
助長してもよい。
７、消化されたＤＮＡを大腸菌に形質転換させ、抗生物
質プレートで平板培養すると形質転換コロニーが再び得
られる。これらのコロニー、即ち二次細胞個体のいくつ
かを採取し、それらのＤＮＡにメチラーゼ遺伝子が存在
しているかどうかを分析できる。残っているコロニーを
掻き集めて二次細胞ライブラリーを形成し、その後この
ライブラリーから二次プラスミドライブラリーを作成す
る。
質プレートで平板培養すると形質転換コロニーが再び得
られる。これらのコロニー、即ち二次細胞個体のいくつ
かを採取し、それらのＤＮＡにメチラーゼ遺伝子が存在
しているかどうかを分析できる。残っているコロニーを
掻き集めて二次細胞ライブラリーを形成し、その後この
ライブラリーから二次プラスミドライブラリーを作成す
る。
８、二次プラスミドライブラリーを制限エンドヌクレア
ーゼ（エキソヌクレアーゼ又はフォスファターゼを併用
するか又は併用せずに）で再び消化し、選択を繰り返し
、三次細胞個体、三次細胞ライブラリー及び三次プラス
ミドライブラリーを回収する。
ーゼ（エキソヌクレアーゼ又はフォスファターゼを併用
するか又は併用せずに）で再び消化し、選択を繰り返し
、三次細胞個体、三次細胞ライブラリー及び三次プラス
ミドライブラリーを回収する。
９、各回の制限エンドヌクレアーゼ消化により、非メチ
ラーゼクローンを選択的に破壊し、所望のメチラーゼを
有するクローンの相対頻度を増加させる。
ラーゼクローンを選択的に破壊し、所望のメチラーゼを
有するクローンの相対頻度を増加させる。
１０、二次及び三次集団のうちで生存しているコロニー
を採取し、メチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
を採取し、メチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
１１、以下に述べる４種類の間車な試験により、メチラ
ーゼスクリーニングを実施する。
ーゼスクリーニングを実施する。
（１）クローンの組換体プラスミドＤＮＡ分子を精製し
、ｉｎ ｖｉｔｒｏで選択制限エンドヌクレアーゼにさ
らし、消化に対して耐性であることを確認する。プラス
ミドベクターがエンドヌクレアーゼに対応する部位を数
個有しているのであれば、耐性は突然変異による部位損
失よりも修飾を意味する。
、ｉｎ ｖｉｔｒｏで選択制限エンドヌクレアーゼにさ
らし、消化に対して耐性であることを確認する。プラス
ミドベクターがエンドヌクレアーゼに対応する部位を数
個有しているのであれば、耐性は突然変異による部位損
失よりも修飾を意味する。
（ｂ）供与体細菌ＤＮＡを断片化するために初めに使用
した酵素で組換体プラスミドを消化させる。クローン中
に存在しているフラグメントは、メチラーゼ遺伝子をコ
ードするのに十分な大きさく即ち５００塩基対を上回る
）を有していると理解されるべきであり、最も重要な点
として、各種の独立して形成されたクローンに共通して
言えることであるが、 。
した酵素で組換体プラスミドを消化させる。クローン中
に存在しているフラグメントは、メチラーゼ遺伝子をコ
ードするのに十分な大きさく即ち５００塩基対を上回る
）を有していると理解されるべきであり、最も重要な点
として、各種の独立して形成されたクローンに共通して
言えることであるが、 。
全クローンに同一のフラグメントが存在しているべきで
ある。
ある。
（ｅ）クローンの全クロモソームＤＮＡ、又は細胞中で
増殖したファージから細胞又はＤＮＡに導入された第２
のプラスミドＤＮＡを精製し、選択的制限エンドヌクレ
アーゼにさらす。クローンがメチラーゼ遺伝子をもって
いるなら、細菌クロモソーム、プラスミド又はファージ
ＤＮＡは部分的又は完全にメチル化され、消化に耐性で
あるべきである。
増殖したファージから細胞又はＤＮＡに導入された第２
のプラスミドＤＮＡを精製し、選択的制限エンドヌクレ
アーゼにさらす。クローンがメチラーゼ遺伝子をもって
いるなら、細菌クロモソーム、プラスミド又はファージ
ＤＮＡは部分的又は完全にメチル化され、消化に耐性で
あるべきである。
（ｄ）クローンからの細胞抽出物を調製し、メチラーゼ
活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する（メチラーゼ保護及
び放射線標識）、特異的なメチラーゼ活性がしばしば認
められる。
活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する（メチラーゼ保護及
び放射線標識）、特異的なメチラーゼ活性がしばしば認
められる。
１２０）メチラーゼ遺伝子をシトシン又はアデニンメチ
ラーゼのいずれかとして特徴付け、対応するエンドヌク
レアーゼ遺伝子をクローニングするための適当な宿主を
決定する。あるいは一連の宿主系を使用してメチラーゼ
遺伝子をクローニングし、そのメチル化特異性を決定し
てもよい。
ラーゼのいずれかとして特徴付け、対応するエンドヌク
レアーゼ遺伝子をクローニングするための適当な宿主を
決定する。あるいは一連の宿主系を使用してメチラーゼ
遺伝子をクローニングし、そのメチル化特異性を決定し
てもよい。
Ｂ、エンドヌクレアーゼ）−のクローニング１、エンド
ヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場合近接し
て結合しているので、メチラーゼ遺伝子を含んでいるク
ローンを同種タンパク質から構成されたエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のプローブとして使用するサザンプロットに
より、ゲノム上のメチラーゼ遺伝子を包囲している領域
をマツピングする。地図中でのメチラーゼクローンと細
菌クロモソームとの間に何らかの不一致により、ＤＮＡ
再配列が発生した位置が確認され、実際にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の位置が示される。
ヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場合近接し
て結合しているので、メチラーゼ遺伝子を含んでいるク
ローンを同種タンパク質から構成されたエンドヌクレア
ーゼ遺伝子のプローブとして使用するサザンプロットに
より、ゲノム上のメチラーゼ遺伝子を包囲している領域
をマツピングする。地図中でのメチラーゼクローンと細
菌クロモソームとの間に何らかの不一致により、ＤＮＡ
再配列が発生した位置が確認され、実際にエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の位置が示される。
２０）制限地図を利用して細菌種のＤＮＡを再び適当な
制限酵素で消化させる。プローブにハイブリダイズする
適当な寸法範囲のフラグメントを精製し、メチラーゼに
比較して低いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するク
ローニング用ベクターに連結反応させる。適当なベクタ
ーは、好ましくはメチラーゼ遺伝子を含むクローニング
用ベクターに適合性のベクターである。この混合物を使
用して次にメチラーゼプラスミドを有している宿主細胞
を形質転換させる。好適な例ではないが、工ンドヌフレ
アーゼ遺伝子の発現が低いか又はプロモーターにより厳
重に制御されるなら、メチラーゼ遺伝子を含むクローニ
ング用ベクターにエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入して
もよい。混合物を使用し、メチラーゼプラスミドを使用
するか又は使用せずに宿主細胞を形質転換させる。いず
れの場合も、ＤＮＡ／細胞混合物は形質転換細胞に選択
的な抗生物質培地で平板培養する。
制限酵素で消化させる。プローブにハイブリダイズする
適当な寸法範囲のフラグメントを精製し、メチラーゼに
比較して低いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するク
ローニング用ベクターに連結反応させる。適当なベクタ
ーは、好ましくはメチラーゼ遺伝子を含むクローニング
用ベクターに適合性のベクターである。この混合物を使
用して次にメチラーゼプラスミドを有している宿主細胞
を形質転換させる。好適な例ではないが、工ンドヌフレ
アーゼ遺伝子の発現が低いか又はプロモーターにより厳
重に制御されるなら、メチラーゼ遺伝子を含むクローニ
ング用ベクターにエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入して
もよい。混合物を使用し、メチラーゼプラスミドを使用
するか又は使用せずに宿主細胞を形質転換させる。いず
れの場合も、ＤＮＡ／細胞混合物は形質転換細胞に選択
的な抗生物質培地で平板培養する。
３、制限エンドヌクレアーゼスクリーニングは以下に述
べる３種類の方法で実施することができる。
べる３種類の方法で実施することができる。
（１）クローンからの細胞抽出物を調製し、感受性ＤＮ
Ａを消化する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。制限
エンドヌクレアーゼ活性が認められるべきである。
Ａを消化する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。制限
エンドヌクレアーゼ活性が認められるべきである。
（ｂ）細胞自体がファージ感染に抵抗する能力を１ｎｖ
ｉｖｏで試験する。ファージ感染に対する耐性は、制限
修飾系の存在を意味している。
ｉｖｏで試験する。ファージ感染に対する耐性は、制限
修飾系の存在を意味している。
（ｅ）エンドヌクレアーゼ遺伝子に対して形成されたオ
リゴヌクレオチドプローブの配列に相補的な配列及び／
又はメチラーゼ遺伝子のプローブに隣接し且つ該プロー
ブ中に含まれない領域が形質転換コロニーに存在してい
るか否かをハイブリダイゼーションにより試験すること
もできる。
リゴヌクレオチドプローブの配列に相補的な配列及び／
又はメチラーゼ遺伝子のプローブに隣接し且つ該プロー
ブ中に含まれない領域が形質転換コロニーに存在してい
るか否かをハイブリダイゼーションにより試験すること
もできる。
以上要約した段階は本発明を実施するための好適方法を
示すものであるが、当該技術分野で既知の技術に従って
上記方法を変更できることは当業者に自明であろう。
示すものであるが、当該技術分野で既知の技術に従って
上記方法を変更できることは当業者に自明であろう。
Ｄｄｅ Ｉ及びＢａｍＨＩの制限及び修飾遺伝子を含ん
でいるクローンを、本発明に従って作製した。上記遺伝
子を含むＤＮＡの原料は、Ｄｅｓｕｌｆｏｉｂｒｉ。
でいるクローンを、本発明に従って作製した。上記遺伝
子を含むＤＮＡの原料は、Ｄｅｓｕｌｆｏｉｂｒｉ。
ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（Ｄｄｅ Ｉ ） （ＭＣ
ＩＢ８３１２０）及びＢａｃｉｌｌｕｓシリュｏｉ ｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＢａｍＨｌ （試料は＾ｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎに＾ＴＣＣ５３４９５で寄託されている）とした。
ＩＢ８３１２０）及びＢａｃｉｌｌｕｓシリュｏｉ ｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＢａｍＨｌ （試料は＾ｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎに＾ＴＣＣ５３４９５で寄託されている）とした。
制限及び修飾遺伝子の適切なりローニングを妨げる一因
は、宿主として使用される大腸菌株にある。多くの細菌
は大腸菌を含む制限修飾系を有している。大腸菌で最も
よく知られている系は、宿主特異性決定基又はＨｓｄ系
であるが、特にＰｌ及びＥｃｏＲ系のような他の系も存
在している（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ。
は、宿主として使用される大腸菌株にある。多くの細菌
は大腸菌を含む制限修飾系を有している。大腸菌で最も
よく知られている系は、宿主特異性決定基又はＨｓｄ系
であるが、特にＰｌ及びＥｃｏＲ系のような他の系も存
在している（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ。
Ｊ、、 Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １２Ｓ：Ｒ
１６７−２０４（１９８４））、これらの系は形質転換
中にもたらされるＤＮＡを破壊するので、クローニング
を牛渉し、形質転換体の数は少なく非典型的なライブラ
リーが形成される。
１６７−２０４（１９８４））、これらの系は形質転換
中にもたらされるＤＮＡを破壊するので、クローニング
を牛渉し、形質転換体の数は少なく非典型的なライブラ
リーが形成される。
従って、一般に本発明の実施にあたり、好適な大腸菌は
制限系が突然変異又は欠失によって不活性化されている
ような種類である。これらの系が不活性化されているか
又は不在であり且つ一般的なりローニングの目的で使用
できる好適な菌株は、ＨＢｌｏｌ（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾
ＴＣＣ３３６９４、ＲＲＩ（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣＣ
３１３４３、Ｋ８０２、ＨＢ１０１、ＲＲ１、Ｋ８０３
（ｈｓｄＲ”Ｍ−）＾ＴＣＣ３３５２８、Ｋ８０２、Ｈ
Ｂ１０１、ＲＲ１、Ｋ８０３（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣ
Ｃ２７０６５及びＭＭ２９４（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣ
Ｃ３３６２５及びＥＲ１４６７（ｈｓｄＲ−Ｍ−）を含
み、このうち最後の菌株の試料は＾ｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに＾Ｔ
ＣＣ５３４９６で寄託しである。
制限系が突然変異又は欠失によって不活性化されている
ような種類である。これらの系が不活性化されているか
又は不在であり且つ一般的なりローニングの目的で使用
できる好適な菌株は、ＨＢｌｏｌ（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾
ＴＣＣ３３６９４、ＲＲＩ（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣＣ
３１３４３、Ｋ８０２、ＨＢ１０１、ＲＲ１、Ｋ８０３
（ｈｓｄＲ”Ｍ−）＾ＴＣＣ３３５２８、Ｋ８０２、Ｈ
Ｂ１０１、ＲＲ１、Ｋ８０３（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣ
Ｃ２７０６５及びＭＭ２９４（ｈｓｄＲ−Ｍ−）＾ＴＣ
Ｃ３３６２５及びＥＲ１４６７（ｈｓｄＲ−Ｍ−）を含
み、このうち最後の菌株の試料は＾ｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに＾Ｔ
ＣＣ５３４９６で寄託しである。
特に外来制限及び／又は修飾遺伝子の大腸菌クローニン
グに間しては、適切なりローニングを妨害する別の系も
存在している。系は不明であり、”Ｒｇｌ”系と呼称さ
れる（Ｒｅｖｅｌ、Ｈ，Ｒ，、Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｈａ
ｅＴ４． ｐｐ、１５６−１６５＾ｍｅｒｉｃａｎ
５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉ−ｏｌｏｇｙ
（１９８３）及びＲｅｖｅ Ｉ他、＾ｎｎｕａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｕ＋ ｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ ４：１７７−１９
２（１９７０））。より特定的には、大腸菌Ｒｇｌ系は
メチル化シトシン残基を有するＤＮ八へ子を制限し、従
ってまさに単離すべき自己メチル化されたプラスミドク
ローンを破壊する。Ｒｇｌ系はｎｃｒＢ（ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ ｃ３ｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ。
グに間しては、適切なりローニングを妨害する別の系も
存在している。系は不明であり、”Ｒｇｌ”系と呼称さ
れる（Ｒｅｖｅｌ、Ｈ，Ｒ，、Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｈａ
ｅＴ４． ｐｐ、１５６−１６５＾ｍｅｒｉｃａｎ
５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉ−ｏｌｏｇｙ
（１９８３）及びＲｅｖｅ Ｉ他、＾ｎｎｕａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｕ＋ ｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ ４：１７７−１９
２（１９７０））。より特定的には、大腸菌Ｒｇｌ系は
メチル化シトシン残基を有するＤＮ八へ子を制限し、従
ってまさに単離すべき自己メチル化されたプラスミドク
ローンを破壊する。Ｒｇｌ系はｎｃｒＢ（ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ ｃ３ｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ。
Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ前掲）と命名されてい
る遺伝子座により調節されることが最近示された。従っ
て、このようなメチラーゼ遺伝子をクローニングするた
めには、Ｈｓｄ （普遍）系及びＲｇｌ（特異）系の両
方を欠失している大腸菌宿主を使用すると好適である。
る遺伝子座により調節されることが最近示された。従っ
て、このようなメチラーゼ遺伝子をクローニングするた
めには、Ｈｓｄ （普遍）系及びＲｇｌ（特異）系の両
方を欠失している大腸菌宿主を使用すると好適である。
’ ｍｃｒＢ’遺伝子座をＴｎｌＯ挿入で不活性化する
ことにより、新規系のクローニング株を構成した。メチ
ラーゼ遺伝子がシトシン型のクローンである場合に好適
に使用されるこのような菌株の一例はＥＲ１４６７であ
り、この菌株はｍｃｒＢにＴｎｌＯ挿入を含むＪＣ１５
５２の誘導様（Ｂａｃｈｍａｎ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
Ｒｅｖ、３６：５２５；１９７２）である。しかしなが
ら、クローニングされたメチラーゼ遺伝子の総てが感受
性という訳ではない。より特定的には、アデニン残基を
メチル化する遺伝子はシトシン残基をメチル化する遺伝
子に較べて８ｇｌ系による影響を全く受けないように思
われる。
ことにより、新規系のクローニング株を構成した。メチ
ラーゼ遺伝子がシトシン型のクローンである場合に好適
に使用されるこのような菌株の一例はＥＲ１４６７であ
り、この菌株はｍｃｒＢにＴｎｌＯ挿入を含むＪＣ１５
５２の誘導様（Ｂａｃｈｍａｎ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
Ｒｅｖ、３６：５２５；１９７２）である。しかしなが
ら、クローニングされたメチラーゼ遺伝子の総てが感受
性という訳ではない。より特定的には、アデニン残基を
メチル化する遺伝子はシトシン残基をメチル化する遺伝
子に較べて８ｇｌ系による影響を全く受けないように思
われる。
理論に拘束される意図はないが、発明者らの確信する処
では、８ｇｌ系はＲｇＩＡ及びＲｇｌＢと呼称される２
種の成分から構成されている。ＲｇｌＢはシトシン−メ
チラーゼを含む多くのＤＮＡを制限するが、現時点では
ＲｇＩＡはただ１種の特異性クローン（ＨｐａＩＩ）し
か制限しないものとして知られている。
では、８ｇｌ系はＲｇＩＡ及びＲｇｌＢと呼称される２
種の成分から構成されている。ＲｇｌＢはシトシン−メ
チラーゼを含む多くのＤＮＡを制限するが、現時点では
ＲｇＩＡはただ１種の特異性クローン（ＨｐａＩＩ）し
か制限しないものとして知られている。
特徴付けされていない制限−修飾系の制限及び／又は修
飾遺伝子、又はシトシンをメチル化することがわかって
いる該遺伝子をクローニングするための宿主を選択する
に当たり、好適な宿主は三重突然変異株である大腸菌株
であり、即ち■ｓｄ、ＲｇｌＡ及びＲ，ｌＢ系を欠失し
ている菌株である。このような菌株にはに８０２がある
。Ｄｄｅ Ｉに好適な宿主はｈｓｔＲ−Ｍ−及びｒｇｌ
＾゛Ｂ−であるＥＲ１４６７である。他方、修飾系がア
デニン−メチラーゼ型の系であるとわかっている場合、
宿主のＲｇｌ活性は無視できる。
飾遺伝子、又はシトシンをメチル化することがわかって
いる該遺伝子をクローニングするための宿主を選択する
に当たり、好適な宿主は三重突然変異株である大腸菌株
であり、即ち■ｓｄ、ＲｇｌＡ及びＲ，ｌＢ系を欠失し
ている菌株である。このような菌株にはに８０２がある
。Ｄｄｅ Ｉに好適な宿主はｈｓｔＲ−Ｍ−及びｒｇｌ
＾゛Ｂ−であるＥＲ１４６７である。他方、修飾系がア
デニン−メチラーゼ型の系であるとわかっている場合、
宿主のＲｇｌ活性は無視できる。
ｒｇｌはアデニンメチラーゼに干渉しないが、大腸菌／
に於ける他の更に貧弱にしか特徴付けられていない系も
アデニンメチル化に作用し得る。従って、宿主の選択は
クローニングすべき修飾遺伝子の特徴に依存する。第１
表は、数種類の修飾遺伝子のクローニングに関する数種
類の大腸菌株の適 。
に於ける他の更に貧弱にしか特徴付けられていない系も
アデニンメチル化に作用し得る。従って、宿主の選択は
クローニングすべき修飾遺伝子の特徴に依存する。第１
表は、数種類の修飾遺伝子のクローニングに関する数種
類の大腸菌株の適 。
合作を要約したものである。
以下の実施例は、現在好適に実施される本発明の実施態
様を示すためのものである。これらの実施例は例示に過
ぎず、本発明は特許請求の範囲に示されている以外はこ
れらの実施例に限定されないものと理解されたい。
様を示すためのものである。これらの実施例は例示に過
ぎず、本発明は特許請求の範囲に示されている以外はこ
れらの実施例に限定されないものと理解されたい。
えＩ鮪■
１、ＤＮＡ精製：
Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡを以下の方法
により精製した。５ｇの凍結細胞を２０Ｈ１の２５％シ
ョ糖、５０ａ＋ＭＴｒｉｓ、 ｐＨ８，０に再懸濁した
。１０１１の０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０と、０
．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐｌ！８．０中の１０ＩＩｇ／
ｘｉのリゾチーム６、Ｏｚｌとを加えた。懸濁液を氷上
に２時間放置した。その後、２４ｘ１の溶菌緩衝液（１
％Ｔｒ ｉ ｔｏｎＸ−１００，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
ｐＨ８，０，６７ｍＭ ＥＤＴＡ）と、５１１１の１
０％ＳＯＳとを加えて混合し、細胞を溶解させた。
により精製した。５ｇの凍結細胞を２０Ｈ１の２５％シ
ョ糖、５０ａ＋ＭＴｒｉｓ、 ｐＨ８，０に再懸濁した
。１０１１の０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０と、０
．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐｌ！８．０中の１０ＩＩｇ／
ｘｉのリゾチーム６、Ｏｚｌとを加えた。懸濁液を氷上
に２時間放置した。その後、２４ｘ１の溶菌緩衝液（１
％Ｔｒ ｉ ｔｏｎＸ−１００，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
ｐＨ８，０，６７ｍＭ ＥＤＴＡ）と、５１１１の１
０％ＳＯＳとを加えて混合し、細胞を溶解させた。
等量のフェノール（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，
０で平衡化）を加え、溶液を振蕩により乳化させた。次
に７０ｔｊ！のクロロホルムを加え、１０分間振蕩させ
た。次に混合物をＢｅｃｋｍａｎ遠心機でＩＯＫで３０
分間遠心し、ＤＮＡを含んでいる頂部水層を新しいびん
に移し、フェノール／クロロホルムで更に２回再抽出し
た。
０で平衡化）を加え、溶液を振蕩により乳化させた。次
に７０ｔｊ！のクロロホルムを加え、１０分間振蕩させ
た。次に混合物をＢｅｃｋｍａｎ遠心機でＩＯＫで３０
分間遠心し、ＤＮＡを含んでいる頂部水層を新しいびん
に移し、フェノール／クロロホルムで更に２回再抽出し
た。
次に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ
８，０を４回交換して２４時間にわたって水層を透析し
た。透析したＤＮＡ溶液を０．１容量のＲＮアーゼ（１
０ｚｇ／ｚｌ）で３７°Ｃで１時間処理した。最終濃度
が０．４Ｍ ＮａＣｌに達するまで５８ ｄａｃｌ溶液
を加え、２容量のエタノールを溶液の頂部に積層させた
。ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、７０％エタノールで１
回洗い、次に１５１１の１０１Ｍ Ｔｒｉｓ。
８，０を４回交換して２４時間にわたって水層を透析し
た。透析したＤＮＡ溶液を０．１容量のＲＮアーゼ（１
０ｚｇ／ｚｌ）で３７°Ｃで１時間処理した。最終濃度
が０．４Ｍ ＮａＣｌに達するまで５８ ｄａｃｌ溶液
を加え、２容量のエタノールを溶液の頂部に積層させた
。ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、７０％エタノールで１
回洗い、次に１５１１の１０１Ｍ Ｔｒｉｓ。
１ｇＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０に溶解させた。ＤＮＡ
を一２０℃で 。
を一２０℃で 。
凍結保存した。５ｇの細胞から、１．５１１１７の精製
［１８＾が回収された。
［１８＾が回収された。
２０）完全消化：
１００１１１の反応液中で、）ＩｉｎｄＩＩＩ［街液（
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
ｐＨ７，５； １０ｍＭ ＭｇＣｌ２； ５０ｍＭ
Ｎａ１ｌ； １０ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール）
中の１５単位の旧ｎｄｌ［［と共に１０１１ｇの精製り
、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡを３７℃で１時
間インキュベートすることにより、Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕ
ｒｉｃａｎｓライブラリーを作成した。
Ｎａ１ｌ； １０ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール）
中の１５単位の旧ｎｄｌ［［と共に１０１１ｇの精製り
、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡを３７℃で１時
間インキュベートすることにより、Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕ
ｒｉｃａｎｓライブラリーを作成した。
３、連結反応
１０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｌｏ−１ａｂｓ）と共に５Ｏｎ＋Ｍ Ｔｒ
ｉｓ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＨｇＣｌ□。
ｌａｎｄ Ｂｌｏ−１ａｂｓ）と共に５Ｏｎ＋Ｍ Ｔｒ
ｉｓ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＨｇＣｌ□。
１０ｎＭ ＤＴＴ、 ０．５ｍＭ＾ＴＰを含むｔｏｏｕ
ｉの反応液容量中で、消化されたＤＮＡ４１ｇを、Ｆｌ
ｉｎｄＩＩＩで開裂し脱リン酸化したｐＢＲ３２２（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２ｐｙに連結
反応させた。連結反応は１６℃で４時間継続した。
ｉの反応液容量中で、消化されたＤＮＡ４１ｇを、Ｆｌ
ｉｎｄＩＩＩで開裂し脱リン酸化したｐＢＲ３２２（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２ｐｙに連結
反応させた。連結反応は１６℃で４時間継続した。
次に試料をクロロホルムで処理し、（５０ｍＭ ＣａＣ
Ｉｚ中の）２００．ｆの氷冷コンピテントＲＲＩ細胞を
形質転換させるために使用した。細胞に４２℃で２分間
熱シヨツクを与え、５１１Ｎのルリアブロス（Ｌ−Ｂｒ
ｏｔｈ）で希釈し、３７°Ｃで飽和に達するまで増殖し
た。
Ｉｚ中の）２００．ｆの氷冷コンピテントＲＲＩ細胞を
形質転換させるために使用した。細胞に４２℃で２分間
熱シヨツクを与え、５１１Ｎのルリアブロス（Ｌ−Ｂｒ
ｏｔｈ）で希釈し、３７°Ｃで飽和に達するまで増殖し
た。
４、影響転換細胞を遠心分雛（４に、１０分、 Ｂｅｃ
ｋｍａｎ遠心機）により採取し、２５０μｌのし一グロ
スに再懸濁させ、１００ｐｙ／ｚ１のアンピシリンを含
むし寒天プレート上にのせ、３７℃で一晩インキユベー
トした。
ｋｍａｎ遠心機）により採取し、２５０μｌのし一グロ
スに再懸濁させ、１００ｐｙ／ｚ１のアンピシリンを含
むし寒天プレート上にのせ、３７℃で一晩インキユベー
トした。
２．５ｘｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１０
ｍＭ ＭＨＣ１２１１衝液を使用し、約１０５の形質転
換体から成る混合集団をプレートから決別した。
ｍＭ ＭＨＣ１２１１衝液を使用し、約１０５の形質転
換体から成る混合集団をプレートから決別した。
５、この混合物を１００μｇ７ｘ１のアンピシリンを含
む５００ａ＋ｌのＬＢに接種し、３７℃で一晩インキユ
ベートした。培養株を３７℃で一晩振蕩させ、その後、
細胞を再び回収した（４に、５分）。細胞を室温で１０
１１の２５％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０
に再懸濁させた。５友ｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ
８，ｏ及び３ｘｌのＩＯＢ／ｚｎリゾチームを加えた。
む５００ａ＋ｌのＬＢに接種し、３７℃で一晩インキユ
ベートした。培養株を３７℃で一晩振蕩させ、その後、
細胞を再び回収した（４に、５分）。細胞を室温で１０
１１の２５％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０
に再懸濁させた。５友ｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ
８，ｏ及び３ｘｌのＩＯＢ／ｚｎリゾチームを加えた。
溶液を４°Ｃに１時間維持し、１２１１の溶菌緩衝液を
加えて細胞懸濁液を静かに混合した。
加えて細胞懸濁液を静かに混合した。
溶解後、溶解物を１５にで１時間遠心した。上清をチー
ズクロースで傾瀉した。固体塩化セシウム（０，９３ｙ
ａｗｌ）を加え、臭化エチジウムを濃度１００ｐｙ／ｚ
βまで加えた。管に充填し、平衡化し、Ｂｅｃｋ７ｍａ
ｎ超遠心機のＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ヘツドで４４０
０Ｏｒｐｍで１７℃で４８時間遠心した。エチジウム染
色したＤＮＡのバンドを注射器で抽出し、凍結時、ＤＮ
Ａをエタノールに沈降させた。１２にで２０分間遠心す
ることにより、プラスミドＤＮＡを収集した。１１１の
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０，１ｍＭ ＥＤＴＡ
に再懸濁後、ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、クロロ
ホルムで１回抽出し、２容量のエタノールに沈降させ、
乾燥させ、１００ｕＮの１０ａ＋ＭＴｒｉｓ、 ｐＨ８
，０，１ｆｉＭ ＥＤＴＡ［漬液に再懸濁させた。
ズクロースで傾瀉した。固体塩化セシウム（０，９３ｙ
ａｗｌ）を加え、臭化エチジウムを濃度１００ｐｙ／ｚ
βまで加えた。管に充填し、平衡化し、Ｂｅｃｋ７ｍａ
ｎ超遠心機のＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ヘツドで４４０
０Ｏｒｐｍで１７℃で４８時間遠心した。エチジウム染
色したＤＮＡのバンドを注射器で抽出し、凍結時、ＤＮ
Ａをエタノールに沈降させた。１２にで２０分間遠心す
ることにより、プラスミドＤＮＡを収集した。１１１の
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０，１ｍＭ ＥＤＴＡ
に再懸濁後、ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、クロロ
ホルムで１回抽出し、２容量のエタノールに沈降させ、
乾燥させ、１００ｕＮの１０ａ＋ＭＴｒｉｓ、 ｐＨ８
，０，１ｆｉＭ ＥＤＴＡ［漬液に再懸濁させた。
６、Ｄｄｅ Ｉ開裂
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭ Ｍｇｃ
１２． １０ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール、１００
ｍＭ ＮａＣｌを含む１００．ｌの反応液中で、５Ｉ１
１７の一次プラスミドブールを８０単位のＤｄｅ ［エ
ンドヌクレアーゼで１時間消化した。
１２． １０ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール、１００
ｍＭ ＮａＣｌを含む１００．ｌの反応液中で、５Ｉ１
１７の一次プラスミドブールを８０単位のＤｄｅ ［エ
ンドヌクレアーゼで１時間消化した。
７、形質転換：
１０１Ｊ１）反応混合物を使用しテ２００１１？７）Ｒ
Ｒ１＋ｌ胞を上述のように形質転換させた。２分間熱処
理後、直ちに、形質転換混合物をＬ−寒天に１００ｐ１
００ｐアンピシリンを加えたプレート培地上にまいた。
Ｒ１＋ｌ胞を上述のように形質転換させた。２分間熱処
理後、直ちに、形質転換混合物をＬ−寒天に１００ｐ１
００ｐアンピシリンを加えたプレート培地上にまいた。
プレートを３７℃で一晩インキユベートした。Ｄｄｅ
Ｉで処理した組換体プラスミドと処理しないものとを比
較した処、１０３の選択性が認められた。アンピシリン
を含む１０肩！のＬ−ブロスにコロニーを接種してミニ
培養株を作製し、ＬＢ及びアンピシリンプレートで画線
培養した。
Ｉで処理した組換体プラスミドと処理しないものとを比
較した処、１０３の選択性が認められた。アンピシリン
を含む１０肩！のＬ−ブロスにコロニーを接種してミニ
培養株を作製し、ＬＢ及びアンピシリンプレートで画線
培養した。
８、ミニプレツブ手順：
各培養株を次のように処理した。−晩培養した１０１１
の培養株を６Ｋ ｒｐｍｓ分間でベレット状にし、ＩＨ
／ｘ１のリゾチームを含む１ｘｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ８，０゜１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ５０ｆｆ１Ｍ
グルコースに再懸濁させた。室温で１０分間経過後、２
ｄの０．２Ｍ Ｎａ１ｌ（、１％ ＳＯＳ溶液を加え、
管を混合し、５分間４℃にした。１，５ａの３Ｍ酢酸ナ
トリウムｐＨ４，８を加え、混合し、氷上で５分間イン
キュベートした。混合物を１５Ｋ ｒｐ＋ａで１０分間
遠心分離した。 ３．０ｘｌのイソプロパツールを含む
遠心分離管に上清を注入した。室温で１０分間放置後、
管を１５Ｋ ｒｐｓ＋で１０分間遠心した。ベレットを
室温で空気乾燥し、０．８５ｍ／の１０＋ｏＭ Ｔｒｉ
ｓ、 １ｍＭＥＤＴＡ ｐ）１８．０に再懸濁させた。
の培養株を６Ｋ ｒｐｍｓ分間でベレット状にし、ＩＨ
／ｘ１のリゾチームを含む１ｘｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ８，０゜１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ５０ｆｆ１Ｍ
グルコースに再懸濁させた。室温で１０分間経過後、２
ｄの０．２Ｍ Ｎａ１ｌ（、１％ ＳＯＳ溶液を加え、
管を混合し、５分間４℃にした。１，５ａの３Ｍ酢酸ナ
トリウムｐＨ４，８を加え、混合し、氷上で５分間イン
キュベートした。混合物を１５Ｋ ｒｐ＋ａで１０分間
遠心分離した。 ３．０ｘｌのイソプロパツールを含む
遠心分離管に上清を注入した。室温で１０分間放置後、
管を１５Ｋ ｒｐｓ＋で１０分間遠心した。ベレットを
室温で空気乾燥し、０．８５ｍ／の１０＋ｏＭ Ｔｒｉ
ｓ、 １ｍＭＥＤＴＡ ｐ）１８．０に再懸濁させた。
７５．Ｎの５Ｍ ＮａＣ１を加え、ＤＮＡイソプロパツ
ールを再び室温で沈降させた。ｅｐｐｅｎｃｉｏｒｆ遠
心器で１分間遠心遠心へレットを空気乾燥させ、２０μ
ｇ７ｍｌのＲＮアーゼを含有する５０μ！の１Ｏｎ＋Ｍ
Ｔｒｉｓ、 ｐｆ１８．ｏ、 １ｍＭ ＥＤＴＡに再
懸濁させた。
ールを再び室温で沈降させた。ｅｐｐｅｎｃｉｏｒｆ遠
心器で１分間遠心遠心へレットを空気乾燥させ、２０μ
ｇ７ｍｌのＲＮアーゼを含有する５０μ！の１Ｏｎ＋Ｍ
Ｔｒｉｓ、 ｐｆ１８．ｏ、 １ｍＭ ＥＤＴＡに再
懸濁させた。
９、メチラーゼ遺伝子クローン：
プラスミドミニブレツブをまずＤｄｅ Ｉ感作により分
析し、次にＨｉｎｄｌｌ［消化により分析しな。生存株
のうちで、２種類の型がＤｄｅ ｆエンドヌクレアーゼ
による開裂に対して耐性であった。これらの型はｐＢＲ
３２２に関して逆の方位に３．０ｋｂの旧ｎｄｌＩ［フ
ラグメントを有していた。これらのプラスミドはその後
、Ｄｄｅ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子を有していることが
認められた。Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、
ＰＮＡＳ （米国）８０：４０２（１９８５）に記載の
標準命名法を使用して、この２種頚のプラスミドをｐＤ
ｄｅＭ３．ｏａ及びｐ［ｌｄｅＭ３．０ｂと呼称した。
析し、次にＨｉｎｄｌｌ［消化により分析しな。生存株
のうちで、２種類の型がＤｄｅ ｆエンドヌクレアーゼ
による開裂に対して耐性であった。これらの型はｐＢＲ
３２２に関して逆の方位に３．０ｋｂの旧ｎｄｌＩ［フ
ラグメントを有していた。これらのプラスミドはその後
、Ｄｄｅ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子を有していることが
認められた。Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、
ＰＮＡＳ （米国）８０：４０２（１９８５）に記載の
標準命名法を使用して、この２種頚のプラスミドをｐＤ
ｄｅＭ３．ｏａ及びｐ［ｌｄｅＭ３．０ｂと呼称した。
これらのクローンの粗抽出物（後述の８−５の欄を参照
のこと）はＤｄｅ ｌエンドヌクレアーゼ活性を示さな
かった。
のこと）はＤｄｅ ｌエンドヌクレアーゼ活性を示さな
かった。
３．０ｋｂ ＨｉｎｄＩ［［フラグメント内におけるメ
チラーゼの位置は、一連のＴｎ５突然変異誘発実験（第
１図＾）により決定した（Ｂｅｒｇ、Ｄ、Ｅ、（１９７
７） ＤＮＡ Ｉｎ５ｅｒ−巨」互Ｅ Ｉ ｅｍ＋狙卦
−Ｐｌａｓｍ±ｄｓａｎｄＥｉ互ザシ、。
チラーゼの位置は、一連のＴｎ５突然変異誘発実験（第
１図＾）により決定した（Ｂｅｒｇ、Ｄ、Ｅ、（１９７
７） ＤＮＡ Ｉｎ５ｅｒ−巨」互Ｅ Ｉ ｅｍ＋狙卦
−Ｐｌａｓｍ±ｄｓａｎｄＥｉ互ザシ、。
Ｂｕｋｈａｒｉ 、＾、１．．５ｈａｐｉｒｏｊ、＾、
及び＾ｄｈｙａ、Ｓ、Ｌ、Ｊｊｉ集。
及び＾ｄｈｙａ、Ｓ、Ｌ、Ｊｊｉ集。
ｐｐ２０５−２１２．Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ。
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。メチラーゼプラスミドｐＤｄｅＭ
３．ｏａ又はｐＤｄｅＭ３．Ｏｂを有しているＨＢＩＯ
Ｉ （ｒｅｃ＾）を、１ｏＯｕｙ／ｚ１アンピシリンと
０．２％マルトースとを含むＬ−グロスで３０℃で一晩
増殖させた。飽和した培養株を５１．１のＬＢ＋アンピ
シリン＋マルトースで１＋１００に希釈し、細胞密度が
約１０’／ｚＺに達するまで増殖させた。
３．ｏａ又はｐＤｄｅＭ３．Ｏｂを有しているＨＢＩＯ
Ｉ （ｒｅｃ＾）を、１ｏＯｕｙ／ｚ１アンピシリンと
０．２％マルトースとを含むＬ−グロスで３０℃で一晩
増殖させた。飽和した培養株を５１．１のＬＢ＋アンピ
シリン＋マルトースで１＋１００に希釈し、細胞密度が
約１０’／ｚＺに達するまで増殖させた。
これらの細胞１ｘｌを一、ｏ、ｉ、＝０．１でＴｉ５を
有するバクテリオファージ（Ｅ、Ｒａｌｅｉｇｈを介し
てＮ、Ｋｌｅｃｋｎｅｒから入手したλ４６７ ： ：
Ｔｉ５）と混合した。混合物を３゜℃で２時間インキュ
ベートした。５０μｇ／ｚ（ｌのカナマイシンと、１０
０ｐｙ／ｚ１のアンピシリンとを含むＬＢプレート上に
０．２ｚｌのアリコートをのせた。プレートを３０℃で
４８時間インキュベートした。
有するバクテリオファージ（Ｅ、Ｒａｌｅｉｇｈを介し
てＮ、Ｋｌｅｃｋｎｅｒから入手したλ４６７ ： ：
Ｔｉ５）と混合した。混合物を３゜℃で２時間インキュ
ベートした。５０μｇ／ｚ（ｌのカナマイシンと、１０
０ｐｙ／ｚ１のアンピシリンとを含むＬＢプレート上に
０．２ｚｌのアリコートをのせた。プレートを３０℃で
４８時間インキュベートした。
コロニーを５ｚｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐｔ１８．
０．１０ｎＭ ＥＤＴ＾。
０．１０ｎＭ ＥＤＴ＾。
５０ｍＭグルコースでプレートから決別し、上述のよう
にミニプレツブを作成したくミニプレツブの手順に関す
る８欄参照）。
にミニプレツブを作成したくミニプレツブの手順に関す
る８欄参照）。
ミニプレツブを使用してｚｏｏｕｌの水冷コンピテント
１（Ｂ１０１細胞（５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ中）を形質転
換させた。
１（Ｂ１０１細胞（５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ中）を形質転
換させた。
細胞に４２℃で２分間熱シヨツクを与え、１１１１のＬ
−ブロスで希釈し、１時間インキュベートした。Ｌ−ブ
ロスに５０ｕｙ／ｚ１のカナマイシンと１００１ｇ／ｚ
１のアンビシリ・ンとを加えて細胞を平板培養した。
−ブロスで希釈し、１時間インキュベートした。Ｌ−ブ
ロスに５０ｕｙ／ｚ１のカナマイシンと１００１ｇ／ｚ
１のアンビシリ・ンとを加えて細胞を平板培養した。
プラスミドＤＮＡのミニプレツブを旧ｎｄｌｌｌで消化
させることにより、形質転換体にＴｎ５を有するプラス
ミドが存在しているかどうかをスクリーニングした。ミ
ニプレツブをＤｄｅ Ｉエンドヌクレアーゼで感作する
ことにより、Ｔｎ５を有するプラスミドのＤｄｅ ｌメ
チラーゼ活性を試験した。
させることにより、形質転換体にＴｎ５を有するプラス
ミドが存在しているかどうかをスクリーニングした。ミ
ニプレツブをＤｄｅ Ｉエンドヌクレアーゼで感作する
ことにより、Ｔｎ５を有するプラスミドのＤｄｅ ｌメ
チラーゼ活性を試験した。
第１図（＾）に示すように、Ｃ１ａ ＩとＨｉｎｄｌ１
部位との間にＴｎ５が挿入されているだけで、Ｄｄｅ
ｌメチラーゼ活性の損失が生じ、遺伝子がこれらの部位
間の領域に含まれていることが暗示される。ρＤｄｅＭ
３、ＯａのＣ１ａ Ｉ欠失株を作成することにより、メ
チラーゼ活性を維持しているサブクローンｐＤｄｅＭ１
．６が形成され、メチラーゼ遺伝子がこの１．６ｋｂ領
域内に位置していることが確認された（第１図（Ｂ））
。
部位との間にＴｎ５が挿入されているだけで、Ｄｄｅ
ｌメチラーゼ活性の損失が生じ、遺伝子がこれらの部位
間の領域に含まれていることが暗示される。ρＤｄｅＭ
３、ＯａのＣ１ａ Ｉ欠失株を作成することにより、メ
チラーゼ活性を維持しているサブクローンｐＤｄｅＭ１
．６が形成され、メチラーゼ遺伝子がこの１．６ｋｂ領
域内に位置していることが確認された（第１図（Ｂ））
。
以下に述べるようなｉｎ ｖｉｖｏ保護アッセイ及びｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ３Ｈ−メチル取り込みアッセイを使用し
て、３種類のＭ、Ｄｄｅ Ｉクローンのメチラーゼ活性
を比較した。
ｎ ｖｉｔｒｏ３Ｈ−メチル取り込みアッセイを使用し
て、３種類のＭ、Ｄｄｅ Ｉクローンのメチラーゼ活性
を比較した。
ａ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ３１（−メチル取り込みアッセイ
（Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、前掲）： メチル化を試験するために、３種−類の混合物を調製し
た。
（Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、前掲）： メチル化を試験するために、３種−類の混合物を調製し
た。
１．１０Ｘメチル化緩衝液＋ ＬＭ ＮａＣ１，０，５
Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，０，ＩＭ ＥＤＴ＾及び
５０Ｉβ−メルカプトエタノール。
Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，０，ＩＭ ＥＤＴ＾及び
５０Ｉβ−メルカプトエタノール。
２０）メチル化反応混合物：ＥｃｏＲＩで線状化した基
質ｐＢＲ３２２を次のように調製した。 １００！１＋
８ ＮａＣｌ、 １０ｍＭＴｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１
０ｍＭ ＨｇＣ１□中に２０１１ｇ７ｍ１の濃度で溶解
された２０倍過剰のＥｃｏＲｌと共にｐＢＲ３２２をイ
ンキュベートした。３７℃で１時間インキュベート後、
線状化したプラスミドをフェノール抽出し、エタノール
沈降させ、ベレットを空気乾燥させた。線状化したプラ
スミドの最終濃度が１ａｇ／ｚｌに達するまでＤＭＡを
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０，１ｍＭ ＥＤＴ＾
に再懸濁させた。メチル化反応混合物は、１ｕｙ（＝
１ｐｆ）の線状化したｐＢＲ３２２と２．５μｌの１０
×メチル化緩衝液と０．５μｌの″Ｈ−Ｓ−アデノシル
−メチオニン及び２０ｕ１までのＨ２Ｏを含んでいた。
質ｐＢＲ３２２を次のように調製した。 １００！１＋
８ ＮａＣｌ、 １０ｍＭＴｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１
０ｍＭ ＨｇＣ１□中に２０１１ｇ７ｍ１の濃度で溶解
された２０倍過剰のＥｃｏＲｌと共にｐＢＲ３２２をイ
ンキュベートした。３７℃で１時間インキュベート後、
線状化したプラスミドをフェノール抽出し、エタノール
沈降させ、ベレットを空気乾燥させた。線状化したプラ
スミドの最終濃度が１ａｇ／ｚｌに達するまでＤＭＡを
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０，１ｍＭ ＥＤＴ＾
に再懸濁させた。メチル化反応混合物は、１ｕｙ（＝
１ｐｆ）の線状化したｐＢＲ３２２と２．５μｌの１０
×メチル化緩衝液と０．５μｌの″Ｈ−Ｓ−アデノシル
−メチオニン及び２０ｕ１までのＨ２Ｏを含んでいた。
３、細胞抽出物を次のように調製した。
試験すべきクローンの培養株５１！を１００ｐｙ／ｉｊ
！のアンピシリンを含むし一ブロスで３７℃−晩増殖さ
せた。飽和後、５Ｋ ｒｐｍで１０分間遠心分離するこ
とにより細胞をベレット状にした。ベレットを５００１
１（の音波処理緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７
，５，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）に再懸濁さ
せた。この混合物に２５μ！のりゾチーム（１０ｍｇ＃
ｊりと５０μｐのＥＤＴ＾（１００ｍＭ）とを加えた。
！のアンピシリンを含むし一ブロスで３７℃−晩増殖さ
せた。飽和後、５Ｋ ｒｐｍで１０分間遠心分離するこ
とにより細胞をベレット状にした。ベレットを５００１
１（の音波処理緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７
，５，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）に再懸濁さ
せた。この混合物に２５μ！のりゾチーム（１０ｍｇ＃
ｊりと５０μｐのＥＤＴ＾（１００ｍＭ）とを加えた。
試料を凍結させてから氷上で融解させた。単一の１０秒
バーストを使用してこれらの試料を音波処理した。５μ
ｌの１ＭＭｇＣｌ□を加２０．１のメチル化反応混合物
に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。２５ｕ
１の全反応液を１インチ平方の３ｍｍの紙にピペットで
移した。紙を空気乾燥後、１０％Ｔ、Ｃ，＾、 （１５
０１１）で２回洗い、次に２００ｙＮのイソプロパツー
ルで２回洗った。紙を再び空気乾燥後、管に配置し、シ
ンチレーション流体（Ｏｍｎｉｆｌｏｕｒ、 ＮＥＮ）
で被覆した。メチル化のレベルを検出するために、試料
の３−メチル取り込みを計数した。
バーストを使用してこれらの試料を音波処理した。５μ
ｌの１ＭＭｇＣｌ□を加２０．１のメチル化反応混合物
に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。２５ｕ
１の全反応液を１インチ平方の３ｍｍの紙にピペットで
移した。紙を空気乾燥後、１０％Ｔ、Ｃ，＾、 （１５
０１１）で２回洗い、次に２００ｙＮのイソプロパツー
ルで２回洗った。紙を再び空気乾燥後、管に配置し、シ
ンチレーション流体（Ｏｍｎｉｆｌｏｕｒ、 ＮＥＮ）
で被覆した。メチル化のレベルを検出するために、試料
の３−メチル取り込みを計数した。
ｂ、ｉｎ ｖｉｖｏλ保護アッセイ
上述の形質転換手順により、メチラーゼを含有するプラ
スミドｐＤｄｅＭ３．ｏａ、 ｐＤｃｌｅＭ３．ｏｂ及
びｐＤｄｅＭｌ、６を菌株ＥＲ１４６７に形質転換させ
た。これらのクローンを１００νｇｏａｌのアンピシリ
ンを含むし一グロス中で飽和に達するまで増殖させた。
スミドｐＤｄｅＭ３．ｏａ、 ｐＤｃｌｅＭ３．ｏｂ及
びｐＤｄｅＭｌ、６を菌株ＥＲ１４６７に形質転換させ
た。これらのクローンを１００νｇｏａｌのアンピシリ
ンを含むし一グロス中で飽和に達するまで増殖させた。
アンピシリン遠心分離によりベレット状にした。細胞ベ
レットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，４，５ｍ
Ｍ Ｍｇｃ１２０．２Ｍ ＮａＣ１，０，１％ゲル
から成るファージ緩衝液１ｘ１に再懸濁させた。 ｌｏ
ｏ、ｌのλファージ（１０”ファージ／１）を加え、混
合し、３７℃で３０分間インキュベートした。 ９ｚｌ
のファージＩＩＩ漬液を加えることにより混合物を希釈
し、５Ｋｒｐｍで１０分間再び遠心分離した。１１００
ｐ＃Ｎアンピシリンを含む１０ｉ＋ｆのし一ブロスにペ
レットを再懸濁させ、３７℃で一晩インキユベートした
。
レットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，４，５ｍ
Ｍ Ｍｇｃ１２０．２Ｍ ＮａＣ１，０，１％ゲル
から成るファージ緩衝液１ｘ１に再懸濁させた。 ｌｏ
ｏ、ｌのλファージ（１０”ファージ／１）を加え、混
合し、３７℃で３０分間インキュベートした。 ９ｚｌ
のファージＩＩＩ漬液を加えることにより混合物を希釈
し、５Ｋｒｐｍで１０分間再び遠心分離した。１１００
ｐ＃Ｎアンピシリンを含む１０ｉ＋ｆのし一ブロスにペ
レットを再懸濁させ、３７℃で一晩インキユベートした
。
次のようにしてファージＤＮＡを調製した。溶解細胞を
遠心管に移し、３滴のクロロホルムを加えた。試料に渦
形成してから１０Ｋｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペ
レットを廃棄し、等量のフェノールを加え、渦形成し、
５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離することにより、上清をフ
ェノール抽出した。次に水層をクロロホルムで抽出し、
渦形成し、再度遠心分離した。頂部層を新しい管に移し
、これに２容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈降させ
た。１０Ｋｒｐｍで２０分間遠心分離後、ペレットを空
気乾燥し、１ｘｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐ）１Ｂ、
０．１ｍＭ ＥＤＴ＾、 ２０！ｇ／ｘｌ ＲＮアーゼ
に再懸濁させた。
遠心管に移し、３滴のクロロホルムを加えた。試料に渦
形成してから１０Ｋｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペ
レットを廃棄し、等量のフェノールを加え、渦形成し、
５Ｋｒｐｍで５分間遠心分離することにより、上清をフ
ェノール抽出した。次に水層をクロロホルムで抽出し、
渦形成し、再度遠心分離した。頂部層を新しい管に移し
、これに２容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈降させ
た。１０Ｋｒｐｍで２０分間遠心分離後、ペレットを空
気乾燥し、１ｘｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐ）１Ｂ、
０．１ｍＭ ＥＤＴ＾、 ２０！ｇ／ｘｌ ＲＮアーゼ
に再懸濁させた。
ファージＤＮへの修飾を試験するために、２０〜４０
・１１！のファージＤＮＡを（５０，ｆｆｉの反
応容量中の）５ＩＩｆの１０Ｄｄｅ Ｉ緩衝液（ＩＭ
ＮａＣｌ、 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５及び
１００＋＊１４ ＭｇＣ１ｚ）及び１．５μｆのＤｄｅ
Ｉエンドヌクレアーゼ（１０，０００単位／１１）と
混合した。試料全体を第２図に示すようにゲル電気泳動
により分析した。
・１１！のファージＤＮＡを（５０，ｆｆｉの反
応容量中の）５ＩＩｆの１０Ｄｄｅ Ｉ緩衝液（ＩＭ
ＮａＣｌ、 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５及び
１００＋＊１４ ＭｇＣ１ｚ）及び１．５μｆのＤｄｅ
Ｉエンドヌクレアーゼ（１０，０００単位／１１）と
混合した。試料全体を第２図に示すようにゲル電気泳動
により分析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果、
メチラーゼ活性の段階が明らかになり、ｐＤｄｅＭ３．
ｏｂは最低の活性を有しており、ｐＤｄｅＭｌ、６は最
高の活性を有しており、ｐＤｄｅＭｌ、６のみがλファ
ージをｉｎ ｖｉｖ。
メチラーゼ活性の段階が明らかになり、ｐＤｄｅＭ３．
ｏｂは最低の活性を有しており、ｐＤｄｅＭｌ、６は最
高の活性を有しており、ｐＤｄｅＭｌ、６のみがλファ
ージをｉｎ ｖｉｖ。
で完全に保護するに十分な活性を有していた。１ｎｖｉ
ｔｒｏアツセイはこれらの結果に一致していた。
ｔｒｏアツセイはこれらの結果に一致していた。
従って、この後の試みではｐＤｄｅＭｌ 、６を使用し
てエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングしたく以下
参照）。
てエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングしたく以下
参照）。
λＤＮＡは２５３２位でオーバーラツプする５ａｕ３ａ
（ＧＡＴＣ）及びＤｄｅ Ｉ （ｃＴＮＡＧ）部位＋
５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧ−３’を含んでいることから、
Ｍ、Ｄｄｅ Ｉはアデニンメチラーゼよりもむしろシト
シンメチラーゼであると立証することが可能である。（
Ｓｕｇｇｓ、Ｓ、Ｖ、Ｊａｉｌａｃｅ、Ｒ，Ｂ、。
（ＧＡＴＣ）及びＤｄｅ Ｉ （ｃＴＮＡＧ）部位＋
５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧ−３’を含んでいることから、
Ｍ、Ｄｄｅ Ｉはアデニンメチラーゼよりもむしろシト
シンメチラーゼであると立証することが可能である。（
Ｓｕｇｇｓ、Ｓ、Ｖ、Ｊａｉｌａｃｅ、Ｒ，Ｂ、。
Ｈｉｒｏｓｅ、Ｔ、、Ｋａｍａｓｈｉｎａ、Ｅ、Ｈ，及
びＩｔａｋｕｒａ、に、（１９８１）ＰＮＡＳ （米国
）７８．６６１３−６６１７． Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、
Ｃｏｕｌｓｏｎ、＾。
びＩｔａｋｕｒａ、に、（１９８１）ＰＮＡＳ （米国
）７８．６６１３−６６１７． Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、
Ｃｏｕｌｓｏｎ、＾。
Ｒ−−）１ｏｎｇ、ＣＦ−、Ｈｉｌｌ、Ｄ、Ｆ、７Ｍび
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｇ、１３．（１９８２）Ｊ、Ｍｏｈ
Ｂｉｏｌ、１６２，７２９−７７３）。
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｇ、１３．（１９８２）Ｊ、Ｍｏｈ
Ｂｉｏｌ、１６２，７２９−７７３）。
λＤＮＡを５ａｕ３ａで開裂すると、この領域から１６
５ｂｐ及び４８７ｂｐのフラグメントが形成される。
５．０ｋｂ旧ｕＩフラグメントは、オーバーラツプする
５ａｕ３ａ及びＤｄｅ Ｉ部位を含んでいる。関連する
５ａｕ３ａフラグメントを良好に視覚化できるようにこ
のフラグメントを単離した。このλフラグメントをＭ、
Ｄｄｅ Ｉで処理後、５ａｕ３ａで怒作した。Ｍ、Ｄｄ
ｅ Ｉがアデニンメチラーゼであるなら、５ａｕ３ａ認
識部位の外側のこの配列内で第２のアデニンに修飾が形
成されよう。従って、５ａｕ３ａ開裂により正常な１６
５ｂｐ及び４８７ｂｐフラグメントが形成される。一方
、Ｍ、Ｄｄｅ Ｉがシトシンメチラーゼであるなら、５
ａｕ３ａ認識配列内でシトシンに修飾が生じるであろう
。５ａｕ３ａ部位内に半メチル化が形成されると５ａｕ
３ａの開裂が阻止され、単に一重鎖のニラキングが形成
される（Ｓｔｒｅｅｋ、Ｒ，Ｅ、（１９８０） Ｇｅｎ
ｅ１２，２６７）。５ａｕ３ａ処理の結果、新しい６５
２ｂｐフラグメントが出現する。
５ｂｐ及び４８７ｂｐのフラグメントが形成される。
５．０ｋｂ旧ｕＩフラグメントは、オーバーラツプする
５ａｕ３ａ及びＤｄｅ Ｉ部位を含んでいる。関連する
５ａｕ３ａフラグメントを良好に視覚化できるようにこ
のフラグメントを単離した。このλフラグメントをＭ、
Ｄｄｅ Ｉで処理後、５ａｕ３ａで怒作した。Ｍ、Ｄｄ
ｅ Ｉがアデニンメチラーゼであるなら、５ａｕ３ａ認
識部位の外側のこの配列内で第２のアデニンに修飾が形
成されよう。従って、５ａｕ３ａ開裂により正常な１６
５ｂｐ及び４８７ｂｐフラグメントが形成される。一方
、Ｍ、Ｄｄｅ Ｉがシトシンメチラーゼであるなら、５
ａｕ３ａ認識配列内でシトシンに修飾が生じるであろう
。５ａｕ３ａ部位内に半メチル化が形成されると５ａｕ
３ａの開裂が阻止され、単に一重鎖のニラキングが形成
される（Ｓｔｒｅｅｋ、Ｒ，Ｅ、（１９８０） Ｇｅｎ
ｅ１２，２６７）。５ａｕ３ａ処理の結果、新しい６５
２ｂｐフラグメントが出現する。
第３図に示すように、実際に新しいバンドが現れ、Ｍ、
Ｄｄｅ Ｉがシトシンメチラーゼであることが示される
。
Ｄｄｅ Ｉがシトシンメチラーゼであることが示される
。
Ｍ、Ｄｄｅｌがシトシンメチラーゼであることがわかっ
たので、次の現象を説明し易くなった。ｐＤｄｅ８１．
６を有するほとんどのメチラーゼを産生ずるクローンは
本発明のクローニング株ＲＲＩ中のｐ１ＭｅＭ３．０ｂ
よりも生存能力が著しく低かった。ｐＤｄｅ８１．６を
有しているＲＲＩの培養株が静止相に達した時、ＲＲ＋
単独から成る類似の培養株と同様に生存可能な細胞の数
は６％に過ぎなかった（第■表）。ある種の大腸菌株は
シトシンメチル化を含むＤＮＡの導入を阻止するシステ
ムを有していることが最近になって明らかにされ（Ｒａ
ｌｅｉｇｈ他、印刷中）、この活性に関与する遺伝子座
は’ ｍｃｒＢ’ （ｍｏｄｉｆ １ｅｄｃｙｔｏｓｉ
ｎｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）と呼称された。ＲＲＩ
の場合、この遺伝子座は大腸菌Ｂから誘導され、異なる
特異性と明らかに弱い活性とを有している（Ｒａｌｅｉ
ｇｈ他、前掲、Ｒｅｖｅｌ、Ｈ，Ｒ，（１９６７）、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ３１，６ＭＭ−７０１）。ｍｃｒＢ遺
伝子座をＴｎｌＯ挿入で不活性化することにより、新し
い系列のクローニング株が構成された。本発明のメチラ
ーゼクローンをこれらの菌株の１ツＥＲ１４６７に導入
し、ｐＤｄｅＭ３．ｏａ、ｐＤｄｅＭ３．ｏｂ。
たので、次の現象を説明し易くなった。ｐＤｄｅ８１．
６を有するほとんどのメチラーゼを産生ずるクローンは
本発明のクローニング株ＲＲＩ中のｐ１ＭｅＭ３．０ｂ
よりも生存能力が著しく低かった。ｐＤｄｅ８１．６を
有しているＲＲＩの培養株が静止相に達した時、ＲＲ＋
単独から成る類似の培養株と同様に生存可能な細胞の数
は６％に過ぎなかった（第■表）。ある種の大腸菌株は
シトシンメチル化を含むＤＮＡの導入を阻止するシステ
ムを有していることが最近になって明らかにされ（Ｒａ
ｌｅｉｇｈ他、印刷中）、この活性に関与する遺伝子座
は’ ｍｃｒＢ’ （ｍｏｄｉｆ １ｅｄｃｙｔｏｓｉ
ｎｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）と呼称された。ＲＲＩ
の場合、この遺伝子座は大腸菌Ｂから誘導され、異なる
特異性と明らかに弱い活性とを有している（Ｒａｌｅｉ
ｇｈ他、前掲、Ｒｅｖｅｌ、Ｈ，Ｒ，（１９６７）、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ３１，６ＭＭ−７０１）。ｍｃｒＢ遺
伝子座をＴｎｌＯ挿入で不活性化することにより、新し
い系列のクローニング株が構成された。本発明のメチラ
ーゼクローンをこれらの菌株の１ツＥＲ１４６７に導入
し、ｐＤｄｅＭ３．ｏａ、ｐＤｄｅＭ３．ｏｂ。
ｐＤｄｅ８１．６及びＥＲ１４６７単独を比較゛した処
、生存能力が完全に復元されていることが分かり、飽和
状態におけるコロニー形成単位（ｃ、ｆ、ｕ、）の数が
若干異なるのみであった。従って、ＥＲ１４６７でＤｄ
ｅ ｌ系を更にクローニング及び特徴付けした。
、生存能力が完全に復元されていることが分かり、飽和
状態におけるコロニー形成単位（ｃ、ｆ、ｕ、）の数が
若干異なるのみであった。従って、ＥＲ１４６７でＤｄ
ｅ ｌ系を更にクローニング及び特徴付けした。
第■表： ＲＲＩ及びＥＲ１４６７中のメチラーゼクロ
ーンの生存能力 １：生存能力は飽和状態における宿主（ＲＲＩ又はＥＲ
１４６７）単独のｃ、ｆ、ｕ、／ｘＮに対する試験菌株
のｃ、ｆ 、ｕ、／肩ｌの比として表す。
ーンの生存能力 １：生存能力は飽和状態における宿主（ＲＲＩ又はＥＲ
１４６７）単独のｃ、ｆ、ｕ、／ｘＮに対する試験菌株
のｃ、ｆ 、ｕ、／肩ｌの比として表す。
Ｂ、エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングエンドヌ
クレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場合近接に連
結しているので、Ｒ，Ｄｄｅｌ遺伝子はメチラーゼ遺伝
子と近接する領域に位置していると予想することが妥当
であると思われる。Ｄ。
クレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場合近接に連
結しているので、Ｒ，Ｄｄｅｌ遺伝子はメチラーゼ遺伝
子と近接する領域に位置していると予想することが妥当
であると思われる。Ｄ。
ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓゲノム上のメチラーゼ遺伝
子の周囲の領域をｐＤｄｅＭ３．ｏａからの３．Ｏｋｂ
旧ｎｄＩ［Ｉフラグメントでサザンプロット分析により
マツピングした。
子の周囲の領域をｐＤｄｅＭ３．ｏａからの３．Ｏｋｂ
旧ｎｄＩ［Ｉフラグメントでサザンプロット分析により
マツピングした。
結果を第４図（＾）に示す。
エンドヌクレアーゼ遺伝子の５′末端に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成した。
ヌクレオチドプローブを合成した。
段階１：Ｄｄｅｌエンドヌクレアーゼの精製による均一
化 Ｄｄｅ Ｉエンド フレアーゼ Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの凍結ベレット２３Ｆ
Ｉを氷上で融解させ、１２０ｚｆｆｉの音波処理Ｍ漬液
（１０ｍＭ ＫＰＯ，。
化 Ｄｄｅ Ｉエンド フレアーゼ Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの凍結ベレット２３Ｆ
Ｉを氷上で融解させ、１２０ｚｆｆｉの音波処理Ｍ漬液
（１０ｍＭ ＫＰＯ，。
ｐＨ６，９，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、 ０
．１ｍＭＥＤＴ＾）、５０ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した
。以下に記載する全段階は４℃で実施した。最終濃度が
３００１ｙ／ｚｆに達するまでリゾチームを加え、細胞
を音波処理により破裂させた。細胞溶解物を１０，０Ｏ
Ｏｘｙで４５分間遠心分離した。
．１ｍＭＥＤＴ＾）、５０ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した
。以下に記載する全段階は４℃で実施した。最終濃度が
３００１ｙ／ｚｆに達するまでリゾチームを加え、細胞
を音波処理により破裂させた。細胞溶解物を１０，０Ｏ
Ｏｘｙで４５分間遠心分離した。
音波緩衝液１５０ｍＭ ＮａＣ１で平衡化した２０）５
Ｘ １５ｃｍのホスホセルロースｐＨ（Ｗｈａｔｎ＋ａ
ｎ）カラムに１２０ｚｆの上清を充填した。１５０ｍＭ
〜ＩＮのＮａＣｌ ７００ｍ１の直線勾配で酵素を溶出
させた。エンドヌクレアーゼは約０．５ＨのＮａＣｌで
溶出した。ピークフラクションを収集し、音波処理ｌＩ
衝漬液０ＩＩＭ ＮａＣｌで透析した。
Ｘ １５ｃｍのホスホセルロースｐＨ（Ｗｈａｔｎ＋ａ
ｎ）カラムに１２０ｚｆの上清を充填した。１５０ｍＭ
〜ＩＮのＮａＣｌ ７００ｍ１の直線勾配で酵素を溶出
させた。エンドヌクレアーゼは約０．５ＨのＮａＣｌで
溶出した。ピークフラクションを収集し、音波処理ｌＩ
衝漬液０ＩＩＭ ＮａＣｌで透析した。
ホスホセルロースカラムからの酵素プール１７０ｍ１を
、音波処理緩衝液２５ｍＭ ＮａＣ１で平衡化した１、
５×１５ｃｍのヘパリンセルロース（Ｐｈａｒｍａｅｉ
１）カラムに充填した。 ２５ｍＭ〜ＩＭのＮａＣ１の
勾配３４０１Ｆｆを使用した処、酵素は約０．５８ Ｍ
ａｉｌで溶出した。エンドヌクレアーゼ活性を有するフ
ラクションをプールし、１（ＰＬＣ［漬液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１０＋Ｍβ−メルカプトエタ
ノール）、 ５０ＩＩＭＫＣＩで透析した。
、音波処理緩衝液２５ｍＭ ＮａＣ１で平衡化した１、
５×１５ｃｍのヘパリンセルロース（Ｐｈａｒｍａｅｉ
１）カラムに充填した。 ２５ｍＭ〜ＩＭのＮａＣ１の
勾配３４０１Ｆｆを使用した処、酵素は約０．５８ Ｍ
ａｉｌで溶出した。エンドヌクレアーゼ活性を有するフ
ラクションをプールし、１（ＰＬＣ［漬液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，５，１０＋Ｍβ−メルカプトエタ
ノール）、 ５０ＩＩＭＫＣＩで透析した。
１０１Ｎの酵素プールをＭｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒ
ｍａｅｉ１）及びＰｏ１ｙａｎｉｏｎ ＳＩカラム（Ｐ
ｈａｒ＋＊ａｃｉ１）に通し、５０ｍＭ ＫＣＩでｌ
Ｘ ８ｃｍのＭｏｎｏ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉ
１）に吸着させた。 ５０ｍＭ〜ＩＮのＫＣＩで５３１
１の直線勾配を構成した。エンドヌクレアーゼは約０．
２８ ＫＣＩで単一のピークとして溶出した。
ｍａｅｉ１）及びＰｏ１ｙａｎｉｏｎ ＳＩカラム（Ｐ
ｈａｒ＋＊ａｃｉ１）に通し、５０ｍＭ ＫＣＩでｌ
Ｘ ８ｃｍのＭｏｎｏ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉ
１）に吸着させた。 ５０ｍＭ〜ＩＮのＫＣＩで５３１
１の直線勾配を構成した。エンドヌクレアーゼは約０．
２８ ＫＣＩで単一のピークとして溶出した。
Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓの液体クロマトグ
ラフを使用して次のようにタンパク質配列用の試料を作
成した。Ｄｃｌｅ Ｉエンドヌクレアーゼ試料（１５μ
ｇ）をＶｙａｃｌａｃ Ｃ４２１４ＴＰ５４（５ｕｍ、
４．６Ｘ３００ｍｍ）３００オングストローム多孔逆相
カラムでクロマトグラフィにかけ、１ｚｌ／ｍｉｎの流
量で２５分にわたって０．１％トリフルオロ酢酸中の５
％のアセトニトリルの直線勾配で展開させ、２１４ｎｍ
で検出した。個々のピークを手作業で収集し、凍結乾燥
した。
ラフを使用して次のようにタンパク質配列用の試料を作
成した。Ｄｃｌｅ Ｉエンドヌクレアーゼ試料（１５μ
ｇ）をＶｙａｃｌａｃ Ｃ４２１４ＴＰ５４（５ｕｍ、
４．６Ｘ３００ｍｍ）３００オングストローム多孔逆相
カラムでクロマトグラフィにかけ、１ｚｌ／ｍｉｎの流
量で２５分にわたって０．１％トリフルオロ酢酸中の５
％のアセトニトリルの直線勾配で展開させ、２１４ｎｍ
で検出した。個々のピークを手作業で収集し、凍結乾燥
した。
八ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７０八型気相
シーゲンサー（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ、Ｊ、Ｅ、、Ｈｕｎ
ｋａｐｉ １１ｅｒ、Ｍ、１４．及び１ｌｌｉｌｓｏｎ
、Ｋ。
シーゲンサー（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ、Ｊ、Ｅ、、Ｈｕｎ
ｋａｐｉ １１ｅｒ、Ｍ、１４．及び１ｌｌｉｌｓｏｎ
、Ｋ。
Ｓ、（１９８４）＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ １４０，５５３−５６６）を使用してタ
ンパク質の逐次分解を実施した。従来の記載（Ｈｕｎｋ
ａｐｉｉｌｅｒ、ＭＪ、及びＨｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、（１９
８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
旧ｒｓ、 Ｃ，Ｈ，１４，及びＴｉｍａ−ｓｈｅｆｆ、
Ｓ、Ｎ、Ｅｄｓ、、 Ｖｏ１９１． ｐｐ、４８６−４
９３．＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）の勾配変化を僅かに変えてＩＢＭＣｙａｎｏ（ｕｍ
、 ４．５ｘ ２５０＋ｍ）カラムで高性能液体クロマ
トグラフィを実施した処、最初の１９個のフェニルチオ
ヒダントインがはっきりと同定された。
ｍｉｓｔｒｙ １４０，５５３−５６６）を使用してタ
ンパク質の逐次分解を実施した。従来の記載（Ｈｕｎｋ
ａｐｉｉｌｅｒ、ＭＪ、及びＨｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、（１９
８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
旧ｒｓ、 Ｃ，Ｈ，１４，及びＴｉｍａ−ｓｈｅｆｆ、
Ｓ、Ｎ、Ｅｄｓ、、 Ｖｏ１９１． ｐｐ、４８６−４
９３．＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）の勾配変化を僅かに変えてＩＢＭＣｙａｎｏ（ｕｍ
、 ４．５ｘ ２５０＋ｍ）カラムで高性能液体クロマ
トグラフィを実施した処、最初の１９個のフェニルチオ
ヒダントインがはっきりと同定された。
タンパク質配列を使用して最小の縮重でＤＮＡを誘導し
た。この１４ヌクレオチドフラグメントはＤＮＡ合成キ
ット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使
用して合成し、Ｗａｔｅｒ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ Ｃ
８（１０ｐｍ、０．５Ｘ １０ｃｍ）Ｒａｄｉａｌ Ｐ
ａｋカラムでクロマトグラフィ精製した。
た。この１４ヌクレオチドフラグメントはＤＮＡ合成キ
ット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使
用して合成し、Ｗａｔｅｒ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ Ｃ
８（１０ｐｍ、０．５Ｘ １０ｃｍ）Ｒａｄｉａｌ Ｐ
ａｋカラムでクロマトグラフィ精製した。
エンドヌクレアーゼの最初の１９種のアミノ酸は、セエ
」Ｌヒ尤ｌ］↓とユむ一＾５ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−＾ｓｎ−＾５ｎ−Ｖａｌである。下線で示し
た５種類のアミノ酸を使用して、配列５′−＾ＴＧ−＾
八Ｒ−ＧへＮ−ＧＣＮ−＾Ｃ−３’ （Ｒはヌクレオチ
ド＾又はＧ、Ｎはヌクレオチド＾、Ｇ、Ｃ又はＴ）によ
り混合１４ヌクレオチドフラグメントプローブを作成し
た。ゲノムＤＮＡ消化物のサザンプロットをプローブで
ハイブリダイズした。エンドヌクレアーゼプローブはメ
チラーゼ遺伝子を含んでいることがわかっている３、Ｏ
ｋｂ Ｈｉｎｄｌｎフラグメントにハイブリダイズしな
い。
」Ｌヒ尤ｌ］↓とユむ一＾５ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−＾ｓｎ−＾５ｎ−Ｖａｌである。下線で示し
た５種類のアミノ酸を使用して、配列５′−＾ＴＧ−＾
八Ｒ−ＧへＮ−ＧＣＮ−＾Ｃ−３’ （Ｒはヌクレオチ
ド＾又はＧ、Ｎはヌクレオチド＾、Ｇ、Ｃ又はＴ）によ
り混合１４ヌクレオチドフラグメントプローブを作成し
た。ゲノムＤＮＡ消化物のサザンプロットをプローブで
ハイブリダイズした。エンドヌクレアーゼプローブはメ
チラーゼ遺伝子を含んでいることがわかっている３、Ｏ
ｋｂ Ｈｉｎｄｌｎフラグメントにハイブリダイズしな
い。
サザンハイブリダイゼーション：
１、ニックトランスレートされたフラグメントの使用
推薦される条件（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ＞に従って１〜ｚｐｙのゲノムＤＮＡを２０倍過剰
のエンドヌクレアーゼ、即ちＰｓｔｌ、 ５ａｌｌ、
ＢｇｌＩ［、Ｂｃｌｌ、 Ｈｉｎｄ［［、ＥｃｏＲＩ
、 ＢａｍＨＩで消化させた。消化物をアガロースゲル
電気泳動にかけ、消化されたＤＮＡをサチン法（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｅ、Ｍ、＜１９７５）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、 ９８゜５０３−５１７）によりニトロセルロー
ス紙に移した。
ｂｓ＞に従って１〜ｚｐｙのゲノムＤＮＡを２０倍過剰
のエンドヌクレアーゼ、即ちＰｓｔｌ、 ５ａｌｌ、
ＢｇｌＩ［、Ｂｃｌｌ、 Ｈｉｎｄ［［、ＥｃｏＲＩ
、 ＢａｍＨＩで消化させた。消化物をアガロースゲル
電気泳動にかけ、消化されたＤＮＡをサチン法（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｅ、Ｍ、＜１９７５）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、 ９８゜５０３−５１７）によりニトロセルロー
ス紙に移した。
これらのニトロセルロースフィルターをｐＤｄｅＨ３．
０ａからの３．Ｏｋｂの旧ｎｄｌ［フラグメントでハイ
ブリダイズした。このフラグメントは次のようなゲル精
製法により作成した。即ちｐＤｄｅＭ３．ｏａを２０倍
過剰の旧ｎｄｌｌで消化させ、１％アガロース、０．５
μｇ／ｘｉ臭化エチジウムで構成したゲル上で電気泳動
にかけた。Ｄｄｅ ｌメチラーゼ遺伝子を含んでいる３
、Ｏｋｂフラグメントをゲルから切り出し、２１．５ゲ
ージ針で押し出して細分し、Ｔｒｉｓ−酢酸塩緩衝液に
懸濁させ、４℃で３５分間５Ｗ５０ 、１型ローター（
Ｂｅｅｋｗ＋ａｎ）で２９０ 、０００ Ｘ ｙで超遠
心分離した。上清を０．４Ｍ ＮａＣ１に加え、ＤＮＡ
をイソプロパツールで沈降させた。ＤＮＡを再懸濁させ
、フェノールで２回抽出し、エタノールで沈降させ、１
０ａＭ Ｔｒｉｓ、 １ｍＭＥＤＴ＾、 ｐＨ８，０に
再懸濁させた。１００ｐ１１０＋（Ｚコ２Ｐ−ｄＡＴＰ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ８００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）を６１１１のフラグメント（ｌｕｇ）、
１．Ｎの１０×ニツクトランスレーシヨン緩衝液（０，
５Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，２，０，ＩＭ Ｈｇ５Ｏ＜
、 １！ＩＮＤＴＴ、 ５００ｐｙ／１ｌＢＳΔ）、１
パのｄＧＴＰ（１ｍＭ） 、ｄＴＴＰ（１ｍＭ） 。
０ａからの３．Ｏｋｂの旧ｎｄｌ［フラグメントでハイ
ブリダイズした。このフラグメントは次のようなゲル精
製法により作成した。即ちｐＤｄｅＭ３．ｏａを２０倍
過剰の旧ｎｄｌｌで消化させ、１％アガロース、０．５
μｇ／ｘｉ臭化エチジウムで構成したゲル上で電気泳動
にかけた。Ｄｄｅ ｌメチラーゼ遺伝子を含んでいる３
、Ｏｋｂフラグメントをゲルから切り出し、２１．５ゲ
ージ針で押し出して細分し、Ｔｒｉｓ−酢酸塩緩衝液に
懸濁させ、４℃で３５分間５Ｗ５０ 、１型ローター（
Ｂｅｅｋｗ＋ａｎ）で２９０ 、０００ Ｘ ｙで超遠
心分離した。上清を０．４Ｍ ＮａＣ１に加え、ＤＮＡ
をイソプロパツールで沈降させた。ＤＮＡを再懸濁させ
、フェノールで２回抽出し、エタノールで沈降させ、１
０ａＭ Ｔｒｉｓ、 １ｍＭＥＤＴ＾、 ｐＨ８，０に
再懸濁させた。１００ｐ１１０＋（Ｚコ２Ｐ−ｄＡＴＰ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ８００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）を６１１１のフラグメント（ｌｕｇ）、
１．Ｎの１０×ニツクトランスレーシヨン緩衝液（０，
５Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，２，０，ＩＭ Ｈｇ５Ｏ＜
、 １！ＩＮＤＴＴ、 ５００ｐｙ／１ｌＢＳΔ）、１
パのｄＧＴＰ（１ｍＭ） 、ｄＴＴＰ（１ｍＭ） 。
ｃｌｃＴＰ（１ｍＭ）混合物、１．Ｎの大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）、及び１μ！のＤＮアーゼＩ（ＳｉＦｉｍ１）希
釈液（３ａｇ／ｚｌのストック３１Ｊ１を１０′Ｒ１の
１１２０で希釈）と結合することにより、このフラグメ
ント１μｇをニックトランスレートした。、１５℃で２
時間インキュヘート後、５０１１（７） ２０１８ Ｅ
ＤＴＡ及び２ｏｏｌＪｌノ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ
８，０，１ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。これをフェノール
で１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、変性したサ
ケ***ＤＮＡ６１１ｇを加えた。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ
。
リメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）、及び１μ！のＤＮアーゼＩ（ＳｉＦｉｍ１）希
釈液（３ａｇ／ｚｌのストック３１Ｊ１を１０′Ｒ１の
１１２０で希釈）と結合することにより、このフラグメ
ント１μｇをニックトランスレートした。、１５℃で２
時間インキュヘート後、５０１１（７） ２０１８ Ｅ
ＤＴＡ及び２ｏｏｌＪｌノ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ
８，０，１ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。これをフェノール
で１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、変性したサ
ケ***ＤＮＡ６１１ｇを加えた。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ
。
ｐＨ８，０，１ｍＭ ＥＤＴＡで容量を１１１まで増加
させた。１０分間煮沸後、ニックトランスレートしたフ
ラグメントをニトロセルロースフィルターに加えるよう
に準備した。
させた。１０分間煮沸後、ニックトランスレートしたフ
ラグメントをニトロセルロースフィルターに加えるよう
に準備した。
ニックトランスレートしたプローブをハイブリダイズす
る以前に、３１１１の５０ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔのスト
ック（５ｇＦｉｃｏｌｌ、 ５ｙポリビニルピロリドン
、５ｇ ＢＳ＾。
る以前に、３１１１の５０ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔのスト
ック（５ｇＦｉｃｏｌｌ、 ５ｙポリビニルピロリドン
、５ｇ ＢＳ＾。
５００ｘ１まｒ （７） Ｈ２Ｏ）、４．５ｉｉ’（７
）２０Ｘ ５ＳＰＥストツク（１７ｈ ＮａＣｌ、 ２
７．６ｇＮａＨｚＰＯ４，Ｈ２Ｏ，７，４１ＦＥＤＴ＾
；ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整、１１までの８２０＞
、０．３μ！の１Ｏ％ＳＤＳ、３ｘｌｆ） ５０％７
”ｒ ス） ラ’／ Ｔａ １１２．４．２１１ｆ）
ＬＯカら成るプレハイブリダイゼーション混合物中で室
温で４時間プレハイブリダイズした。
）２０Ｘ ５ＳＰＥストツク（１７ｈ ＮａＣｌ、 ２
７．６ｇＮａＨｚＰＯ４，Ｈ２Ｏ，７，４１ＦＥＤＴ＾
；ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整、１１までの８２０＞
、０．３μ！の１Ｏ％ＳＤＳ、３ｘｌｆ） ５０％７
”ｒ ス） ラ’／ Ｔａ １１２．４．２１１ｆ）
ＬＯカら成るプレハイブリダイゼーション混合物中で室
温で４時間プレハイブリダイズした。
ハイブリダイズするために、ニックトランスレートした
プローブをプレハイブリダイズしたフィルター〈プレハ
イブリダイゼーション混合物を含む）に加え、６５℃で
一晩インキユベートした。ハイブリダイズしたフィルタ
ーを２ｘ ５ＳＰＥ（１００ｚｌ）で室温で５分間２回
洗い、２ｘＳＳＰＥト０．５％ＳＤＳ、！−テ５５℃で
３０分間２回洗った。次にフィルターを空気乾燥させ、
Ｘ線フィルムに露光させた。
プローブをプレハイブリダイズしたフィルター〈プレハ
イブリダイゼーション混合物を含む）に加え、６５℃で
一晩インキユベートした。ハイブリダイズしたフィルタ
ーを２ｘ ５ＳＰＥ（１００ｚｌ）で室温で５分間２回
洗い、２ｘＳＳＰＥト０．５％ＳＤＳ、！−テ５５℃で
３０分間２回洗った。次にフィルターを空気乾燥させ、
Ｘ線フィルムに露光させた。
２０）オリゴヌクレオチドプローブの使用１〜２目のゲ
ノムＤＮＡ又は０．５〜１μｇのプラスミドＤＮＡを消
化させ、ゲル電気泳動にかけ、従来記載されているよう
にニトロセルロースフィルターに移した。これらのフィ
ルムを次のようにオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズした。２−ノフローブ（２５〜５０ｕｇ／ｘｌ
’）と２．５ｐ１（７） １０ｘ Ｍ浸液（０，５Ｍ
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，６，０，ＩＭ Ｈｇｃｌ、、
５０ｍＭ ＤＴＴ、 １ｍＭスペルミジン、 １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）、１５μｌのＨ２Ｏ，５，ｆのγ−３２
村Ｐ−＾ＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ、 ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び０．５．１の
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅ？ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした
。次に混合物を６５℃まで１０分間加熱した。標識した
プローブに１μ！の１Ｏ蒙Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，０
，１ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。
ノムＤＮＡ又は０．５〜１μｇのプラスミドＤＮＡを消
化させ、ゲル電気泳動にかけ、従来記載されているよう
にニトロセルロースフィルターに移した。これらのフィ
ルムを次のようにオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズした。２−ノフローブ（２５〜５０ｕｇ／ｘｌ
’）と２．５ｐ１（７） １０ｘ Ｍ浸液（０，５Ｍ
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，６，０，ＩＭ Ｈｇｃｌ、、
５０ｍＭ ＤＴＴ、 １ｍＭスペルミジン、 １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）、１５μｌのＨ２Ｏ，５，ｆのγ−３２
村Ｐ−＾ＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ、 ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び０．５．１の
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅ？ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした
。次に混合物を６５℃まで１０分間加熱した。標識した
プローブに１μ！の１Ｏ蒙Ｍ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，０
，１ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。
これをプレハイブリダイズしたニトロセルロースフィル
ター（上記記載）に加え、室温で一晩インキユベートし
た。
ター（上記記載）に加え、室温で一晩インキユベートし
た。
ハイブリダイズしたフィルターを２ ｘ ５ＳＰＥ （
２００ｚｌ）で室温で５分間２回洗い、２ ｘ ５ＳＰ
Ｅと０．５％ＳＤＳとで３０℃で３０分間２回洗った。
２００ｚｌ）で室温で５分間２回洗い、２ ｘ ５ＳＰ
Ｅと０．５％ＳＤＳとで３０℃で３０分間２回洗った。
次にフィルターを空気乾燥し、Ｘ線フィルムに露光した
。
。
サザンプロットを使用して第４図（Ｂ）に示すような制
限地図を作成した。２種類の酵素消化物は、両方のプロ
ーブにハイブリダイズし且つメチラーゼ及び／又はエン
ドヌクレアーゼをコードするに十分な大きさを有するフ
ラグメントを形成した。
限地図を作成した。２種類の酵素消化物は、両方のプロ
ーブにハイブリダイズし且つメチラーゼ及び／又はエン
ドヌクレアーゼをコードするに十分な大きさを有するフ
ラグメントを形成した。
両方のプローブは第４図（＾）の（１）列に示すような
単一のＰｓｔ Ｉフラグメントにハイブリダイズするの
で、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子Φ の両方ともこの４．８ｋｂ片のＤＮＡに位置していると
か考えられる。更に、両方のプローブは第４図（＾）の
（ｇ）列に示すように５．３ｋｂＢａｍＨＩフラグメン
トにハイブリダイズする。このフラグメントはメチラー
ゼ遺伝子の一部を含んでおり、完全なエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をコードするのに十分な大きさを有している。
単一のＰｓｔ Ｉフラグメントにハイブリダイズするの
で、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子Φ の両方ともこの４．８ｋｂ片のＤＮＡに位置していると
か考えられる。更に、両方のプローブは第４図（＾）の
（ｇ）列に示すように５．３ｋｂＢａｍＨＩフラグメン
トにハイブリダイズする。このフラグメントはメチラー
ゼ遺伝子の一部を含んでおり、完全なエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をコードするのに十分な大きさを有している。
エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を別々に適合
性のプラスミドに導入した。 Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕ−ｒ
ｉｃａｎｓ ＤＨへの２．３ｋｂＢａｍＨｌフラグメン
トをｐＡｃＹｃ１１３４（ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１３４：１１３１（１９７
８））に次のようにクローニングした。５０目の（１，
ｄｅｓｕｉｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡをＢａａ＋ｌｌ
Ｉで切断し、電気泳動にかけた。適当な寸法範囲のフラ
グメントを従来記載されているようにゲル精製し、約１
１００ｎのＤＮＡを回収し、この量をＢａｍＨＩで切断
し且つ脱リン酸化したｐＡｃＹｃ１８４に仔つシ腸アル
カリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
、）を使用して連結反応させた。
性のプラスミドに導入した。 Ｄ、ｄｅｓｕｌｆｕ−ｒ
ｉｃａｎｓ ＤＨへの２．３ｋｂＢａｍＨｌフラグメン
トをｐＡｃＹｃ１１３４（ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１３４：１１３１（１９７
８））に次のようにクローニングした。５０目の（１，
ｄｅｓｕｉｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡをＢａａ＋ｌｌ
Ｉで切断し、電気泳動にかけた。適当な寸法範囲のフラ
グメントを従来記載されているようにゲル精製し、約１
１００ｎのＤＮＡを回収し、この量をＢａｍＨＩで切断
し且つ脱リン酸化したｐＡｃＹｃ１８４に仔つシ腸アル
カリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
、）を使用して連結反応させた。
この連結反応混合物を使用してＭ、Ｄｄｅ ｌクローン
ｐＤＤＥ１４１．８を有するＥＲ１４６７細胞を形質転
換させた。
ｐＤＤＥ１４１．８を有するＥＲ１４６７細胞を形質転
換させた。
Ｌ−寒天に１００目７ｘｉのアンピシリン、３０ｐｙ／
ｚｌのクロラムフェニコールを加えた培地で平板培養す
ることにより、形質転換体を選択した。培地は３７℃で
一部インキユベートした。
ｚｌのクロラムフェニコールを加えた培地で平板培養す
ることにより、形質転換体を選択した。培地は３７℃で
一部インキユベートした。
５、制限エンドヌクレアーゼスクリーニング：夫々１０
０ｐｊ！のＬ−ブロスと１１００ＩＩ／ｌｆ１のアンピ
シリンと３０１１ｇ／ｘｌのクロラムフェニコールとを
含んでいる微量滴定ウェル（Ｎｕｎｃ）に無菌よう技を
挿入して５０個の形質転換体を任意に採取した。３７℃
で６時間インキュベート後、Ｌ−寒天、アンピシリン、
クロラムフェニコール及び１０４〜１０ｓフアージ／培
地からのλｖｌｒファージ希釈液を含んでいる６個のプ
レートでレプリカ平板培養した。これらのプレートを３
７°Ｃで一部インキュベート後、１個の形質転換体は約
１０− ’のレベルでファージを制限した。
０ｐｊ！のＬ−ブロスと１１００ＩＩ／ｌｆ１のアンピ
シリンと３０１１ｇ／ｘｌのクロラムフェニコールとを
含んでいる微量滴定ウェル（Ｎｕｎｃ）に無菌よう技を
挿入して５０個の形質転換体を任意に採取した。３７℃
で６時間インキュベート後、Ｌ−寒天、アンピシリン、
クロラムフェニコール及び１０４〜１０ｓフアージ／培
地からのλｖｌｒファージ希釈液を含んでいる６個のプ
レートでレプリカ平板培養した。これらのプレートを３
７°Ｃで一部インキュベート後、１個の形質転換体は約
１０− ’のレベルでファージを制限した。
活性Ｄｄｅ ｌエンドヌクレアーゼの存在を確認するた
めに、この形質転換体の粗抽出物（従来記載）を作成し
た。１１１りのｐＢＲ３２２（＝ ｂ＋ｆ）に、５μｐ
の１０×ｄＤｅ Ｉ Ｍ 浸液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ７，５，１１００ＩＩ ＭｇＣｈ及び１８ Ｎ
ａＣ１）、４３ｕ１のＨ２Ｏ及びｔｐｚの粗抽出物を加
え、３７℃で３０分間インキュベート後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。このクローンからのＤＮＡを作成
し、予備的制限マツピングを行った処、この２．３ｋｂ
ＢａｍＨＩフラグメントは第６図に示すようにｐＤＤ
ＥＭｌ、８のＨｉｎｄｌ［［部分にＢａｍＨＩをオーバ
ーラツプすることがわかった。従って、Ｄｄｅ ｌ系は
２．９ｋｂのり、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡ
に含まれている。
めに、この形質転換体の粗抽出物（従来記載）を作成し
た。１１１りのｐＢＲ３２２（＝ ｂ＋ｆ）に、５μｐ
の１０×ｄＤｅ Ｉ Ｍ 浸液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ７，５，１１００ＩＩ ＭｇＣｈ及び１８ Ｎ
ａＣ１）、４３ｕ１のＨ２Ｏ及びｔｐｚの粗抽出物を加
え、３７℃で３０分間インキュベート後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。このクローンからのＤＮＡを作成
し、予備的制限マツピングを行った処、この２．３ｋｂ
ＢａｍＨＩフラグメントは第６図に示すようにｐＤＤ
ＥＭｌ、８のＨｉｎｄｌ［［部分にＢａｍＨＩをオーバ
ーラツプすることがわかった。従って、Ｄｄｅ ｌ系は
２．９ｋｂのり、ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＤＮＡ
に含まれている。
実Ｊ１烈」−
ＢａｍＨＩ制 修飾遺伝子のクローニング１、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｈの
ＤＮＡを作成するために、５．の新たに増殖した細胞ペ
ーストを２５％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８
，０に゛再懸濁させた。１０１１の０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、 ｐＨ８，０と８ 、Ｏｘｌの１０凝ｇａｚｅリゾ
チーム（０，２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ中）を加え
た。懸濁液を氷上に２時間放置した。その後、２４ｚｌ
の溶菌緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ ６７ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）と５ｚ１の１０％ＳＤＳとを加え、混合し、細胞
を溶解させた。等量のフェノール（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ８で平衡化）を加え、溶液を振蕩により乳化さ
せた。次に７０ｚｌのクロロホルムを加え、１０分間振
蕩させた。
ｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｈの
ＤＮＡを作成するために、５．の新たに増殖した細胞ペ
ーストを２５％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８
，０に゛再懸濁させた。１０１１の０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、 ｐＨ８，０と８ 、Ｏｘｌの１０凝ｇａｚｅリゾ
チーム（０，２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ中）を加え
た。懸濁液を氷上に２時間放置した。その後、２４ｚｌ
の溶菌緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ ６７ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）と５ｚ１の１０％ＳＤＳとを加え、混合し、細胞
を溶解させた。等量のフェノール（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ８で平衡化）を加え、溶液を振蕩により乳化さ
せた。次に７０ｚｌのクロロホルムを加え、１０分間振
蕩させた。
次に混合物をＢｅｃｋｍａｎ遠心機でＩＯＫで３０分間
遠心し、ＤＮＡを含んでいる頂部水層を新しいびんに移
し、フェノール−クロロホルムで更に２回再抽出した。
遠心し、ＤＮＡを含んでいる頂部水層を新しいびんに移
し、フェノール−クロロホルムで更に２回再抽出した。
次に上部層を４Ｘ １１ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ。
１ｍＭ ＥＤＴＡ。
ｐ１１８．０）で２４時間以上透析した。透析後、ＤＮ
Ａを０．１容量のＲＮアーゼ（１０μＩＦ／１１）で３
７℃で１時間処理した。
Ａを０．１容量のＲＮアーゼ（１０μＩＦ／１１）で３
７℃で１時間処理した。
最終濃度が０．４８ ＮａＣｌに達するまで５ＭＭａＣ
１溶液を加え、頂部に２容量のエタノールを積層した。
１溶液を加え、頂部に２容量のエタノールを積層した。
ＤＮＡをガラスロッドに巻き取り、７０％ＥＤＴ＾で１
回洗い、次に１５ｉ＋１のＴＨに再溶解させ、−２０℃
で凍結保存した。 ＤＮＡの最終濃度は１００ｕｙ／ｚ
ｆであった。
回洗い、次に１５ｉ＋１のＴＨに再溶解させ、−２０℃
で凍結保存した。 ＤＮＡの最終濃度は１００ｕｙ／ｚ
ｆであった。
２０）部分消化：２１１のＢａｎ ＤＮＡ（１００ｕｙ
＃＋４）を旧ｎｄｎＩ緩衝液（１０ＩＩＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７，５； １０＋＋＋Ｍ Ｈｇｃ１２．５０ｍＭ
ＮａＣｌ。
＃＋４）を旧ｎｄｎＩ緩衝液（１０ＩＩＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７，５； １０＋＋＋Ｍ Ｈｇｃ１２．５０ｍＭ
ＮａＣｌ。
１０ｍＮメルカプトエタノール）中で１０本の管に加え
た（２００ｕｉ’／管）、 ＨｉｎｄＩ［［酵素を一連
の２×希釈液として管に加え、即ち４０単位を管１に加
え、２０単位を管２に加え、以下同様とした。消化は３
７℃で１時間実施し１反応物を７２℃で１５分間インキ
ュベートすることにより、酵素を熱で不活化した。各消
化物７１０■を除去し、ゲル電気泳動により分析した。
た（２００ｕｉ’／管）、 ＨｉｎｄＩ［［酵素を一連
の２×希釈液として管に加え、即ち４０単位を管１に加
え、２０単位を管２に加え、以下同様とした。消化は３
７℃で１時間実施し１反応物を７２℃で１５分間インキ
ュベートすることにより、酵素を熱で不活化した。各消
化物７１０■を除去し、ゲル電気泳動により分析した。
部分開裂を示す試料を混合し、使用した。
３、連結反応： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，１
０１Ｍ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＨＤＴＴ、０．５ｍＨＡＴ
Ｐ及び１０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎ。
０１Ｍ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＨＤＴＴ、０．５ｍＨＡＴ
Ｐ及び１０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎ。
Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１００．ｆの反応容量中で
、Ｈｉｎｄｎｌにより消化した４１１１？のＢａｍＤＮ
Ａをアルカリフォスファターゼで処理したｐＢＲ３２２
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２目と１
６℃で４時間連結反応させた。試料をクロロホルムで処
理し、１０個のアリコ゛−トに分割し、夫々を使用して
Ｚｏｏ、１の水冷コンピテントＲＲＩ細胞（５０Ｍｍ
ＣａＣｌ２中）を形質転換した。細胞に４２℃で２分間
熱シヨツクを与え、５ｚｌのルリアブロス（Ｌ−ブロス
）で希釈し、３７℃で飽和に達するまで増殖した。
、Ｈｉｎｄｎｌにより消化した４１１１？のＢａｍＤＮ
Ａをアルカリフォスファターゼで処理したｐＢＲ３２２
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２目と１
６℃で４時間連結反応させた。試料をクロロホルムで処
理し、１０個のアリコ゛−トに分割し、夫々を使用して
Ｚｏｏ、１の水冷コンピテントＲＲＩ細胞（５０Ｍｍ
ＣａＣｌ２中）を形質転換した。細胞に４２℃で２分間
熱シヨツクを与え、５ｚｌのルリアブロス（Ｌ−ブロス
）で希釈し、３７℃で飽和に達するまで増殖した。
４、形質転換した細胞を遠心分離（４Ｋ １０分）によ
り採取し、２５０μｌのし一グロスに再懸濁させ、１０
０．り／肩！のアンピシリンを含むし寒天プレートにの
せ、３７℃で一部インキユベートした。形質転換体を２
．５ｘｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５； １０ｍ
Ｍ ＭｇＣＬで培地から決別した。
り採取し、２５０μｌのし一グロスに再懸濁させ、１０
０．り／肩！のアンピシリンを含むし寒天プレートにの
せ、３７℃で一部インキユベートした。形質転換体を２
．５ｘｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５； １０ｍ
Ｍ ＭｇＣＬで培地から決別した。
５、この混合物を使用して、１００１ｇ／ｘｉ’のアン
ピシリンを含むＬ−ブロス５００ａ＋ｌ／接種した。培
養株を３７℃で一部振蕩させた後、細胞を再採取した（
４に、５分）。
ピシリンを含むＬ−ブロス５００ａ＋ｌ／接種した。培
養株を３７℃で一部振蕩させた後、細胞を再採取した（
４に、５分）。
細胞を１０ｉ＋４の２５％ショ糖、室温の５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ８，０，５ｘｆの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８及び３ｚｌの１０肩ｇ／ｘ１リゾチーム（Ｈ２Ｏ
中）に再懸濁させた。溶液を４０°Ｃに一時間維持した
後、１２１Ｎの溶菌ｙ１１街液加え、細胞懸濁液を静か
に混合した。溶解後、溶解物を１５にで１時間遠心した
。上清をチーズクロースで傾瀉した。固体ＣｓＣｌを加
え（０，９３ｇ／ｘｉ’）、濃度が１００．ｇ／１１に
達するまで臭化エチジウムを加えた。管に充填し、平衡
化し、Ｂｅｃｋ＋ａｎ超遠心機のＢｅｅｋｍａｎ Ｔｉ
７０ヘツドで１７℃で４８時間４４，０００ｒｐｍで遠
心した。エチジウム染色したＤＮＡバンドを注射器で収
集した。
ｒｉｓ ｐＨ８，０，５ｘｆの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８及び３ｚｌの１０肩ｇ／ｘ１リゾチーム（Ｈ２Ｏ
中）に再懸濁させた。溶液を４０°Ｃに一時間維持した
後、１２１Ｎの溶菌ｙ１１街液加え、細胞懸濁液を静か
に混合した。溶解後、溶解物を１５にで１時間遠心した
。上清をチーズクロースで傾瀉した。固体ＣｓＣｌを加
え（０，９３ｇ／ｘｉ’）、濃度が１００．ｇ／１１に
達するまで臭化エチジウムを加えた。管に充填し、平衡
化し、Ｂｅｃｋ＋ａｎ超遠心機のＢｅｅｋｍａｎ Ｔｉ
７０ヘツドで１７℃で４８時間４４，０００ｒｐｍで遠
心した。エチジウム染色したＤＮＡバンドを注射器で収
集した。
２容量のエタノールを加えて凍結させることによりプラ
スミドを沈降させ、１２，０ＯＯｒｐ翰で２０分間遠心
することによりプラスミドＤＮＡを収集した。ＤＮＡを
１１！のＴＥ）！浸液に再懸濁させた後、フェノールで
１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、その後、２容
量のエタノールに沈降させ、乾燥させ、１００．／のＴ
Ｅ［街液に再懸濁させた。
スミドを沈降させ、１２，０ＯＯｒｐ翰で２０分間遠心
することによりプラスミドＤＮＡを収集した。ＤＮＡを
１１！のＴＥ）！浸液に再懸濁させた後、フェノールで
１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、その後、２容
量のエタノールに沈降させ、乾燥させ、１００．／のＴ
Ｅ［街液に再懸濁させた。
６、Ｂａ―感作： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，
１０＋ｓＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭＮａＣｌ ； １
０ｎＭβ−メルカプトエタノール中に２０．。
１０＋ｓＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭＮａＣｌ ； １
０ｎＭβ−メルカプトエタノール中に２０．。
のプラスミドＤＮＡを含有する５Ｘ１００ｐｆのアリコ
ート反応液中で、−次プラスミドブール（１００ｕＮ中
に約１００．、のＤＮＡを含む）を消化させた。１００
単位のＢａｍＨＩ （Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）を第１
の管に加え、５０単位を第２の管に加え、以下同様にし
て管を３７℃で１時間インキュベートした。
ート反応液中で、−次プラスミドブール（１００ｕＮ中
に約１００．、のＤＮＡを含む）を消化させた。１００
単位のＢａｍＨＩ （Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）を第１
の管に加え、５０単位を第２の管に加え、以下同様にし
て管を３７℃で１時間インキュベートした。
７、形質転換：各反応液からの１ａｐｌを使用してＲＲ
ｌ［胞１００，１を上述のように形質転換させた。２分
間熱処理した直後に形質転換混合物を平板にのせ、Ｌ−
寒天及びアンピシリン上で３７℃で一部インキユベート
した。
ｌ［胞１００，１を上述のように形質転換させた。２分
間熱処理した直後に形質転換混合物を平板にのせ、Ｌ−
寒天及びアンピシリン上で３７℃で一部インキユベート
した。
その後の実験で明らかになったことであるが、２．５単
位のエキソヌクレアーゼｍ （Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ
）又は１０単位のアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎ−ｇｅｒ）を加える制限反応処理の結果、選択性
は１０３又は１０’増加した。生存数が最小のプレート
から約２００個のコロニーを採取した。
位のエキソヌクレアーゼｍ （Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ
）又は１０単位のアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎ−ｇｅｒ）を加える制限反応処理の結果、選択性
は１０３又は１０’増加した。生存数が最小のプレート
から約２００個のコロニーを採取した。
８、各コロニーを１０１のし一ブロスとアンピシリンと
に接種し、同様にＬＢとアンピシリンを含むマスタープ
レート上で画線培養した。
に接種し、同様にＬＢとアンピシリンを含むマスタープ
レート上で画線培養した。
各培養株を使用して「ミニプレツブＪＤＮＡを次のよう
に作成した。１０ｚＺの培養株を採取しく６にで５分間
）、１１１の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、 １０ｍＭ ＥＤＴ
＾、 ５０ｍＭグルコース、 ｐＨ８及びＩＨ７ｘ１の
りゾチームに再懸濁させた。
に作成した。１０ｚＺの培養株を採取しく６にで５分間
）、１１１の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、 １０ｍＭ ＥＤＴ
＾、 ５０ｍＭグルコース、 ｐＨ８及びＩＨ７ｘ１の
りゾチームに再懸濁させた。
室温テ１０分間維持しり後、２ｉｊ’（’）０．２Ｍ
ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ溶液を加え、管を混合し、５分間
４℃に維持した。 １．５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐ
ｎ＋、ａを加え、混合し、氷上で５分間インキュベート
した。混合物を１５にで１０分間遠心し、上清を傾瀉し
、３．０ｚｆ’のイソプロパツールに加えた。室温に１
０分間維持した後、管を１５にで１０分間遠心した。ペ
レットを乾燥し、０．８５ｚ１のＴＥに再懸濁した。７
５面の５ＭＭａＣｌを加え、ＤＮＡをアルコールで室温
でもう一度沈降させた。
ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ溶液を加え、管を混合し、５分間
４℃に維持した。 １．５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐ
ｎ＋、ａを加え、混合し、氷上で５分間インキュベート
した。混合物を１５にで１０分間遠心し、上清を傾瀉し
、３．０ｚｆ’のイソプロパツールに加えた。室温に１
０分間維持した後、管を１５にで１０分間遠心した。ペ
レットを乾燥し、０．８５ｚ１のＴＥに再懸濁した。７
５面の５ＭＭａＣｌを加え、ＤＮＡをアルコールで室温
でもう一度沈降させた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で１分間遠心分離後、ＤＮＡ
ベレットを乾燥し、２０μｇ７ｘ１のＲＮアーゼを含ん
でいる５０μｌのＴＥ ｐ）１８．０に再懸濁させた。
ベレットを乾燥し、２０μｇ７ｘ１のＲＮアーゼを含ん
でいる５０μｌのＴＥ ｐ）１８．０に再懸濁させた。
次に、個体プラスミド調製物の旧ｎｄｌｌ［フラグメン
トの成分及びＢａｍＨｌエンドヌクレアーゼに対する耐
性を試験した。
トの成分及びＢａｍＨｌエンドヌクレアーゼに対する耐
性を試験した。
４個の各コロニーがＢａｍ）Ｉ １に耐性であり複数の
旧ｎｄｌｌｒフラグメントを含んでいることが認められ
た。４個のコロニーの各々を更に分析した。各クローン
の少量（１０ｚ１）の細胞培養株を増殖させ、完全クロ
モソームＯＮへを作成した（１欄参照）、このうち１個
はＢａｗｌ Ｉ開裂に耐性の宿主ＤＮＡを含んでおり、
その後の実験に使用した。
旧ｎｄｌｌｒフラグメントを含んでいることが認められ
た。４個のコロニーの各々を更に分析した。各クローン
の少量（１０ｚ１）の細胞培養株を増殖させ、完全クロ
モソームＯＮへを作成した（１欄参照）、このうち１個
はＢａｗｌ Ｉ開裂に耐性の宿主ＤＮＡを含んでおり、
その後の実験に使用した。
９、メ −−ゼアッセイ：
実施例Ｉの記載と同様にしてＢａｍＨｌ抽出物の１ｎｖ
ｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを実施した。但し
１ｎｖｉｔｒｏアツセイで使用した基質は連結反応した
Ｂａｗｌ ｌリンカ−（ｄｐＣＧＧＡＴＣＣＧ） （Ｎ
、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）とし、以下に述べる方法で調製
した。
ｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを実施した。但し
１ｎｖｉｔｒｏアツセイで使用した基質は連結反応した
Ｂａｗｌ ｌリンカ−（ｄｐＣＧＧＡＴＣＣＧ） （Ｎ
、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）とし、以下に述べる方法で調製
した。
１０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）と共に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８； ２
０１１Ｍ ＤＴＴ、 ２ｍＭ＾ＴＰ、 １０ｍＭＭｇＣ
１ｚ ５０ｙ／ｚｌウシ血清アルブミン（Ｐｅｎｔａｘ
）を含む１００．１の反応液中で、１０．０．単位のＢ
ａｍＨｌリンカ−を室温で一晩連結反応させた１反応液
を１０分間７０℃に加熱して不活性化させた。０．００
５００単位のリンカ−を各メチラーゼ反応液に加え、［
３Ｈ］−Ｓ−アデノシルメチオニンと反応させた。
ｌａｂｓ）と共に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８； ２
０１１Ｍ ＤＴＴ、 ２ｍＭ＾ＴＰ、 １０ｍＭＭｇＣ
１ｚ ５０ｙ／ｚｌウシ血清アルブミン（Ｐｅｎｔａｘ
）を含む１００．１の反応液中で、１０．０．単位のＢ
ａｍＨｌリンカ−を室温で一晩連結反応させた１反応液
を１０分間７０℃に加熱して不活性化させた。０．００
５００単位のリンカ−を各メチラーゼ反応液に加え、［
３Ｈ］−Ｓ−アデノシルメチオニンと反応させた。
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは実施例Ｉで述べたようにλフ
ァージを使用して実施した。
ァージを使用して実施した。
同様にメチラーゼクローンのエンドヌクレアーゼ活性を
試験した［粗抽出物のエンドヌクレアーゼアッセイは、
１０単位のＰｓｔ ｌエンドヌクレアーゼ（Ｈ，Ｅ、Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）で線状化したＩＩＩＩＦのｐＢＲ３２Ｚ
を基質として使用した以外は実施例１と同様に実施した
コ。
試験した［粗抽出物のエンドヌクレアーゼアッセイは、
１０単位のＰｓｔ ｌエンドヌクレアーゼ（Ｈ，Ｅ、Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）で線状化したＩＩＩＩＦのｐＢＲ３２Ｚ
を基質として使用した以外は実施例１と同様に実施した
コ。
活性は何ら検出されなかった。
Ｂ、エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング＝１、メ
チラーゼプラスミドのマツピング製造業者の推薦する条
件の従って制限エンドヌクレアーゼで一連の二重消化物
を形成することにより、Ｈｉｎｄｌ［フラグメントの順
序を決定した（第５図）。
チラーゼプラスミドのマツピング製造業者の推薦する条
件の従って制限エンドヌクレアーゼで一連の二重消化物
を形成することにより、Ｈｉｎｄｌ［フラグメントの順
序を決定した（第５図）。
更に、同種Ｂａ１ｌ ｌエンドヌクレアーゼから推定し
た配列から作成したオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄｄ
ｅプローブに類似、実施例Ｉを参照）を使用して、次の
ように旧ｎｄｌｌｌフラグメントを配列した。
た配列から作成したオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄｄ
ｅプローブに類似、実施例Ｉを参照）を使用して、次の
ように旧ｎｄｌｌｌフラグメントを配列した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐ）１７．５．１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｌ、 ５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１５、、のＢａａメチラ
ーゼプラスミドを含有する反応液１５０μｌを混合し、
９個の管に収容し、最初の管には３０ｕ１を収容した。
Ｌ、 ５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１５、、のＢａａメチラ
ーゼプラスミドを含有する反応液１５０μｌを混合し、
９個の管に収容し、最初の管には３０ｕ１を収容した。
２単位のＢｉｎｄｌ［エンドヌクレアーゼ［Ｎ、Ｅ、Ｂ
ｉｏｌａｂｓ］を第１の管に加え、容量の２分の１を第
２の管に移し、以下同様にして連続的希釈液を作成した
。１時間後、反応（３７℃でインキュベート）を終了さ
せ、消化物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動にか
けた。次に実施例■に記載したように電気泳動材料をニ
トロセルロースフィルターに移し、これを使用してオリ
ゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。尚、
該プローブには実施例Ｉで述べたように、γ”Ｐ ＡＴ
Ｐ［ＮｅｗＥｎｇｌａｎｃｌ Ｎｕｃｌｅａｒ］及びＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ［Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ
］で処理することにより放射活性を与えておいた。こう
してプローブにハイブリダイズする２０）２ｋｂのフラ
グメントが見いだされた。
ｉｏｌａｂｓ］を第１の管に加え、容量の２分の１を第
２の管に移し、以下同様にして連続的希釈液を作成した
。１時間後、反応（３７℃でインキュベート）を終了さ
せ、消化物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動にか
けた。次に実施例■に記載したように電気泳動材料をニ
トロセルロースフィルターに移し、これを使用してオリ
ゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。尚、
該プローブには実施例Ｉで述べたように、γ”Ｐ ＡＴ
Ｐ［ＮｅｗＥｎｇｌａｎｃｌ Ｎｕｃｌｅａｒ］及びＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ［Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ
］で処理することにより放射活性を与えておいた。こう
してプローブにハイブリダイズする２０）２ｋｂのフラ
グメントが見いだされた。
２０）メチラーゼ遺伝子のマツピング及びサブクローニ
ング メチラーゼ遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐＤＨｌと
呼称する）をＣＩＬＣ１２処理により１１Ｂ１０１細胞
に形質転換させた。５１１ｉｉｌに詳述したように、プ
ラスミドＤＮＡをＣｓＣＩ勾配で精製した。
ング メチラーゼ遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐＤＨｌと
呼称する）をＣＩＬＣ１２処理により１１Ｂ１０１細胞
に形質転換させた。５１１ｉｉｌに詳述したように、プ
ラスミドＤＮＡをＣｓＣＩ勾配で精製した。
１）ｐＤＨｌを含んでいる）ＩＢＩＯＩ細胞をλ４６７
ニアＴｎ５で怒染させ、トランスボゾン突然変位誘発
によりメチラーゼ機能をマツピングした。この方法の詳
細については実施例Ｉに示した。
ニアＴｎ５で怒染させ、トランスボゾン突然変位誘発
によりメチラーゼ機能をマツピングした。この方法の詳
細については実施例Ｉに示した。
ｂ）メチラーゼ遺伝子は２．２ｋｂの旧ｎｄＩＩ［フラ
グメントに位置しているようであった。 １００ＩＩｙ
のｐ［ｌ旧ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［Ｉで完全に消化させ、
予備の０．７％アガロースゲル上で泳動させた。 ２．
２ｋｂのフラグメントを長波長Ｕｖで可視化させ、メス
で切り出し、製造業者の指示に従ってＩＢＩ型ＵＥ＾分
析電気溶出装置で電気溶出させた。フラグメントを２容
量のエタノールに沈降させ、３００１のＴＨに再懸濁さ
せ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、エタノー
ルと０．２８のＬｉＣ１で再沈降させた。次にＤＮＡフ
ラグメントを１００μりのＴＥに再懸濁させ、−２０℃
で凍結させた。
グメントに位置しているようであった。 １００ＩＩｙ
のｐ［ｌ旧ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［Ｉで完全に消化させ、
予備の０．７％アガロースゲル上で泳動させた。 ２．
２ｋｂのフラグメントを長波長Ｕｖで可視化させ、メス
で切り出し、製造業者の指示に従ってＩＢＩ型ＵＥ＾分
析電気溶出装置で電気溶出させた。フラグメントを２容
量のエタノールに沈降させ、３００１のＴＨに再懸濁さ
せ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、エタノー
ルと０．２８のＬｉＣ１で再沈降させた。次にＤＮＡフ
ラグメントを１００μりのＴＥに再懸濁させ、−２０℃
で凍結させた。
ｃ）２ｕｌＦのこのフラグメントを０．１μｇの（アル
カリフォスファターゼ処理した）ｐＢＲ３２２−１（ｉ
ｎｄｌｌｌ又はアルカリフォスファターゼ化した０、１
■のｐＵＣ１９−）！ ｉｎｄ ＩＩＩに連結反応させ
、連結反応物を室温で一部インキユベートした。連結反
応混合物（連結反応の詳細については＾−３の欄を参照
）をクロロホルムで１回抽出し、次にこれを使用してコ
ンピテントＨＢ１０１＋ＩＢ胞を形質転換させた。形質
転換体をミニプレツブとし、プラスミドのメチラーゼ活
性（＾−９の欄参照）を試験した。 ｐＢＲ３２２及び
ｐＵＣ１９の両方に２．２ｋｂのフラグメントを含んで
いる構成物はＢａＩＩ＋メチラーゼ産生するものであっ
た。これらのプラスミドを夫々ｐＤ）１２及びｐＤ）１
３と呼称した。
カリフォスファターゼ処理した）ｐＢＲ３２２−１（ｉ
ｎｄｌｌｌ又はアルカリフォスファターゼ化した０、１
■のｐＵＣ１９−）！ ｉｎｄ ＩＩＩに連結反応させ
、連結反応物を室温で一部インキユベートした。連結反
応混合物（連結反応の詳細については＾−３の欄を参照
）をクロロホルムで１回抽出し、次にこれを使用してコ
ンピテントＨＢ１０１＋ＩＢ胞を形質転換させた。形質
転換体をミニプレツブとし、プラスミドのメチラーゼ活
性（＾−９の欄参照）を試験した。 ｐＢＲ３２２及び
ｐＵＣ１９の両方に２．２ｋｂのフラグメントを含んで
いる構成物はＢａＩＩ＋メチラーゼ産生するものであっ
た。これらのプラスミドを夫々ｐＤ）１２及びｐＤ）１
３と呼称した。
ｃｌ）ｐＤＨｌを標準手段によりマツピングし、同様に
エンドヌクレアーゼプローブをフラグメントにマツピン
グした（第６図）。適当なＸｎ＋ｎ １部位が１つのＨ
ｉｎｄｌｌＩ部位の上流的４５０ｂｐで且つオリゴヌク
レオチドプローブがハイブリダイズしていた位置に近接
する場所に位置していた。
エンドヌクレアーゼプローブをフラグメントにマツピン
グした（第６図）。適当なＸｎ＋ｎ １部位が１つのＨ
ｉｎｄｌｌＩ部位の上流的４５０ｂｐで且つオリゴヌク
レオチドプローブがハイブリダイズしていた位置に近接
する場所に位置していた。
１０ｕｇの精製した２０）２ｋｂフラグメントをＸｍｎ
Ｉエンドヌクレアーゼで徹底的に消化し、反応混合物
をフェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沙に５六＋３− 甫縣遺気捗か 翳、ｄ−め［Ｉ
ＮＡを旧ｎｄ［及びＳｅａ Ｉで二重に消化させた０、
５ｕｙのｐ［Ｉｃ８に連結反応させた。連結反応混合物
を使用してコンピテントに８０２ｔａｌ胞を形質転換さ
せた。
Ｉエンドヌクレアーゼで徹底的に消化し、反応混合物
をフェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沙に５六＋３− 甫縣遺気捗か 翳、ｄ−め［Ｉ
ＮＡを旧ｎｄ［及びＳｅａ Ｉで二重に消化させた０、
５ｕｙのｐ［Ｉｃ８に連結反応させた。連結反応混合物
を使用してコンピテントに８０２ｔａｌ胞を形質転換さ
せた。
個々の形質転換体をミニプレツブ化し、プラスミド構造
を観察すると共に、クローンのＢａ１ｍメチラーゼ活性
を（ｉｎ ｖｉｖｏで〉試験した。′１つのクローンは
１．７５ｋｂの旧ｎｄ■−Ｘ糟ｎｌフラグメント及びメ
チラーゼ活性を有していることが認められた（０．４５
ｋｂのフラグメントを有している他のクローンはエンド
ヌクレアーゼプローブに対して維持され、Ｂａｍメチラ
ーゼ活性を有していなかった）。依然としてＢａｍメチ
ラーゼ陽性であったこの短縮された構成体をｐＤＨ５と
呼称した。
を観察すると共に、クローンのＢａ１ｍメチラーゼ活性
を（ｉｎ ｖｉｖｏで〉試験した。′１つのクローンは
１．７５ｋｂの旧ｎｄ■−Ｘ糟ｎｌフラグメント及びメ
チラーゼ活性を有していることが認められた（０．４５
ｋｂのフラグメントを有している他のクローンはエンド
ヌクレアーゼプローブに対して維持され、Ｂａｍメチラ
ーゼ活性を有していなかった）。依然としてＢａｍメチ
ラーゼ陽性であったこの短縮された構成体をｐＤＨ５と
呼称した。
ｅ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のＢａｌ１ｌクロモソー
ムへのマツピング 精製したＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ＯＮ八を標準条件下で一連の制限エンドヌク
レアーゼで消化させ、消化物を０．５％アガロースゲル
上で泳動させた。実施例Ｉに詳細に記載したようにＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターに移した。次にサザン
プロット転移体をキナーゼ化Ｂａ−オリゴヌクレオチド
プローブ［配列：５’ ＴＣＣ（Ｔ）ＴＴＣ（Ｔ）ＴＣ
Ｇ（ＴＣ八）八ＣＣ（Ｔ）ＴＣＣＡＴ３’ ］及びニッ
クトランスレートした精製Ｚ、Ｚｋｂフラグメント［ニ
ックトランスレーション手順は実施例Ｉに記載したコと
同様にハイブリダイズした。
ムへのマツピング 精製したＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ＯＮ八を標準条件下で一連の制限エンドヌク
レアーゼで消化させ、消化物を０．５％アガロースゲル
上で泳動させた。実施例Ｉに詳細に記載したようにＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターに移した。次にサザン
プロット転移体をキナーゼ化Ｂａ−オリゴヌクレオチド
プローブ［配列：５’ ＴＣＣ（Ｔ）ＴＴＣ（Ｔ）ＴＣ
Ｇ（ＴＣ八）八ＣＣ（Ｔ）ＴＣＣＡＴ３’ ］及びニッ
クトランスレートした精製Ｚ、Ｚｋｂフラグメント［ニ
ックトランスレーション手順は実施例Ｉに記載したコと
同様にハイブリダイズした。
オリゴプローブハイブリダイゼーション及び洗浄はあま
り厳重には実施せず、従って特異的なハイブリダイゼー
ションは余り形成されないが、どちらの部分もＢａｎク
ロモソームの同一領域にハイブリダイズしていることは
明らかであった（第７図）、特に、両方のプローブはＢ
ａａ＋クロモソームの４．５ｋｂＨｉｎｄｌ［Ｉフラグ
メントにハイブリダイズした。
り厳重には実施せず、従って特異的なハイブリダイゼー
ションは余り形成されないが、どちらの部分もＢａｎク
ロモソームの同一領域にハイブリダイズしていることは
明らかであった（第７図）、特に、両方のプローブはＢ
ａａ＋クロモソームの４．５ｋｂＨｉｎｄｌ［Ｉフラグ
メントにハイブリダイズした。
３、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発見
１１００１Ｊの精製［３ｓｍＤＮＡを２００単位の旧ｎ
ｄｌ［［エンドヌクレアーゼで完全に消化させた。 Ｄ
ＮＡを予備０．５％アガロースゲル上で泳動させ、切り
出し、上述のように電気溶出させた。
ｄｌ［［エンドヌクレアーゼで完全に消化させた。 Ｄ
ＮＡを予備０．５％アガロースゲル上で泳動させ、切り
出し、上述のように電気溶出させた。
１０同の精製４．５ｋｂフラグメントを、Ｈｉｎｄｌｌ
［で消化させアルカリフォスファターゼで処理した１１
１１９のｐＡｃＹｃ１８４ベクターに連結反応させた。
［で消化させアルカリフォスファターゼで処理した１１
１１９のｐＡｃＹｃ１８４ベクターに連結反応させた。
連結反応混合物をクロロホルム処理後、′１００〜３０
０ｕＮに希釈した。１００ｕｆを使用して、あらかじめ
ｐＤＨ５で形質転換されているコンピテントに８０Ｚ１
１１胞を形質転換させた。
０ｕＮに希釈した。１００ｕｆを使用して、あらかじめ
ｐＤＨ５で形質転換されているコンピテントに８０Ｚ１
１１胞を形質転換させた。
八ｍｐ’Ｃａｍ’に相当する形質転換体を選択した。よ
う技を挿入してこれらの形質転換体の３５０個を採取し
、ｔｏｏｚのし一ブロス十へｍｐ＋ｃａｍ（クロラムフ
ェニコール；最終濃度３０ｕｙ／ｉｆ）を含む無菌微量
滴定皿［Ｎｕｎｃｌに移し、３７℃で一晩増殖させた。
う技を挿入してこれらの形質転換体の３５０個を採取し
、ｔｏｏｚのし一ブロス十へｍｐ＋ｃａｍ（クロラムフ
ェニコール；最終濃度３０ｕｙ／ｉｆ）を含む無菌微量
滴定皿［Ｎｕｎｃｌに移し、３７℃で一晩増殖させた。
翌日、多枝接種装置を使用してコロニーを［、Ｂ＋＾ｍ
ｐ＋ｃａｍプレートに押し当て、プレート化たり５０コ
ロニーの割合で３７℃で一晩インキユベートした。
ｐ＋ｃａｍプレートに押し当て、プレート化たり５０コ
ロニーの割合で３７℃で一晩インキユベートした。
エンドヌクレアーゼ活性の試験ニア個のマスタープレー
トに５ｚＮの音波緩衝液（１００ｓＭ、 Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ８゜１０ｍＭメルカプトエタノール）を加え、コロニ
ーをプレートの表面から決別した。細胞懸濁液を５にで
１０分間遠心して細胞を採取し、０．５ｚｊ！の音波緩
衝液に再懸濁させた。細胞を２ｈＮのりゾチーム（１０
Ｂ／ｚｌ）と５０．１の０．ＩＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７，
ｏとで処理後、マイクロチップで１５秒間音波処理し、
凍結融解させた。１０１ＪｌのＬＭ ＭｇＣｌ□を添加
後、低速遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏ＋（で５分間）によ
り音波処理物からの細胞破片を除去した。１０ｕｔ’の
Ｐｓｔ ■を反応混合物（１０ｍＭ。
トに５ｚＮの音波緩衝液（１００ｓＭ、 Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ８゜１０ｍＭメルカプトエタノール）を加え、コロニ
ーをプレートの表面から決別した。細胞懸濁液を５にで
１０分間遠心して細胞を採取し、０．５ｚｊ！の音波緩
衝液に再懸濁させた。細胞を２ｈＮのりゾチーム（１０
Ｂ／ｚｌ）と５０．１の０．ＩＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７，
ｏとで処理後、マイクロチップで１５秒間音波処理し、
凍結融解させた。１０１ＪｌのＬＭ ＭｇＣｌ□を添加
後、低速遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏ＋（で５分間）によ
り音波処理物からの細胞破片を除去した。１０ｕｔ’の
Ｐｓｔ ■を反応混合物（１０ｍＭ。
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，１０ｍＭ ＭｇＣｌ□、 １００
ｍＭ ＮａＣ１）に加えることにより、直線化した１１
１ｙのｐＢＲ３２２ＤＮ八を、プールした各抽出物１．
１を使用して消化した。アガロースゲルで消化物をｔ分
Ｍ後、プレート＃５に有望な徴候が認められた。従って
、各コロニーからの細胞を５ｚＮのしＢ＋＾ｍｐ＋ｃａ
ｍに接種し、−晩増殖させ、夫々個々に採取し、Ｂａ＋
ｍＨＩエンドヌクレアーゼ活性を試験した。
ｍＭ ＮａＣ１）に加えることにより、直線化した１１
１ｙのｐＢＲ３２２ＤＮ八を、プールした各抽出物１．
１を使用して消化した。アガロースゲルで消化物をｔ分
Ｍ後、プレート＃５に有望な徴候が認められた。従って
、各コロニーからの細胞を５ｚＮのしＢ＋＾ｍｐ＋ｃａ
ｍに接種し、−晩増殖させ、夫々個々に採取し、Ｂａ＋
ｍＨＩエンドヌクレアーゼ活性を試験した。
更に、コロニーのファージ制限を検査した（実施例Ｉ参
照）、 Ｂａｇエンドヌクレアーゼ活性を有するコロニ
ーが１つ認められた。
照）、 Ｂａｇエンドヌクレアーゼ活性を有するコロニ
ーが１つ認められた。
第１図はメチラーゼを有するプラスミドｐＤｄｅＭ３、
ＯａのＴｎマツピング及び、高いレベルのＤｄｅ ｌメ
チラーゼを発現するクローンであるｐＤｄｅＭｌ 、６
の構造を示しており、第２図はＭ、Ｄｄｅ ■クローン
の１ｎｖｉｖｏ保護アツセイの結果を示しており、第３
図はＭ、Ｄｄｅ ｌがシトシン型メチラーゼであること
を示しており、第４図はＤｄｅ Ｉクローンのサザンプ
ロット分析及び制限地図を示しており、第４図はゲノム
ＤＮＡ消化物をプローブするためにｐＤｄｅＭ３．ｏａ
からの３．Ｏｋｂの旧ｎｄＩ［［インサートを使用する
サザンプロット（＾）及びＤｄｅ ｌ系及び誘導体プラ
スミドを含んでいる領域におけるり、ｄｅｓｕｌｆｕｒ
ｉｃａｎｓゲノムの制限地図（Ｂ）を示しており、第５
図はメチラーゼを有するプラスミドのＢａｌｌ１）Ｉ
Ｉに関するマッピングを示しており、第６図はｐＤＨ２
エンドヌクレアーゼを有するプラスミドのＢａｍＨＩに
関するマツピングを示しており、第７図はＢａｇクロモ
ソームを示している。 代理人弁理士 中 村 至 図面の洋芭（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ａｂｃａ”ｅ ＦＩＧ、２ ｂｃ ＦＩＧ、３ 手続ネ１■正書（方式） 昭和６２年１０月７ 日 １、事件の表示 昭和６２年特訂願第１４１３１０
号２０）発明の名称 制限ｒｉ篩系をクローニング
するための方法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・
インコーホレイテッド ４、代 理 人 東京都新宿区新宿１丁目１？ＩＦ
１４号 山田ビル５、補正指令の日付 昭和６２年８
月５日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 願廁中、出願人の代表者の欄、図
面及び委任状 ８、補正の内容 （１）黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙の通り補充
する。 （内容に変更なし） ■出願人の代表者を記載した適正な願書及び委任状につ
いては、昭和６２年７月２３日付の手続補正書（自発）
にて提出致しました。 尚、同日付にて本願に関する上申書を提出致しました。 手続補正書 昭和６２年１０月７８ ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス
・インコーホレイテッド ４、代 埋 人 東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号 山田ピル（郵便番号１６０） １！話（０３）
３５４−８６２３６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 ８、補正の内容 （１）明細書中、第７７頁第９行目に「示しており、」
とあるを、「示す写真であり、」と補正する。
ＯａのＴｎマツピング及び、高いレベルのＤｄｅ ｌメ
チラーゼを発現するクローンであるｐＤｄｅＭｌ 、６
の構造を示しており、第２図はＭ、Ｄｄｅ ■クローン
の１ｎｖｉｖｏ保護アツセイの結果を示しており、第３
図はＭ、Ｄｄｅ ｌがシトシン型メチラーゼであること
を示しており、第４図はＤｄｅ Ｉクローンのサザンプ
ロット分析及び制限地図を示しており、第４図はゲノム
ＤＮＡ消化物をプローブするためにｐＤｄｅＭ３．ｏａ
からの３．Ｏｋｂの旧ｎｄＩ［［インサートを使用する
サザンプロット（＾）及びＤｄｅ ｌ系及び誘導体プラ
スミドを含んでいる領域におけるり、ｄｅｓｕｌｆｕｒ
ｉｃａｎｓゲノムの制限地図（Ｂ）を示しており、第５
図はメチラーゼを有するプラスミドのＢａｌｌ１）Ｉ
Ｉに関するマッピングを示しており、第６図はｐＤＨ２
エンドヌクレアーゼを有するプラスミドのＢａｍＨＩに
関するマツピングを示しており、第７図はＢａｇクロモ
ソームを示している。 代理人弁理士 中 村 至 図面の洋芭（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ａｂｃａ”ｅ ＦＩＧ、２ ｂｃ ＦＩＧ、３ 手続ネ１■正書（方式） 昭和６２年１０月７ 日 １、事件の表示 昭和６２年特訂願第１４１３１０
号２０）発明の名称 制限ｒｉ篩系をクローニング
するための方法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス・
インコーホレイテッド ４、代 理 人 東京都新宿区新宿１丁目１？ＩＦ
１４号 山田ビル５、補正指令の日付 昭和６２年８
月５日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 願廁中、出願人の代表者の欄、図
面及び委任状 ８、補正の内容 （１）黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙の通り補充
する。 （内容に変更なし） ■出願人の代表者を記載した適正な願書及び委任状につ
いては、昭和６２年７月２３日付の手続補正書（自発）
にて提出致しました。 尚、同日付にて本願に関する上申書を提出致しました。 手続補正書 昭和６２年１０月７８ ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 ニュー・イングランド・バイオレイブス
・インコーホレイテッド ４、代 埋 人 東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号 山田ピル（郵便番号１６０） １！話（０３）
３５４−８６２３６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 ８、補正の内容 （１）明細書中、第７７頁第９行目に「示しており、」
とあるを、「示す写真であり、」と補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）制限修飾系をクローニングするための方法であっ
て、 （ａ）修飾遺伝子をクローニング用ベクターに導入し、
該遺伝子を適当な宿主細胞中で発現させ、（ｂ）修飾遺
伝子を含む宿主細胞に制限遺伝子を導入することから成
る方法。 （２）修飾遺伝子をクローニング用ベクターに導入し、
該遺伝子を適当な宿主細胞中で発現させる段階が、 （ａ）クローニングすべき制限修飾系を含んでいる原料
からＤＮＡを精製する段階、 （ｂ）精製したＤＮＡを少なくとも部分的に消化してＤ
ＮＡフラグメントを形成する段階、 （ｃ）フラグメントをクローニング用ベクターに連結反
応させる段階、 （ｄ）宿主細胞を段階（ｃ）のクローニング用ベクター
で形質転換してライブラリーを形成する段階、（ｅ）ラ
イブラリー中で修飾遺伝子を含んでいるクローンをスク
リーニングする段階、及び （ｆ）段階（ｅ）のクローンを含んでいる宿主細胞を培
養する段階とから成る特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 （３）ＤＮＡ原料が制限修飾系を含んでいる細菌又はウ
ィルスから選択される特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 （４）クローニング用ベクターがプラスミド又はウィル
スＤＮＡ分子である特許請求の範囲第２項に記載の方法
。 （５）プラスミドがｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９
、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９である特許請求の範囲第４
項に記載の方法。 （６）制限遺伝子を宿主細胞に導入する段階が、修飾遺
伝子を含んでいるプラスミドに適合性の第２のプラスミ
ドに制限遺伝子を導入し、宿主細胞を第２のプラスミド
で形質転換することから成る特許請求の範囲第５項に記
載の方法。 （７）制限遺伝子を宿主細胞に導入する段階が、修飾遺
伝子を含んでいるプラスミドに制限遺伝子を導入するこ
とから成る特許請求の範囲第５項に記載の方法。 （８）宿主細胞が、ＥＲ１４６７、Ｋ８０２、ＨＢ１０
１、ＲＲ１、Ｋ８０３及びＭＭ２９４から成る群から選
択される特許請求の範囲第４項に記載の方法。 （９）特許請求の範囲第１項に記載の方法に従って作製
されたクローン。 （１０）クローニングすべき系がＤｄｅＩ制限修飾系か
ら成る特許請求の範囲第９項に記載のクローン。 （１１）クローニングすべき系がＢａｍＨＩ制限修飾系
から成る特許請求の範囲第９項に記載のクローン。 （１２）制限酵素の産生方法であって、 （１）クローニングすべき制限修飾系を含んでいる原料
からＤＮＡを精製する段階、 （ｂ）精製したＤＮＡを少なくとも部分的に消化してＤ
ＮＡフラグメントを形成する段階、 （ｃ）フラグメントをクローニング用ベクターに連結反
応させる段階、 （ｄ）適当な宿主細胞を段階（ｃ）のクローニング用ベ
クターで形質転換してライブラリーを形成する段階、 （ｅ）ライブラリー中で修飾遺伝子を含んでいるクロー
ンをスクリーニングする段階、 （ｆ）修飾遺伝子を含んでいる宿主細胞に制限遺伝子を
導入する段階、 （ｇ）段階（ｆ）のクローンを含んでいる宿主細胞を培
養する段階、及び （ｈ）培養株から制限酵素を回収する段階とから成る方
法。 （１３）ＤＮＡ原料が制限修飾系を含んでいる細菌又は
ウィルスから選択される特許請求の範囲第１２項に記載
の方法。 （１４）クローニング用ベクターがプラスミド又はウィ
ルスＤＮＡ分子である特許請求の範囲第１２項に記載の
方法。 （１５）プラスミドがｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９である特許請求の範囲第
１４項に記載の方法。 （１６）制限遺伝子を宿主細胞に導入する段階が、修飾
遺伝子を含んでいるプラスミドに適合性の第２のプラス
ミドに制限遺伝子を導入し、宿主細胞を第２のプラスミ
ドで形質転換することから成る特許請求の範囲第１５項
に記載の方法。 （１７）制限遺伝子を宿主細胞に導入する段階が、修飾
遺伝子を含んでいるプラスミドに制限遺伝子を導入する
ことから成る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１８）宿主細胞が、ＥＲ１４６７、Ｋ８０２、ＨＢ１
０１、ＲＲ１、Ｋ８０３及びＭＭ２９４から成る群から
選択される特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１９）クローニングされたＢａｍＨＩエンドヌクレア
ーゼ遺伝子。 （２０）特許請求の範囲第１９項に記載のクローンで形
質転換された宿主。 （２１）クローニングされたＤｄｅＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子。 （２２）特許請求の範囲第２１項に記載のクローンで形
質転換された宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87204686A | 1986-06-06 | 1986-06-06 | |
| US872046 | 1986-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6387982A true JPS6387982A (ja) | 1988-04-19 |
| JP2647847B2 JP2647847B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=25358720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62141310A Expired - Lifetime JP2647847B2 (ja) | 1986-06-06 | 1987-06-05 | ＢａｍＨＩ制限修飾系のクローニング |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5137823A (ja) |
| EP (3) | EP0618296B1 (ja) |
| JP (1) | JP2647847B2 (ja) |
| CN (1) | CN87104039A (ja) |
| AT (1) | ATE113653T1 (ja) |
| AU (1) | AU607141B2 (ja) |
| DE (3) | DE3751923T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257185A (ja) * | 1988-08-22 | 1990-02-26 | Toyobo Co Ltd | 新規なＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
| WO1997034006A1 (fr) * | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Plasmide |
| JP2009528839A (ja) * | 2006-03-08 | 2009-08-13 | ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド | 大腸菌におけるＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＳｔｕＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 |
Families Citing this family (40)
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|---|---|---|---|---|
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| ATE127154T1 (de) * | 1987-10-15 | 1995-09-15 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur herstellung der afl ii restriktionsendonuklease. |
| JPH022365A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
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| US4983522A (en) * | 1987-12-17 | 1991-01-08 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HinPI restriction endonuclease and methylase |
| US4999293A (en) * | 1987-12-17 | 1991-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HhaI restriction endonuclease and methylase |
| US4999294A (en) * | 1987-12-17 | 1991-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the FokI restriction endonuclease and methylase |
| US4988620A (en) * | 1987-12-17 | 1991-01-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the FnuDI restriction endonuclease and methylase |
| US4983542A (en) * | 1987-12-21 | 1991-01-08 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the XbaI restriction endonuclease and methylase |
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