JPH022365A - ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼ３ａｎ工およびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。、ｆｆｒｌＪ限エンドヌクレアーぜは、
夾渾する他の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ
分子を切断して各々相応する正確な断片を形成するのに
使用することができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子は
ひとつずつ独自に同定することができ、また分画してそ
の構成遺伝子を単離することができる。制限エンドヌク
レアーぎは現代の遺伝子研究における不可欠の手段であ
ることが立証されている。これらの酵素は生化学的な［
ハサミＪであり、これによって遺伝子の工学および解析
が達成される。

制限エンドヌクレアービは、ＤＮＡ分子−［の特定のヌ
クレオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこ
れに結合することににって作用する。

これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なるｉ！、＋１
限エンドヌクレアーゼはそれぞれ異なるｉ２　Ｌ’を配
列に対して親和力をもっている。今日までに調べられた
幾百種もの細菌で百を越える数の異なる１．１限エンド
ヌクレアーぜが同定されている。

通常細菌は、その極毎に、小数の制限エンドヌクレアー
ゼをもつのみである。これらのエキソヌクレアーピはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
ｌｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ａｅｇｙｐｔｉｕｓはＨ
ａｃＩ　、　Ｈａａ■およびｌ−１ａｃｌ］（とよばれ
る３つの異なる制限エンドヌクレアーぜを合成する。こ
れらの酵素は、それぞれ（八Ｔ　）ＧＧＣＣ（ＡＴ　）
、Ｐ　ＩＪ　Ｇ　ＣＧ　ＣＰ　ｙおよびＧＧＣＣという
配列をみＲ識して開裂する。一方、大腸菌Ｅｓｃｂｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＲＹ１３は１種類の酵素Ｅｃ
。

Ｒ１を合成するだけであり、この酵素はＧＡＡＴＴＣと
いう配列を認識する。

理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレア＝Ｕは細菌細胞の繁殖に関して保護的４１役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、放っておくとこれらの１１菌を破壊したりまた
はこれらに寄生したりするウィルスやプラスミドのよう
な外来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可
能になる。

制限エキソヌクレアーゼは、浸入して来るＤＮＡ分子に
結合し、認識配列に出会う度毎にそれらの［）Ｎへ分子
を開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こ
うして生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは無
能となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーげによってざ
らに分解され易くなる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メヂラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別でさるにうにザる手段が提供される。

修飾メヂラーゼは対応する制限エンドヌクレアーぜと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列
に制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また
、その配列が制限エンドヌクレアーぜに開裂されること
らない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性
のおかげで常に充分修飾されており、したがって白身の
内因性制限エンドヌクレアーゼのｑ在に対して完全にノ
１感受性となっている。制限エンドヌクレアーぜの認識
と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮＡ、した
がって外来のものと確認できるＤＮＡたりである。

’Ｕ仏子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子が」−ドしているタンパク買
ヤ酵素を従来の精製技術で入手可能な闇より天吊に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離づる際の鍵は、そのようなりローンの
出現ｖｊ度が１０３〜１０−４程度に低い場合、複雑な
「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で１９
られるクローンの集団の中で目的とするクローンを同定
する筒中で信頼のおける方法を開発することである。好
ましくは、この方法は、目的としない大多数のクローン
は破壊されるが珍にある望ましいクローンは牛ざ残るよ
うに）バ択的であるべきである。

■型の制限−修飾系はクローニングされており、その数
は次第に増加している。最初にクローニングされた系は
、制限エンドヌクレアーぜクローンを同定または選択す
る手段としてバクチリオフｉ・−ジ感染を使用した［１
１ｈａ［：　Ｈａｎｎ　ｃｔ　ａｌ、、Ｇｅｒ＋ｃ３：
　９７−１１２　（１９７８）　；　ＥｃｏＲＩｆ　：
　Ｋｏｓｙｋｈ　ａｔ　ａＩＩｓΔ、７８．１５０３−
１５０７　（１９８１）］　ｏｌ菌中に制限修飾系が存
在すると細菌はバクテリオファージにＪ：る感染に対し
て抵抗できるので、クローニングされた制限−注飾遺伝
子を担持する細胞は、原理的に、ファージに父露したラ
イブラリーから生えて来る（生き残る）株として選択的
に単離することができる。しかしこの方法は限られた価
１ｆｊ　Ｌがないことが判明した。特定的にいうと、ク
ローニングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残
りを可能にする程に充分なファージ耐性を常に発現でる
とは限らないことが判明したのである。

もうひとつのクローニング法では、最初プラスミド由来
とされていた系をＦ、ｃｏｌｉクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［ＥＣ０ＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｃｒ
ｅｔ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　八ｃ
ｉｄｓ　　ｎｅｓ、　　　１２３６５９−３６７６ｆ１
９８４）：ＰａＱＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ　ａｎｄ　Ｂ
ｒｏｏｋｓＰｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８０：４０２−４０６（１
９８３）　；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ　ａｎｄ　　Ｒｏｙ、
　Ｇｅｎｅ、　１９：３５５−３５９　（１９８２）Ｐ
ｖｕＩｒ：Ｂｌｕｍｃｎ口）ａｌａｔａｌ、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｃｒｉ。

１６４・　５０１−５０９　　（１９８５）］。

第三の方法、リ−へわら多くの系のクローニングに使用
されている方法では、本発明者らの特許出願第７０７０
７９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択
する［ＢｓｕＲＩ　：　Ｋ１５ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕ
ｃｌｅ＋ｃ＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、　　＋３：　６４０
３−６４２１（１９８５）］。制限ｊｎ伝子と修飾遺伝
子とは近接して結合している傾向があるので、雨音の遺
伝子を含イ１するクローンは一方の遺伝子について選択
１゛るだけでｔｌｊ母１できることが多い。しかし、メ
チル（ヒ活性によるｆｆｌ　ｉＲで（１常に完全な制限
−１Ｉ飾系が１ｑられるわけではなく、逆に、メチラー
ゼ遺伝子のみが１ｑられることもある［　Ｂ　５ｐＲＩ
　：　Ｓｚｏ＋ｎｏｌａｎｙｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅ、　１０：２１９−２２５　（１９８０）；３ｃｎ工
：　Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｃｎｃ２
０１９７−２０４　（１９８２）：Ｂ　ｓｕＲＩ　：に
！ＳＳ　ａｎｄ　１３ａｌｄａｕｆ。

Ｇｅｎｅ、　２１：１１１−１１９　（１９８３）；お
よびＭＳｌｌＩ：Ｗａ同ｅｒａｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、
　　Ｒｉｏｔ、　　Ｃｈｅｍ、、２５８：１２３５−１
２４１（１９８３）］　　。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する考えられる障
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレア−ケ遺伝子とを一緒に甲
−のクローンとして導入づると、エンドヌクレアーゼが
宿主ＤＮＡを開裂する機会を１７る萌にメチラーぎがそ
のＤＮＡを４飾して保護するはずである。したがって、
場合にＪ：って（よ、これらの遺伝子（，１順ＫＩ（す
なわら、最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの
順）にのみクローニングが可能となるかもしれない。

制限−修飾系のクローニングに対する別の障害は、旦、
　ｃｏｌｉ−の株の中にはシトシンのＬ飾に対して逆の
反応を示すものがあるという発見にある。すなわら、そ
のような株は、メチル化シトシンを含有しているＤＮＡ
をｒＪｌ壊する系をもっているのであるｒＲａｌｃｉｇ
ｈ　ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　ＡｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：　９０７０−９
０７４　（１９８６）］。これらの株では、その自身の
遺伝子上でも、あるいはその対応するエンドヌクレアー
ゼ遺伝子と共にでち、シトシン１５巽的メヂラーゼｊｎ
伝子を容易にクローニングすることができない。この問
題を避（）るために、これらの系を欠１０シているＥ、
ｃｏｌｉ変異株（ＭＣｒＡ　　Ｊ３．Ｊ−び１Ｖｌｃｒ
Ｂ−）を使用する必要がある。

ｆＩ′ｌ製したｆｌ、１１限エンドヌクレアーゼ、およ
び千要性はそれより下がるが隆篩メヂラーピは、実験室
でＤＮＡの１，１刊決定と再配列をするのに有用な道具
であるから、組換えＤＮＡ技術によって、これらの酵素
を大量に合成する細菌株を１ηることは商栗的な魅力が
ある。そのような株が１７られれば、商ヱ的に有用な吊
で生産（るための手段が提供されるばがりでなく精製の
作業ら簡単になると思われるのでイｊｌｌ］て゛あろう
。

判物で通常見られる夾雑物を含んでいない。

発明のＩＩ！ｉ費 本発明にＪ、−）　ｃ　、　８ａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｃ
ｕｒｌｎｏｌｙｔｉｃｕｓ［ＩＡＭ　＋０７７）に由来
ヂるＢａｎ１制限エンドヌクレアピおよび修飾メヂラー
ぜの遺伝子を含有するり〔コーン、イでらびにこれら酵
素の生産方法が提供される。より特定゛するど、本発明
は、ＧＧＰｙＰｕＣＣというＤＮＡ配列を認識して２つ
のＱの間で開裂する酵素Ｃある制限二しンドヌクレアー
げＢａｎ１を発現りるり［１−ンに係る。Ｓｕｇｉｓａ
ｋｉ、Ｉｌ、、　Ｈａｃｋａｗａ、ＹＫａｎａｚａｗａ
　　ｓ、　ａｎ（Ｉ　Ｔａｋａｎａｍｌ　Ｈ，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　ＡＣＩｄＳＲｃｓ、、　１０　：　５７４７−
５７５２　（１９８２）参照（その開示内合は、ここで
引用したことによって本川ｉ１　Ｅ’４中に含まれるも
のとする）。本発明に従って生産されるＢａｎ■制限エ
ンドヌクレアーピは実質的に純粋であり、Ｓｕｇｉｓａ
ｋｉ　ａｔ　ａｌ、　５ｕｐｒａに開示きれているよう
な従来の技術によって製造されたＱａｎ１調この酵素を
クローニングする好ましい方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ　（ＩＡＨ１０７７）
に由来するＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、Ｂ
ａｎ■修飾メヂラーゼをコードしているＤＮＡを含有づ
るクローンをｔａｍし、これらをスクリーニングしで、
１３ａｎＪ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に含有し
ているクローンを同定することからなる。

発明の詳細な説明 本発明は、９ａｎＴ制限、！３よび修飾遺伝子のり［’
ｍｌ−ン、ならびにそのようなりローン１こよって′生
産される制限エンドヌクレアーピ３ａｎｉに係る。これ
らのＢａｎｌ１ｆｆｆ云子は、ＢａｎＩＩ飾メヂラーゼ
ｊ４仏子を３有し発現することに基づいて選択したいく
つかのクローンが同時に１３ａｎ工制限薗伝子も含有し
ているという事実を利用した方法ににつてクローニング
される。そのようなりローンのＤＮＡはＢａｎｌ１り限
エンドヌクレアーゼによるｉｎ　ＶｉｔｒＯ消化に低抗
性である。この藺止に対する抵抗性によって、ｆ３ａｎ
、ｒメチラーＬ’　ｊＪ３よびイ１ｊ限エンドヌクレア
ーゼをコードしている（１０）−ンを選択的にｆ１ガ１
するための手段が社ｌられる。

）３ａｎ■制限ｊ只伝子およびメブラーゼ遺伝子をクロ
ーニングして発現さＩるための本発明の好ましいＩ）法
を第１図に示ずが、これには以Ｆのステップが含まれる
。

（１）　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔ
ｉｃｕｓのＤＮＡを精製する。ＢａＣ１１ｌｕＳ　ａｎ
（！ｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｌＩｓはＳｕｇｉｓａｋｉ　
０ｔａ１．、５ｕｐｒａに記載されている。この細菌の
サンプルは東京入学応用１２Ｉ！４Ｌ物１１１＋究所か
らカタログ＃［ＡＨ１０７７どじて入手７Ｊ能である。

（２）　　このｌ）　Ｎ　ＡをＨｉｎｄｌｌｌのような
制限エンドメクレ７−ゼでン肖化りる。

（３）　　消化したＤＮＡを、１周以トのＢａｎＩ部位
を含有するｐＢＲ３２２（＾ＴＣＣ３７０１７）のＪ、
うなり【】−ニングベクターに連結する。連結したＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＲＲ１株（
ΔＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転換Ｊ
る。

（４）　　形質転換（）た註合物を、形質転換細胞を選
択づるためのアンピシリンのような抗生物質を含有する
培地（Ａｍｌｌ　Ｉ）ｆａｔｅｓ）に接種する。培り後
形質転換体コ臼ニーをひとつに集めてセルライブラリー
とＪる。

（５）　　このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
Ｊる。

（６）　　このプラスミドライブラリーを、Ｓｕｇｉｓ
ａｋｉｅｔ　ａｌ、　５ｕｐｒａに記載されている方法
と類似の方法でＢ、　ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ
から調製した［３ａｎ工制限エンドヌクレアーげで完全
にｉｔ′ｉ化する。８ａｎＩ消化により、メチラーぜを
含有しない未昨飾クローンが１♂１巽的に破壊され、Ｂ
ａｎエメチラーＵクローンの相Ｒ，Ｉ頻度が増入りる。

（７）　　’ａ’ｒ化したプラスミドライブラリーを「
ｃｏｌｉ　ＲＲＩのような適当な宿主に形質転換し、選
択培地に接種して形質転換体を回収する。これらのコロ
ニーを採取し、ＢａｎＩＩ！飾遺伝子の存在について分
析する。すなわち、コロニーが担持するプラスミドを精
製し、Ｂａｎ１制限エンドヌクレアーゼと共にインキュ
ベートして消化に対して抵抗↑−［か否かを決定する。

まｌこ、ｑ１胞の全ＯＮΔ（染色体およびプラスミド）
も精製し、３ａｎＩ制限エンドヌクレアーぜと共にイン
キコベ−１・する。ＢａｎＩｒそ飾遺伝子を担持するク
ローンの１）Ｎｕま充分にＬ飾されているはずであり、
プラスミドＤＮＡと全ＤＮＡは両方とも消化に対して実
？１的に抵抗性であるはずである。

（８）　　ステップ（７）で同定されたＢａｎＩメチラ
ーゼクローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のＢａ
ｎ■制限エンドヌクレアーぜ活性を検定することにＪ、
って、［′３ａｎＩ制限エンドヌクレアーピを担持する
クローンを同定する。

（９）　　コピー数の多いベクターを使用して遺伝子吊
を高めることによって、また活性の高い外因性ブｌコモ
−ターを使用して転写速度を上げることによって、クロ
ーンの３ａｎ工制限エンドヌクレアーピ産生ωを増大さ
せることができる。

（１０）　　ＢａｎＩ制限および修飾）寞伝子を担持し
ているクローンを醗酵槽内のアンピシリン含有富化培地
中で増殖させることによって、ＢａｎＩ制限エンドヌク
レアーピを生産することができる。細胞を遠心して集め
、音波処理で破壊すると、ＢａｎＩ制限エンドヌクレア
ーゼ活性を含有する粗細胞抽出物が生成する。

（１１）　　ＢａｎＩ制限エンドヌクレアービ活性を含
有づる粗細胞抽出物を、アフィニティーク［１マドグラ
フイーやイオン交換クロマトグラフィーのように標準的
なタンパク質精製＆術によって精製する。

Ｌにｌｌ■略を記載した手順は本発明の好ましい実施態
様であるが、１−記の手順を業界で公知の技術に従って
変化さけることができるということは当業音には明らか
であろう。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示づる
が、これらの実施例は甲なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはイ５いものと考えられたい。

実施例 Ｂａｎ１制限エンドヌクレアーぜ渭伝子のりＩＩ　−ニ
ング （１）　　ＤＮＡの精）１Ｊ： 凍結したＢａＣｌ１ｌＵＳ　ａｎｃｕｒｉｎｏｌｙｔ＋
ｃｕｓ　（ＪＡＭ　１０７７）の細胞１０ｇを氷上で１
時間ｗ？凍した後２０−の２５％５％スフ−ス、　５０
ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０中に再懸濁させた。

１０ｍ１！の０．２５Ｈ「ＤＴ八へＨ８，ＯＪ３よび６
ｄのｌ０ＩＱ　／　ｄリゾデーム（０，２５ＨＴｒｉｓ
吋］８．ｏ中）を加えた。

この懸濁液を２時間氷上に保った後、２４ｍの１％Ｔｒ
＋ｔｏｎ　Ｘ−１００，５０１１ＩＨＴｒｙｓ　ｐＨ８
，０，６７ｍＨＩ’：Ｄｌ＾および５ｄの１０％ＳＤＳ
を加えで溶菌させた。１ｊ１られた溶液を、（前もって
０．５ＨＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０で平衡化した）フェノ
ール７０ｍ１ｔ３よびクロロホルム６０ｍ！で抽出した
。得られた乳濁液をＩＯＫ　ｒｐｍで３０分遠心して相
を分離した。粘稠な上相を新しいびんに移してもう一度
フエノールａ３よびクロ１］ホルムで抽出した。ＩＩＪ
られた乳濁液を再度遠心した後、イの上相をＤＮＡ緩衝
液（１０ｍＨＴｒｉｓ　Ｄｌｌ　ａ、ｏ　　１ｍ＋［：
ＤＴＡ）に対しこの緩衝液を四回交換しで透析しｌこ。

次に、透析した溶液を最終濃度２００即／成の１ｉＮａ
ｓｅにより３７℃で１時間消化した後、！ｉ　ＨＮ　ａ
　Ｃρを最終潤度０．４８まで１ｊ１１え、かつ０．５
５倍容吊のイソプロピルアルコールを添加しＣＤＮ△を
沈澱さＵだ。沈澱したＤＮＡをガラス捧に巻き付けで取
り出し、凪乾した（ｐ約４５０即／　ｍｌの濃度でＤＮ
Ａ緩Ｖ！ｉ液に溶解させて４℃ぐ貯蔵した。

（２）　　ＤＮＡの消化： ａ、　ａｒ＋ＣｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓのＤ　Ｎ　Ａ
　３０１Ｌｇを、３００７／Ａの（ｉｎｄ　ｍ制限エン
ドヌクレアーゼ開化用緩衝液（１０ｍＨＩｒ１ｓ　ｐｉ
ｔ　７．５．　１０ｍＨＨｇＣ１！２．　１０ｍＨメル
カプ１−エクノール、　　５０ｍｔイ５ａＣｉり中に希
釈した。

１−１１ｎ（ｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを３０　ｕ
ｎｉｔ加え、１１１られた溶液を１時間３７℃にインキ
ュベートした俊、１２分間７２℃に加熱して消化を停止
させた。

（３）　　連結および形質転換ニ ドｌ　ｉｎｄ　ｍで消化したＢ、　ａｎｅｕｒｉｎｏｌ
ｙｔｉｃｕｓのＤＮ八へ埒（６０成）を、ｌ−１ｉｎｄ
ｌｌで開裂し脱リン酸化し／、：ｐ）１３　Ｒ３２２Ｆ
ＡｒＣＣ３７０１７）　３埒（１５成）と混合した。１
０×連結用緩衝液（５００ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５１
００ｍＨＨｇＣ１！２，１００ｍＨＤＴＴ、　５ｍＭ　
ＡＴＰ＞を２０成加え、さらに滅菌魚溜水を１０５μｅ
加えて容積を２００Ｊ１１とした。Ｔ４　ＤＮＡリガー
げを５成加え、得られた溶液を３時間１７℃にインキュ
ベ−１へした。この溶液をクロロホルム２０成で抽出し
て滅菌した後、１５秒間軽く遠心（ｍ１ｃｒｏｃｅｎｔ
ｒｉｆｕａａｔｉｏｎ）してｌｉ　ｍ化した。連結溶液
８５ハを１００鱈のＳＳＣ／ＣａＧ！２　（５０ｍＨＮ
ａＣ７！、　５ｍＭクエン酸Ｎａ　　、　　６７ｍＨＣ
ａ（Ｊ！、２）と混合し、氷冷り、　タ旦　ｃｏｌｉ　
　Ｒ１１ｉ　（ＡｒＣＣ３１３４３）ｒンヒアント細胞
を１４威加えた。得られた溶液を４分間４４℃にインキ
ュベートした後、１２５ｄの１ｕｒｉａブロス（１−ｂ
ｒｏｔｈ）を添加して３７℃でインキュベーションを３
時間続行した。

（４）　　セルライブラリー： 形質転換した培養液を穏やかに遠心した後、上清を捨て
、細胞を１．Ｏｄの１−ｂｒｏｔｈに再懸濁ざ１！た。

再懸濁した細胞のうら２００ｄを、アンピシリンを　１
００．ｗ／ｍ１含有するｔｕｒｉａ−寒天（１−ａｇａ
ｒ）プレート上に接種した。このプレートを一晩３７℃
にイン１ユベートシた。プレートの表面十に生えてきた
形質転換細胞をまとめて回収するために、各プレー１〜
に２５ｍ１の１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１０ｍＨ
Ｈｏｅ？　２を満たし、コロニーを全部掻き集め、得ら
れた懸濁液を１木のデユープ内にプールした。

（５）　　プラスミドライブラリ〜： ２．０ｄのセルライブラリーを、アンピシリンを＋ＯＯ
ｎ／ｄ含右するＬ含有ｒｏｔｈ　５００　ｍ中に接種【
ノた。

３７℃で−・晩１辰課培養した後、４Ｋ　ｒｐｍで５分
遠心した。上清を捨て、細胞ベレットを１０ｄの２５％
５％スフロー、　５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０に室温
で再懸濁させた。

０．２５８　［ＤＴＡ、　Ｄｌｌ　８．０を５ｄ、およ
び１０ｍ９／ｒｒｄｔリゾデーム（０，２５ＨＴｒｉｓ
、　ｐＨ８，０中）を３ｄ加えた。

１′、１られた溶液を氷トに１時間放置した後、１２ｄ
の１％　ＴｒＩｔｏｎ　　Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉ
ｓ　　ｐＨ８，０、６７ｍＨ［ＤＴＡを添加し、この懸
濁液に穏やかに渦を巻かＵて細胞の溶菌を誘導した。

溶菌した混合物を５０　ｎｒＲのチューブに移して１７
に１゛ρｍ、４℃で４５分間遠心した。ピペットで上清
を取り出した。固体のＣ５Ｃ１を２０．０（、ｌ秤部し
で５０ｄのプラスチック装ネジブタ付きチューブに入れ
、このデユープ中に上清２２．０９をピペットで入れて
０合した。５　ｍｇ／ｄ、のエヂジウムブロミド（１０
ｍＨＴｒｙｓ　Ｄｌｌ　８．０．　１００ｍＨＮａｐ、
　　４ｍＭ　［ＤＴ＾中）を　１０ｄ加えた。この溶液
を、２本の５／８１ｎＸ３　ｉｎ遠心管に移し、Ｂｃｃ
ｋｍａｎ　Ｔ　ｉ　７０ロ一ター中１！４Ｋｒｌ１ｍ。

１７℃で４２時間回転させた。プラスミドを集めるため
に、これらのデユープを開き、紫外光を照射して２本の
ケイ光バンドの下側の方を性用；Ｓで集めた。各デユー
プから（ｑた下側のバンドを合わぼ、等容ら１の、水で
飽和した氷冷ｎ−ブタノールで四回抽出することによっ
てエヂジウムブロミドを除去し　ｌご　。

抽出された溶液をＤＮＡ緩衝液を四回交換しながらこの
緩ｉ！ｊ液に対して透析した（す、２倍容吊のイソブ［
１パノールと最終濃度が０，４Ｈとなるのに充分な５８
　Ｎａ０２を添加して核酸を沈澱させた。１７られた溶
液を一晩−２０℃で保存した後１５にｒｐｍ、ＯｏＣで
１５分遠心した。上清を捨て、ベレットを１５分間風乾
したｉ役、５００成のｌＯｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５１
ｍＨＥＣＴ八に溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミ
ドＤＮＡの１度は約１００ＩＪ３／′ｍ＆であった。

（６）　　プラスミドライブラリーのン肖化：９ＩＪｇ
（９０ｍ＞のプラスミドライブラリーを３００成の［３
ａｎ■制限１ンドヌクレアーぜ消化用緩衝液ｆｌＯｍＨ
ｒｒｉｓ　ｐｌ＋　７．５．　ｌＯｍＨＨｇＣ１！、、
　、　１０ｍＨメルカ１１〜エタノール、ｌＯｍＨＮａ
Ｃｊ！　）に希釈した。２５　ｕｎｉｔ（２５ｕ１）の
［３ａｎ■制限エンドヌクレアーゼを加え、デユープを
３時間３７℃にインキュベー１〜した後、１２分間１２
℃に加熱して反応を停止させた。

（７）　　形質転換： ２０Ａｅ　（０，６／Ｓ　＞の消化したライブラリーを
１３０ｄのＳＳＣ／ＣａＣ１！２（上記第３項）および
３００屑の水冷したコンビテン１〜Ｅ、　ｃｏｌｉ　　
ＲＲＩと混合した。得られた混合物を３分間４２℃に暖
めた後軽く遠心した。得られた細胞ペレッｌ−を１５０
．Ｍの１−ｂｒｏｔｈに再懸濁させ、アンピシリンを　
１００ＵＳ、／７含イ１づる１−ａｇａｒプレー１−に
接腫し゛た。このプレー１−を−晩３７°Ｃにインキュ
ベ−１−Ｌ、た。３ａｎ■消化によって、米量化のプラ
スミドによる形質転換の１易合ど比較して、形質転換体
の故は１／１０”に減少した。

この［３ａｎ）消化で生き残ったもののうちから２８個
のコロニーを採り、それぞれ、１０ｄのアンピシリン含
有Ｌ−ｂｒｏｔｈ中に接柱してミニ７Ｊルヂヤー〈小培
養物）を調製し、アンピシリンを含有するＬａｇａｒプ
レー１〜上に画線してマスツースｌ−ツクを調製した。

（８）　　生き残った周体の解析ニ ド記第７頂で（９られた２８ｆｌｌ！ｉｌの生き残りの
コロニーを１０ｍになるまで増殖させ、これらが担持す
るプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ
、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ　へ（！Ｓ、、　７　
：　１５１３　（１９７’ｌ）の方法を応用した以下の
ｍ１ｎｉｐｒｃｐ精製法によって調）ツした。

ｍ１ｎｉｐｒｃｐ法： 呂培査物を８Ｋｐｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて（
ｑられた（１１１胞ペレッｌ−を、１η／　ｍｅリゾチ
ームを含イｊする　１０ｄの２！＋ｍＨＴｒｉｓ、ｌＯ
ｍＨ［ＤＴＡ　　５０ｍＨグルコース、　ｐＨ８，０中
に再懸濁させた。室温に１０分間装いた後、各デユープ
に２．Ｏｄの０．２ＨＮａ０１１１％ＳＯ３を加え、チ
ューブを振憑して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。

溶液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，８）を１．５ｍｅずつ加えて振【２した。生じた沈
澱を１５にｒｐｍ、　４°Ｃて１０分間遠心して沈まＵ
た。１！ｌられた上清を各々、イソプロパツールを３威
含有する遠心管に流し入れて混合した。室温で１０分経
った後遠心管を１５Ｋｒｐｍで１０分間遠心して沈澱し
た核酸をベレット化した。

上ン古を捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。

乾燥した後ベレットを８！ｉｏ度の　ｌＯｍＨ丁ｒｉｓ
、　１ｍＨＥＤＴ八、ｐｌ＋　８．０に再懸濁さぜｌコ
。５８　ＮａＣ１を７５／Ｊｆつ加え、１すられた溶液
を、５７５成のイソプロパツルを含有するｃｐｐｃｎｄ
ｏｒｒチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱さ
せた。次に、チューブをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４５秒
間回転し、上清を捨ててベレットをｆ！ｉｌｌした。こ
のベレットを、次いで、ＲＮａｓｅをｉｏＯ縛／−含有
づる５００度のｌＯｍＨＴｒｉｓｌｍＨ［ＤＴＡ、　ｐ
Ｈ８，０に溶解し、１　［１５間３７℃にインキュベー
トしてＲＮＡを）１化した。５０〃の５ＨＮａＣｉ！、
次いで３５０屑のイソプロパツールを添加してＤＮＡを
もう一度沈澱させた。至温で１０分後、４５秒間遠心し
てＤＮＡを沈ませ、上Ｆ？ｌを捨て、（りられたベレッ
を１５０度の１０ｍＨＴｒ＋ｓ、　１ｍＨＥＯＴＡ、　
１ｕｌｌ　ＬＯに再溶解した。次いで、プラスミドｍ１
ｎｉｐｒｃｐ　（小調製物）をＢａｎＩとＨｉｎｄｌｌ
［で消化し−Ｃ解析した。

（’ｌ）　　［３ａｎＩメヂラーゼ道伝子クローン：解
析した２８個のプラスミドのうちほぼ半分が、ＢａｎＩ
消化に対して感受性でありＢ、　ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙ
−ｔｉｃｕｓ　Ｄ　Ｎ　ＡのさまざまなＨｉｎｄｌ断片
を担持していることが判明した。これらのプラスミドは
にせらのであるので捨てた。残りの１２個のプラスミド
は、３ａｎ■消化に対して抵抗性であり、７．５Ｋｂの
１ｌｉｎｄｌｌ［断片を担持していることが判明した。

これらのプラスミドのいくつかは、染色体上で７．５Ｋ
ｂに近Ｈ３ｔ−’でいると思われる別の共通断ｊ″Ｉを
担持していた。この別の断片が存在していてもプラスミ
ドの性質には影響がないので、筒中にするため７６５に
ｔ１断片を担持しているプラスミドだけを詳細に解析し
た（第２図）。ＩＩＧＷ１１８ＲＨ２−１を代表とする
これらのプラスミドは、Ｂａｎ１１飾メチラーゼを］−
ドしているばかりでなく、Ｂａｎ■制限エ制限エンドヌ
クレアコピドしていることが示された。

（１０）　　ＢａｎＩ制限遺伝子り［１−ン：ｐＧＷ１
１８ＲＨ２−１および類似のプラスミドは、これらのプ
ラスミドを担持しているＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｒ１１の抽
出物を検定することにより、３ａｎＩ制限エンドヌクレ
アーゼをコードしていて発現することが判明した。

エンドヌクレアーぜアラレイ： 検定すべき培養細胞１００−を、１００埒／　ｍＱファ
ンシリンを含有する１−ｂｒｏｔｈ中３７°Ｃで一晩増
殖さＩだ。ｌ物を４にｒｐｍで５分間遠心し、得られた
細胞ペレットを３５ｍ１の１０ｍＨＫＰＯ４ａｌｌ　７
．５．１０＋ｎＨメルカプトエタノール、　０．１ｍＨ
［ＤＴΔ中に再懸濁させた。同じ緩衝液中に１０／ｒｔ
ＦＪ／ｍ！！のりゾチームを含有する液を０５威加え、
ＩＰられた懸濁液を２時間氷上に放置した。この懸濁液
を一２０°Ｃで凍結し、次いで氷上で解凍した。解凍し
た懸濁液１．０ｄを、１０秒ずつ三回目やかに音波処理
して細胞を破壊した。音波処理した抽出物を５分間軽く
遠心して細胞の破片を除去し、上清のエンドヌクレアー
ゼ活性を以下のようにして検定した。

精製したλフアージＤＮＡ６０〜（８５成）を、１２０
０／１１１１のＢａｎＪ制限エンドヌクレアーピ消化用
緩雨液（上記第６項）中に希釈した。この溶液を６木の
ヂ１−ブに、最初の１本は１５０度、残りの５本はｉ　
ｏｏｍずつ分注した。最初のチューブに抽出物７５成を
入れてＤＮＡ　　１埒当たり抽出物１成とした。次に、
最初のヂ１−ブから５０成を取り出して第二のチューブ
に移して　０．３／ｌＪ、、／／ｉとした。続けてチュ
ーブ３．４．５にも順次５０成ずつ移して、ヂコー１３
（０，１度、／乃）、４（０，（１３／ＩＩＪ／Ｉｉ！
Ｉおよび５（０，００１１ｄ、／諷）とした。６木目の
チューブには抽出物を入れないで負のコントロールとし
て使用した。これらのチ１−ブを１時間３７°Ｃにイン
キュベートした後、各デユープの蚤ナンプル２０成をゲ
ル電気泳動によって分析した。

これらの抽出物は、１戒に付き約＋ｘｌＯ’ｕｎ口の［
３ａｎＴ制限エンドヌクレアーゼを含イｊしていること
が判明した。これは、細胞１ｄ当たり約１×１０５ｕ旧
【に相当する。

（Ｉｌｌ　　ＢａｎＩ　　ＲＨクローンのファージ耐性
二制限−昨飾系には、Ｅ、Ｃ０１ｉ中でクローニングさ
れたときに制限表現型を発現するものらあればしないも
のらある。この制限表現型は、ファージの感染に対して
細胞が生き残り〕７−ジが再生できないことである。ｐ
ＧＷ１１８ＲＨ２−２または７．５Ｋｂ１」１ｎｄＩ［
Ｉ断片を含有する他のプラスミドを担持しているＥ　、
　ｃｏｌｉ　ＲＲＩは強い制限表現ｙ）を示す。これら
のクローン上に約１０−６の効率でラムドイドフアージ
プラータが出現することはｐ［！Ｒ３２２を担１、〜し
ている同じ株では効率１に匹敵する。

（１２）　　７．５Ｋｂｌｆ７ｉ片のρＵＣ１９への移
入：債装したｐＧＷ１１８ｆｔ）Ｉ　２−Ｉ　ＤＮＡ　
５μ５（５０成）を　１００ｇの１−１ｉｎｄ　Ｉ［！
制限エンドヌクレアーぜ消化用緩衝液（上記第２項）中
に準備した。制限エンドヌク１ツアーｔｎ−１ｉｎｄ１
１１、［３ａｍｌｌ！およびｐｓｔ王を各々４０１Ｊｎ
ｌずつ加えた。１９られた溶液を１時間３７℃にインキ
ュベートした後、１５分間７５℃に加熱して消化を１７
止した。Ｈｉｎｄｌを用いてこのベクターから　７５に
ｂ断片を切り出した。ｐＢＲ３２２を開裂するがこの断
片は間饗しないＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いてこの
ベクターを消化して以下の連結中に再結合（再出現）す
るのを防いだ。

消化したｐＧ見１１８Ｒ）ｌ　２−Ｉ　ＤＮＡ３埒（６
０成）を、ｎｄ　［１で開裂し脱リン酸化したＤＩＩＣ
１９の１．５μｓ（７，５Ｎ）と混合した。１０成の１
０×連結用緩衝液（上記第３項）と２２５屑の滅菌蒸溜
水を加えて８宿を１００度とした。４ρのＴ４ＤＮ△リ
ガーピを添加し、１１１られた溶液を４時間１７°Ｃに
インキュベトした。この連結湿合物を、１０成のクロロ
ホルムで抽出して滅菌した１９簡単に遠心して清澄化し
た。こうして滅菌した連結混合物１２５成を、　１００
成のＣ，ＩＣ１２／ＳＳＣ（上記第３項）および２００
薦の氷冷したコンビテン１〜Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＲｌと
混合した。１′７られた混合物を５分間４２°Ｃにイン
キュベートした後、１０ｄのり、−ｂｒｏｔｈ中に希釈
し、−晩３０℃にインキュベ−１〜した。次に、培養物
のサンプル２５成をアンピシリン含Ｎ　Ｌ−ａｇａｒプ
レー１〜上に接種し、３０°Ｃにイン−１ユベーシコン
した後形質転換体を回収した。

２８周の形７１転換体コロニーを採取し、ｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ法（ト記第８項）によってスクリーニングして、ｌ
−１ｉｎｄ　１部位に挿入された７、　５Ｋｂｌｆｌ’
ｉ片を有スルρＵＣ１９から構成されたプラスミドを同
定した。２つのプラスミドｐＲｃ１１８ＲＨ１０２−６
ど　ｐＨｃ１１８ＲＨ１０２１８がこの構造を保有して
いることが判明した。これらは？、　５Ｋｂ断片を反夕
・ｊの配向で損１）シており、Ｂａｎ丁消化に対して完
全なｔ＋、を抗性を示す。これらのプラスミドの各々を
相持するＦ　、　ｃｏｌｉ　Ｒ１口の粗細胞抽出物の３
ａｎ■制限エンドヌクレアーピ活性を検定した（第３図
）。これらの抽出物は、親のクローンよりもかなり多量
に、すなわち抽出物１　ｍｐに付ぎ　ＩＸ　１０５１１
ｎｉｔ超（細胞１ｇにイ」き　１×１ｏ”　ｕｎｔｔ超
）でｊ３ａｎ■制限エンドヌクレアーＵを含有している
ことが判明した。

１１１１Ｃ１１８Ｒ）１１０２−（ｉまたはｐｌｉｌｃ
１１８ＲＨ１０２−１８を担持するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｒ
旧は、３　ａｎ　［制限１ンドヌクＬ／／’−ゼを精製
する際の好ましい宿主として使用づることかできる。こ
の株を、ｒｆＡＭ　槍の７ンピシリン含有Ｌ　−ｂｒｏ
ｔｈ４＋　３７℃で定常期まで増殖さ６　／、：　後、
遠心して細胞を集め、直ぐに破砕して抽出物を調製して
もよいし、使用時まで一７０℃で凍結保存してちにい。

【図面の簡単な説明】

第１図シよ、Ｂａｎ１制限エンドメクレ７−ピをり【゛
１−ニングして生産する方法の概略を示１゜第２図は、
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーぜおよび修飾メヂラーＵ
を１−ドしているＢ　、　ａｎｅｕｒｉｎ−ｏｌｙｔｉ
ｃｕｓＤ　Ｎ△の７．５Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片の制限
地図であり、この断片をｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０
１７）のｆｌ　ｉｎｄ　Ｉ［１部位にり【コーニングし
てｐＧＷ１１８ＲＨ２−１を創作し、次にこれをｐＵ　
Ｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＨｉｎｄｆｌ［部位に
移してｐＲｃ１１８１？）Ｉ　１０２−６とｐｌｉｃ１
１８Ｒ）ｌ＋０２−１８を創作した。 第３図は、Ｉ）ＧＷ１１Ｂ１１ｔ４２−１．１）ＩＣ１
１８＋＋８１０２−６およびｌ１ｌＲＣ１１８ＲＨ１０
２−１８を担持りる旦、凹　１（Ｒ１（八ＴＣＣ３１３
４３＞の細胞抽出物中のＢａｎ■制限エンドヌクレアー
ゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。 ｐＧＷ１１８ＲＭ２−１　ｐＲｃ１１８ＲＭＩＱ２−６
　ｐＲｃＩＬ８ＲＭ１０２−１ｆ３ＦＩＧ’３

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｂａｎ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む
   クローニングベクター。
2. （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
3. （３）Ｂａｎ I 遺伝子が、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅ
   ｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ￥ＩＡＭ１０７７から切り出
   されたものである、請求項１に記載のクローニングベク
   ター。
4. （４）Ｂａｎ I 修飾遺伝子を含むクローニングベクタ
   ー。
5. （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
6. （６）（ａ）￥Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙ
   ｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリーを形成
   し、 （ｂ）Ｂａｎ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単離
   し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
   し、 （ｄ）Ｂａｎ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同時
   に含有しているクローンを単離する ことからなる、Ｂａｎ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝
   子のクローニング方法。
7. （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
   ｕｓ￥ＩＡＭ１０７７に由来するＤＮＡを精製するステ
   ップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
   ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
   ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
   胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
   、 （ｃ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。
8. （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である、請
   求項７に記載の方法。
9. （９）宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉのｍｃｒＢ＾−およびｈ
   ｓｄＲ＾−株である、請求項７に記載の方法。
10. （１０）プラスミドライブラリーをＢａｎ I で消化し
    て消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中に
    形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択する
    ことによつて、Ｂａｎ I 修飾遺伝子を含有するクロー
    ンを単離する、請求項７に記載の方法。
11. （１１）（ａ）￥Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌ
    ｙｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
    で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
    ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
    転換してライブラリーを形成し、（ｅ）Ｂａｎ I 修飾
    メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）Ｂａｎ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロ
    ーンをスクリーニングし、Ｂａｎ I 制限エンドヌクレ
    アーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
    培養し、 （ｈ）この培養物からＢａｎ I 制限エンドヌクレアー
    ゼを回収する ことからなる、Ｂａｎ I 制限エンドヌクレアーゼの製
    造方法。
12. （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
    ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。
13. （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１２
    に記載の方法。
14. （１４）プラスミドがｐＵＣ１９である、請求項１２に
    記載の方法。