JP2761227B2 - ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法Info
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- JP2761227B2 JP2761227B2 JP63317574A JP31757488A JP2761227B2 JP 2761227 B2 JP2761227 B2 JP 2761227B2 JP 63317574 A JP63317574 A JP 63317574A JP 31757488 A JP31757488 A JP 31757488A JP 2761227 B2 JP2761227 B2 JP 2761227B2
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- restriction endonuclease
- dna
- restriction
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼHinP Iおよびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に同定することができ、また分画してその構成遺伝子
を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証
されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」であ
り、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に同定することができ、また分画してその構成遺伝子
を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証
されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」であ
り、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。これらの酵素はDNA
分子に結合すると、その配列の内部または一端でその分
子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれぞ
れ異なる認識配列に対して親和力をもっている。今日ま
でに調べられた域百種もの細菌で百を越える数の異なる
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。これらの酵素はDNA
分子に結合すると、その配列の内部または一端でその分
子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれぞ
れ異なる認識配列に対して親和力をもっている。今日ま
でに調べられた域百種もの細菌で百を越える数の異なる
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
通常細菌は、その種毎に、小数の制限エンドヌクレア
ーゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たとえ
ば、Haemophilus aegyptiusはHas I、Hae IIおよびHae
IIIとよばれる３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は、それぞれ（AT）GGCC（A
T）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識して開裂す
る。一方、大腸菌Escherichia coli RY13は１種類の酵
素EcoR Iを合成するだけであり、この酵素はGAATTCとい
う配列を認識する。
ーゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たとえ
ば、Haemophilus aegyptiusはHas I、Hae IIおよびHae
IIIとよばれる３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は、それぞれ（AT）GGCC（A
T）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識して開裂す
る。一方、大腸菌Escherichia coli RY13は１種類の酵
素EcoR Iを合成するだけであり、この酵素はGAATTCとい
う配列を認識する。
理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンド
ヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を
果していると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来DNA分子による感染に対して抵抗することが可能にな
る。制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るDNA分子
に結合し、認識配列に出合う度毎にそれらのDNA分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは無能
となり、そのDNAはエキソヌクレアーゼによってさらに
細かく分解されることになる。
ヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を
果していると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来DNA分子による感染に対して抵抗することが可能にな
る。制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るDNA分子
に結合し、認識配列に出合う度毎にそれらのDNA分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは無能
となり、そのDNAはエキソヌクレアーゼによってさらに
細かく分解されることになる。
細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これによって、細菌が外来の感染性DNAから自身のD
NAを防御して区別できるようにする手段が提供される。
修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このDNAを破断する代わりに、メチル基を付加すること
によってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的
に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列に
制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また、
その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されることも
ない。細菌細胞のDNAはその修飾メチラーゼの活性のお
かげでいつも完全に修飾されており、したがって自身の
内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非
感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認識と
攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、したがっ
て外来のものであることが確認できるDNAだけである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これによって、細菌が外来の感染性DNAから自身のD
NAを防御して区別できるようにする手段が提供される。
修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このDNAを破断する代わりに、メチル基を付加すること
によってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的
に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列に
制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また、
その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されることも
ない。細菌細胞のDNAはその修飾メチラーゼの活性のお
かげでいつも完全に修飾されており、したがって自身の
内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非
感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認識と
攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、したがっ
て外来のものであることが確認できるDNAだけである。
遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で入手可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10-3〜10-4程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは破
壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的なものであるべきである。
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で入手可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10-3〜10-4程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは破
壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的なものであるべきである。
II型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、そ
の数は次第に増加している。最初にクローニングされた
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージによる感染を使用
した［Hha II:Mannet al.,Gene,3:97−112（1978）;Eco
R II:kosykh et al.,Molec.gen.Genet.178:717−719（1
980）;Pst I:Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,7
8,1503−1507（1981）］。細菌中に制限−修飾系が存在
すると細菌はバクテリオファージによる感染に対して抵
抗できるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を
担持する細胞は、原理的に、ファージに暴露されたライ
ブラリーから生えて来る（生き残る）株として選択的に
単離することができる。しかしこの方法は限られた価値
しかないことが判明した。特定的にいうと、クローニン
グされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可能
にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは限ら
ないことが判明したのである。
の数は次第に増加している。最初にクローニングされた
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージによる感染を使用
した［Hha II:Mannet al.,Gene,3:97−112（1978）;Eco
R II:kosykh et al.,Molec.gen.Genet.178:717−719（1
980）;Pst I:Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,7
8,1503−1507（1981）］。細菌中に制限−修飾系が存在
すると細菌はバクテリオファージによる感染に対して抵
抗できるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を
担持する細胞は、原理的に、ファージに暴露されたライ
ブラリーから生えて来る（生き残る）株として選択的に
単離することができる。しかしこの方法は限られた価値
しかないことが判明した。特定的にいうと、クローニン
グされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可能
にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは限ら
ないことが判明したのである。
もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド
由来とされていた系をＥ．coliクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［E.coR V:Bougueleret et al.,Nuc
leic Acids Res.,12:3659−3676（1984）;PaeR7:Ginger
as and Brooks,Proc.Natl.Acal.Sci.USA,80:402−406
（1983）;Theriault and Roy,Gene,19:355−359（198
2）;Pvu II:Blumenthal et al.,J.Bacteriol.,164:501
−509（1985）］。
由来とされていた系をＥ．coliクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［E.coR V:Bougueleret et al.,Nuc
leic Acids Res.,12:3659−3676（1984）;PaeR7:Ginger
as and Brooks,Proc.Natl.Acal.Sci.USA,80:402−406
（1983）;Theriault and Roy,Gene,19:355−359（198
2）;Pvu II:Blumenthal et al.,J.Bacteriol.,164:501
−509（1985）］。
第三の方法として多くの系のクローニングに使用され
ている方法では、本発明者らの特許出願第707079号に関
連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択する［BsuR
I:Kiss et.al.,Nucleic Acids Res.,13:6403−6421（1
985）。］制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結合し
ている傾向があるので、両者の遺伝子を含有するクロー
ンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できるこ
とが多い。しかし、メチル化活性による選択では常に完
全な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、メチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspR I:Szomo
lanyi et al.,Gene,10:219−225（1980）;BcnI:Janulai
tis et al.,Gene,20:197−204（1982）;BsuR I:Kiss an
d Baldauf,Gene,21:111−119（1983）；およびMsp I:Wa
lder et al.,J.Biol.Chem.,258;1235−1241（198
3）］。
ている方法では、本発明者らの特許出願第707079号に関
連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択する［BsuR
I:Kiss et.al.,Nucleic Acids Res.,13:6403−6421（1
985）。］制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結合し
ている傾向があるので、両者の遺伝子を含有するクロー
ンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できるこ
とが多い。しかし、メチル化活性による選択では常に完
全な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、メチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspR I:Szomo
lanyi et al.,Gene,10:219−225（1980）;BcnI:Janulai
tis et al.,Gene,20:197−204（1982）;BsuR I:Kiss an
d Baldauf,Gene,21:111−119（1983）；およびMsp I:Wa
lder et al.,J.Biol.Chem.,258;1235−1241（198
3）］。
制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単
一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが
宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのDNA
を修飾して保護するはずである。したがって、場合によ
っては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初にメチ
ラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクローニ
ングが可能となるかもしれない。制限−修飾系のクロー
ニングに対する別の障害は、Ｅ．coliの株の中にはシト
シンの修飾に対して逆の反応を示すものがあるという発
見にある。すなわち、そのような株は、メチル化シトシ
ンを含有しているDNAを破壊する系をもっているのであ
る［Raleigh and Wilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83−
9070−9074（1986）］。シトシンに対して特異的なメチ
ラーゼ遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にでも、これらの株中
で容易にクローニングすることができない。この問題を
避けるためには、これらの系を欠損しているＥ．coli変
異株（McrA-およびMcrB-）を使用する必要がある。
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単
一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが
宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのDNA
を修飾して保護するはずである。したがって、場合によ
っては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初にメチ
ラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクローニ
ングが可能となるかもしれない。制限−修飾系のクロー
ニングに対する別の障害は、Ｅ．coliの株の中にはシト
シンの修飾に対して逆の反応を示すものがあるという発
見にある。すなわち、そのような株は、メチル化シトシ
ンを含有しているDNAを破壊する系をもっているのであ
る［Raleigh and Wilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83−
9070−9074（1986）］。シトシンに対して特異的なメチ
ラーゼ遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対応する
エンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にでも、これらの株中
で容易にクローニングすることができない。この問題を
避けるためには、これらの系を欠損しているＥ．coli変
異株（McrA-およびMcrB-）を使用する必要がある。
精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそ
れより落ちるが、修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特
性決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これ
らの酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
れより落ちるが、修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特
性決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これ
らの酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
発明の概要 本発明によって、Haemophilus influenza P1に由来す
るHinP I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ
の遺伝子を含有するクローン、ならびにこれらの酵素の
生産方法が提供される。より特定すると、本発明は、GC
GCというDNA配列を認識して最初のＧとＣの間で開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼHinP Iを発現する
クローンに係る。Shen,S.,Li,Q.,Yan,P.,Zhou,B.,Ye,
S.,Lu,Y.and Wang,D.,Science Sin.,23:1435−1442（19
80）参照（その開示内容は、ここで引用したことによっ
て本明細書中に含まれるものとする）。本発明に従って
生産されるHinP I制限エンドヌクレアーゼは、Shen et
al.,supraに開示されているような従来の技術によって
製造されたHinP I調製物中に通常みられる夾雑物を含ん
でいない。
るHinP I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ
の遺伝子を含有するクローン、ならびにこれらの酵素の
生産方法が提供される。より特定すると、本発明は、GC
GCというDNA配列を認識して最初のＧとＣの間で開裂す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼHinP Iを発現する
クローンに係る。Shen,S.,Li,Q.,Yan,P.,Zhou,B.,Ye,
S.,Lu,Y.and Wang,D.,Science Sin.,23:1435−1442（19
80）参照（その開示内容は、ここで引用したことによっ
て本明細書中に含まれるものとする）。本発明に従って
生産されるHinP I制限エンドヌクレアーゼは、Shen et
al.,supraに開示されているような従来の技術によって
製造されたHinP I調製物中に通常みられる夾雑物を含ん
でいない。
この酵素をクローニングする好ましい方法は、Haemop
hilus influenza P1に由来するDNAを含有するライブラ
リーを形成し、HinP I修飾メチラーゼをコードしている
DNAを含有するクローンを単離し、これらをスクリーニ
ングして、HinP I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に
含有しているクローンを同定することからなる。
hilus influenza P1に由来するDNAを含有するライブラ
リーを形成し、HinP I修飾メチラーゼをコードしている
DNAを含有するクローンを単離し、これらをスクリーニ
ングして、HinP I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に
含有しているクローンを同定することからなる。
発明の詳細な説明 本発明は、HinP I制限および修飾遺伝子のクローン、
ならびにそのようなクローンによって生産される制限エ
ンドヌクレアーゼHinP Iに係る。これらのHinP I遺伝子
は、HinP I修飾メチラーゼ遺伝子を含有し発現すること
に基づいて選択したある種のクローンが同時にHinP I制
限遺伝子も含有しているという事実を利用する方法によ
ってクローニングされる。そのようなクローンのDNAはH
inP I制限エンドヌクレアーゼによるin vitro消化に抵
抗性である。この消化に対する抵抗性によって、HinP I
メチラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼをコードして
いるクローンを選択的に単離するための手段が得られ
る。
ならびにそのようなクローンによって生産される制限エ
ンドヌクレアーゼHinP Iに係る。これらのHinP I遺伝子
は、HinP I修飾メチラーゼ遺伝子を含有し発現すること
に基づいて選択したある種のクローンが同時にHinP I制
限遺伝子も含有しているという事実を利用する方法によ
ってクローニングされる。そのようなクローンのDNAはH
inP I制限エンドヌクレアーゼによるin vitro消化に抵
抗性である。この消化に対する抵抗性によって、HinP I
メチラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼをコードして
いるクローンを選択的に単離するための手段が得られ
る。
HinP I制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
（１） Haemophilus influenza P1のDNAを精製する。
H.influenza P1はShen et al.,supraに記載されてお
り、この細菌のサンプルはthe American Type Culture
Collectionからcatalog NO.ATCC 53700として入手し得
る。
H.influenza P1はShen et al.,supraに記載されてお
り、この細菌のサンプルはthe American Type Culture
Collectionからcatalog NO.ATCC 53700として入手し得
る。
（２） このDNAをPst Iのような制限エンドヌクレアー
ゼで部分消化する。
ゼで部分消化する。
（３） 消化したDNAを、１個以上のHinP I部位を含有
するpBR322（ATCC 37017）のようなクローニングベクタ
ーに連結する。連結したDNAをEscherichia coli RR1株
（ATCC 31343）のような適当な宿主に形質転換する。
するpBR322（ATCC 37017）のようなクローニングベクタ
ーに連結する。連結したDNAをEscherichia coli RR1株
（ATCC 31343）のような適当な宿主に形質転換する。
（４） このDNA/細胞混合物を、形質転換細胞を選択す
るためのテトラサイクリンのような抗生物質を含有する
培地に接種する。培養後形質転換細胞コロニーをひとつ
に集めてセルライブラリーとする。
るためのテトラサイクリンのような抗生物質を含有する
培地に接種する。培養後形質転換細胞コロニーをひとつ
に集めてセルライブラリーとする。
（５） このセルライブラリーから組換えプラスミド全
部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成す
る。
部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成す
る。
（６） このプラスミドライブラリーを、Shen et al.,
supraに記載されている方法と類似の方法によってH.inf
luenza P1から製造したHinP I制限エンドヌクレアーゼ
で完全に消化する。HinP I消化により、メチラーゼを含
有しない未修飾クローンが特異的に破壊され、HinP Iメ
チラーゼ担持クローンの相対頻度が増大する。
supraに記載されている方法と類似の方法によってH.inf
luenza P1から製造したHinP I制限エンドヌクレアーゼ
で完全に消化する。HinP I消化により、メチラーゼを含
有しない未修飾クローンが特異的に破壊され、HinP Iメ
チラーゼ担持クローンの相対頻度が増大する。
（７） 消化したプラスミドライブラリーのDNAをＥ．c
oli RR1株のような適当な宿主に形質転換し、抗生物質
プレートに接種して形質転換コロニーを再度取得する。
これらのコロニーを採取し、そのDNAをHinP I修飾遺伝
子の存在について以下のように分析する。すなわち、コ
ロニーが担持するプラスミドDNAを精製し、HinP I制限
エンドヌクレアーゼと共にin vitroでインキュベートし
てHinP I消化に対して抵抗性が否かを決定する。また、
このクローンの全細胞DNA（染色体およびプラスミド）
も精製し、HinP I制限エンドヌクレアーゼと共にインキ
ュベートする。HinP Iメチラーゼ遺伝子を担持するクロ
ーンのDNAは充分に修飾されているはずであり、プラス
ミドDNAと全DNAは両方とも消化に対して実質的または完
全に抵抗性であるはずである。
oli RR1株のような適当な宿主に形質転換し、抗生物質
プレートに接種して形質転換コロニーを再度取得する。
これらのコロニーを採取し、そのDNAをHinP I修飾遺伝
子の存在について以下のように分析する。すなわち、コ
ロニーが担持するプラスミドDNAを精製し、HinP I制限
エンドヌクレアーゼと共にin vitroでインキュベートし
てHinP I消化に対して抵抗性が否かを決定する。また、
このクローンの全細胞DNA（染色体およびプラスミド）
も精製し、HinP I制限エンドヌクレアーゼと共にインキ
ュベートする。HinP Iメチラーゼ遺伝子を担持するクロ
ーンのDNAは充分に修飾されているはずであり、プラス
ミドDNAと全DNAは両方とも消化に対して実質的または完
全に抵抗性であるはずである。
（８） ステップ（７）でHinP Iメチラーゼ遺伝子を担
持していることが確認されたクローンの細胞抽出物を調
製し、この抽出物のHinP I制限エンドヌクレアーゼ活性
を検定することによって、HinP I制限エンドヌクレアー
ゼを担持するクローンを同定する。
持していることが確認されたクローンの細胞抽出物を調
製し、この抽出物のHinP I制限エンドヌクレアーゼ活性
を検定することによって、HinP I制限エンドヌクレアー
ゼを担持するクローンを同定する。
（９） HinP I制限および修飾遺伝子を担持しているク
ローンを醗酵槽内のテトラサイクリン含有富化培地中で
増殖させることによって、HinP I制限エンドヌクレアー
ゼを生産することができる。その後、細胞を遠心して採
集し、音波処理で破砕すると、HinP I制限エンドヌクレ
アーゼ活性を含有する粗細胞抽出物が生成する。
ローンを醗酵槽内のテトラサイクリン含有富化培地中で
増殖させることによって、HinP I制限エンドヌクレアー
ゼを生産することができる。その後、細胞を遠心して採
集し、音波処理で破砕すると、HinP I制限エンドヌクレ
アーゼ活性を含有する粗細胞抽出物が生成する。
（10） HinP I制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーや
イオン交換クロマトグラフィーのように標準的なタンパ
ク質精製技術によって精製する。
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーや
イオン交換クロマトグラフィーのように標準的なタンパ
ク質精製技術によって精製する。
上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。
以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示す
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。
実 施 例 HinP I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング （１） DNAの精製： Haemophilus influenza P1（ATCC 53700）の凍結した
細胞10gを氷上で１時間解凍した後20mlの25％スクロー
ス,50mM Tris pH8.0に再懸濁させた。10mlの0.25M EDTA
pH8.0および6mlの10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH
8.0中）を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った
後、24mlの１％ Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM
EDTAおよび5mlの10％SDSを加えて溶菌させた。得られた
溶液を、（前もって0.5M Tris,pH8.0で平衡化した）フ
ェノール70mlおよびクロロホルム60mlで抽出した。得ら
れた乳濁液を10Krpmで30分遠心し、粘稠な上相を採り、
10mM Tris pH8.0,1mM EDTAに対しこれを四回交換して透
析した。次に、透析した溶液を最終濃度100μg/mlのRNa
seにより37℃で１時間消化した。次に、DNAを沈澱させ
るために、NaClを最終濃度0.4Mまで加え、0.55倍容量の
イソプロピルアルコールを重層し、相を一緒に混合する
ことによってDNAをガラス棒に巻き付けて取り出した。
このDNAを10mM Tris pH8.0,1mM EDTAに再懸濁させて４
℃で貯蔵した。
細胞10gを氷上で１時間解凍した後20mlの25％スクロー
ス,50mM Tris pH8.0に再懸濁させた。10mlの0.25M EDTA
pH8.0および6mlの10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH
8.0中）を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った
後、24mlの１％ Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM
EDTAおよび5mlの10％SDSを加えて溶菌させた。得られた
溶液を、（前もって0.5M Tris,pH8.0で平衡化した）フ
ェノール70mlおよびクロロホルム60mlで抽出した。得ら
れた乳濁液を10Krpmで30分遠心し、粘稠な上相を採り、
10mM Tris pH8.0,1mM EDTAに対しこれを四回交換して透
析した。次に、透析した溶液を最終濃度100μg/mlのRNa
seにより37℃で１時間消化した。次に、DNAを沈澱させ
るために、NaClを最終濃度0.4Mまで加え、0.55倍容量の
イソプロピルアルコールを重層し、相を一緒に混合する
ことによってDNAをガラス棒に巻き付けて取り出した。
このDNAを10mM Tris pH8.0,1mM EDTAに再懸濁させて４
℃で貯蔵した。
（２） DNAの消化： 精製DNAを、以下のようにしていろいろな程度の消化
物を得るためPst Iで開裂した。すなわち、DNA80μｇ
を、800μｇの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,50mM NaCl,
10mMメルカプトエタノール中に希釈した。得られた溶液
を200μｌの試料１個と100μｌの試料６個に分けた。最
初の200μｌのチューブに、20unitのPst Iを加えてDNA1
μｇ当たり酵素1unitとした。この最初のチューブから1
00μｌを取り出し、第２のチューブに移して0.5unit/μ
ｇとした。以下、同様にPst Iの量が前のチューブの半
分になるようにした。これらのチューブを１時間37℃に
インキュベートした後、72℃で14分後処理し、各チュー
ブから10μｌずつ取り出してアガロースゲル電気泳動で
分析した。全てのチューブの内容物を合わせて、クロー
ニング用の消化断片材料として使用した。
物を得るためPst Iで開裂した。すなわち、DNA80μｇ
を、800μｇの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,50mM NaCl,
10mMメルカプトエタノール中に希釈した。得られた溶液
を200μｌの試料１個と100μｌの試料６個に分けた。最
初の200μｌのチューブに、20unitのPst Iを加えてDNA1
μｇ当たり酵素1unitとした。この最初のチューブから1
00μｌを取り出し、第２のチューブに移して0.5unit/μ
ｇとした。以下、同様にPst Iの量が前のチューブの半
分になるようにした。これらのチューブを１時間37℃に
インキュベートした後、72℃で14分後処理し、各チュー
ブから10μｌずつ取り出してアガロースゲル電気泳動で
分析した。全てのチューブの内容物を合わせて、クロー
ニング用の消化断片材料として使用した。
（３） 連結および形質転換： Pst Iでさまざまに消化したH.influenza P1のDNA3μ
ｇ（30μｌ）を、Pst Iで開裂し脱リン酸化したpBR322
（ATCC 37017）２μｇ（20μｌ）と混合した。10μｌの
500mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5mM ATP、お
よび40μｌの滅菌蒸溜水を加えて容積を、100μｌとし
た。T4DNAリガーゼを3.4μｌ加え、得られた溶液を４時
間16℃にインキュベートした後、クロロホルム20μｌで
抽出した滅菌した。連結した混合物80μｌを、1.0mlの5
0mM NaCl,5mMクエン酸Na3,67mM CaCl2と混合し、氷冷し
たＥ．coli RR1（ATCC 31343）コンピテント細胞を2.0m
l加えた。得られた溶液を５分間42℃にインキュベート
した後、8mlのLuria−ブロス（Ｌ−broth）を添加して3
7℃で４時間インキュベーションを続行した。
ｇ（30μｌ）を、Pst Iで開裂し脱リン酸化したpBR322
（ATCC 37017）２μｇ（20μｌ）と混合した。10μｌの
500mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5mM ATP、お
よび40μｌの滅菌蒸溜水を加えて容積を、100μｌとし
た。T4DNAリガーゼを3.4μｌ加え、得られた溶液を４時
間16℃にインキュベートした後、クロロホルム20μｌで
抽出した滅菌した。連結した混合物80μｌを、1.0mlの5
0mM NaCl,5mMクエン酸Na3,67mM CaCl2と混合し、氷冷し
たＥ．coli RR1（ATCC 31343）コンピテント細胞を2.0m
l加えた。得られた溶液を５分間42℃にインキュベート
した後、8mlのLuria−ブロス（Ｌ−broth）を添加して3
7℃で４時間インキュベーションを続行した。
（４） セルライブラリー： 形質転換した細胞培養液を簡単に遠心した後、上清を
捨て、細胞を1.0mlのＬ−brothに再懸濁させた。そのう
ちの200μｌを、テトラサイクリンを30μg/ml含有するL
uria−寒天（Ｌ−agar）プレート上に接種した。このプ
レートを一晩37℃にインキュベートした後、各プレート
に2.5mlの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2を満たし、形質
転換コロニーを全部掻き集めてプールした。
捨て、細胞を1.0mlのＬ−brothに再懸濁させた。そのう
ちの200μｌを、テトラサイクリンを30μg/ml含有するL
uria−寒天（Ｌ−agar）プレート上に接種した。このプ
レートを一晩37℃にインキュベートした後、各プレート
に2.5mlの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2を満たし、形質
転換コロニーを全部掻き集めてプールした。
（５） プラスミドライブラリー： 2.5mlのセルライブラリーを、テトラサイクリンを30
μg/ml含有するＬ−broth500ml中に接種した。37℃で一
晩振盪培養した後、4000rpmで５分遠心した。上清を捨
て、細胞ペレットを10mlの25％スクロール,50mM Tris p
H8.0に室温で再懸濁させた。0.25M EDTA,pH8.0を5ml、
および10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris,pH8.0中）を3ml
加えた。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、12ml
の１％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAをピ
ペットで激しく添加し、この懸濁液に穏やかに渦を巻か
せて溶菌を誘導した。
μg/ml含有するＬ−broth500ml中に接種した。37℃で一
晩振盪培養した後、4000rpmで５分遠心した。上清を捨
て、細胞ペレットを10mlの25％スクロール,50mM Tris p
H8.0に室温で再懸濁させた。0.25M EDTA,pH8.0を5ml、
および10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris,pH8.0中）を3ml
加えた。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、12ml
の１％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAをピ
ペットで激しく添加し、この懸濁液に穏やかに渦を巻か
せて溶菌を誘導した。
溶菌した混合物を50mlのチューブに移して17000rpm,4
℃で45分間遠心した。ピレットで上清を取り出した。固
体のCsClを20.0g秤量して50mlのプラスチック製ネジブ
タ付きチューブに入れ、このチューブ中に上清22.0gを
ピレットで入れて混合した。5mg/mlのエチジウムブロミ
ド（10mMTris pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA中）を1.0ml
加えた。この溶液を、5/8 in×3inの遠心管２本に移
し、Beckman Ti70ローター中44000rpm,17℃で42時間回
転させた。プラスミドを集めるために、これらのチュー
ブを開き、紫外光を照射して２本のケイ光バンドの下側
の方を注射器で集めた。各チューブから得た下側のバン
ドを合わせ、等容量の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノー
ルで四回抽出することによってエチジウムブロミドを除
去した。
℃で45分間遠心した。ピレットで上清を取り出した。固
体のCsClを20.0g秤量して50mlのプラスチック製ネジブ
タ付きチューブに入れ、このチューブ中に上清22.0gを
ピレットで入れて混合した。5mg/mlのエチジウムブロミ
ド（10mMTris pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA中）を1.0ml
加えた。この溶液を、5/8 in×3inの遠心管２本に移
し、Beckman Ti70ローター中44000rpm,17℃で42時間回
転させた。プラスミドを集めるために、これらのチュー
ブを開き、紫外光を照射して２本のケイ光バンドの下側
の方を注射器で集めた。各チューブから得た下側のバン
ドを合わせ、等容量の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノー
ルで四回抽出することによってエチジウムブロミドを除
去した。
抽出された溶液を、10mM Tris pH7.5,1mM EDTAを四回
交換しながらこの液に対して透析した後、２倍容量のイ
ソプロパノールと最終濃度が0.4Mとなるのに充分な5M N
aClを添加して核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩
−20℃で保存した後15000rpm,0℃で15分遠心した。上清
を捨て、ペレットを15分間風乾した後、500μｌの10mM
Tris pH7.5,1mM EDTAに溶かして−20℃で貯蔵した。プ
ラスミドDNAの濃度は約100μg/mlであった。
交換しながらこの液に対して透析した後、２倍容量のイ
ソプロパノールと最終濃度が0.4Mとなるのに充分な5M N
aClを添加して核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩
−20℃で保存した後15000rpm,0℃で15分遠心した。上清
を捨て、ペレットを15分間風乾した後、500μｌの10mM
Tris pH7.5,1mM EDTAに溶かして−20℃で貯蔵した。プ
ラスミドDNAの濃度は約100μg/mlであった。
（６） プラスミドライブラリーの消化： プラスミドライブラリーをHinP I制限エンドヌクレア
ーゼ消化用緩衝液（50mM Tris pH7.5,5mM MaCl2:0.5mM
ジチオトレイトール）中で30μg/mlに希釈した。HinP I
制限エンドヌクレアーゼを加えてDNA1μｇに付き3.2uni
tの濃度とし、チューブを１時間37℃にインキュベート
した。12分間72℃に加熱して反応を停止させた。
ーゼ消化用緩衝液（50mM Tris pH7.5,5mM MaCl2:0.5mM
ジチオトレイトール）中で30μg/mlに希釈した。HinP I
制限エンドヌクレアーゼを加えてDNA1μｇに付き3.2uni
tの濃度とし、チューブを１時間37℃にインキュベート
した。12分間72℃に加熱して反応を停止させた。
（７） 形質転換： 12.5μｌの消化したライブラリーをＥ．coli RR1株に
形質転換し、テトラサイクリンを30μg/ml含有するＬ−
agarプレートに接種して一晩37℃にインキュベートした
（上記第３項および第４項）。HinP I消化によって、未
消化のプラスミドによる形質転換の場合と比較して形質
転換体の数は約1/103に減少した。29個のコロニーを個
別に採り、それぞれ、30μg/mlのテトラサイクリンを含
有するプレートと、100μg/mlのアンピシリンを含有す
るプレートの２つのプレート上に画線して断片が組み込
まれているアンピシリン感受性のクローンを同定した。
29個のコロニーのうち14個がアンピシリン感受性である
ことが判明したので、各々を10mlのテトラサイクリン含
有Ｌ−broth中に接種してミニカルチャー（小培養物）
を調製し、テトラサイクリンを含有するＬ−agarプレー
ト上に画線してマスターストックを調製した。
形質転換し、テトラサイクリンを30μg/ml含有するＬ−
agarプレートに接種して一晩37℃にインキュベートした
（上記第３項および第４項）。HinP I消化によって、未
消化のプラスミドによる形質転換の場合と比較して形質
転換体の数は約1/103に減少した。29個のコロニーを個
別に採り、それぞれ、30μg/mlのテトラサイクリンを含
有するプレートと、100μg/mlのアンピシリンを含有す
るプレートの２つのプレート上に画線して断片が組み込
まれているアンピシリン感受性のクローンを同定した。
29個のコロニーのうち14個がアンピシリン感受性である
ことが判明したので、各々を10mlのテトラサイクリン含
有Ｌ−broth中に接種してミニカルチャー（小培養物）
を調製し、テトラサイクリンを含有するＬ−agarプレー
ト上に画線してマスターストックを調製した。
（８） 生き残った固体の解析： 上記第７項に記載した14個のテトラサイクリン耐性で
アンピシリン感受性のコロニーを10mlになるまで増殖さ
せ、これらが担持するプラスミドを、Birnboin and Dol
y,Nucleic Acids Res.,7:1513（1979）の方法を応用し
た以下のminiprep精製法によって調製した。
アンピシリン感受性のコロニーを10mlになるまで増殖さ
せ、これらが担持するプラスミドを、Birnboin and Dol
y,Nucleic Acids Res.,7:1513（1979）の方法を応用し
た以下のminiprep精製法によって調製した。
miniprep法： 各培養物を8000rpmで５分間遠心し、上清を捨てて得
られた細胞ペレットを、1mg/mlリゾチームを含有する1.
0mlの25mM Tris,10mM EDTA,50mMグルコース,pH8.0中に
再懸濁させた。室温に10分間置いた後、各チューブに2.
0mlの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを振盪して細
胞を溶解し、次いで氷上に置いた。溶液が透明になって
から各々3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を1.5mlずつ加えて
振盪した。生じた沈澱を15000rpm,4℃で10分間遠心して
沈ませた。得られた上清を各々、イソプロパノールを3m
l含有する遠心管に流し入れて混合した。室温で10分経
った後遠心管を1500rpmで10分間遠心して沈澱した核酸
をペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で30分
風乾した。乾燥した後ペレットを850μｌの10mM Tris,1
mM EDTA,pH8.0に再懸濁させた。5M NaClを75μｌずつ加
え、得られた溶液を、575μｌのイソプロパノールを含
有するEppendorfチューブに移し、室温で10分かけて再
度沈澱させた。次に、チューブをmicrofuge中で45秒間
回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレッ
トを、次いで、RNaseを100μg/ml含有する500μｌの10m
M Tris,1mM EDTA,pH8.0に溶解し、１時間37℃にインキ
ュベートしてRNAを消化した。50μｌの5M NaCl、次いで
350μｌのイソプロパノールを添加してDNAをもう一度沈
澱させた。室温で10分後、45秒間遠心してDNAを沈ま
せ、上清を捨て、得られたペレッを150μｌの10mM Tri
s,1mM EDTA,pH8.0に再溶解した。次いで、プラスミドmi
niperp（小調製物）をHinP IとPst Iで消化して解析し
た。
られた細胞ペレットを、1mg/mlリゾチームを含有する1.
0mlの25mM Tris,10mM EDTA,50mMグルコース,pH8.0中に
再懸濁させた。室温に10分間置いた後、各チューブに2.
0mlの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを振盪して細
胞を溶解し、次いで氷上に置いた。溶液が透明になって
から各々3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を1.5mlずつ加えて
振盪した。生じた沈澱を15000rpm,4℃で10分間遠心して
沈ませた。得られた上清を各々、イソプロパノールを3m
l含有する遠心管に流し入れて混合した。室温で10分経
った後遠心管を1500rpmで10分間遠心して沈澱した核酸
をペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で30分
風乾した。乾燥した後ペレットを850μｌの10mM Tris,1
mM EDTA,pH8.0に再懸濁させた。5M NaClを75μｌずつ加
え、得られた溶液を、575μｌのイソプロパノールを含
有するEppendorfチューブに移し、室温で10分かけて再
度沈澱させた。次に、チューブをmicrofuge中で45秒間
回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレッ
トを、次いで、RNaseを100μg/ml含有する500μｌの10m
M Tris,1mM EDTA,pH8.0に溶解し、１時間37℃にインキ
ュベートしてRNAを消化した。50μｌの5M NaCl、次いで
350μｌのイソプロパノールを添加してDNAをもう一度沈
澱させた。室温で10分後、45秒間遠心してDNAを沈ま
せ、上清を捨て、得られたペレッを150μｌの10mM Tri
s,1mM EDTA,pH8.0に再溶解した。次いで、プラスミドmi
niperp（小調製物）をHinP IとPst Iで消化して解析し
た。
（９） HinP Iメチラーゼ遺伝子クローン： 解析した14個のプラスミドのうち12個が、HinP Iに対
して感受性でありH.influenza P1のDNAのさまざまな断
片を担持していることが判明した。これらのプラスミド
はにせものであるので捨てた。残りの２個のプラスミド
は、HinP Iに対して耐性であり、4.6kbと1.5kbの長さの
２個のPst I断片を担持していることが判明した（第２
図）。これらのプラスミドは同一であるように思われ
た。これらをpJB124RM4−11およびpJB124RM4−20と命名
した。これらは両方ともHinP I修飾メチラーゼ遺伝子を
担持しているばかりでなく、HinP I制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子も担持していることが示された。
して感受性でありH.influenza P1のDNAのさまざまな断
片を担持していることが判明した。これらのプラスミド
はにせものであるので捨てた。残りの２個のプラスミド
は、HinP Iに対して耐性であり、4.6kbと1.5kbの長さの
２個のPst I断片を担持していることが判明した（第２
図）。これらのプラスミドは同一であるように思われ
た。これらをpJB124RM4−11およびpJB124RM4−20と命名
した。これらは両方ともHinP I修飾メチラーゼ遺伝子を
担持しているばかりでなく、HinP I制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子も担持していることが示された。
（10） HinP I制限遺伝子クローン： pJB124RM4−11およびpJB124RM4−20は、これらのプラ
スミドを担持しているＥ．coli RR1から調製した抽出物
を検定することにより、HinP I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を担持していることが判明した。
スミドを担持しているＥ．coli RR1から調製した抽出物
を検定することにより、HinP I制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を担持していることが判明した。
細胞抽出物を調製するために、この培養物50mlを、30
μg/mlテトラサイクリンを含有するＬ−broth中37℃で
一晩増殖させた。この細胞を4Krpmで５分間遠心してペ
レット化し、上清を捨てて得られたぺレットを3mlの音
波処理用緩衝液（10mM Tris pH8.0,10mMメルカプトエタ
ノール,0.1mM EDTA中に再懸濁させた。再懸濁後10mg/ml
のリゾチームを含有する音波処理用緩衝液を0.3ml加え
た。得られた懸濁液をかき混ぜ、３時間氷上に放置し
た。この懸濁液を−20℃で一晩凍結した。凍結した懸濁
液を氷上で解凍し1mlをeppendorfチューブに移した。、
１％Triton X−100を５μｌ加えて最終濃度を0.005％と
し、よく混合した。得られた混合物を４℃で10分間軽く
遠心し、上清を細胞抽出物として使用した。
μg/mlテトラサイクリンを含有するＬ−broth中37℃で
一晩増殖させた。この細胞を4Krpmで５分間遠心してペ
レット化し、上清を捨てて得られたぺレットを3mlの音
波処理用緩衝液（10mM Tris pH8.0,10mMメルカプトエタ
ノール,0.1mM EDTA中に再懸濁させた。再懸濁後10mg/ml
のリゾチームを含有する音波処理用緩衝液を0.3ml加え
た。得られた懸濁液をかき混ぜ、３時間氷上に放置し
た。この懸濁液を−20℃で一晩凍結した。凍結した懸濁
液を氷上で解凍し1mlをeppendorfチューブに移した。、
１％Triton X−100を５μｌ加えて最終濃度を0.005％と
し、よく混合した。得られた混合物を４℃で10分間軽く
遠心し、上清を細胞抽出物として使用した。
線状のpUC19DNA25μｇ、500μｌのHinP I制限エンド
ヌクレアーゼ消化用緩衝液（上記第６項）中に希釈し
た。この溶液を４本のチューブに、最初の１本には150
μｌ、残りの３本には102.5μｌずつ分注した。最初の
チューブに細胞抽出物7.5μｌを入れて混合した。最初
のチューブから47.5μｌを取り出して第二のチューブに
移して混合した。このようにして、最初のチューブはDN
A1μｇ当たり抽出物１μｌ、第２のチューブは0.3μl/
μｇ、第３のチューブは0.1μl/μｇ、および第４のチ
ューブは0.03μl/μｇとした。各々100μｌずつ含有す
るこれらのチューブを１時間37℃にインキュベートした
後、各チューブのサンプル20μｌをゲル電気泳動によっ
て分析した。この抽出物の力価は、1mlに付き約1000uni
tのHinP I制限エンドヌクレアーゼであることが判明し
た。これは、湿潤細胞ペースト1g当たり約１×104unit
に相当する（第３図）。
ヌクレアーゼ消化用緩衝液（上記第６項）中に希釈し
た。この溶液を４本のチューブに、最初の１本には150
μｌ、残りの３本には102.5μｌずつ分注した。最初の
チューブに細胞抽出物7.5μｌを入れて混合した。最初
のチューブから47.5μｌを取り出して第二のチューブに
移して混合した。このようにして、最初のチューブはDN
A1μｇ当たり抽出物１μｌ、第２のチューブは0.3μl/
μｇ、第３のチューブは0.1μl/μｇ、および第４のチ
ューブは0.03μl/μｇとした。各々100μｌずつ含有す
るこれらのチューブを１時間37℃にインキュベートした
後、各チューブのサンプル20μｌをゲル電気泳動によっ
て分析した。この抽出物の力価は、1mlに付き約1000uni
tのHinP I制限エンドヌクレアーゼであることが判明し
た。これは、湿潤細胞ペースト1g当たり約１×104unit
に相当する（第３図）。
第１図は、HinP I制限エンドヌクレアーゼをクローニン
グおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、HinP I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼをコードしているH.influenza P1のDNAの6.1Kb
Pst Iマルチフラグメント（大断片）の制限地図であ
り、この断片をpBR322（ATCC 37017）のPst I部位に挿
入してpJB124RM4−11およびpJB124RM4−20を創作した。 第３図は、pJB124RM4−11およびpJB124RM4−20を担持す
るE.coli RR1（ATCC 31343）の粗抽出物中のHinP I制限
エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真で
ある。
グおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、HinP I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼをコードしているH.influenza P1のDNAの6.1Kb
Pst Iマルチフラグメント（大断片）の制限地図であ
り、この断片をpBR322（ATCC 37017）のPst I部位に挿
入してpJB124RM4−11およびpJB124RM4−20を創作した。 第３図は、pJB124RM4−11およびpJB124RM4−20を担持す
るE.coli RR1（ATCC 31343）の粗抽出物中のHinP I制限
エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】DNA配列GCGCを認識して最初のＧとＣの間
で開裂する、ヘモフィラス・インフルエンザPI（Haemop
hilus influenza PI）由来のHinP I制限エンドヌクレア
ーゼをコードし、以下に示すような制限部位を有する、
単離されたDNAセグメント。 - 【請求項２】請求項１に記載の単離されたDNAセグメン
トが挿入されているクローニングベクター。 - 【請求項３】請求項２に記載のベクターにより形質転換
された原核生物宿主細胞。 - 【請求項４】請求項２に記載のベクターにより形質転換
された原核生物宿主細胞を下記エンドヌクレアーゼを発
現する条件下で培養することを特徴とする、DNA配列GCG
Cを認識して最初のＧとＣの間で開裂する、ヘモフィラ
ス・インフルエンザPI（Haemophilus influenza PI）由
来のHinP I制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US134,235 | 1987-12-17 | ||
| US07/134,235 US4983522A (en) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | Method for producing the HinPI restriction endonuclease and methylase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022369A JPH022369A (ja) | 1990-01-08 |
| JP2761227B2 true JP2761227B2 (ja) | 1998-06-04 |
Family
ID=22462385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63317574A Expired - Lifetime JP2761227B2 (ja) | 1987-12-17 | 1988-12-15 | ＨｉｎＰＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4983522A (ja) |
| EP (1) | EP0321269B1 (ja) |
| JP (1) | JP2761227B2 (ja) |
| AT (1) | ATE106448T1 (ja) |
| DE (1) | DE3889884T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| US5731185A (en) * | 1995-07-21 | 1998-03-24 | New England Biolabs, Inc. | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| EP2562252A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-02-27 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CA2684923C (en) | 2007-05-02 | 2015-01-06 | Merial Limited | Dna plasmids having improved expression and stability |
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| EP0618296B1 (en) * | 1986-06-06 | 1996-10-09 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning restriction modification systems |
-
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- 1987-12-17 US US07/134,235 patent/US4983522A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-15 JP JP63317574A patent/JP2761227B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-16 DE DE3889884T patent/DE3889884T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-16 AT AT88311920T patent/ATE106448T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-16 EP EP88311920A patent/EP0321269B1/en not_active Expired - Lifetime
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| EP0321269A3 (en) | 1990-03-21 |
| DE3889884D1 (de) | 1994-07-07 |
| ATE106448T1 (de) | 1994-06-15 |
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| EP0321269B1 (en) | 1994-06-01 |
| DE3889884T2 (de) | 1995-01-05 |
| JPH022369A (ja) | 1990-01-08 |
| US4983522A (en) | 1991-01-08 |
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| ENDONUCLEASE | Barsomian et al. | |
| ENDONUCLEASE | Looney et al.[45] Date of Patent: Mar. 12, 1991 |
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