JPS6356292A - 組換えｄｎａ分子の製造方法 - Google Patents

組換えｄｎａ分子の製造方法

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JPS6356292A
JPS6356292A JP62112630A JP11263087A JPS6356292A JP S6356292 A JPS6356292 A JP S6356292A JP 62112630 A JP62112630 A JP 62112630A JP 11263087 A JP11263087 A JP 11263087A JP S6356292 A JPS6356292 A JP S6356292A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 組換えＤＮＡ分子およびそれにより変異されてＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＨＢＶ抗原性を示す少
なくとも７種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子
を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えＤＮ
Ａ分子は、ＨＢＶ抗原性を特徴とする遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれら
の使用と、人間におけるＨＢＶビールス感染を検出して
この感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能に
する。
本発明は、組換えＤＮＡ分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現される組換えＤＮＡ分子に関するもの
である。本明細書中に開示する組換えＤＮＡ分子は、肝
炎Ｂビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコー
ド化するＤＮＡが特徴である。以下の記載から了解され
るよって、組換えＤＮＡ分子は、人間における肝炎Ｂビ
ールスの検出およびこのビールスに対する人間における
抗体の刺戟のために使用することができる。
肝炎Ｂすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人間
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Ｂビールス
（ｒＨＢＶＪ　）感染は蔓延している。英国、米国およ
び西欧において、全供血者の約０．　／％はＨＢＶの慢
性保菌者である。
ビールス性肝炎による死亡率は高くないが（英国におい
て／り７ｊ年には１００万六当シ３人であった）、英国
における人口の５％および米国における人口の７３％と
いう多くが感染していると示されている。多くのアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の２０％までがＨ
ＢＶの慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の
５０％以上がＨＢＶに感染したかまたは感染している。
肝炎の感染は、３つの一般的機作によって伝染される。
すなわち、（１）輸血におけるような多量で゛または事
故による皮膚刺通を介するような少量で、感染された血
液もしくは体液が非経口的（で接種されることによるも
の、（２）近親または***渉によるもの、および（３）
妊娠中に感染した母親が新生児にビールスを移すことに
よるものである。自然条件下では、ＨＢＶは大して感染
性の高いものでない。呼吸による伝染は、あったとして
も稀である。
大抵のＨＢＶ感染は準臨床的のものである。
臨床的疾病は通常３〜６週間続き、疾病度において軟度
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なＨＢＶ感染からの回復
は通常完全でちる。
しかしながら、成る場合には重度の長期結果が生ずる。
（１）急性感染の約ｊ％は肝炎Ｂビールス抗原の慢性保
有者であり、他人知対する１感染潜在力を継続して有す
ると共に肝臓損傷を進行させておシ、また（２）　ＨＢ
　Ｖによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および
第−期肝臓癌というＨＢＶ−血清陰性例の相当な割合を
開始させる完全なまたは部分的な原因となシうる。
分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成熟
核蛋白質をコード化するＤＮＡを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成によシ製造したも
の以外のＤＮＡを用いる場合、組換えＤＮＡ分子の構成
は、所望の蛋白質に対する精製メツセンジャー（ｍＲＮ
Ａ）雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃ　ＤＮＡ　）を生成
させ、このｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換し、このＤＮ
Ａを適当なりローン用ベヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈ
ｉｃｌｅ　）における適当な部位に結合させそしてその
組換えＤＮＡ分子によシ適当な宿主を変異させる手順か
らなっている。このような変異により、宿主は所望の蛋
白質を生産することが可能になる。さらに、少なくとも
オバルブミンＤＮＡの場合、強力な細苗促進子または表
現調節順序Ｇて対する特定ＤＮＡの適当な融合は、よ９
大量の所望オパルプミン蛋白質、すなわち大腸菌（Ｅ、
　ｃｏｌｉ　）細胞の全蛋白質の約０．　ｊ　、　／％
を生成させることが知られている（オー・メルセローー
プイジャロン等、「組換えプラスミドを有するイー・コ
リに／２によるオバルブミン状蛋白質の合成」、ネーチ
ャー誌第２７ｊ巻第！Ｏ！〜よ７０頁（／り７♂）なら
びにティー・エッチ働フレーザーおよびビー・ジエー拳
ブルース、「雛鳥オバルプミンはイー・コリにより合成
かつ分泌される」、プロシープインク・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７ｊ巻、第５
２３乙〜！り≠Ｏ頁（ｌり７♂））。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えＤＮＡ技
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白質（エル・グイラーコマ
ロフＬ　　ｒプロインシュリンを合成する細菌クローン
」、プロシーテイング・ナショナル・アカデミ−・サイ
エンス、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、第７３巻、第３７２７〜３
７３／Ｊｊ（／Ｆ７ｒ））、ラッテの成長ホルモン（ピ
ー・エッチ・シーブルク等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネーチャー誌、第２７’　巻、第７２よ〜７
り２頁（／り”））ｓねずみのジヒドロフオレートレダ
クターゼ（ニー・シー・ワイ・チャンク等、「ねずみの
ジヒドロフオレートレダクターゼをコード化するＤＮＡ
順序のイー・コリにおける表現型式」、ネーチャー誌、
第２７ｊ巻、第６／７〜６２≠頁（ｌり７ｇ））、ソマ
トスタチン（ケー・イタクラ等、「ンマトスタチンホル
モンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリにおけ
る表現」、サイエンス誌、第１９を巻、第１０３４〜１
０６３頁（／り７７）、ならびに英国特許第２，００７
，６７ｊＡ号、第２００Ｚｔ７ｔＡ号および第シ００１
，７２３Ａ号明細書およびそれらの他国出頭）、および
ひとインシュリンのＡおよびＢポリペプチド鎖（ディー
・ヴイー・ゲデル等、［ひとインシュリンに対する化学
合成された遺伝子のイー・コリにおける表現」、グロシ
ーデイング壷ナショナル令アカデミ−・サイエンス、Ｕ
、Ｓ、Ａ、、第７６巻、第７０６〜／１０頁（／り７り
）および上記英国特許明細書）が包含される。
しかしながら、本発明とは異なり、上記のものはいずれ
もたとえば肝炎Ｂビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えＤＮＡ合成に向けられていない。
ＨＢＶ感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、ＨＢＶ感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。
しかしながら、肝炎Ｂビールスの抗原に対する人工的刺
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Ｂビールスによる実験的感染は、その他
二三の学長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。この限られ
た宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビールス
とその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感染
抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げている
。
抗体を発生させまた感染を検知するため、ＨＢＶ感染の
犠牲者から単離された真正）（ＢＹビールス抗原を使用
する試みが幾つかなさ几たが、これらの処置は活性様の
供給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、
これら抗原を得るため人間を原材料として使用すること
は、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題の
ため好ましくない。
本発明は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えＤＮＡ分子を本発明
によシ提供して上記の諸問題を解決する。
本発明によれば、ワクチン製造のためならびにビールス
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、ＨＢＶ抗原および遺伝子を汚染されていない
かなりの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養シてお
ける繁殖不能のため、従来入手できなかった。
以下の記載から判るように、本発明の組換えＤＮＡ分子
は、適当な宿主において、ＨＢＶ抗原性を示す少なくと
も７種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化
する構造遺伝子を生成させると七ができる。これら組換
えＤＮＡ分子と宿主とを用いて、ＨＢＶ抗原性を示すポ
リペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺
伝子とを製造することができる。これら生産物はまた同
定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成されたまま
の状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、
これら生産物自身の製造を改善する組成物および方法に
使用でき、またＨＢＶ感染を検知し、その病理学を追跡
しかつ人間におけるＨＢＶ抗体の生産を刺戟する組成物
および方法に使用することができる。
さらに本発明によれ（ケ、ディン粒子（Ｄａｎｅｐａｒ
Ｌｉｃｌｅ　）の内生ＤＮＡから調製されたＤＮＡ順序
をディン粒子以外の材料源から調製された他のＤＮＡ順
序に結合させることを特徴とする、組換えＤＮＡ分子の
製造方法が提供される。
本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区別
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
ＤＮＡ分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはＤＮＡを使用しない。その代シとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはｃＤＮＡ順
序を作シ出すため供与体細胞から単離されたｍＲＮＡを
酵素的に転写することによシ作られた人工遺伝子のいず
れかを使用する。
蛋白質の組換えＤＮＡ合成において天然ＤＮＡが従来直
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然ＤＮＡおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が［イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ　）　Ｊすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。
これらイントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形
成しない。寧ろ、それらは高等生物に訃いて一次転写生
成物如作用する特殊処理酵素ＩＣより生体内で除去され
て遺伝子の最終的メツセンジャー（ｍ　ＲＮ　Ａ　）　
ｔ−与える。細菌はこのようなイントロンを処理するの
に使用できないと思われ、したがって天然ＤＮＡは細菌
宿主において表現することが期待されずまた所望の蛋白
質はこれら宿主によシ生産することが期待されないであ
ろう。
第１図は、ディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図で
ある。これは２本の補完的ＤＮＡ鎖すなわちストランド
ａとｂとを示し、さらにストランドａにおける割目とス
トランドｂにおける間隙とを示すと共にこの間隙がＤＮ
Ａポリメラーゼ反応により閉鎖されることを示している
。
第２図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であシ、
ディン粒子から単離された内生ＤＮＡの断片は犬腸苗（
イー・コリ）ベニンリナーゼ遺伝子に対しフラズミドｐ
ＢＲ３２−２上のＰｓＬ１部位に融合される。イー・コ
リＨＢ／Ｑ／に変異した後、組換えＤＮＡ分子バフＲＪ
２２−ＰｓＬｌ　ｄＧ　：　ＨＢＶ−Ｋｐｎ　ｌ　ｄＣ
（ｄ　ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドの合成に向けら
れる。
第３〜り図は、本発明によシ肝炎Ｂビールスゲノムの一
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された３つの読み枠における停
止コドンによシ示される。本発明で決定されたＨＢｃＡ
ｇをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−！θ〜−ｌ
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。
ヌクレオチット／〜よりりは肝炎Ｂビールス核抗原をコ
ード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、こ
の抗原のアミノ酸順序（読み枠ｌ）はその順序の上部に
示される。ヌクレオチットｌ弘３７〜２／／≠は肝炎Ｂ
す゛−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオ
チット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序（読み枠３
）はその順序の上部に示される。これら遺伝子における
各種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位についても第３
〜夕図に示される。
第７０図は、本発明方法の略説明図であシ、ここで肝炎
Ｂビールス核抗／ｉ！を示すポリペプチドを生産するこ
とのできる組換えＤＮＡ分子は断片化され、この断片は
改善された表現制御順序、すなわち結糸に付加される。
第１１図は、本発明方法の略説明図であり、ここで本発
明の組換えＤＮＡ分子は断片化されかつ７アージＤＮＡ
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よシその中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。
第１２図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であシ
、ここで肝炎Ｂビールス核↑堵社ヲ示すポリペプチドを
生産しない本発明の組換えＤＮＡ分子は断片化されてＨ
ＢｓＡｇに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝
子を使用して組換えＤＮＡ分子を生成させ、それにより
適当な宿主においてＨＢｓＡｉ（を生産する。
本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。
以下の記載において、下記の用語を使用する。
ヌクレオチツド：：＃Ｍ部分（ペントース）ト燐酸部分
と窒素系複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの
単量体単位。この塩基はグリコシド炭素（ぺ／ドースの
ｌ′炭素）を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結
合物はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特
性化する。弘種のＤＮＡ塩基はアデニン（”Ａ”）、ク
アニン（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミンじ
Ｔ”）である。≠種のＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウ
ラシル（“Ｕ”）である。　　　゛ＤＮＡ順序：隣接す
るペントースの３′炭素と！′炭素との間のホスホジエ
ステル結合によシ互いに結合されたヌクレオチットの線
状系列。
コドン：　　ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳終了信号をコード化する３種のヌクレオチッ
ト（トリプレット）のＤＮＡ順序。
たとえば、ヌクレオチントトリプレットＴＴＡ。
ＴＴＧ％ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧ　はアミ
ノ酸ロイ７ン（”Ｌｅｕ“）をコード化し、ＴＡＧ、Ｔ
ＡＡ＞よびＴＧＡは翻訳停止信号であシ、ＡＴＧは翻訳
開始信号である。
読み忰：ｍＲＮＡをアミノ酸順序に翻訳する際のコドン
のグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持されねば
ならない。たとえば、順序ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ　
　を３つの読み枠もしくは相において翻訳することがで
き、その各々は異なるアミノ酸順序を与える。すなわち
、ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミン基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によシ互いに結合され
たアミノ酸の線状系列。
ゲノム：物質の全ＤＮＡ　０これは特に物質のポリペプ
チドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進
子およびたとえはシャインータ゛ルカ゛ルノｌ頃序のよ
うな順序を含むリホ゛ソーム拮合および相互作用順序を
包含する。
構造遺伝子：雛型またはメツセンジャーＲＮＡ（”ｍＲ
ＮＡ”）を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するＤＮＡ順序。
転　写：構造遺伝子からｍ　ＲＮ　Ａを生成させる過程
。
翻　訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成させる過程。
表　現：構造遺伝子によシポリベプチドを生成させるた
めに受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモンー
ム二重鎖ＤＮＡ順序であシ、これによシブラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐
性（Ｔｅｔ）についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに敏感であった細胞をこれに対し
抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異され
た細胞を「変具体（トランスホーマンＩ−）Ｊと呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：細胞性ビールスで
あシ、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化でれたＤＮＡ順序を有する。
単細胞生物において、ファージは「トランスフェクショ
ン」と呼ばｒシ８工程によシ再現する。
クローン用ベヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ　
）　：宿主細胞中で再現しうるプラスミド、ファージＤ
ＮＡ−１たはその他のＤＮＡ順序であシ、これは７個ま
たは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、こ
の部位においてこのＤＮＡ順序はＤＮＡの本質的な生物
学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成の喪失
または促進子もしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可
能に切断され、またこの部位は変異細胞の同定（たとえ
ばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）Ｋ使
用するのに適する印しを含有する。クローン用ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化（ｃｌｏｎｉｎｇ）　：　　無性繁殖の過程
オチツド項序からなる混成りＮＡ屓序であり、第一〇頭
片は天然において第二の順序と一緒ｌて調整するヌクレ
オチットのＤＮＡ順序。
次に、第１図を参照すれば、ディン粒子の内生ＤＮＡの
略図が示されている。ディン粒子は、肝炎Ｂビールス感
染した患者の血漿中に検出される（ディー・ニス・ディ
ンおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原江関する肝炎を持った患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセット誌、第１巻、第６り！〜乙り２
号（／り７０））。　この粒子は、肝炎Ｂの感染性ビー
ルス単位（ｖｉｒｉｏｎ　）と同一または密接に関連す
ると考えられる。その大きさは知られているが（直径弘
２ナノメータ）、その構造は充分には理解されていない
。一般に、ディン粒子は外１層と内核とからなると信じ
られる。粒子の外層は一般に、肝炎８表面抗原（”ＨＢ
ｓＡｇ”）として知られるポリペプチドを含有する。内
核（直径２７ナノメータ）ハ第二のポリペプチドすなわ
ち肝炎Ｂ核抗原（“’ＨＢｃＡｇ”）ならびに、２．／
　Ｘ　／　０６ダルトンの内生二重鎖の円形ＤＮＡ分子
を含有し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有
する。第三のポリペプチド、すなわちｅ”抗原（”ＨＢ
ｅＡｇ”）もディ／粒子に関係する。さらに、ディン粒
子は内生ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを含むと信
じられ、これはそのＤＮＡをプライマ／雛型として用い
るポリメラーゼ反応によシ内生ＤＮＡ中の単一ストラン
ド間隙を閉鎖する。ディン粒子、さらに詳しくはそのＤ
ＮＡの構造および性質は幾つかの分析の主題である（た
とえばダブリュー・ニスΦロビンンン、ｒ肝炎Ｂビール
スのゲノム」、アニュアル争しビューＱオフ゛・マイク
ロバイオロジー、第３１巻第３！７〜３７７頁（／り７
７））。
しかしながら、各種の抗原またはその遺伝子の実際の構
造はまだ決定されていない。
ディン粒子の内生ＤＮＡは、抽出によりディン粒子から
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの７本のヌクレオチソド鎖（第
１図、ストランドａ、〜３０００ヌクレオチット）と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチソド鎖（第１
図、ストランド５１〜２０００ヌクレオチツト）とから
１つている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であり、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合によ）標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第１図に見られる。
ディン粒子のＤＮＡポリメラーゼは、内生ＤＮＡの第二
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することによｊ）種々の間隙を、
第一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌ
クレオチットで埋めて約３０００ヌクレオチツト対の二
重鎖Ｄ　Ｎ　Ａを与え６と忠われる。
肝炎ＢビールスＤＮＡの調製方法 単一のＨＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血
清型ａｄｙｍ　）　　からのひと血清を等容量のＰＨ７
≠の緩衝液（０，／　Ｍ　）リス−ＨＣｌ％　０．１Ｍ
塩水（ＮａＣ１）、Ｑ、　／％の２−メルカプトエタノ
ール、０．１％子牛血清アルブミン、ただしチは木切細
書中全てＷ／Ｖ　％とする、および０．００／ＭのＥＤ
ＴＡ）で希釈した。これを＜ｚ’（、にて３ｊ０００　
ｒｐｍで２時間遠心分離した。かく得られたベレットを
２００μ）の同じ緩衝液に再懸濁させ、２０％の蔗糖を
含有する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を弘℃にて
弘Ｑ、０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。かぐ得られ
たベレットを再びｉｏｏμｌのＰＨ７ｚの緩衝液（０，
／　Ｍ　）リスーＨＣ１１０１Ｍ塩水）に再懸濁させた
。
次いで、得られたＤＮＡ含有のベレットを３Ｈまたは３
２ｐでラベルしくビー嘩エム・カブラン等、「ひと肝炎
Ｂ抗原に関係するＤＮＡポリメラーゼ」、ジャーナル・
ヴイロロジー、第１２巻第タタ！〜１００！頁（ｌり７
３））で、後の過程における追跡を容易てした。このラ
ベル化は、濃厚ディン粒子と　Ｈ−もしくは　Ｐ−ラベ
ルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェ−）（ｄＮ
ＴＰ）との３７℃における≠時間の反応によシ得られる
。このＤＮＡポリメラーゼ反応の後、ＤＮＡ中の単一ス
トランド間隙は部分的に閉鎖され（第１図参照）、ラベ
ル化された材料を蔗糖３０％含有の遠沈管の頂部に層化
させ、≠℃にて弘ＱＯＯＯｒｐｍで３．！時間遠心分離
した。
次いで、ＤＮＡを得られたベレットからフェノールによ
シ抽出した（エル・アイ・ルトウイツクおよびダブリュ
ー・ニス・ロビンンン、「肝炎Ｂディン粒子ＤＮＡポリ
メラーゼ反応で合成されるＤＮＡＪ、　ジャーナル・ヴ
イロロジー、第２７巻第７６〜１０≠頁（／り７７）の
手順を使用）。次いで、抽出されたＤＮＡを００７Ｍト
リス−ＨＣｌ％Ｑ、００／ＭのＥＤＴＡの溶液（ｐＨｒ
、　ｏ　）で透析してフェノール溶すを除去した。かく
して単離されたＤＮＡは制置酵素消化に対して準備でき
た。これは〜／　０８ｃｐｍ／μｙの比放射活性を示し
た。上記した方法を概略第２図に示す。
上記のように単離した二重鎖ＤＮＡを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。
たとえば、有用なりローン用ペヒクルハクロモソーム系
、非りロモソーム系および合成のＤＮＡ項序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド（たとえばｐＢＲｊ　２２、
その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体）
、および広宿主範囲のプラスミド（たとえばＲＰ弘）、
ファージＤＮＡたとえば多種のファージλの誘導体（た
とえばＮ　Ｍ　Ｉタタ）、およびプラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえば
ファージＤＮＡ表現制御順序を使用するよう改変したプ
ラスミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイ
ー・コＩＪＸ／７７Ａ、イーーコリＸλ２ｒノ、イー−
コリＨＢ　／　０　／およびイー・コリＭＲＣ／　およ
びシュードモナス、バチルス・ズブチリスおよびその他
細菌の菌株、酵母薗およびその細菌類、動物または植物
宿主（たとえば培養動物もしくは植物細胞）、およびそ
の他宿主を包含する。勿論、全ての宿主が同等の効果を
もつものではない。宿主−クローン用ベヒクル組合せ物
の特定の選択は、本発明の範囲から逸脱することなく上
記の原理を正当て考慮して当業者が行なうことができる
。
さらに１各特定ベクター中には、単離された二重鎖ＤＮ
Ａを挿入するため種々な部位を選択することができる。
通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、ｐ
ＢＲＪ、ｌ！λにおいては、Ｐｓｔ　／部位はペニシリ
ナーゼ遺伝子中におけるベニシリナーゼ蛋白のアミノ酸
／♂／および／♂２をコード化する。ヌクレオチソドト
リプレソトの間に位置する。この部位は、ラッテプロイ
ンツユリン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のビラー
コマロフ等により用いられた。Ｈｉｎｄ　ｌｌエンドヌ
クレアーゼ識別部位は、アミノ酸１０／および１０−２
をコード化するトリプレットの間に存在し、　Ｔａｇ部
位はｐＢＲ３２２におけるその蛋白のアミノ酸≠５をコ
ード化するトリプレットに存在する。同様に、このプラ
スミドに対するＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ識別部
位は、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに
対する耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この
部位は、イタクラ等およびゲデル等によシ、上記した組
換、えＤＮＡ合成法において使用された。第２図および
第１１図は、例示の目的でプラスミドｐＢＲＪ２−２お
よびファージλＮＭりｇりにおける幾つかの制限部位を
示している。
選択ＤＮＡ断片をクローン用ベヒクル中に挿入して組換
えＤ　Ｎ　Ａ分子を生成させるため選択される特定部位
は種々の因子番でより決定される。
これらは表現すべきポリペプチドの寸法および構造、宿
主細胞成分による内生酵素分解に対する所望ポリペプチ
ドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば閉止お
よび停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当業
者に知られたその他因子を包含する。表現過程は充分に
は理解されていないので、これら因子はいずれも単独で
は特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制
御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラン
スさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全ての
部位が同等の効果を示すものではない。
外来ＤＮＡをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えＤ
ＮＡ分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第２図に示す
。これは、ディン粒子ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
により開裂させ、開裂ＤＮＡの３′末端（ＤＮＡ糖骨格
のデオキシリポース炭素から便宜上名付けられる）にポ
リープオキシＣ順序を付加させ、そして伸長したＤＮＡ
をクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、た
だしクローン用ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼによ
り特定部位で切断されて、その切断の３′末端に開裂Ｄ
ＮＡのボＩＪ−ｄＣ順序に対し補完的なポリデオキシＧ
順序を伸長させたものを使用する。ＤＮＡおよびクロー
ン用ベヒクルの３′末端の補完的性質はこれら末端の結
合を可能にする。
本発明の方法において有用であるためには、ＨＢ　Ｖ　
−Ｄ　Ｎ　Ａを開裂させるのに選択される制限酵素は、
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子
の必須部分内においてＨＢＶ・ＤＮＡを開裂してはなら
ず、特に好適には制限された数の部位にてＤＮＡを開裂
すべきである。本発明で使用された制限酵素はＫｐｎ’
Ｌμ已・Ｂ、と・ＨＩ、Ａｖａ　＊　（およびと−Ｒ１
を包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同様に
本発明において使用することができる。
これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することなく、上
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。
第３〜り図は、ＨＢＶゲノムの一部における制限エンド
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
勿論、ＤＮＡ順序をクローン用ベヒクル中に挿入して組
換えＤＮＡ分子を生成させるその他公知の方法も同等に
本発明において使用される。
これらには、たとえば同一の制限エンドヌクレアーゼを
使用してＨＢ　Ｖ−Ｄ　Ｎ　Ａとクローン用ベヒクルと
を開裂させるような直接結紮、云が包含される。この方
法は本質的に補完的端部を結合に供する。
勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入された
ヌクレオチット順序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’ａＤＮＡ西己ダリを１
申入しても変異された宿主ばＨＢＶＫ原性を示すポリペ
プチドを生産することの−Ｓ’　ｈ”’Ｗ　？である。
。 混成遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を使用して宿主
を変異させ、この宿主（変異体）が構造遺伝子＝ｆｃは
その断片を表現しかつ混成ＤＮＡのコード化するポリペ
プチドまたはその一部を生産するようにさせることもで
きる。また組換えＤＮＡ分子を使用して宿主を変異させ
、この宿主が再現性をもって付加的な組換えＤＮＡ分子
をＨＢＶ構造遺伝子およびその断片の源泉として生産す
るようにさせることもできる。これらいずれかの使用て
対する適当な宿主の選択は、当分野で知られた多くの因
子によシ管理される。これらの因子には、たとえば選択
ベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望ポリペプチ
ドの回収容易性、表現特性、生物学的安全性および価格
が包含される。また、表現のメカニズムは充分には理解
されていないので、宿主の絶対的選択をこれら因子のい
ずれか単独によシ特定の組換えＤＮＡ分子またはポリペ
プチドＧてついて行なうことはできないであろう。寧ろ
、特定の組換えＤＮＡ分子の表現に対し全ての宿主が同
等の効果を示しえないという現実に鑑みてこれら因子を
バランスさせねばならない。
本発明の合成において、好適なりローン用ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲＪ２２であシ、そこの好適な制限
エンドヌクレアーゼ部（ＤａＰｓｔ／部位である（第２
図）。このプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ａｍ
ｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性遺
伝子を担持する小さい（分子量約２６メガダルトン）プ
ラスミドである。プラスミドは充分に特性化されている
（エフ・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒクル
Ｈの構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン、
第り５〜７７３頁（／り７７））。本発明による好適な
宿主はイー・コリＨＥ１０１である。
ｔ　　ｄＣ−伸長化したディン粒子ＤＮＡの調型本発明
の好適具体例の実際的実施ておいて、ディン粒子から上
記のように単離したＤ　Ｎ　Ａを制限エンドヌクレアー
ゼＫｐｎ　ｌ　（／　ＯｍＭＯト’）　ス−ＨＣｌ　（
ｐＨ７６）、／　０’ｍＭ　ＣＩ　ＭｇＣ１２，１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、ａ。
ｍＭのＮａＣｌ、ｏ、５ｔｔｚノ酵素調製物１０μｌ中
のＤＮＡ約２Ｏｎ、５１）により３７℃にてり０分間消
化させ、開胸酵素を７０℃、５分間の加熱によシネ活性
化させた。ポリープオキシＣ順序（例示の目的で第２図
にはＣＣＣとして示ｆ）を、フェノールおよびクロロホ
ルム（各２０μｌ）での抽出により残留蛋白質を除去し
た後、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼとの標
準的反応により消化生成物の３′末端に付加させた。エ
ーテルでの抽出によジフェノールを水相から除去し、ｊ
Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ＆、！（！μｌ）と冷エタノ
ール０．　／　ｍｌとの添加によｐ　ＤＮＡを沈殿させ
た。−７０℃に１時間保った後、沈殿ＤＮＡを／　Ｑ、
０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離して回収し、このベ
レットを／　ＯｍＭのトＩＪス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７６
（／　０μＩり中に溶解させた。
これに３μｌのｕ００ｍＭカコジル酸カリウム（ＰＨｚ
Ｏ）と４４ｍＭの塩化コバルトとｖｍＭのデオキシ７ト
シントリホスフエート （ｄＣＴＰ）とｘｏＯｔｔ９／”ｍｌ（Ｄ子牛血清アル
ブミンとを加え、　’ｔ１合物を０．　ｊμｌのポリヌ
クレオチド末端トランスフェラーゼ（ｔｏｏ。
ｕ／ｍｅ）　　と共に２７℃にて１０分間培養しそして
よＯｍＭのＥＤＴＡ（／μｌりを添加して反応を停止さ
せた。
３２−２の調製 プラスミドｐＢＲＪ２λを制限エンドヌクレアー−ｔ／
Ｐｓｔ　［（これに対しプラスミドは７つの目標を有す
る）によシ消化し、この生成物をＨＢＶ、ＤＮＡについ
て上記したようにフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精美した。ポリ−’　ｄ　Ｇ順序（例示の目的で
第２図にＧＧＧとして示す）を、ＨＢＶに対するポ１７
−ｄＣ順序の付加について上記したように、末端トラン
スフェラーゼによりｉ状ｐＢＲＪｊＪの３′末端に付加
させ、ただしこの場合反応は３７°Ｃにて行なった。
次いで、等モル量のｐＢＲＪ２２−ポリ−ｄＧとＨＢＶ
・ＤＮＡ−ポリ−ｄＣとを混合し、補完的、順序を１０
０ｍＭのＮａＣｌ、ｊ　Ｏｍ　ＡＩのトリス−ＭＣＩ（
ｐＨ７ｊ）、ｊｍＭ（７）ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）（７０μ
ｌ）中にて６５′Ｃで７時間、次いで≠７℃で１時間、
３７℃で１時間およびコ０°Ｃ″［／ｖｊ間培養するこ
とにより結合させ、そして等容量のＴＮＥと２０μｌの
ｉｏ。
ｍＭのＭｇＣＩ　２．１００ｍＭのＣａＣｌ２．１００
ｍＭのトリス−ＨＣｌ！（ｐＨ７，５）とを加えた。
４、　イー・コリＨＢ１０／の変異 変異に適したイー・コＩＪＨＢ／（１７／の培養ｉｔ−
、イー・エム争し−ターヘルクオヨヒエス・−エッチ・
ローヘンによシ「プラスミドデオキシリポ核酸によるサ
ルモネラ・チフイムリウムの変異」、ジャーナル・バク
テリオロジー、第１１り巻、第１０７２〜１０７弘頁（
／９７弘）に記載されているよつに調装した。
細胞の０．　／　’ｎ１部をアニールされたＤＮＡ調製
物λ！μでと混合し、０℃で２０分間培養し、次いで２
０℃にて７０分間培養した後、テトラサイクリン（ｊＯ
μｙ　／ｒｔｖ：　＞を含有するＬ−寒天板上に塗床し
て３７℃で一晩培養した。
プラスミドｐＢＲｊ２２はテトラサイクリン耐性につい
ての遺伝子を有するので、このプラスミドによシ変異さ
れたイー・コリ集落は、このように変異されなかったイ
ー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養物
中−で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリ
ン含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の
選択を可能にする。
５、　交雑化によるイー・コリ集落のスクリーニング 培養されたテトラサイクリン含有し一寒天板上に増殖し
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドｐＢＲｊココはアンピシリン耐性につい
ての遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の提
案部位である。したがって、選定識別部位に挿入された
ＤＮＡを有するプラスミドによシ変異された集落はアン
ビアリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに対
する耐性を保持するであろう。アンピシリンに対し感受
性であるがテトラサイクリンに対し耐性であったイー・
コリ集落を、テトラサイクリンを含有するＬ−ｇ天板上
に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの円板
の上に載置した。３７℃で一晩増殖させた後、このミリ
ポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェニコ
ール（／！０μｐ／ｍｉ；）　トｔ−含有する新たなＬ
−寒天板に移し、３７℃にてさらに数時間培養して細胞
内のプラスミドのコピー数を増加させた（第２図）。次
いで、エム争グルンスタインおよヒティー〇ニス・ホグ
ネスにより「集落交雑化；特異遺伝子を含有するクロー
ン化ＤＮＡの単離方法」、プロシープインク会す７ヨナ
ルΦアカデミ−・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、　第７　ｊ
　％第、３５＞　ｊ　／　〜３り６１頁（／９７りに記
載されているように、集落交雑化のため、前記でｔｕ’
ｌ製した３２ｐ−ラベルされたＨＢＶ−ＤＮＡを試４Ｆ
とじてミリポアフィルタ−を使用した。フィルターのラ
ジオオートグラフは、標準ＨＢＶ−ＤＮＡに対し補完的
なり　Ｎ　Ａ順序を含有する集落の存在を示した。
テトラサイクリンに耐性であり、アンピシリンに感受性
であシかつ標準ＨＢＶ・ＤＮＡで交雑化した集落を、Ｈ
ＢＶ抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも７種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のし一寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、３７℃で一晩
培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病法を感
染させたく感染度約／の倍率）イー・コＩＪ　Ｃ４００
の培養物（軟質寒天−２ｍＣ中０．　／　ｍｅ　）、を
有する第二のＬ−寒天板で覆い、３７℃で一晩培養し、
その際細菌叢は総合的にファージ（λヴイル）により溶
菌された（丁なわち、実質的に全ての宿主細胞壁が破裂
した）。本発明により変異された細胞を含有するミリポ
アフィルタ−を板から釣り上げ、集落を下面としてλヴ
イルで溶菌されたイー・コリｃｔｏｏのＬ−寒天板の表
面に接怠させた。この接触を約７０分間続けて、ミリポ
アフィルタ−上に存在する細胞のλヴイルによる感染を
行なわせた。
次いで、ミリポアフィルタ−をＬ−寒天の新たな板に移
し、３７℃でさらに５時間培養した。その間、ニス・プ
ルームおよびダブりニー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法」、プ
ロシーディング・ナショナル会アカデミ−・サイエンス
、Ｕ、Ｓ、Ａ、　第７５巻第２７弘６〜２７弘り頁（ｌ
り７Ｆ）に記載されているように、ＨＢＶ抗体でポリビ
ニル円板を被覆した。
変異した細菌集落が明白に溶菌し・たミリポアフィルタ
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、μ
℃に３時間保った。この接触の結果、ミリポアフィルタ
−上の細胞から溶出したＨＢＶ抗原は全て日板の）ＩＢ
Ｍ抗体と結合する５被覆円板をミ＋）ボアフィルターか
ら分離し、次いで洗浄して　　エーフヘルされたＨＢＶ
抗体と共に培養した。この培５の結果、ミリポアフィル
タ−からの）ｆＢＶ抗原が円板のＨＢＶ抗体により事前
に結合きれてしまった円板上の個所が放射活性となる。
洗浄後、上記プルームおよびギルバートにより記載され
ている＝うにラジオオートグラフィーにかけると、）Ｉ
ＢＭ抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落は
ラジオオートグラフによシ位置確認された。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるＨＢＶ抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう設計した方法およ
び装置（・ζ使用することができる。
たとえば、本発明の組換えＤＮＡ分子によシ変異された
宿主により生産されるＨＢｃＡｇを、肝炎Ｂビールス検
知のため現在利用しつる免疫学的診断試験、すなわち放
射性免疫分析法またはエリザ（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免
疫吸着分析法）、に使用することができる。放射性免疫
分析法の−型式においては、実験動物中に成育させた抗
−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側に付着さ
せる。次いで、この試験管にＨＢｃＡｇを加えて抗体と
結合させる。抗原−抗体複合物により被覆されたこの試
験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射性沃素のよ
うな放射性同位元素でラベルしたＨＢＶ抗−核抗体の既
知量を添加する。患者血清中のＨＢＶ抗体は、抗原−抗
体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体と競合する
であろう。血清を作用させた後、過剰の液体を除去し、
試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定する。陽性の
結果、すなわち思考面ｍがＨＢＶ抗体を含有するという
結果（ζ、低放射計数によって示される。エリザ試験法
の一型弐においては、マイクロ滴定板をＨＢ　ｃ　Ａ　
ｇで被覆し、これに患者血清の試料を加える。抗体と抗
原とを反応させる培養期間の後、板体を洗浄しそして実
験動物で成育させかつ酵素ラベルに結合させた抗−ひと
抗体の調製物を加え、培養して反応を生せしめ、次いで
板体を再洗浄する。その後、酵素基質をマイクロ滴定板
に加え、酵素を基質に作用させる期間培養しそして最終
調製物の吸着率を測定する。吸着率における大きな変化
は陽性結果を示す。
本発明のイー・コリにおける組換えＤＮＡ分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、ＨＢｃＡｇを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容量のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。
２匹の動物には重装の細菌抽出物を与え、また２匹の動
物には同じ抽出物の試料をセファデノクスｔｊＯカラム
での分画の後に加えた。さらに、凍結および貯麓した（
充分な抗原活性を保持する）同じ試料の注射を、最初の
注射から２週間後および！週間後に与えた。これら動物
を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出血さ
せた。
オー・オウチタロニーにより「免疫拡散２よび免疫電気
泳動」、ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・イ
ミュノロジー（ディー・ダブリュー・ウェア編、ブラッ
クウェル・サイエンティフインク出版社、オツクスフオ
ート・およびニシンバラ）、第１り章（ｌりＪ７）に記
載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清（
抗体）をひと肝臓から得られたＨＢｃＡｇを使用してひ
と肝炎Ｂビールス核抗体（”ＨＢｃＡｂ”）と比較した
（ビー・リュー・ローへ７およびワイ・イー・コサルト
、「肝炎Ｂ核捷原に対する抗体のスクリーニング試験の
応用」、ジャーナル・クリニカル・パソロジー、第３０
巻第７０２〜７／３頁（／り７７））。弘匹の兎の血清
全ては、人間から得られたＨＢｃＡｇとＨＢｃＡｂとの
間に形成されたものと同一の、　ＨＢｃＡｇを有する沈
降素ラインを与えた。したがって、本発明の組換えＤＮ
Ａ分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生体内
において血清学的に活性である。この活性は、微生物細
胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物および方
法を人間における抗体形成の刺戟のために使用しうろこ
とを確立した。この種の組成物および方法は、本発明で
製造された組換えＤＮＡ分子によシ変異された宿主が生
産するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプチ
ドは、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置お
よび予防のだめの組成物および方法に使用される当分野
で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤の
如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用されるで
あろう。
前記したように、本発明の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を製造
するには、上記ｆ（ｐｎ　［／ＰｓＬ　［組合せ物取外
の制限酵素も有効に使用することができる。プラスミド
ｐＢＲＪ１２およびＨＢＶゲノムの一部における他の制
限部位をそれぞれ第２図および第３図に示す。これらの
代案となるが余り好適でない具体例を説明するため、以
下に実施レリ？示す。
Ｂ＋ｓｍ＠ＨＩ、Ｅｃｏ＊ＲＩ、Ｂｇｌ　−［−Ｐｓｔ
　１組合せＫｐｎｌにより生成されたものとは異なシ、
ｌ二・Ｈｌ、旦二・Ｒ１およびシ已・■の使用によシ生
成されたＨＢＶ、ＤＮＡ断片は、短、かいｓｌ−単一ス
トランド突出部が存在するため、直接に末端結合させる
ことが便利にできなかった。したがって、これらは、３
′末端にポ！Ｊ　−ｄＣ順序を付加させる前に、λエキ
ソヌクレアーゼで処理して上記突出部を除去した。これ
は、制限されたＤＮＡ　（前記したように１０μｌの溶
液）ヲ／ヨμｌの／　００　ｍＭグリシン酸ナトリウム
（ｐＨｚり、１０ｍＭのＭｇＣ＋　２　；　”　／　０
．０　μｌ）　／Ｉｎｌの子牛血清アルブミン、よμｌ
のλエキソヌクレアーゼと共にＱ″ＣＣンＣ，７時間培
養することにより行なった。次いで、混合物をフェノー
ルとクロロホルムとで抽出し、工程を続けた。１３ａｍ
・Ｈｌを使用した調製物の場合、後の放射免疫分析法に
よｐ　ＨＢＶ抗原特異性を有するポリペプチドの生成を
確認した。
上記したようにＤＮＡ断片を末端結合させる代シに、本
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別の２種の調製物ニオイテは、
ＨＢＶ、ＤＮＡ（ｕＯｎｌ）を１０ｍＭのトリス−ＭＣ
Ｉ（ｐＨ７７）、１０ｍＭのＭｇ　Ｃｌ　２．１０ｍＭ
の２−メルカプトエタノール、ｊＯｍＭのＮａＣ１（／
　０　μｌり中において制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
−ＲＩまたはシニ・ＨＩにより３７℃にて／、５時間制
限化処理し、同一条件下で同一酵素と共に培養された過
剰のｐＢＲＪ２２と混合した。濃厚緩衝溶液〔３６０ｍ
Ｍのトリス−Ｈ，ＣＩ　（ｐＨ７ｊ　）、１００ｍＭの
Ｍｇ　Ｃ！　２．１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの２
−メルカプトエタノール、弘００　ｍＮＩのＮａＣｌ、
／ｍＭのＡＴＰ〕（２μＩりを加え、この混合物をＴ≠
・ＤＮＡリガーゼ（０，ｊμＩりと共に１０℃で３時間
、次いで０℃で少なくとも２≠時間培養した。この浴Ｒ
’ｆｒ：／　ＯｍＭのトリｘ−ｆ（ＣＩ（ｐＨ７りによ
り　０．７　ｍｅに希釈し、前記したよ５にイー・コリ
ＨＢ１０／の適当な培養物を変異させるのに使用した。
シュ・ＨＩ調製した組換えＤＮＡ分子の場合、交雑化に
対するスクリーニングの前に、集落をアンピシリンに対
してでなくテトラサイクリンに対する感度について試験
した。
何故なら、ｐＢＲｊ　２２中の、ｂ皿・ＨＩの目標はテ
トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にあシ、シ
たがってこの識別部位〈おいて上手に挿入すればＰｓｔ
１部位における挿入の場合と同様にアンピシリン耐性で
なくテトラサイクリン耐性の喪失が生ずるからである。
シュ・ＲＩ部位を介して調製された組換えＤＮＡ分子６
場合には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集
落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する
耐性につき試、験した。
何故なら、ｐＢＲｊ−２−２中のＥｃｏ・ＲＩの目標は
テトラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化す
る遺伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテ
トラサイクリンの耐性ｉ／Ｃ関する遺伝子の不活性化は
この部位ておける混成りＮＡ挿入の除虫じないからであ
る。
本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、／り
７♂年１２月／！日にポートンダウン在ノカルチャー・
コレクション・オフ”−ザ・マイクロバイオロジカル・
リサーチ・エスタプリツシュメントに寄託されかつｐＢ
ＲＪ２Ｊ−ＨＢＶ−Ａ　、　Ｆとして同定された培養物
シてより例示される。
詳細には、これら培養物の特徴は次の通りである。
ＴｅｔＲ＃ＩＴｏ”ｈＢＶ” これらと同一の培養物の一部を、ｌり７り年／２月ｌり
日にスコツトランド、アバディーン在のカルチャー・コ
レクション・オプーザ働ナショナル・コレクション・オ
フ・インダストリアル・バクテリアにも寄託した。
培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載で
ある。宿主／クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット（もし存在
すれば）を示す：肝炎Ｂビールス中の肝炎Ｂビールス制
限部位であって、伸長（もしあれば）を示すニーテトラ
サイクリン（Ｔｅｔ）およびアンピシリン（Ａｍｐ）に
対する耐性（Ｒ）まだは感受性（Ｓ）：上記の集落交雑
化試、験におけるＨＢＶ−ＤＮＡに対する＋ 陽***雑化（ＨＢＶ）および上記のＨＢＶ抗原性を示す
ポリペプチドの生産（ＶＡ’）。この命名ヲ用イレハ、
培養物ｐＢＲｊｕ、２−ＨＢＶ−Ａは、プラスミドとし
て組換えＤＮＡ分子を含有するイー・コＩＪ　ＨＢ　／
　０　／培養物を示し、この組換えＤ　Ｎ　Ａ分子はジ
止１部位で開裂されかつ３′末端にボ１７−ｄＧ端部が
伸長化されたｐＢＲＪＪ−！からなシ、さらにＨＢＶ、
ＤＮＡはＫｐｎ　［により開裂されかつ３′末端にポＩ
Ｊ　−ｄＣ端部が伸長化されておシ、また培養物はテト
ラサイクリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のＨＢＶ
＠ＤＮＡ交雑化試験とを示すと共にＨＢＶ抗原性を示す
ポリペプチドを生産する。
勿論、混成微生物、組換えＤＮＡ分子およびポリペプチ
ドならびＫこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定さ九るものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えＤＮＡ分子およびポ
リペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法によ
シ有利シて改変することができる。たとえば、より効果
的な表現制御順序を利用してＨ８Ｖ遺伝子または混成遺
伝子の転写を得ることができ、また望フしくない遺伝子
生成物の合成を減少させるよう突然変異を導入すること
ができ、また宿主細胞中のグロテアーゼレベルを減少さ
せることもでき、さらにＨＢＶ遺伝子を含有する熱誘導
性リゾゲンを宿主クロモソーム中に一体化させることが
でき、或いはその他の改変および手１項を行なって細胞
中の遺伝子コピーの数を増加させたシ所望ポリペプチド
を生産する細胞の生産性を増大させたシすることもでき
る。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Ｂビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のＤ
ＮＡを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することシてよる増殖、或・いは突然変異を
用いてＨＢｖ順序を含むバクテリオファージヒプリドに
おける溶菌を防止することは、従来得られなかった量の
ＨＢＶ−ＤＮＡの製造を可能シてする。
このように製造されたＨＢＶ、ＤＮＡを使用して、ゲノ
ムのヌクレオチド順序を決定することができ、これから
遺伝子ならびにＨＢＶ抗原および構造遺伝子自体のアミ
ノ酸順序を決定することができる。これら順序の知見は
、肝炎Ｂビールスの生物学を理解する上で役立ち、また
上記した改変を最も有利に用いることを可能にする。
上記の方法により製造された、固相放射免疫分析法によ
り検出されるようなＨＢｃＡｇの合成能力を宿主細胞に
付与する一連の組換えＤＮＡ分子を順序分析のために使
用した。断片を適当な制限酵素での消化によシこれら組
換えＤＮＡ分子から調製し、この断片をその！′　末端
に〔α−３２Ｐ）ＡＴＰとＴ弘ポリヌクレオチドキナー
ゼとでラベルした。次いで各断片のヌクレオテンド順序
を周知の化学的分解法により決定した（ニー・ニム・マ
キサムおよびダブりニー・ギルバート、「ＤＮＡの新規
な順序決定方法」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、　Ｕ、Ｓ、Ａ。
第７１Ｘ巻第よｔＯ，！６≠頁（／り７７））。
得られたヌクレオチット順序を第３〜り図に示す。参考
のため、順序には核遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのＡ
からナンバーを付す、る。
ＨＢｃＡｇに関する遺伝子のヌクレオチント順序および
この遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸順序
（読み枠ｌ）を第３〜り図においてヌクレオチットｌ−
！≠りの間に示す。この遺伝子によ）コード化されるポ
リペプチドの寸法は、ディン粒子からの核抗原について
観察された分子量／９０００に近いものである。しかし
ながら、この・構造決定は１若干のアミノ酸が標準抗原
の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミノ末端から
切除されつる可能性を排除しない。さらに、この構造は
、他のひと酵素たとえば蛋白質とクリコソル化（ｇｌｙ
ｃｏｓｏｌａｔｅ　）するような酵素との相互作用によ
シもたらされるポリペプチドへのその他７たは追加的改
変をも考慮導入れない。
したがって、ここで決定されたポリペプチド構造は生体
内に見出されるＨＢｃＡｇとは同一でないが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。
検査した組換えＤＮＡ分子の全ては挿入されたＨＢＶ、
ＤＮＡを有したので、核抗原遺伝子はｐＢＲ３２２のペ
ニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された
。さらに、各種の組換え物において、ＨＢＶ、ＤＮＡ挿
入物はＨＢＶ順序における同じ位置の１個もしくは２個
のヌクレオチット内で始まった。これら組換えＤＮＡ分
子は各種の制限酵素（たとえば−シ！、・ＨＩおよびμ
二・Ｉ）で消化されたＨＢＶ、ＤＮＡから生じたので、
この独特々付加は部具的でありかつティン粒子の内生Ｄ
ＮＡにおける割目でのＨＢＶ−ＤＮＡの偶発的＠断マた
はポリヌクレオチド末端結合から生じたのであろう（第
１図）。異なる翻訳相中にＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物を有す
る徂換えＤＮＡ分子はＨＢｃＡｇ遺伝子を表現せず、ま
たこの種の組換えＩ）ＮＡＡ分子より変異された宿主に
はＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドか検出されなかった
。勿論、この種の非遺伝子表決宿主および組換えＤＮＡ
分子も本発明によりＨＢＶ−ＤＮＡを生産するのに有用
でるる。
ＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物の表現を介して生成されたＨＢｃ
Ａｇ’にたけその断片は少数のグリシン残基金倉してベ
ニシリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物（β−ラクタ
マーゼ）Ｋ融合するであろうことが予」１１され７’（
が、実際にはそうでなかった。寧ろ、各場合にβ−ラク
タマーゼはｊ　、　Ｊ個のグリシンを介して同一のペプ
チド順序に融合きれたが、この順序は２ｊ個のアミノ酸
の後に終端した。この読み枠（枠ｌ、第３図）において
、停市コドン（ＴＡＧ）に次いで３個のヌクレオチット
がチさ、その後に開佑コドンが玩さ、そこから翻訳が妨
げられず、こ伏いてペプチドに／♂３個のアミノ酸の長
さを与える（第３〜ｒ図）。
したがって、核抗原活性は、組換えＤ　Ｎ　Ａ分子から
転写された＋ｎ　ＲＮ　Ａ内のＨＢＶ順序：Ｃより初め
から翻訳された約−２／、０００ダルトンのポリペプチ
ド中に存在する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存
しない。何故なら、これはＨＢ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ挿入
物の停止コドンおよび開始コドン、の配置によシ分泌ペ
ニシリナーゼ担体蛋白質に結合されないからである。
２、肝炎３表面抗原 ＨＢｓＡｇに対する遺伝子のヌクレオチット順序および
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序（読み枠３）も、第６〜♂図においてヌクレオテッド
／弘３７〜λ／／≠間に示される。このポリペプチドの
アミノ酸順序′ｒｉＮ末端から始まって順序ｍｅｔ−ｇ
ｌｕ　−ａｓｎ　−ｉ　ｌｅ　−ｔｈｒ　−ｓｃｒを有
する。この最初のアミノｋ　１ｉｆｆｌ　／″Ｆは、テ
ィー・エル・ヒーターンン等、「肝炎３表面抗原の２つ
の主成分ポリペプチドの部分的アミノ酸順序」、グロシ
ーデインク・ナンヨナル・アカデミ−・サイエンス、Ｕ
、Ｓ、Ａ、　、第７≠巻第ｉｒ３゜〜ｌｊ３φ頁（／り
７７）により、標準ひとＨＢ　ｓ　Ａｇから決定された
。この蛋白質のアミノ酸順序は第６〜ｇ図において停止
コドンまで２２６個のアミノ酸を続ける。この２２６ポ
リペプチド順序はλ５ｔｉ−ｏｏダルトンの蛋白質に相
当する。
ＨＢｓＡｇのアミノ酸および長さは、ピー・バレンツエ
ラ等、「肝炎Ｂビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第２♂Ｏ巻、第ざ／ｊ−ざｌり頁（／り７り）により、
適当な組換えＤＮＡ分子を順序決定することにより単独
に確認された。
本発明の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子について決定されたヌク
レオチット順序０序（４，Ｈａｔ：Ａｇに幻する遺伝子
を表現した検査されたもの全てか適当な宿主細胞内に表
現されることを期待する位置にＨＢｓＡｇに対する遺伝
子を持ち得ないことを示す。事実、ＨＢｃＡｇに対する
遺伝子を表現することが見出されたプラスミドにより変
異させた細胞の抽出物には、ＨＢｓＡｇは検出されなか
った。しかしながら、上記したように、これら遺伝子の
ヌクレオチット順序の知見は、表現過程の改変が収率と
効果とを向上させかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは
検出されなかったポリペプチドの生産とを容易化するの
を可能にする。
これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞当
シの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。
蛋白質の生産レベルはλつの主要因子により支配される
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこｎら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写訃よひ翻
訳（これは表現をも含む）の効率は、通常所望のコード
化用順序の前方（で位置するヌクレオチット順序に依存
する。これらのヌクレオチット順序または表現制ｍ＋；
ｉ序：＝、特にＲＮＡポリメラーゼが相互反応して転写
（促進子順序）を開始しかつリボソームがｍＲＮＡ（転
写の生成物）と結合かつ相互反応して翻訳を開始する位
置を規定する。この種の表現制御１！全てが同等の効率
をもって機能するものではない。したがって、隣接する
ヌクレオチット順序から所望蛋白質に対する特異的コー
ド化順序を分離し、これらを公知の表現制御順序に融合
させてよシ高度の表現レベルを得ることが有利である。
これは達成されており、新たて処理されたＤ　Ｎ　Ａ断
片を多コピープラスミドまたはバクテリオファージ訪導
体中に導入して、細胞内の遺伝子コピーの数を増加させ
それてより表現蛋白質の収率をさらに改善することがで
きる。
例示の目的で、ＨＢｃＡｇの遺伝子について決定した順
序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるＨＢｃ
ＡＫの生産を改善した。その一つの過程を第１Ｏ図番て
示す。
第３図におけるＨＢｃＡｇについてのＤＮＡ順序を点検
すると、この遺伝子はヌクレオチット−２６に、配ユ・
Ｉに対する目標（ＡＧＣＴ）を有シ、ヌクレオチット、
２２および／！’？０に肚・ＲＩ＊に対する目標を有し
、２０りに旦二・Ｒ１１に対する目標（ＣＣＴＧＧ）、
λ♂ＯＫ旦已・■に対する目標（ＧＧＣＣ）また２≠６
および≠６１に至上弓に対する目標（Ｃ，ＧＡＣＣｌＧ
ＧＴＣＣ）を有することが判る。この複雑性が与えられ
ると、核抗原コード化順序をより効果的な表現制御１！
頁序に２段階で移行させるのが便利である。
たとえば、本発明により製造されて約２３６０塩基対（
ヌクレオチット）、すなわち第３図のヌクレオチット−
♂Ｏ〜約２２７０のＨＢＶ＠Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物を有する
組換えＤＮＡ分子をΔ堕・１およびＥｃｏ・Ｒｆ　で消
化すると、特にヌクレオチット−２６と２２との間に断
片（断片Ａ）を与える一方、以凸Ｒ１の単独消化はヌク
レオチット２３〜／！ｒりに断片（断片Ｂ）を与えかつ
ヌクレオチット２３〜よ７６における断片（断片Ｂ′）
の収率を低くする。これらの断片は第３〜弘図を参照し
て容易−で確認することができ、第１０図に図示する。
断片ＡおよびＢはゲル電気泳動により分別精製され、そ
れらのＥｃｏ−Ｒ１”を介して端部結合し、合体断片（
断片Ｃ）を与える。次いで、必要に応じ断片Ｃを直接結
紮により新たな表現制御順序に付加させ、前記したよう
な３部端部結合法を介しまたは合成的オリゴ−ヌクレオ
チット結合を介して正しい翻訳相を維持する。この付加
はよシ良好な表現・制御順序を使用して蛋白質生産を改
善させるだけでなく、ＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子
断片を表現制御順序自身により近接して付加させそれに
よりその遺伝子断片の表現の制御を向上させることも可
能にする。同様にして、断片ＡおよびＢ′を合体させ、
または多くの他の調製断片を合体させ、得られた断片を
上記のように使用することができる。この方法（り、特
定ポリペプチドをコード化する構造遺伝子の７部のみを
本発明の組換えＤＮＡ分子（ｐＨＢＶ／／弘）に使用す
る需要があることを示している。
選択された遺伝子断片の特定表現制御１序と開始コドン
との間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその末
端で７たは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼの
組合せ物により軽く処理するかまたはエキソヌクレアー
ゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片の
開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全てまた
は幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオチ
ット−２ｚおよび３０で開裂して生するたとえばΔ巨・
１断片のような断片を同様にエキンヌクレアーゼ処理ま
たはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次いで
旦二・ＲＩ”で開裂させてヌクレオチット−２６および
／とヌクレオチット２２との間から断片をもたらし、断
片ＢＫ融合させた後に表現制御順序に付加さぜることが
できる。別の経路は断片Ｂまたは同等の＋Ｖｉ片の交雑
化全包含し、これはＤＮＡポリメラーゼおよび限られた
数のヌクレオシドトリホスフニートとの一連の反応にお
いて伸長の丸め元の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子から適当な単
一ストランド雛型に対して行なわれ、したがって断片ス
トランドにコード化順序の初めに再構成することができ
るであろう。次いで雛型ストランドを伸長断片ストラン
ドに関連する位置においてエンドヌクレアーゼＳ／によ
り開裂させ、そして得られた断片を表現制御順序に付加
させる。
幾つかの表現制御順序は、上記したように使用すること
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン（「士
ミ系」）の作動子、促進子およびリポソーム結合および
作用順序（たとえばシャインーク゛ゝルガ７Ｊ順序のよ
うな順序を含む）、イー・コリのトリ２［トファン合成
酵素系Ｃｒｔｒｐ系」）の対応する順序、？アージλの
主要作動子および促進子板（ＯＬＰＬおよびＯ，Ｐ几Ｉ
）ならびＯてファージｃｄ被覆蛋白質の制御域を包含す
る１、これら順序金含有するＤＮＡ＠片は。
±二もしくはｔｒｐオペロンを担持する変換用ファージ
から単離されたＤＮＡからまたはファージλもしくはｆ
ｄのＤＮＡから制限酵素での開裂りこより創出される。
次いで、これら断片をＨＢＶ抗原頑序について記載した
ように処理して限られた数の分子を得、重要な制御順序
を断片Ｃについて上記したように所望抗原に対するコー
ド化順序の開始コドンに極めて近接してまたはこれに並
列させて結合させることができる。
゛次いで、融合生成物を上記のようにクローン用ベヒク
ル中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベル
を細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も
効果的な表現を与える細胞はこのように選択することが
できる。或いは、開始コドンに付加されたｌａｃ、　　
ｔｒｐもしくはλＰＬ制御系を担持するクローン用ベヒ
クルを使用して、これをＨＢＶ抗原性を示すポリペプチ
ドをコード化する順序を持った断片に融合させ、構造遺
伝子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確に
翻訳する。
これらの実験を特にＨＢＶ核抗原の生産に関連させたが
、これらはたとえばＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ遺伝子
ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改良する
のにも使用することができる。
こｎら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に使
用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えＤＮＡ分
子を雛型バクテリオファージλ（ＮＭりｔり）中に挿入
することにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえば旦二・Ｒ１または一旦ｉｎｄ・ｍで消
化して線状分子を与え、次いでこれを制限ファージスク
ローン用ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレ−等、［
組換え体の試験管内（・ておける回収を簡易化するラム
ダ型ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネテイツク
、第１ｊＯ巻第ｊ３〜６１頁（ｌり７７）およびエヌ・
イー・ムレ−等、「バクテリオ７アージＴ４ｔからのＤ
ＮＡリガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ジャーナル・モ
レキュラー・バイオロジー、第１３２巻第≠り３〜ＳＯ
ｔ頁（ｌり７り）に記載された１側と混合し、そして組
換えＤＮＡ分子をＤＮＡＩＪガーゼとの培養によシ生成
させる。このような手順を第１／図に示す。次いで、所
望の徂換え７アージを、特定抗原に対する放射免疫分所
によシまたは放射ラベルしたＨＢＶ−ＤＮＡ順序との交
雑化により選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化する
のに使用した。
特に有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子ｃｌにお
ける感温性突然変異株および遺伝子旦における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あ夛、さらに遺伝子Ｅに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞を３２℃にて成育せしめ、次いで４Ｌ
ｊ℃に加熱してプロファージの創出を誘発させる。３７
℃にて長期成育させると高レベルの抗原生産をもたらし
、これが細胞内（て保持される。何故なら、これらはフ
ァージ遺伝子生放物により通常のようには溶解されない
からでちゃ、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化さ
れないので、それは転写用として使用可能に留まるから
である。次いで、細胞の人工的溶解は抗原を高収率で遊
離させる（第１／図）。
これら実施例が原理的に関係するイー・コリ系に加え、
同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス・ズブチ
リス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビのよう
な他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞におい
て抗原生産レベルを増大させることができる。バチルス
−ズブチリスの場合、バチルスφリヒエニホルミスから
単離されたベニシリナーゼの決定子を担持するプラスミ
ドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供する。
ＨＢｓＡｇについて決定した遺伝子およびアミラ醒順序
け、本発明の方法ＫＪニジＨＢｓＡｇＫ対する遺伝子の
表現を可能にする方法を設計する際に有用である。この
ような表現は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生成
した組換えＤ　Ｎ　Ａ分子により変異させた宿主におい
て従来観察されなかった。
第６〜ｒ図のヌクレオチット順序は、ヌクレオチットｌ
≠３７と２／／弘との間のＨＢｓＡｇをコード化する遺
伝子を示す。この遺伝子は。
第３〜２図のＨＢＶゲノムに２けるＨＢｃＡｇをコード
化する遺伝子（読み枠／）とは異なる翻訳相（読み枠３
）にある。したがって、適当な宿主を変異させるために
使用された時ＨＢｃＡｇを生成しなかったが、約２３よ
０個のヌクレオチット（第３〜を図の順序のヌクレオチ
ット−１０，２２７０ＩＩＣホホ相当する）のＨＢＶ−
ＤＮＡ挿入物を含有する組換えＤＮＡ分子をＨＢｓＡｇ
生産に使用するため選択した。
選択された組換えＤＮＡ分子は、特（・てＨＢｓＡｇを
コード化する全遺伝子を含有した。この徂換えＤＮＡ分
子のＨＢＶφＤＮＡ挿入物のヌクレオチット順序を検査
すると、ＨＢｓＡｇをコード化する遺伝子を含有する断
片の創出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
目標が示される。たとえば、ヌクレオチットｌ弘Ｏり（
Ｘｈｏ）、ヌクレオチットｌ≠”　（”ｇ　）％　ヌク
レオチット／≠Ｏり（Ａｖａｌ）、およびヌクレオチッ
ト／≠２♂（Ｈｈａ　Ｉ　）　（第６図）。これらのう
ち最後のもの（Ｈｈａｌ）は特に有用である。何故なら
、ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物の開裂はヌクレオチット／弘３
０とｌ弘３７との間で起こシ、ＨＢｓＡｇ自身に対する
遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の前方に僅か６個の
ヌクレオチットが存在するからである。≠種の場合全て
において、創出された断片は、選択されたＨＢＶ−ＤＮ
Ａ挿入物を越えて、組換えＤＮＡ分子の２８８３２２部
分のヌクレオチット項序内に位置する特定制限エンドヌ
クレアーゼに対する目標まで延在する。したがって、こ
れら制限エンドヌクレアーゼおよびその他同様に有用な
ものを単独または組合せて使用すると、開始コドンの近
辺であるかその前方と翻訳終末コドンの後とにおいてＨ
ＢｓＡｇをコード化する遺伝子の創出が可能となる。勿
論、ＨＢｃＡｇに対する遺伝子の場合に示したように、
全遺伝子の断片のみを組換えＤＮＡ分子中に実際使用し
、適当な宿主においてＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリヌク
レオチットを生成させうろことが了解さｎよう。
このような消化物から生ずるＨＢＶ、ＤＮＡの断片を、
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したもの【て類似した一連の反応で処理した。たと
えば、遺伝子断片をｐＢＲＪ２２のペニシリン討性をコ
ード化する遺伝子（たとえばＰｓｔ　ｌ識別部位、第２
図）中に挿入してＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリペプチド
をβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ遺伝子の生成物）
と融合させて生成させることができ、遺伝子断片をｐＢ
Ｒ３２−２におけるペニンリン討性をコード化する遺伝
子とテトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子との間
（Ｅｃｏ　−Ｒ１ｉたはＨｉｎｄ　［１識別部位、第２
図）に挿入して、これをそこでまたは挿入前（で三基表
現ｍｌｔ卸順序ンて結合することＯでよりＨＢｓＡｇ抗
原性を示すポリペプチドを生成させてｌａｃ系のβ−ガ
ラクトシダーゼ蛋白質に融合させることができ、遺伝子
断片を、ＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子について前記
したと同様に、選択された表現制御順序自身にできるだ
け近接してクローン用ベヒクル中に挿入することができ
、或いは遺伝子断片を本発明によシ記載したと同様に無
性増殖させることができる。
例示の目的で、一つのこの種の方法を第１Ｊ図に示す。
ここで、はぼヌクレオチット−♂Ｏと２２７０（第３〜
ｒ図）との間に延在したＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物を有する
選択組換えＤＮＡ分子をＨｈａ　−１での消化シてより
断片化させた。
得られた断片を、前記した３′末端結合法によシｐＢＲ
ｊ２−２のＬ隻【部位に挿入した。この組換えＤＮＡ分
子によシ変異させた宿主は、ＨＢｓＡｇ抗原性を示すポ
リペプチドを生成した。
他の断片（たとえばＡｖａｌ、Ｔａｇ、　Ｘｈｏまたば
ＰｓｔＪ（部分消化））をも、ｐＢＲｊＪ−２における
Ｐｓｔ　ｌ識別部位ま念は他の部位て挿入して、ＨＢｓ
Ａｇ抗原性を示すポリペプチドまたばＨＢｓＡｇをコー
ド化する遺伝子断片の生産に有用な組換えＤＮＡ分子を
生成させた。
さらに、この種の遺伝子断片ｆ　Ｐｓｔ　ｌにより開裂
されたｐＢＲＪ２−２に挿入し、次いで得られたベニシ
リナーゼをコード化する遺伝子の断片ヲ、ヘニシリナー
ゼまたはβ−ラクタマーゼのアミノｉ／♂２をコード化
するコドンから成る場合にはアミノ酸３２をコード化す
るコドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミ
ノ酸１３をコード化するコドンへと切シ離す。またｐＢ
ＲＪ２２−ＰｓＬ・Ｉ′のこれら誘導化プラスミドをヌ
クレオチット／弘≠７から／７り乙まで延在するＨＢ　
ｓ　Ａｇ遺伝子断片（第６〜７図）と共に使用してＨＢ
　ｓ　Ａ　ｇ抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
ＨＢｓＡｇをコード化する構造遺伝子の直前（ておける
ヌクレオチツドタ≠♂〜／　４ｔＪ　７１ａ’ｌ　ノヌ
クレオテソド順序を使用断片中に含ませて、　ＨＢｓＡ
ｇ抗原性？示すポリペプチドおよびｌ（ＢｓＡｇに対す
る構造遺伝子の遺伝子断片を生産するのに有用な組換え
Ｄ　Ｎ　Ａ分子を生成させることもできる。このヌクレ
オチット順序は、遺伝子の先９厖本１１迫序と（Ｉ＋ば
れる。この先、枢体順序とＨＢｓＡばに対する構造遺伝
子との両者をきむ遺伝子断片をΔ坦・Ｉ（ヌクレオチツ
ドタ３り）、Ｈｈａ−１（ヌクレオチツドタ００）また
はＨａｅ＊ｌｌ（ヌクレオチット♂タタ）Ｋより割出す
ることができる。ム想・１およびＨｈａ・Ｉの場合、部
分消化と得られた断片のたとえばゲル電気泳動による分
離とが必要である。何故なら、これら酵素に対する識別
部位は、先駆体順序内において、ＡｌｕｍＩについては
ヌクレオチット１０り／にまた旦■・■についてはスク
レオチツド／弘２ｇにも生するからである。
以上、本発明の多くの具体例について記載したが、この
基本構成を変化させて、本発明方法を使用する池の具体
例を与えることもできることが明白である。したがって
、本発明の範囲は例示した特定実施例によシ規定さるべ
きでなく、特許請求の範囲 ることが了解されよう。
本明細書中（・ζ記載した方法（／ｃよう調製した微生
物は、ｌタ７タ年７ｌ月ｌタ日江ス；ントランド、アバ
ディーン在のザ・カルチャー・ニレク／ヨン＠Ｘ７′１
ザーナショナルφニレクション争万ブ・インダストリア
ル・バクテリア　（　ＴｈｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａ　）　　に寄託されかつｐＢＲＪ　２　２　
−ＨＢＶ−Ｇ−Ｌと同定された培養物によシ例示され、
次のような特性を有する。
Ｇ：イー・コリ８８１０１　／ｐＢＲ３２２一匣ＩｄＧ
：ＨＢＶ−１−１ｄＣ（以下、’　ｐＨＢＶ１１４　”
　）：　Ｔｅｔ’Ａｍｐ’ＨＢＶ÷ Ｈ：イー・コリＨＢＩＯＬ　／　ｐＢＲ３２２一旦リ，
ビｄＧ：ｐＨＢＶ１１４−Ｐｓｔ　Ｉ　：　Ｔｅｔ”Ａ
ｍｐ’ＨＢＶ”ＶＡ”Ｉ：イー・コリＩ｛８１０１　／
　（　（Ｐ８１２３２２一亜１？Ｉ。
Ｂａ＋＊旧：　　ｌａｃ　　プロモータ配列）−ｌ｛ｉ
ｎｄ　ＩＩＩリンカー：　ＨＢＶ１１４−Ｈｈａ　ＩＢ
ｑｍ　　Ｈ［　　：　　Ｔｅｔ’Ａｍｐ”ＨＢＶ”ＶＡ
ヤｊ：イー−）す１（８１０１／ＰＩＩＲ２Ｅｃｏ　Ｒ
１：　１（ＢＶ１１４−Ｈｈａ　ｒ　Ｅｃｏ　Ｒ１リジ
カー：　Ｔｅｔ’Ａｍｐ’ＨＢＶ”ＶＡ十 に：イー・コリＨＢＩＯＩ　／ＰＢＲ３２２−Ｐｓｔ　
Ｉ　ｄＧ　：ｐＨＢＶ１１４−Ａｖａ　１　ｄＣＴｅＬ
”ＡｍｐｓＨＢＶ”ＶＡ”Ｌ：イー・コリＨＢＩＯＩ　
／　ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔ　Ｉ　ｄＧ　：ｐＨＢＶ１１
４−Ｔａｑ　ｄＣＴｅｔ”Ａｍ、ｐ’ＨＢＶ４ＶＡ”※
　：テトラサイクリン討性ンζついてのポリペプチドを
コード化する遺伝子と含む ＤＮＡ順序を持ったｐＢＲＪλλの誘導体を、イー・コ
リｌａｃ系を含むよシ小きいＤＮＡ順序で置き換えた。
【図面の簡単な説明】
第１図はディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図であ
シ、第２図は本発明方法の好適具体例の略説明図であシ
、第３〜り図は本発明により　肝炎Ｂビールスゲノムの
一部について決定したヌクレオチット順序の説明図であ
シ、第１Ｏ図は肝炎Ｂビールス核抗原を示すポリペプチ
ドを生産することのできる組換えＤＮＡ分子を断片化し
、その断片を改善表現制御項圧に結合させる本発明方法
の略説明図であり、　第”図は本発明方法の略説明図で
あり、第１．２図は不発明方法の他の具体例の略説明図
である。 ＬＬｌ−１

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ＨＢＶ抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチ
    ドをコードしかつＢ型肝炎ウィルス表面抗原をコードす
    るＤＮＡ配列もしくはその断片、Ｂ型肝炎ウィルス核抗
    原をコードする ＤＮＡ配列もしくはその断片、および前記配列もしくは
    断片を１部として有するＤＮＡ配列よりなる群から選択
    されるＤＮＡ配列をクローン化ビークル中へ導入し、前
    記ＤＮＡ配列は組換えＤＮＡ分子における発現制御配列
    に作用結合されかつ発現して、前記組換えＤＮＡ分子で
    形質転換された単細胞宿主を培養する際にＨＢＶ抗原性
    を示すポリペプチドを産生することを特徴とするＤＮＡ
    配列をクローン化しかつ発現させる際に使用する組換え
    ＤＮＡ分子の製造方法。
  2. （２）ＨＢＶ抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチ
    ドをコードするＤＮＡ配列を、クローン化ビークルの第
    １および第２制限エンドヌクレアーゼ識別部位の間に挿
    入して組換えＤＮＡ分子を生産することを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
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