JPS6356292A - 組換えdna分子の製造方法 - Google Patents
組換えdna分子の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の要約
組換えDNA分子およびそれにより変異されてHBV抗
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えDNA分子は、HBV抗原性を示す少
なくとも7種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子
を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えDN
A分子は、HBV抗原性を特徴とする遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれら
の使用と、人間におけるHBVビールス感染を検出して
この感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能に
する。
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えDNA分子は、HBV抗原性を示す少
なくとも7種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子
を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えDN
A分子は、HBV抗原性を特徴とする遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれら
の使用と、人間におけるHBVビールス感染を検出して
この感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能に
する。
本発明は、組換えDNA分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現される組換えDNA分子に関するもの
である。本明細書中に開示する組換えDNA分子は、肝
炎Bビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコー
ド化するDNAが特徴である。以下の記載から了解され
るよって、組換えDNA分子は、人間における肝炎Bビ
ールスの検出およびこのビールスに対する人間における
抗体の刺戟のために使用することができる。
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現される組換えDNA分子に関するもの
である。本明細書中に開示する組換えDNA分子は、肝
炎Bビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコー
ド化するDNAが特徴である。以下の記載から了解され
るよって、組換えDNA分子は、人間における肝炎Bビ
ールスの検出およびこのビールスに対する人間における
抗体の刺戟のために使用することができる。
肝炎Bすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人間
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Bビールス
(rHBVJ )感染は蔓延している。英国、米国およ
び西欧において、全供血者の約0. /%はHBVの慢
性保菌者である。
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Bビールス
(rHBVJ )感染は蔓延している。英国、米国およ
び西欧において、全供血者の約0. /%はHBVの慢
性保菌者である。
ビールス性肝炎による死亡率は高くないが(英国におい
て/り7j年には100万六当シ3人であった)、英国
における人口の5%および米国における人口の73%と
いう多くが感染していると示されている。多くのアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の20%までがH
BVの慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の
50%以上がHBVに感染したかまたは感染している。
て/り7j年には100万六当シ3人であった)、英国
における人口の5%および米国における人口の73%と
いう多くが感染していると示されている。多くのアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の20%までがH
BVの慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の
50%以上がHBVに感染したかまたは感染している。
肝炎の感染は、3つの一般的機作によって伝染される。
すなわち、(1)輸血におけるような多量で゛または事
故による皮膚刺通を介するような少量で、感染された血
液もしくは体液が非経口的(で接種されることによるも
の、(2)近親または***渉によるもの、および(3)
妊娠中に感染した母親が新生児にビールスを移すことに
よるものである。自然条件下では、HBVは大して感染
性の高いものでない。呼吸による伝染は、あったとして
も稀である。
故による皮膚刺通を介するような少量で、感染された血
液もしくは体液が非経口的(で接種されることによるも
の、(2)近親または***渉によるもの、および(3)
妊娠中に感染した母親が新生児にビールスを移すことに
よるものである。自然条件下では、HBVは大して感染
性の高いものでない。呼吸による伝染は、あったとして
も稀である。
大抵のHBV感染は準臨床的のものである。
臨床的疾病は通常3〜6週間続き、疾病度において軟度
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なHBV感染からの回復
は通常完全でちる。
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なHBV感染からの回復
は通常完全でちる。
しかしながら、成る場合には重度の長期結果が生ずる。
(1)急性感染の約j%は肝炎Bビールス抗原の慢性保
有者であり、他人知対する1感染潜在力を継続して有す
ると共に肝臓損傷を進行させておシ、また(2) HB
Vによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および
第−期肝臓癌というHBV−血清陰性例の相当な割合を
開始させる完全なまたは部分的な原因となシうる。
有者であり、他人知対する1感染潜在力を継続して有す
ると共に肝臓損傷を進行させておシ、また(2) HB
Vによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および
第−期肝臓癌というHBV−血清陰性例の相当な割合を
開始させる完全なまたは部分的な原因となシうる。
分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成熟
核蛋白質をコード化するDNAを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成によシ製造したも
の以外のDNAを用いる場合、組換えDNA分子の構成
は、所望の蛋白質に対する精製メツセンジャー(mRN
A)雛型の単一鎖DNAコピー(c DNA )を生成
させ、このcDNAを二重鎖DNAに変換し、このDN
Aを適当なりローン用ベヒクル(cloningveh
icle )における適当な部位に結合させそしてその
組換えDNA分子によシ適当な宿主を変異させる手順か
らなっている。このような変異により、宿主は所望の蛋
白質を生産することが可能になる。さらに、少なくとも
オバルブミンDNAの場合、強力な細苗促進子または表
現調節順序Gて対する特定DNAの適当な融合は、よ9
大量の所望オパルプミン蛋白質、すなわち大腸菌(E、
coli )細胞の全蛋白質の約0. j 、 /%
を生成させることが知られている(オー・メルセローー
プイジャロン等、「組換えプラスミドを有するイー・コ
リに/2によるオバルブミン状蛋白質の合成」、ネーチ
ャー誌第27j巻第!O!〜よ70頁(/り7♂)なら
びにティー・エッチ働フレーザーおよびビー・ジエー拳
ブルース、「雛鳥オバルプミンはイー・コリにより合成
かつ分泌される」、プロシープインク・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、U、S、A、、第7j巻、第5
23乙〜!り≠O頁(lり7♂))。
核蛋白質をコード化するDNAを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成によシ製造したも
の以外のDNAを用いる場合、組換えDNA分子の構成
は、所望の蛋白質に対する精製メツセンジャー(mRN
A)雛型の単一鎖DNAコピー(c DNA )を生成
させ、このcDNAを二重鎖DNAに変換し、このDN
Aを適当なりローン用ベヒクル(cloningveh
icle )における適当な部位に結合させそしてその
組換えDNA分子によシ適当な宿主を変異させる手順か
らなっている。このような変異により、宿主は所望の蛋
白質を生産することが可能になる。さらに、少なくとも
オバルブミンDNAの場合、強力な細苗促進子または表
現調節順序Gて対する特定DNAの適当な融合は、よ9
大量の所望オパルプミン蛋白質、すなわち大腸菌(E、
coli )細胞の全蛋白質の約0. j 、 /%
を生成させることが知られている(オー・メルセローー
プイジャロン等、「組換えプラスミドを有するイー・コ
リに/2によるオバルブミン状蛋白質の合成」、ネーチ
ャー誌第27j巻第!O!〜よ70頁(/り7♂)なら
びにティー・エッチ働フレーザーおよびビー・ジエー拳
ブルース、「雛鳥オバルプミンはイー・コリにより合成
かつ分泌される」、プロシープインク・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、U、S、A、、第7j巻、第5
23乙〜!り≠O頁(lり7♂))。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えDNA技
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白質(エル・グイラーコマ
ロフL rプロインシュリンを合成する細菌クローン
」、プロシーテイング・ナショナル・アカデミ−・サイ
エンス、U、 S、 A、、第73巻、第3727〜3
73/Jj(/F7r))、ラッテの成長ホルモン(ピ
ー・エッチ・シーブルク等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネーチャー誌、第27’ 巻、第72よ〜7
り2頁(/り”))sねずみのジヒドロフオレートレダ
クターゼ(ニー・シー・ワイ・チャンク等、「ねずみの
ジヒドロフオレートレダクターゼをコード化するDNA
順序のイー・コリにおける表現型式」、ネーチャー誌、
第27j巻、第6/7〜62≠頁(lり7g))、ソマ
トスタチン(ケー・イタクラ等、「ンマトスタチンホル
モンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリにおけ
る表現」、サイエンス誌、第19を巻、第1034〜1
063頁(/り77)、ならびに英国特許第2,007
,67jA号、第200Zt7tA号および第シ001
,723A号明細書およびそれらの他国出頭)、および
ひとインシュリンのAおよびBポリペプチド鎖(ディー
・ヴイー・ゲデル等、[ひとインシュリンに対する化学
合成された遺伝子のイー・コリにおける表現」、グロシ
ーデイング壷ナショナル令アカデミ−・サイエンス、U
、S、A、、第76巻、第706〜/10頁(/り7り
)および上記英国特許明細書)が包含される。
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白質(エル・グイラーコマ
ロフL rプロインシュリンを合成する細菌クローン
」、プロシーテイング・ナショナル・アカデミ−・サイ
エンス、U、 S、 A、、第73巻、第3727〜3
73/Jj(/F7r))、ラッテの成長ホルモン(ピ
ー・エッチ・シーブルク等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネーチャー誌、第27’ 巻、第72よ〜7
り2頁(/り”))sねずみのジヒドロフオレートレダ
クターゼ(ニー・シー・ワイ・チャンク等、「ねずみの
ジヒドロフオレートレダクターゼをコード化するDNA
順序のイー・コリにおける表現型式」、ネーチャー誌、
第27j巻、第6/7〜62≠頁(lり7g))、ソマ
トスタチン(ケー・イタクラ等、「ンマトスタチンホル
モンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリにおけ
る表現」、サイエンス誌、第19を巻、第1034〜1
063頁(/り77)、ならびに英国特許第2,007
,67jA号、第200Zt7tA号および第シ001
,723A号明細書およびそれらの他国出頭)、および
ひとインシュリンのAおよびBポリペプチド鎖(ディー
・ヴイー・ゲデル等、[ひとインシュリンに対する化学
合成された遺伝子のイー・コリにおける表現」、グロシ
ーデイング壷ナショナル令アカデミ−・サイエンス、U
、S、A、、第76巻、第706〜/10頁(/り7り
)および上記英国特許明細書)が包含される。
しかしながら、本発明とは異なり、上記のものはいずれ
もたとえば肝炎Bビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えDNA合成に向けられていない。
もたとえば肝炎Bビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えDNA合成に向けられていない。
HBV感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、HBV感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。
起することが知られている。これらの抗体は、HBV感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。
しかしながら、肝炎Bビールスの抗原に対する人工的刺
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Bビールスによる実験的感染は、その他
二三の学長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。この限られ
た宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビールス
とその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感染
抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げている
。
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Bビールスによる実験的感染は、その他
二三の学長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。この限られ
た宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビールス
とその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感染
抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げている
。
抗体を発生させまた感染を検知するため、HBV感染の
犠牲者から単離された真正)(BYビールス抗原を使用
する試みが幾つかなさ几たが、これらの処置は活性様の
供給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、
これら抗原を得るため人間を原材料として使用すること
は、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題の
ため好ましくない。
犠牲者から単離された真正)(BYビールス抗原を使用
する試みが幾つかなさ几たが、これらの処置は活性様の
供給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、
これら抗原を得るため人間を原材料として使用すること
は、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題の
ため好ましくない。
本発明は、HBV抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えDNA分子を本発明
によシ提供して上記の諸問題を解決する。
する構造遺伝子を特徴とする組換えDNA分子を本発明
によシ提供して上記の諸問題を解決する。
本発明によれば、ワクチン製造のためならびにビールス
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、HBV抗原および遺伝子を汚染されていない
かなりの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養シてお
ける繁殖不能のため、従来入手できなかった。
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、HBV抗原および遺伝子を汚染されていない
かなりの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養シてお
ける繁殖不能のため、従来入手できなかった。
以下の記載から判るように、本発明の組換えDNA分子
は、適当な宿主において、HBV抗原性を示す少なくと
も7種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化
する構造遺伝子を生成させると七ができる。これら組換
えDNA分子と宿主とを用いて、HBV抗原性を示すポ
リペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺
伝子とを製造することができる。これら生産物はまた同
定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成されたまま
の状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、
これら生産物自身の製造を改善する組成物および方法に
使用でき、またHBV感染を検知し、その病理学を追跡
しかつ人間におけるHBV抗体の生産を刺戟する組成物
および方法に使用することができる。
は、適当な宿主において、HBV抗原性を示す少なくと
も7種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化
する構造遺伝子を生成させると七ができる。これら組換
えDNA分子と宿主とを用いて、HBV抗原性を示すポ
リペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺
伝子とを製造することができる。これら生産物はまた同
定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成されたまま
の状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、
これら生産物自身の製造を改善する組成物および方法に
使用でき、またHBV感染を検知し、その病理学を追跡
しかつ人間におけるHBV抗体の生産を刺戟する組成物
および方法に使用することができる。
さらに本発明によれ(ケ、ディン粒子(Danepar
Licle )の内生DNAから調製されたDNA順序
をディン粒子以外の材料源から調製された他のDNA順
序に結合させることを特徴とする、組換えDNA分子の
製造方法が提供される。
Licle )の内生DNAから調製されたDNA順序
をディン粒子以外の材料源から調製された他のDNA順
序に結合させることを特徴とする、組換えDNA分子の
製造方法が提供される。
本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区別
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
DNA分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはDNAを使用しない。その代シとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはcDNA順
序を作シ出すため供与体細胞から単離されたmRNAを
酵素的に転写することによシ作られた人工遺伝子のいず
れかを使用する。
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
DNA分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはDNAを使用しない。その代シとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはcDNA順
序を作シ出すため供与体細胞から単離されたmRNAを
酵素的に転写することによシ作られた人工遺伝子のいず
れかを使用する。
蛋白質の組換えDNA合成において天然DNAが従来直
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然DNAおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が[イントロン(Intron ) Jすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然DNAおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が[イントロン(Intron ) Jすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。
これらイントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形
成しない。寧ろ、それらは高等生物に訃いて一次転写生
成物如作用する特殊処理酵素ICより生体内で除去され
て遺伝子の最終的メツセンジャー(m RN A )
t−与える。細菌はこのようなイントロンを処理するの
に使用できないと思われ、したがって天然DNAは細菌
宿主において表現することが期待されずまた所望の蛋白
質はこれら宿主によシ生産することが期待されないであ
ろう。
成しない。寧ろ、それらは高等生物に訃いて一次転写生
成物如作用する特殊処理酵素ICより生体内で除去され
て遺伝子の最終的メツセンジャー(m RN A )
t−与える。細菌はこのようなイントロンを処理するの
に使用できないと思われ、したがって天然DNAは細菌
宿主において表現することが期待されずまた所望の蛋白
質はこれら宿主によシ生産することが期待されないであ
ろう。
第1図は、ディン粒子の内生DNAの構造を示す略図で
ある。これは2本の補完的DNA鎖すなわちストランド
aとbとを示し、さらにストランドaにおける割目とス
トランドbにおける間隙とを示すと共にこの間隙がDN
Aポリメラーゼ反応により閉鎖されることを示している
。
ある。これは2本の補完的DNA鎖すなわちストランド
aとbとを示し、さらにストランドaにおける割目とス
トランドbにおける間隙とを示すと共にこの間隙がDN
Aポリメラーゼ反応により閉鎖されることを示している
。
第2図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であシ、
ディン粒子から単離された内生DNAの断片は犬腸苗(
イー・コリ)ベニンリナーゼ遺伝子に対しフラズミドp
BR32−2上のPsL1部位に融合される。イー・コ
リHB/Q/に変異した後、組換えDNA分子バフRJ
22−PsLl dG : HBV−Kpn l dC
(d HBV抗原性を示すポリペプチドの合成に向けら
れる。
ディン粒子から単離された内生DNAの断片は犬腸苗(
イー・コリ)ベニンリナーゼ遺伝子に対しフラズミドp
BR32−2上のPsL1部位に融合される。イー・コ
リHB/Q/に変異した後、組換えDNA分子バフRJ
22−PsLl dG : HBV−Kpn l dC
(d HBV抗原性を示すポリペプチドの合成に向けら
れる。
第3〜り図は、本発明によシ肝炎Bビールスゲノムの一
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された3つの読み枠における停
止コドンによシ示される。本発明で決定されたHBcA
gをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−!θ〜−l
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された3つの読み枠における停
止コドンによシ示される。本発明で決定されたHBcA
gをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−!θ〜−l
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。
ヌクレオチット/〜よりりは肝炎Bビールス核抗原をコ
ード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、こ
の抗原のアミノ酸順序(読み枠l)はその順序の上部に
示される。ヌクレオチットl弘37〜2//≠は肝炎B
す゛−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオ
チット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序(読み枠3
)はその順序の上部に示される。これら遺伝子における
各種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位についても第3
〜夕図に示される。
ード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、こ
の抗原のアミノ酸順序(読み枠l)はその順序の上部に
示される。ヌクレオチットl弘37〜2//≠は肝炎B
す゛−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオ
チット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序(読み枠3
)はその順序の上部に示される。これら遺伝子における
各種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位についても第3
〜夕図に示される。
第70図は、本発明方法の略説明図であシ、ここで肝炎
Bビールス核抗/i!を示すポリペプチドを生産するこ
とのできる組換えDNA分子は断片化され、この断片は
改善された表現制御順序、すなわち結糸に付加される。
Bビールス核抗/i!を示すポリペプチドを生産するこ
とのできる組換えDNA分子は断片化され、この断片は
改善された表現制御順序、すなわち結糸に付加される。
第11図は、本発明方法の略説明図であり、ここで本発
明の組換えDNA分子は断片化されかつ7アージDNA
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よシその中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。
明の組換えDNA分子は断片化されかつ7アージDNA
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よシその中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。
第12図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であシ
、ここで肝炎Bビールス核↑堵社ヲ示すポリペプチドを
生産しない本発明の組換えDNA分子は断片化されてH
BsAgに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝
子を使用して組換えDNA分子を生成させ、それにより
適当な宿主においてHBsAi(を生産する。
、ここで肝炎Bビールス核↑堵社ヲ示すポリペプチドを
生産しない本発明の組換えDNA分子は断片化されてH
BsAgに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝
子を使用して組換えDNA分子を生成させ、それにより
適当な宿主においてHBsAi(を生産する。
本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。
る。
以下の記載において、下記の用語を使用する。
ヌクレオチツド::#M部分(ペントース)ト燐酸部分
と窒素系複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの
単量体単位。この塩基はグリコシド炭素(ぺ/ドースの
l′炭素)を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結
合物はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特
性化する。弘種のDNA塩基はアデニン(”A”)、ク
アニン(“G”)、シトシン(“C”)およびチミンじ
T”)である。≠種のRNA塩基はA、G、Cおよびウ
ラシル(“U”)である。 ゛DNA順序:隣接す
るペントースの3′炭素と!′炭素との間のホスホジエ
ステル結合によシ互いに結合されたヌクレオチットの線
状系列。
と窒素系複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの
単量体単位。この塩基はグリコシド炭素(ぺ/ドースの
l′炭素)を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結
合物はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特
性化する。弘種のDNA塩基はアデニン(”A”)、ク
アニン(“G”)、シトシン(“C”)およびチミンじ
T”)である。≠種のRNA塩基はA、G、Cおよびウ
ラシル(“U”)である。 ゛DNA順序:隣接す
るペントースの3′炭素と!′炭素との間のホスホジエ
ステル結合によシ互いに結合されたヌクレオチットの線
状系列。
コドン: mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳終了信号をコード化する3種のヌクレオチッ
ト(トリプレット)のDNA順序。
または翻訳終了信号をコード化する3種のヌクレオチッ
ト(トリプレット)のDNA順序。
たとえば、ヌクレオチントトリプレットTTA。
TTG%CTT、CTC,CTAおよびCTG はアミ
ノ酸ロイ7ン(”Leu“)をコード化し、TAG、T
AA>よびTGAは翻訳停止信号であシ、ATGは翻訳
開始信号である。
ノ酸ロイ7ン(”Leu“)をコード化し、TAG、T
AA>よびTGAは翻訳停止信号であシ、ATGは翻訳
開始信号である。
読み忰:mRNAをアミノ酸順序に翻訳する際のコドン
のグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持されねば
ならない。たとえば、順序GCTGGTTGTAAG
を3つの読み枠もしくは相において翻訳することがで
き、その各々は異なるアミノ酸順序を与える。すなわち
、ポリペプチド:隣接するアミノ酸のα−アミン基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によシ互いに結合され
たアミノ酸の線状系列。
のグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持されねば
ならない。たとえば、順序GCTGGTTGTAAG
を3つの読み枠もしくは相において翻訳することがで
き、その各々は異なるアミノ酸順序を与える。すなわち
、ポリペプチド:隣接するアミノ酸のα−アミン基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によシ互いに結合され
たアミノ酸の線状系列。
ゲノム:物質の全DNA 0これは特に物質のポリペプ
チドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進
子およびたとえはシャインータ゛ルカ゛ルノl頃序のよ
うな順序を含むリホ゛ソーム拮合および相互作用順序を
包含する。
チドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進
子およびたとえはシャインータ゛ルカ゛ルノl頃序のよ
うな順序を含むリホ゛ソーム拮合および相互作用順序を
包含する。
構造遺伝子:雛型またはメツセンジャーRNA(”mR
NA”)を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するDNA順序。
NA”)を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するDNA順序。
転 写:構造遺伝子からm RN Aを生成させる過程
。
。
翻 訳:mRNAからポリペプチドを生成させる過程。
表 現:構造遺伝子によシポリベプチドを生成させるた
めに受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
めに受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
プラスミド:完全「レプリコン」からなる非りロモンー
ム二重鎖DNA順序であシ、これによシブラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのDNAの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐
性(Tet)についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに敏感であった細胞をこれに対し
抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異され
た細胞を「変具体(トランスホーマンI−)Jと呼ぶ。
ム二重鎖DNA順序であシ、これによシブラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのDNAの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐
性(Tet)についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに敏感であった細胞をこれに対し
抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異され
た細胞を「変具体(トランスホーマンI−)Jと呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ:細胞性ビールスで
あシ、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆(「カ
プシド」)中にカプセル化でれたDNA順序を有する。
あシ、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆(「カ
プシド」)中にカプセル化でれたDNA順序を有する。
単細胞生物において、ファージは「トランスフェクショ
ン」と呼ばrシ8工程によシ再現する。
ン」と呼ばrシ8工程によシ再現する。
クローン用ベヒクル(cloningvehicle
) :宿主細胞中で再現しうるプラスミド、ファージD
NA−1たはその他のDNA順序であシ、これは7個ま
たは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、こ
の部位においてこのDNA順序はDNAの本質的な生物
学的機能(たとえば再現性)、被覆蛋白質の生成の喪失
または促進子もしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可
能に切断され、またこの部位は変異細胞の同定(たとえ
ばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性)K使
用するのに適する印しを含有する。クローン用ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
) :宿主細胞中で再現しうるプラスミド、ファージD
NA−1たはその他のDNA順序であシ、これは7個ま
たは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、こ
の部位においてこのDNA順序はDNAの本質的な生物
学的機能(たとえば再現性)、被覆蛋白質の生成の喪失
または促進子もしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可
能に切断され、またこの部位は変異細胞の同定(たとえ
ばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性)K使
用するのに適する印しを含有する。クローン用ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化(cloning) : 無性繁殖の過程
オチツド項序からなる混成りNA屓序であり、第一〇頭
片は天然において第二の順序と一緒lて調整するヌクレ
オチットのDNA順序。
オチツド項序からなる混成りNA屓序であり、第一〇頭
片は天然において第二の順序と一緒lて調整するヌクレ
オチットのDNA順序。
次に、第1図を参照すれば、ディン粒子の内生DNAの
略図が示されている。ディン粒子は、肝炎Bビールス感
染した患者の血漿中に検出される(ディー・ニス・ディ
ンおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原江関する肝炎を持った患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセット誌、第1巻、第6り!〜乙り2
号(/り70))。 この粒子は、肝炎Bの感染性ビー
ルス単位(virion )と同一または密接に関連す
ると考えられる。その大きさは知られているが(直径弘
2ナノメータ)、その構造は充分には理解されていない
。一般に、ディン粒子は外1層と内核とからなると信じ
られる。粒子の外層は一般に、肝炎8表面抗原(”HB
sAg”)として知られるポリペプチドを含有する。内
核(直径27ナノメータ)ハ第二のポリペプチドすなわ
ち肝炎B核抗原(“’HBcAg”)ならびに、2./
X / 06ダルトンの内生二重鎖の円形DNA分子
を含有し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有
する。第三のポリペプチド、すなわちe”抗原(”HB
eAg”)もディ/粒子に関係する。さらに、ディン粒
子は内生DNA依存性のDNAポリメラーゼを含むと信
じられ、これはそのDNAをプライマ/雛型として用い
るポリメラーゼ反応によシ内生DNA中の単一ストラン
ド間隙を閉鎖する。ディン粒子、さらに詳しくはそのD
NAの構造および性質は幾つかの分析の主題である(た
とえばダブリュー・ニスΦロビンンン、r肝炎Bビール
スのゲノム」、アニュアル争しビューQオフ゛・マイク
ロバイオロジー、第31巻第3!7〜377頁(/り7
7))。
略図が示されている。ディン粒子は、肝炎Bビールス感
染した患者の血漿中に検出される(ディー・ニス・ディ
ンおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原江関する肝炎を持った患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセット誌、第1巻、第6り!〜乙り2
号(/り70))。 この粒子は、肝炎Bの感染性ビー
ルス単位(virion )と同一または密接に関連す
ると考えられる。その大きさは知られているが(直径弘
2ナノメータ)、その構造は充分には理解されていない
。一般に、ディン粒子は外1層と内核とからなると信じ
られる。粒子の外層は一般に、肝炎8表面抗原(”HB
sAg”)として知られるポリペプチドを含有する。内
核(直径27ナノメータ)ハ第二のポリペプチドすなわ
ち肝炎B核抗原(“’HBcAg”)ならびに、2./
X / 06ダルトンの内生二重鎖の円形DNA分子
を含有し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有
する。第三のポリペプチド、すなわちe”抗原(”HB
eAg”)もディ/粒子に関係する。さらに、ディン粒
子は内生DNA依存性のDNAポリメラーゼを含むと信
じられ、これはそのDNAをプライマ/雛型として用い
るポリメラーゼ反応によシ内生DNA中の単一ストラン
ド間隙を閉鎖する。ディン粒子、さらに詳しくはそのD
NAの構造および性質は幾つかの分析の主題である(た
とえばダブリュー・ニスΦロビンンン、r肝炎Bビール
スのゲノム」、アニュアル争しビューQオフ゛・マイク
ロバイオロジー、第31巻第3!7〜377頁(/り7
7))。
しかしながら、各種の抗原またはその遺伝子の実際の構
造はまだ決定されていない。
造はまだ決定されていない。
ディン粒子の内生DNAは、抽出によりディン粒子から
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの7本のヌクレオチソド鎖(第
1図、ストランドa、〜3000ヌクレオチット)と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチソド鎖(第1
図、ストランド51〜2000ヌクレオチツト)とから
1つている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であり、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合によ)標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第1図に見られる。
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの7本のヌクレオチソド鎖(第
1図、ストランドa、〜3000ヌクレオチット)と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチソド鎖(第1
図、ストランド51〜2000ヌクレオチツト)とから
1つている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であり、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合によ)標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第1図に見られる。
ディン粒子のDNAポリメラーゼは、内生DNAの第二
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することによj)種々の間隙を、
第一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌ
クレオチットで埋めて約3000ヌクレオチツト対の二
重鎖D N Aを与え6と忠われる。
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することによj)種々の間隙を、
第一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌ
クレオチットで埋めて約3000ヌクレオチツト対の二
重鎖D N Aを与え6と忠われる。
肝炎BビールスDNAの調製方法
単一のHBsAg陽性かつHBeAg陽性の供血者(血
清型adym ) からのひと血清を等容量のPH7
≠の緩衝液(0,/ M )リス−HCl% 0.1M
塩水(NaC1)、Q、 /%の2−メルカプトエタノ
ール、0.1%子牛血清アルブミン、ただしチは木切細
書中全てW/V %とする、および0.00/MのED
TA)で希釈した。これを<z’(、にて3j000
rpmで2時間遠心分離した。かく得られたベレットを
200μ)の同じ緩衝液に再懸濁させ、20%の蔗糖を
含有する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を弘℃にて
弘Q、000rpmで2時間遠心分離した。かぐ得られ
たベレットを再びiooμlのPH7zの緩衝液(0,
/ M )リスーHC1101M塩水)に再懸濁させた
。
清型adym ) からのひと血清を等容量のPH7
≠の緩衝液(0,/ M )リス−HCl% 0.1M
塩水(NaC1)、Q、 /%の2−メルカプトエタノ
ール、0.1%子牛血清アルブミン、ただしチは木切細
書中全てW/V %とする、および0.00/MのED
TA)で希釈した。これを<z’(、にて3j000
rpmで2時間遠心分離した。かく得られたベレットを
200μ)の同じ緩衝液に再懸濁させ、20%の蔗糖を
含有する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を弘℃にて
弘Q、000rpmで2時間遠心分離した。かぐ得られ
たベレットを再びiooμlのPH7zの緩衝液(0,
/ M )リスーHC1101M塩水)に再懸濁させた
。
次いで、得られたDNA含有のベレットを3Hまたは3
2pでラベルしくビー嘩エム・カブラン等、「ひと肝炎
B抗原に関係するDNAポリメラーゼ」、ジャーナル・
ヴイロロジー、第12巻第タタ!〜100!頁(lり7
3))で、後の過程における追跡を容易てした。このラ
ベル化は、濃厚ディン粒子と H−もしくは P−ラベ
ルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェ−)(dN
TP)との37℃における≠時間の反応によシ得られる
。このDNAポリメラーゼ反応の後、DNA中の単一ス
トランド間隙は部分的に閉鎖され(第1図参照)、ラベ
ル化された材料を蔗糖30%含有の遠沈管の頂部に層化
させ、≠℃にて弘QOOOrpmで3.!時間遠心分離
した。
2pでラベルしくビー嘩エム・カブラン等、「ひと肝炎
B抗原に関係するDNAポリメラーゼ」、ジャーナル・
ヴイロロジー、第12巻第タタ!〜100!頁(lり7
3))で、後の過程における追跡を容易てした。このラ
ベル化は、濃厚ディン粒子と H−もしくは P−ラベ
ルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェ−)(dN
TP)との37℃における≠時間の反応によシ得られる
。このDNAポリメラーゼ反応の後、DNA中の単一ス
トランド間隙は部分的に閉鎖され(第1図参照)、ラベ
ル化された材料を蔗糖30%含有の遠沈管の頂部に層化
させ、≠℃にて弘QOOOrpmで3.!時間遠心分離
した。
次いで、DNAを得られたベレットからフェノールによ
シ抽出した(エル・アイ・ルトウイツクおよびダブリュ
ー・ニス・ロビンンン、「肝炎Bディン粒子DNAポリ
メラーゼ反応で合成されるDNAJ、 ジャーナル・ヴ
イロロジー、第27巻第76〜10≠頁(/り77)の
手順を使用)。次いで、抽出されたDNAを007Mト
リス−HCl%Q、00/MのEDTAの溶液(pHr
、 o )で透析してフェノール溶すを除去した。かく
して単離されたDNAは制置酵素消化に対して準備でき
た。これは〜/ 08cpm/μyの比放射活性を示し
た。上記した方法を概略第2図に示す。
シ抽出した(エル・アイ・ルトウイツクおよびダブリュ
ー・ニス・ロビンンン、「肝炎Bディン粒子DNAポリ
メラーゼ反応で合成されるDNAJ、 ジャーナル・ヴ
イロロジー、第27巻第76〜10≠頁(/り77)の
手順を使用)。次いで、抽出されたDNAを007Mト
リス−HCl%Q、00/MのEDTAの溶液(pHr
、 o )で透析してフェノール溶すを除去した。かく
して単離されたDNAは制置酵素消化に対して準備でき
た。これは〜/ 08cpm/μyの比放射活性を示し
た。上記した方法を概略第2図に示す。
上記のように単離した二重鎖DNAを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。
たとえば、有用なりローン用ペヒクルハクロモソーム系
、非りロモソーム系および合成のDNA項序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド(たとえばpBRj 22、
その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体)
、および広宿主範囲のプラスミド(たとえばRP弘)、
ファージDNAたとえば多種のファージλの誘導体(た
とえばN M Iタタ)、およびプラスミドとファージ
DNAとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえば
ファージDNA表現制御順序を使用するよう改変したプ
ラスミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイ
ー・コIJX/77A、イーーコリXλ2rノ、イー−
コリHB / 0 /およびイー・コリMRC/ およ
びシュードモナス、バチルス・ズブチリスおよびその他
細菌の菌株、酵母薗およびその細菌類、動物または植物
宿主(たとえば培養動物もしくは植物細胞)、およびそ
の他宿主を包含する。勿論、全ての宿主が同等の効果を
もつものではない。宿主−クローン用ベヒクル組合せ物
の特定の選択は、本発明の範囲から逸脱することなく上
記の原理を正当て考慮して当業者が行なうことができる
。
、非りロモソーム系および合成のDNA項序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド(たとえばpBRj 22、
その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体)
、および広宿主範囲のプラスミド(たとえばRP弘)、
ファージDNAたとえば多種のファージλの誘導体(た
とえばN M Iタタ)、およびプラスミドとファージ
DNAとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえば
ファージDNA表現制御順序を使用するよう改変したプ
ラスミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイ
ー・コIJX/77A、イーーコリXλ2rノ、イー−
コリHB / 0 /およびイー・コリMRC/ およ
びシュードモナス、バチルス・ズブチリスおよびその他
細菌の菌株、酵母薗およびその細菌類、動物または植物
宿主(たとえば培養動物もしくは植物細胞)、およびそ
の他宿主を包含する。勿論、全ての宿主が同等の効果を
もつものではない。宿主−クローン用ベヒクル組合せ物
の特定の選択は、本発明の範囲から逸脱することなく上
記の原理を正当て考慮して当業者が行なうことができる
。
さらに1各特定ベクター中には、単離された二重鎖DN
Aを挿入するため種々な部位を選択することができる。
Aを挿入するため種々な部位を選択することができる。
通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、p
BRJ、l!λにおいては、Pst /部位はペニシリ
ナーゼ遺伝子中におけるベニシリナーゼ蛋白のアミノ酸
/♂/および/♂2をコード化する。ヌクレオチソドト
リプレソトの間に位置する。この部位は、ラッテプロイ
ンツユリン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のビラー
コマロフ等により用いられた。Hind llエンドヌ
クレアーゼ識別部位は、アミノ酸10/および10−2
をコード化するトリプレットの間に存在し、 Tag部
位はpBR322におけるその蛋白のアミノ酸≠5をコ
ード化するトリプレットに存在する。同様に、このプラ
スミドに対するEco RIエンドヌクレアーゼ識別部
位は、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに
対する耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この
部位は、イタクラ等およびゲデル等によシ、上記した組
換、えDNA合成法において使用された。第2図および
第11図は、例示の目的でプラスミドpBRJ2−2お
よびファージλNMりgりにおける幾つかの制限部位を
示している。
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、p
BRJ、l!λにおいては、Pst /部位はペニシリ
ナーゼ遺伝子中におけるベニシリナーゼ蛋白のアミノ酸
/♂/および/♂2をコード化する。ヌクレオチソドト
リプレソトの間に位置する。この部位は、ラッテプロイ
ンツユリン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のビラー
コマロフ等により用いられた。Hind llエンドヌ
クレアーゼ識別部位は、アミノ酸10/および10−2
をコード化するトリプレットの間に存在し、 Tag部
位はpBR322におけるその蛋白のアミノ酸≠5をコ
ード化するトリプレットに存在する。同様に、このプラ
スミドに対するEco RIエンドヌクレアーゼ識別部
位は、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに
対する耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この
部位は、イタクラ等およびゲデル等によシ、上記した組
換、えDNA合成法において使用された。第2図および
第11図は、例示の目的でプラスミドpBRJ2−2お
よびファージλNMりgりにおける幾つかの制限部位を
示している。
選択DNA断片をクローン用ベヒクル中に挿入して組換
えD N A分子を生成させるため選択される特定部位
は種々の因子番でより決定される。
えD N A分子を生成させるため選択される特定部位
は種々の因子番でより決定される。
これらは表現すべきポリペプチドの寸法および構造、宿
主細胞成分による内生酵素分解に対する所望ポリペプチ
ドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば閉止お
よび停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当業
者に知られたその他因子を包含する。表現過程は充分に
は理解されていないので、これら因子はいずれも単独で
は特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制
御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラン
スさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全ての
部位が同等の効果を示すものではない。
主細胞成分による内生酵素分解に対する所望ポリペプチ
ドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば閉止お
よび停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当業
者に知られたその他因子を包含する。表現過程は充分に
は理解されていないので、これら因子はいずれも単独で
は特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制
御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラン
スさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全ての
部位が同等の効果を示すものではない。
外来DNAをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えD
NA分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第2図に示す
。これは、ディン粒子DNAを制限エンドヌクレアーゼ
により開裂させ、開裂DNAの3′末端(DNA糖骨格
のデオキシリポース炭素から便宜上名付けられる)にポ
リープオキシC順序を付加させ、そして伸長したDNA
をクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、た
だしクローン用ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼによ
り特定部位で切断されて、その切断の3′末端に開裂D
NAのボIJ−dC順序に対し補完的なポリデオキシG
順序を伸長させたものを使用する。DNAおよびクロー
ン用ベヒクルの3′末端の補完的性質はこれら末端の結
合を可能にする。
NA分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第2図に示す
。これは、ディン粒子DNAを制限エンドヌクレアーゼ
により開裂させ、開裂DNAの3′末端(DNA糖骨格
のデオキシリポース炭素から便宜上名付けられる)にポ
リープオキシC順序を付加させ、そして伸長したDNA
をクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、た
だしクローン用ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼによ
り特定部位で切断されて、その切断の3′末端に開裂D
NAのボIJ−dC順序に対し補完的なポリデオキシG
順序を伸長させたものを使用する。DNAおよびクロー
ン用ベヒクルの3′末端の補完的性質はこれら末端の結
合を可能にする。
本発明の方法において有用であるためには、HB V
−D N Aを開裂させるのに選択される制限酵素は、
HBV抗原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子
の必須部分内においてHBV・DNAを開裂してはなら
ず、特に好適には制限された数の部位にてDNAを開裂
すべきである。本発明で使用された制限酵素はKpn’
Lμ已・B、と・HI、Ava * (およびと−R1
を包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同様に
本発明において使用することができる。
−D N Aを開裂させるのに選択される制限酵素は、
HBV抗原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子
の必須部分内においてHBV・DNAを開裂してはなら
ず、特に好適には制限された数の部位にてDNAを開裂
すべきである。本発明で使用された制限酵素はKpn’
Lμ已・B、と・HI、Ava * (およびと−R1
を包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同様に
本発明において使用することができる。
これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することなく、上
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。
第3〜り図は、HBVゲノムの一部における制限エンド
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
勿論、DNA順序をクローン用ベヒクル中に挿入して組
換えDNA分子を生成させるその他公知の方法も同等に
本発明において使用される。
換えDNA分子を生成させるその他公知の方法も同等に
本発明において使用される。
これらには、たとえば同一の制限エンドヌクレアーゼを
使用してHB V−D N Aとクローン用ベヒクルと
を開裂させるような直接結紮、云が包含される。この方
法は本質的に補完的端部を結合に供する。
使用してHB V−D N Aとクローン用ベヒクルと
を開裂させるような直接結紮、云が包含される。この方
法は本質的に補完的端部を結合に供する。
勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入された
ヌクレオチット順序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’aDNA西己ダリを1
申入しても変異された宿主ばHBVK原性を示すポリペ
プチドを生産することの−S’ h”’W ?である。
ヌクレオチット順序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’aDNA西己ダリを1
申入しても変異された宿主ばHBVK原性を示すポリペ
プチドを生産することの−S’ h”’W ?である。
。
混成遺伝子を含有する組換えDNA分子を使用して宿主
を変異させ、この宿主(変異体)が構造遺伝子=fcは
その断片を表現しかつ混成DNAのコード化するポリペ
プチドまたはその一部を生産するようにさせることもで
きる。また組換えDNA分子を使用して宿主を変異させ
、この宿主が再現性をもって付加的な組換えDNA分子
をHBV構造遺伝子およびその断片の源泉として生産す
るようにさせることもできる。これらいずれかの使用て
対する適当な宿主の選択は、当分野で知られた多くの因
子によシ管理される。これらの因子には、たとえば選択
ベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望ポリペプチ
ドの回収容易性、表現特性、生物学的安全性および価格
が包含される。また、表現のメカニズムは充分には理解
されていないので、宿主の絶対的選択をこれら因子のい
ずれか単独によシ特定の組換えDNA分子またはポリペ
プチドGてついて行なうことはできないであろう。寧ろ
、特定の組換えDNA分子の表現に対し全ての宿主が同
等の効果を示しえないという現実に鑑みてこれら因子を
バランスさせねばならない。
を変異させ、この宿主(変異体)が構造遺伝子=fcは
その断片を表現しかつ混成DNAのコード化するポリペ
プチドまたはその一部を生産するようにさせることもで
きる。また組換えDNA分子を使用して宿主を変異させ
、この宿主が再現性をもって付加的な組換えDNA分子
をHBV構造遺伝子およびその断片の源泉として生産す
るようにさせることもできる。これらいずれかの使用て
対する適当な宿主の選択は、当分野で知られた多くの因
子によシ管理される。これらの因子には、たとえば選択
ベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望ポリペプチ
ドの回収容易性、表現特性、生物学的安全性および価格
が包含される。また、表現のメカニズムは充分には理解
されていないので、宿主の絶対的選択をこれら因子のい
ずれか単独によシ特定の組換えDNA分子またはポリペ
プチドGてついて行なうことはできないであろう。寧ろ
、特定の組換えDNA分子の表現に対し全ての宿主が同
等の効果を示しえないという現実に鑑みてこれら因子を
バランスさせねばならない。
本発明の合成において、好適なりローン用ベヒクルは細
菌性プラスミドpBRJ22であシ、そこの好適な制限
エンドヌクレアーゼ部(DaPst/部位である(第2
図)。このプラスミドは、抗生物質アンピシリン(Am
p)およびテトラサイクリン(Tet)に対する耐性遺
伝子を担持する小さい(分子量約26メガダルトン)プ
ラスミドである。プラスミドは充分に特性化されている
(エフ・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒクル
Hの構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン、
第り5〜773頁(/り77))。本発明による好適な
宿主はイー・コリHE101である。
菌性プラスミドpBRJ22であシ、そこの好適な制限
エンドヌクレアーゼ部(DaPst/部位である(第2
図)。このプラスミドは、抗生物質アンピシリン(Am
p)およびテトラサイクリン(Tet)に対する耐性遺
伝子を担持する小さい(分子量約26メガダルトン)プ
ラスミドである。プラスミドは充分に特性化されている
(エフ・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒクル
Hの構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン、
第り5〜773頁(/り77))。本発明による好適な
宿主はイー・コリHE101である。
t dC−伸長化したディン粒子DNAの調型本発明
の好適具体例の実際的実施ておいて、ディン粒子から上
記のように単離したD N Aを制限エンドヌクレアー
ゼKpn l (/ OmMOト’) ス−HCl (
pH76)、/ 0’mM CI MgC12,10m
Mの2−メルカプトエタノール、a。
の好適具体例の実際的実施ておいて、ディン粒子から上
記のように単離したD N Aを制限エンドヌクレアー
ゼKpn l (/ OmMOト’) ス−HCl (
pH76)、/ 0’mM CI MgC12,10m
Mの2−メルカプトエタノール、a。
mMのNaCl、o、5ttzノ酵素調製物10μl中
のDNA約2On、51)により37℃にてり0分間消
化させ、開胸酵素を70℃、5分間の加熱によシネ活性
化させた。ポリープオキシC順序(例示の目的で第2図
にはCCCとして示f)を、フェノールおよびクロロホ
ルム(各20μl)での抽出により残留蛋白質を除去し
た後、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼとの標
準的反応により消化生成物の3′末端に付加させた。エ
ーテルでの抽出によジフェノールを水相から除去し、j
Mの酢酸ナトリウム、pH&、!(!μl)と冷エタノ
ール0. / mlとの添加によp DNAを沈殿させ
た。−70℃に1時間保った後、沈殿DNAを/ Q、
000 rpmで20分間遠心分離して回収し、このベ
レットを/ OmMのトIJス−HCl 、 pH76
(/ 0μIり中に溶解させた。
のDNA約2On、51)により37℃にてり0分間消
化させ、開胸酵素を70℃、5分間の加熱によシネ活性
化させた。ポリープオキシC順序(例示の目的で第2図
にはCCCとして示f)を、フェノールおよびクロロホ
ルム(各20μl)での抽出により残留蛋白質を除去し
た後、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼとの標
準的反応により消化生成物の3′末端に付加させた。エ
ーテルでの抽出によジフェノールを水相から除去し、j
Mの酢酸ナトリウム、pH&、!(!μl)と冷エタノ
ール0. / mlとの添加によp DNAを沈殿させ
た。−70℃に1時間保った後、沈殿DNAを/ Q、
000 rpmで20分間遠心分離して回収し、このベ
レットを/ OmMのトIJス−HCl 、 pH76
(/ 0μIり中に溶解させた。
これに3μlのu00mMカコジル酸カリウム(PHz
O)と44mMの塩化コバルトとvmMのデオキシ7ト
シントリホスフエート (dCTP)とxoOtt9/”ml(D子牛血清アル
ブミンとを加え、 ’t1合物を0. jμlのポリヌ
クレオチド末端トランスフェラーゼ(too。
O)と44mMの塩化コバルトとvmMのデオキシ7ト
シントリホスフエート (dCTP)とxoOtt9/”ml(D子牛血清アル
ブミンとを加え、 ’t1合物を0. jμlのポリヌ
クレオチド末端トランスフェラーゼ(too。
u/me) と共に27℃にて10分間培養しそして
よOmMのEDTA(/μlりを添加して反応を停止さ
せた。
よOmMのEDTA(/μlりを添加して反応を停止さ
せた。
32−2の調製
プラスミドpBRJ2λを制限エンドヌクレアー−t/
Pst [(これに対しプラスミドは7つの目標を有す
る)によシ消化し、この生成物をHBV、DNAについ
て上記したようにフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精美した。ポリ−’ d G順序(例示の目的で
第2図にGGGとして示す)を、HBVに対するポ17
−dC順序の付加について上記したように、末端トラン
スフェラーゼによりi状pBRJjJの3′末端に付加
させ、ただしこの場合反応は37°Cにて行なった。
Pst [(これに対しプラスミドは7つの目標を有す
る)によシ消化し、この生成物をHBV、DNAについ
て上記したようにフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精美した。ポリ−’ d G順序(例示の目的で
第2図にGGGとして示す)を、HBVに対するポ17
−dC順序の付加について上記したように、末端トラン
スフェラーゼによりi状pBRJjJの3′末端に付加
させ、ただしこの場合反応は37°Cにて行なった。
次いで、等モル量のpBRJ22−ポリ−dGとHBV
・DNA−ポリ−dCとを混合し、補完的、順序を10
0mMのNaCl、j Om AIのトリス−MCI(
pH7j)、jmM(7)EDTA(TNE)(70μ
l)中にて65′Cで7時間、次いで≠7℃で1時間、
37℃で1時間およびコ0°C″[/vj間培養するこ
とにより結合させ、そして等容量のTNEと20μlの
io。
・DNA−ポリ−dCとを混合し、補完的、順序を10
0mMのNaCl、j Om AIのトリス−MCI(
pH7j)、jmM(7)EDTA(TNE)(70μ
l)中にて65′Cで7時間、次いで≠7℃で1時間、
37℃で1時間およびコ0°C″[/vj間培養するこ
とにより結合させ、そして等容量のTNEと20μlの
io。
mMのMgCI 2.100mMのCaCl2.100
mMのトリス−HCl!(pH7,5)とを加えた。
mMのトリス−HCl!(pH7,5)とを加えた。
4、 イー・コリHB10/の変異
変異に適したイー・コIJHB/(17/の培養it−
、イー・エム争し−ターヘルクオヨヒエス・−エッチ・
ローヘンによシ「プラスミドデオキシリポ核酸によるサ
ルモネラ・チフイムリウムの変異」、ジャーナル・バク
テリオロジー、第11り巻、第1072〜107弘頁(
/97弘)に記載されているよつに調装した。
、イー・エム争し−ターヘルクオヨヒエス・−エッチ・
ローヘンによシ「プラスミドデオキシリポ核酸によるサ
ルモネラ・チフイムリウムの変異」、ジャーナル・バク
テリオロジー、第11り巻、第1072〜107弘頁(
/97弘)に記載されているよつに調装した。
細胞の0. / ’n1部をアニールされたDNA調製
物λ!μでと混合し、0℃で20分間培養し、次いで2
0℃にて70分間培養した後、テトラサイクリン(jO
μy /rtv: >を含有するL−寒天板上に塗床し
て37℃で一晩培養した。
物λ!μでと混合し、0℃で20分間培養し、次いで2
0℃にて70分間培養した後、テトラサイクリン(jO
μy /rtv: >を含有するL−寒天板上に塗床し
て37℃で一晩培養した。
プラスミドpBRj22はテトラサイクリン耐性につい
ての遺伝子を有するので、このプラスミドによシ変異さ
れたイー・コリ集落は、このように変異されなかったイ
ー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養物
中−で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリ
ン含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の
選択を可能にする。
ての遺伝子を有するので、このプラスミドによシ変異さ
れたイー・コリ集落は、このように変異されなかったイ
ー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養物
中−で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリ
ン含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の
選択を可能にする。
5、 交雑化によるイー・コリ集落のスクリーニング
培養されたテトラサイクリン含有し一寒天板上に増殖し
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドpBRjココはアンピシリン耐性につい
ての遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の提
案部位である。したがって、選定識別部位に挿入された
DNAを有するプラスミドによシ変異された集落はアン
ビアリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに対
する耐性を保持するであろう。アンピシリンに対し感受
性であるがテトラサイクリンに対し耐性であったイー・
コリ集落を、テトラサイクリンを含有するL−g天板上
に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの円板
の上に載置した。37℃で一晩増殖させた後、このミリ
ポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェニコ
ール(/!0μp/mi;) トt−含有する新たなL
−寒天板に移し、37℃にてさらに数時間培養して細胞
内のプラスミドのコピー数を増加させた(第2図)。次
いで、エム争グルンスタインおよヒティー〇ニス・ホグ
ネスにより「集落交雑化;特異遺伝子を含有するクロー
ン化DNAの単離方法」、プロシープインク会す7ヨナ
ルΦアカデミ−・サイエンス、U、S、A、 第7 j
%第、35> j / 〜3り61頁(/97りに記
載されているように、集落交雑化のため、前記でtu’
l製した32p−ラベルされたHBV−DNAを試4F
とじてミリポアフィルタ−を使用した。フィルターのラ
ジオオートグラフは、標準HBV−DNAに対し補完的
なり N A順序を含有する集落の存在を示した。
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドpBRjココはアンピシリン耐性につい
ての遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の提
案部位である。したがって、選定識別部位に挿入された
DNAを有するプラスミドによシ変異された集落はアン
ビアリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに対
する耐性を保持するであろう。アンピシリンに対し感受
性であるがテトラサイクリンに対し耐性であったイー・
コリ集落を、テトラサイクリンを含有するL−g天板上
に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの円板
の上に載置した。37℃で一晩増殖させた後、このミリ
ポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェニコ
ール(/!0μp/mi;) トt−含有する新たなL
−寒天板に移し、37℃にてさらに数時間培養して細胞
内のプラスミドのコピー数を増加させた(第2図)。次
いで、エム争グルンスタインおよヒティー〇ニス・ホグ
ネスにより「集落交雑化;特異遺伝子を含有するクロー
ン化DNAの単離方法」、プロシープインク会す7ヨナ
ルΦアカデミ−・サイエンス、U、S、A、 第7 j
%第、35> j / 〜3り61頁(/97りに記
載されているように、集落交雑化のため、前記でtu’
l製した32p−ラベルされたHBV−DNAを試4F
とじてミリポアフィルタ−を使用した。フィルターのラ
ジオオートグラフは、標準HBV−DNAに対し補完的
なり N A順序を含有する集落の存在を示した。
テトラサイクリンに耐性であり、アンピシリンに感受性
であシかつ標準HBV・DNAで交雑化した集落を、H
BV抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも7種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のし一寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、37℃で一晩
培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病法を感
染させたく感染度約/の倍率)イー・コIJ C400
の培養物(軟質寒天−2mC中0. / me )、を
有する第二のL−寒天板で覆い、37℃で一晩培養し、
その際細菌叢は総合的にファージ(λヴイル)により溶
菌された(丁なわち、実質的に全ての宿主細胞壁が破裂
した)。本発明により変異された細胞を含有するミリポ
アフィルタ−を板から釣り上げ、集落を下面としてλヴ
イルで溶菌されたイー・コリctooのL−寒天板の表
面に接怠させた。この接触を約70分間続けて、ミリポ
アフィルタ−上に存在する細胞のλヴイルによる感染を
行なわせた。
であシかつ標準HBV・DNAで交雑化した集落を、H
BV抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも7種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のし一寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、37℃で一晩
培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病法を感
染させたく感染度約/の倍率)イー・コIJ C400
の培養物(軟質寒天−2mC中0. / me )、を
有する第二のL−寒天板で覆い、37℃で一晩培養し、
その際細菌叢は総合的にファージ(λヴイル)により溶
菌された(丁なわち、実質的に全ての宿主細胞壁が破裂
した)。本発明により変異された細胞を含有するミリポ
アフィルタ−を板から釣り上げ、集落を下面としてλヴ
イルで溶菌されたイー・コリctooのL−寒天板の表
面に接怠させた。この接触を約70分間続けて、ミリポ
アフィルタ−上に存在する細胞のλヴイルによる感染を
行なわせた。
次いで、ミリポアフィルタ−をL−寒天の新たな板に移
し、37℃でさらに5時間培養した。その間、ニス・プ
ルームおよびダブりニー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法」、プ
ロシーディング・ナショナル会アカデミ−・サイエンス
、U、S、A、 第75巻第27弘6〜27弘り頁(l
り7F)に記載されているように、HBV抗体でポリビ
ニル円板を被覆した。
し、37℃でさらに5時間培養した。その間、ニス・プ
ルームおよびダブりニー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法」、プ
ロシーディング・ナショナル会アカデミ−・サイエンス
、U、S、A、 第75巻第27弘6〜27弘り頁(l
り7F)に記載されているように、HBV抗体でポリビ
ニル円板を被覆した。
変異した細菌集落が明白に溶菌し・たミリポアフィルタ
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、μ
℃に3時間保った。この接触の結果、ミリポアフィルタ
−上の細胞から溶出したHBV抗原は全て日板の)IB
M抗体と結合する5被覆円板をミ+)ボアフィルターか
ら分離し、次いで洗浄して エーフヘルされたHBV
抗体と共に培養した。この培5の結果、ミリポアフィル
タ−からの)fBV抗原が円板のHBV抗体により事前
に結合きれてしまった円板上の個所が放射活性となる。
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、μ
℃に3時間保った。この接触の結果、ミリポアフィルタ
−上の細胞から溶出したHBV抗原は全て日板の)IB
M抗体と結合する5被覆円板をミ+)ボアフィルターか
ら分離し、次いで洗浄して エーフヘルされたHBV
抗体と共に培養した。この培5の結果、ミリポアフィル
タ−からの)fBV抗原が円板のHBV抗体により事前
に結合きれてしまった円板上の個所が放射活性となる。
洗浄後、上記プルームおよびギルバートにより記載され
ている=うにラジオオートグラフィーにかけると、)I
BM抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落は
ラジオオートグラフによシ位置確認された。
ている=うにラジオオートグラフィーにかけると、)I
BM抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落は
ラジオオートグラフによシ位置確認された。
HBV抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるHBV抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう設計した方法およ
び装置(・ζ使用することができる。
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるHBV抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう設計した方法およ
び装置(・ζ使用することができる。
たとえば、本発明の組換えDNA分子によシ変異された
宿主により生産されるHBcAgを、肝炎Bビールス検
知のため現在利用しつる免疫学的診断試験、すなわち放
射性免疫分析法またはエリザ(ELISA、酵素結合免
疫吸着分析法)、に使用することができる。放射性免疫
分析法の−型式においては、実験動物中に成育させた抗
−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側に付着さ
せる。次いで、この試験管にHBcAgを加えて抗体と
結合させる。抗原−抗体複合物により被覆されたこの試
験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射性沃素のよ
うな放射性同位元素でラベルしたHBV抗−核抗体の既
知量を添加する。患者血清中のHBV抗体は、抗原−抗
体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体と競合する
であろう。血清を作用させた後、過剰の液体を除去し、
試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定する。陽性の
結果、すなわち思考面mがHBV抗体を含有するという
結果(ζ、低放射計数によって示される。エリザ試験法
の一型弐においては、マイクロ滴定板をHB c A
gで被覆し、これに患者血清の試料を加える。抗体と抗
原とを反応させる培養期間の後、板体を洗浄しそして実
験動物で成育させかつ酵素ラベルに結合させた抗−ひと
抗体の調製物を加え、培養して反応を生せしめ、次いで
板体を再洗浄する。その後、酵素基質をマイクロ滴定板
に加え、酵素を基質に作用させる期間培養しそして最終
調製物の吸着率を測定する。吸着率における大きな変化
は陽性結果を示す。
宿主により生産されるHBcAgを、肝炎Bビールス検
知のため現在利用しつる免疫学的診断試験、すなわち放
射性免疫分析法またはエリザ(ELISA、酵素結合免
疫吸着分析法)、に使用することができる。放射性免疫
分析法の−型式においては、実験動物中に成育させた抗
−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側に付着さ
せる。次いで、この試験管にHBcAgを加えて抗体と
結合させる。抗原−抗体複合物により被覆されたこの試
験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射性沃素のよ
うな放射性同位元素でラベルしたHBV抗−核抗体の既
知量を添加する。患者血清中のHBV抗体は、抗原−抗
体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体と競合する
であろう。血清を作用させた後、過剰の液体を除去し、
試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定する。陽性の
結果、すなわち思考面mがHBV抗体を含有するという
結果(ζ、低放射計数によって示される。エリザ試験法
の一型弐においては、マイクロ滴定板をHB c A
gで被覆し、これに患者血清の試料を加える。抗体と抗
原とを反応させる培養期間の後、板体を洗浄しそして実
験動物で成育させかつ酵素ラベルに結合させた抗−ひと
抗体の調製物を加え、培養して反応を生せしめ、次いで
板体を再洗浄する。その後、酵素基質をマイクロ滴定板
に加え、酵素を基質に作用させる期間培養しそして最終
調製物の吸着率を測定する。吸着率における大きな変化
は陽性結果を示す。
本発明のイー・コリにおける組換えDNA分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、HBcAgを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容量のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、HBcAgを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容量のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。
2匹の動物には重装の細菌抽出物を与え、また2匹の動
物には同じ抽出物の試料をセファデノクスtjOカラム
での分画の後に加えた。さらに、凍結および貯麓した(
充分な抗原活性を保持する)同じ試料の注射を、最初の
注射から2週間後および!週間後に与えた。これら動物
を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出血さ
せた。
物には同じ抽出物の試料をセファデノクスtjOカラム
での分画の後に加えた。さらに、凍結および貯麓した(
充分な抗原活性を保持する)同じ試料の注射を、最初の
注射から2週間後および!週間後に与えた。これら動物
を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出血さ
せた。
オー・オウチタロニーにより「免疫拡散2よび免疫電気
泳動」、ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・イ
ミュノロジー(ディー・ダブリュー・ウェア編、ブラッ
クウェル・サイエンティフインク出版社、オツクスフオ
ート・およびニシンバラ)、第1り章(lりJ7)に記
載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清(
抗体)をひと肝臓から得られたHBcAgを使用してひ
と肝炎Bビールス核抗体(”HBcAb”)と比較した
(ビー・リュー・ローへ7およびワイ・イー・コサルト
、「肝炎B核捷原に対する抗体のスクリーニング試験の
応用」、ジャーナル・クリニカル・パソロジー、第30
巻第702〜7/3頁(/り77))。弘匹の兎の血清
全ては、人間から得られたHBcAgとHBcAbとの
間に形成されたものと同一の、 HBcAgを有する沈
降素ラインを与えた。したがって、本発明の組換えDN
A分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生体内
において血清学的に活性である。この活性は、微生物細
胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物および方
法を人間における抗体形成の刺戟のために使用しうろこ
とを確立した。この種の組成物および方法は、本発明で
製造された組換えDNA分子によシ変異された宿主が生
産するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプチ
ドは、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置お
よび予防のだめの組成物および方法に使用される当分野
で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤の
如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用されるで
あろう。
泳動」、ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・イ
ミュノロジー(ディー・ダブリュー・ウェア編、ブラッ
クウェル・サイエンティフインク出版社、オツクスフオ
ート・およびニシンバラ)、第1り章(lりJ7)に記
載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清(
抗体)をひと肝臓から得られたHBcAgを使用してひ
と肝炎Bビールス核抗体(”HBcAb”)と比較した
(ビー・リュー・ローへ7およびワイ・イー・コサルト
、「肝炎B核捷原に対する抗体のスクリーニング試験の
応用」、ジャーナル・クリニカル・パソロジー、第30
巻第702〜7/3頁(/り77))。弘匹の兎の血清
全ては、人間から得られたHBcAgとHBcAbとの
間に形成されたものと同一の、 HBcAgを有する沈
降素ラインを与えた。したがって、本発明の組換えDN
A分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生体内
において血清学的に活性である。この活性は、微生物細
胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物および方
法を人間における抗体形成の刺戟のために使用しうろこ
とを確立した。この種の組成物および方法は、本発明で
製造された組換えDNA分子によシ変異された宿主が生
産するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプチ
ドは、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置お
よび予防のだめの組成物および方法に使用される当分野
で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤の
如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用されるで
あろう。
前記したように、本発明の組換えD N A分子を製造
するには、上記f(pn [/PsL [組合せ物取外
の制限酵素も有効に使用することができる。プラスミド
pBRJ12およびHBVゲノムの一部における他の制
限部位をそれぞれ第2図および第3図に示す。これらの
代案となるが余り好適でない具体例を説明するため、以
下に実施レリ?示す。
するには、上記f(pn [/PsL [組合せ物取外
の制限酵素も有効に使用することができる。プラスミド
pBRJ12およびHBVゲノムの一部における他の制
限部位をそれぞれ第2図および第3図に示す。これらの
代案となるが余り好適でない具体例を説明するため、以
下に実施レリ?示す。
B+sm@HI、Eco*RI、Bgl −[−Pst
1組合せKpnlにより生成されたものとは異なシ、
l二・Hl、旦二・R1およびシ已・■の使用によシ生
成されたHBV、DNA断片は、短、かいsl−単一ス
トランド突出部が存在するため、直接に末端結合させる
ことが便利にできなかった。したがって、これらは、3
′末端にポ!J −dC順序を付加させる前に、λエキ
ソヌクレアーゼで処理して上記突出部を除去した。これ
は、制限されたDNA (前記したように10μlの溶
液)ヲ/ヨμlの/ 00 mMグリシン酸ナトリウム
(pHzり、10mMのMgC+ 2 ; ” / 0
.0 μl) /Inlの子牛血清アルブミン、よμl
のλエキソヌクレアーゼと共にQ″CCンC,7時間培
養することにより行なった。次いで、混合物をフェノー
ルとクロロホルムとで抽出し、工程を続けた。13am
・Hlを使用した調製物の場合、後の放射免疫分析法に
よp HBV抗原特異性を有するポリペプチドの生成を
確認した。
1組合せKpnlにより生成されたものとは異なシ、
l二・Hl、旦二・R1およびシ已・■の使用によシ生
成されたHBV、DNA断片は、短、かいsl−単一ス
トランド突出部が存在するため、直接に末端結合させる
ことが便利にできなかった。したがって、これらは、3
′末端にポ!J −dC順序を付加させる前に、λエキ
ソヌクレアーゼで処理して上記突出部を除去した。これ
は、制限されたDNA (前記したように10μlの溶
液)ヲ/ヨμlの/ 00 mMグリシン酸ナトリウム
(pHzり、10mMのMgC+ 2 ; ” / 0
.0 μl) /Inlの子牛血清アルブミン、よμl
のλエキソヌクレアーゼと共にQ″CCンC,7時間培
養することにより行なった。次いで、混合物をフェノー
ルとクロロホルムとで抽出し、工程を続けた。13am
・Hlを使用した調製物の場合、後の放射免疫分析法に
よp HBV抗原特異性を有するポリペプチドの生成を
確認した。
上記したようにDNA断片を末端結合させる代シに、本
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別の2種の調製物ニオイテは、
HBV、DNA(uOnl)を10mMのトリス−MC
I(pH77)、10mMのMg Cl 2.10mM
の2−メルカプトエタノール、jOmMのNaC1(/
0 μlり中において制限エンドヌクレアーゼEco
−RIまたはシニ・HIにより37℃にて/、5時間制
限化処理し、同一条件下で同一酵素と共に培養された過
剰のpBRJ22と混合した。濃厚緩衝溶液〔360m
Mのトリス−H,CI (pH7j )、100mMの
Mg C! 2.10mMのEDTA、100mMの2
−メルカプトエタノール、弘00 mNIのNaCl、
/mMのATP〕(2μIりを加え、この混合物をT≠
・DNAリガーゼ(0,jμIりと共に10℃で3時間
、次いで0℃で少なくとも2≠時間培養した。この浴R
’fr:/ OmMのトリx−f(CI(pH7りによ
り 0.7 meに希釈し、前記したよ5にイー・コリ
HB10/の適当な培養物を変異させるのに使用した。
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別の2種の調製物ニオイテは、
HBV、DNA(uOnl)を10mMのトリス−MC
I(pH77)、10mMのMg Cl 2.10mM
の2−メルカプトエタノール、jOmMのNaC1(/
0 μlり中において制限エンドヌクレアーゼEco
−RIまたはシニ・HIにより37℃にて/、5時間制
限化処理し、同一条件下で同一酵素と共に培養された過
剰のpBRJ22と混合した。濃厚緩衝溶液〔360m
Mのトリス−H,CI (pH7j )、100mMの
Mg C! 2.10mMのEDTA、100mMの2
−メルカプトエタノール、弘00 mNIのNaCl、
/mMのATP〕(2μIりを加え、この混合物をT≠
・DNAリガーゼ(0,jμIりと共に10℃で3時間
、次いで0℃で少なくとも2≠時間培養した。この浴R
’fr:/ OmMのトリx−f(CI(pH7りによ
り 0.7 meに希釈し、前記したよ5にイー・コリ
HB10/の適当な培養物を変異させるのに使用した。
シュ・HI調製した組換えDNA分子の場合、交雑化に
対するスクリーニングの前に、集落をアンピシリンに対
してでなくテトラサイクリンに対する感度について試験
した。
対するスクリーニングの前に、集落をアンピシリンに対
してでなくテトラサイクリンに対する感度について試験
した。
何故なら、pBRj 22中の、b皿・HIの目標はテ
トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にあシ、シ
たがってこの識別部位〈おいて上手に挿入すればPst
1部位における挿入の場合と同様にアンピシリン耐性で
なくテトラサイクリン耐性の喪失が生ずるからである。
トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にあシ、シ
たがってこの識別部位〈おいて上手に挿入すればPst
1部位における挿入の場合と同様にアンピシリン耐性で
なくテトラサイクリン耐性の喪失が生ずるからである。
シュ・RI部位を介して調製された組換えDNA分子6
場合には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集
落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する
耐性につき試、験した。
場合には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集
落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する
耐性につき試、験した。
何故なら、pBRj−2−2中のEco・RIの目標は
テトラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化す
る遺伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテ
トラサイクリンの耐性i/C関する遺伝子の不活性化は
この部位ておける混成りNA挿入の除虫じないからであ
る。
テトラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化す
る遺伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテ
トラサイクリンの耐性i/C関する遺伝子の不活性化は
この部位ておける混成りNA挿入の除虫じないからであ
る。
本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、/り
7♂年12月/!日にポートンダウン在ノカルチャー・
コレクション・オフ”−ザ・マイクロバイオロジカル・
リサーチ・エスタプリツシュメントに寄託されかつpB
RJ2J−HBV−A 、 Fとして同定された培養物
シてより例示される。
7♂年12月/!日にポートンダウン在ノカルチャー・
コレクション・オフ”−ザ・マイクロバイオロジカル・
リサーチ・エスタプリツシュメントに寄託されかつpB
RJ2J−HBV−A 、 Fとして同定された培養物
シてより例示される。
詳細には、これら培養物の特徴は次の通りである。
TetR#ITo”hBV”
これらと同一の培養物の一部を、lり7り年/2月lり
日にスコツトランド、アバディーン在のカルチャー・コ
レクション・オプーザ働ナショナル・コレクション・オ
フ・インダストリアル・バクテリアにも寄託した。
日にスコツトランド、アバディーン在のカルチャー・コ
レクション・オプーザ働ナショナル・コレクション・オ
フ・インダストリアル・バクテリアにも寄託した。
培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載で
ある。宿主/クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット(もし存在
すれば)を示す:肝炎Bビールス中の肝炎Bビールス制
限部位であって、伸長(もしあれば)を示すニーテトラ
サイクリン(Tet)およびアンピシリン(Amp)に
対する耐性(R)まだは感受性(S):上記の集落交雑
化試、験におけるHBV−DNAに対する+ 陽***雑化(HBV)および上記のHBV抗原性を示す
ポリペプチドの生産(VA’)。この命名ヲ用イレハ、
培養物pBRju、2−HBV−Aは、プラスミドとし
て組換えDNA分子を含有するイー・コIJ HB /
0 /培養物を示し、この組換えD N A分子はジ
止1部位で開裂されかつ3′末端にボ17−dG端部が
伸長化されたpBRJJ−!からなシ、さらにHBV、
DNAはKpn [により開裂されかつ3′末端にポI
J −dC端部が伸長化されておシ、また培養物はテト
ラサイクリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のHBV
@DNA交雑化試験とを示すと共にHBV抗原性を示す
ポリペプチドを生産する。
ある。宿主/クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット(もし存在
すれば)を示す:肝炎Bビールス中の肝炎Bビールス制
限部位であって、伸長(もしあれば)を示すニーテトラ
サイクリン(Tet)およびアンピシリン(Amp)に
対する耐性(R)まだは感受性(S):上記の集落交雑
化試、験におけるHBV−DNAに対する+ 陽***雑化(HBV)および上記のHBV抗原性を示す
ポリペプチドの生産(VA’)。この命名ヲ用イレハ、
培養物pBRju、2−HBV−Aは、プラスミドとし
て組換えDNA分子を含有するイー・コIJ HB /
0 /培養物を示し、この組換えD N A分子はジ
止1部位で開裂されかつ3′末端にボ17−dG端部が
伸長化されたpBRJJ−!からなシ、さらにHBV、
DNAはKpn [により開裂されかつ3′末端にポI
J −dC端部が伸長化されておシ、また培養物はテト
ラサイクリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のHBV
@DNA交雑化試験とを示すと共にHBV抗原性を示す
ポリペプチドを生産する。
勿論、混成微生物、組換えDNA分子およびポリペプチ
ドならびKこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定さ九るものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えDNA分子およびポ
リペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法によ
シ有利シて改変することができる。たとえば、より効果
的な表現制御順序を利用してH8V遺伝子または混成遺
伝子の転写を得ることができ、また望フしくない遺伝子
生成物の合成を減少させるよう突然変異を導入すること
ができ、また宿主細胞中のグロテアーゼレベルを減少さ
せることもでき、さらにHBV遺伝子を含有する熱誘導
性リゾゲンを宿主クロモソーム中に一体化させることが
でき、或いはその他の改変および手1項を行なって細胞
中の遺伝子コピーの数を増加させたシ所望ポリペプチド
を生産する細胞の生産性を増大させたシすることもでき
る。
ドならびKこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定さ九るものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えDNA分子およびポ
リペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法によ
シ有利シて改変することができる。たとえば、より効果
的な表現制御順序を利用してH8V遺伝子または混成遺
伝子の転写を得ることができ、また望フしくない遺伝子
生成物の合成を減少させるよう突然変異を導入すること
ができ、また宿主細胞中のグロテアーゼレベルを減少さ
せることもでき、さらにHBV遺伝子を含有する熱誘導
性リゾゲンを宿主クロモソーム中に一体化させることが
でき、或いはその他の改変および手1項を行なって細胞
中の遺伝子コピーの数を増加させたシ所望ポリペプチド
を生産する細胞の生産性を増大させたシすることもでき
る。
HBV抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Bビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のD
NAを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することシてよる増殖、或・いは突然変異を
用いてHBv順序を含むバクテリオファージヒプリドに
おける溶菌を防止することは、従来得られなかった量の
HBV−DNAの製造を可能シてする。
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Bビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のD
NAを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することシてよる増殖、或・いは突然変異を
用いてHBv順序を含むバクテリオファージヒプリドに
おける溶菌を防止することは、従来得られなかった量の
HBV−DNAの製造を可能シてする。
このように製造されたHBV、DNAを使用して、ゲノ
ムのヌクレオチド順序を決定することができ、これから
遺伝子ならびにHBV抗原および構造遺伝子自体のアミ
ノ酸順序を決定することができる。これら順序の知見は
、肝炎Bビールスの生物学を理解する上で役立ち、また
上記した改変を最も有利に用いることを可能にする。
ムのヌクレオチド順序を決定することができ、これから
遺伝子ならびにHBV抗原および構造遺伝子自体のアミ
ノ酸順序を決定することができる。これら順序の知見は
、肝炎Bビールスの生物学を理解する上で役立ち、また
上記した改変を最も有利に用いることを可能にする。
上記の方法により製造された、固相放射免疫分析法によ
り検出されるようなHBcAgの合成能力を宿主細胞に
付与する一連の組換えDNA分子を順序分析のために使
用した。断片を適当な制限酵素での消化によシこれら組
換えDNA分子から調製し、この断片をその!′ 末端
に〔α−32P)ATPとT弘ポリヌクレオチドキナー
ゼとでラベルした。次いで各断片のヌクレオテンド順序
を周知の化学的分解法により決定した(ニー・ニム・マ
キサムおよびダブりニー・ギルバート、「DNAの新規
な順序決定方法」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、 U、S、A。
り検出されるようなHBcAgの合成能力を宿主細胞に
付与する一連の組換えDNA分子を順序分析のために使
用した。断片を適当な制限酵素での消化によシこれら組
換えDNA分子から調製し、この断片をその!′ 末端
に〔α−32P)ATPとT弘ポリヌクレオチドキナー
ゼとでラベルした。次いで各断片のヌクレオテンド順序
を周知の化学的分解法により決定した(ニー・ニム・マ
キサムおよびダブりニー・ギルバート、「DNAの新規
な順序決定方法」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、 U、S、A。
第71X巻第よtO,!6≠頁(/り77))。
得られたヌクレオチット順序を第3〜り図に示す。参考
のため、順序には核遺伝子のATG翻訳開始コドンのA
からナンバーを付す、る。
のため、順序には核遺伝子のATG翻訳開始コドンのA
からナンバーを付す、る。
HBcAgに関する遺伝子のヌクレオチント順序および
この遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸順序
(読み枠l)を第3〜り図においてヌクレオチットl−
!≠りの間に示す。この遺伝子によ)コード化されるポ
リペプチドの寸法は、ディン粒子からの核抗原について
観察された分子量/9000に近いものである。しかし
ながら、この・構造決定は1若干のアミノ酸が標準抗原
の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミノ末端から
切除されつる可能性を排除しない。さらに、この構造は
、他のひと酵素たとえば蛋白質とクリコソル化(gly
cosolate )するような酵素との相互作用によ
シもたらされるポリペプチドへのその他7たは追加的改
変をも考慮導入れない。
この遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸順序
(読み枠l)を第3〜り図においてヌクレオチットl−
!≠りの間に示す。この遺伝子によ)コード化されるポ
リペプチドの寸法は、ディン粒子からの核抗原について
観察された分子量/9000に近いものである。しかし
ながら、この・構造決定は1若干のアミノ酸が標準抗原
の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミノ末端から
切除されつる可能性を排除しない。さらに、この構造は
、他のひと酵素たとえば蛋白質とクリコソル化(gly
cosolate )するような酵素との相互作用によ
シもたらされるポリペプチドへのその他7たは追加的改
変をも考慮導入れない。
したがって、ここで決定されたポリペプチド構造は生体
内に見出されるHBcAgとは同一でないが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。
内に見出されるHBcAgとは同一でないが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。
検査した組換えDNA分子の全ては挿入されたHBV、
DNAを有したので、核抗原遺伝子はpBR322のペ
ニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された
。さらに、各種の組換え物において、HBV、DNA挿
入物はHBV順序における同じ位置の1個もしくは2個
のヌクレオチット内で始まった。これら組換えDNA分
子は各種の制限酵素(たとえば−シ!、・HIおよびμ
二・I)で消化されたHBV、DNAから生じたので、
この独特々付加は部具的でありかつティン粒子の内生D
NAにおける割目でのHBV−DNAの偶発的@断マた
はポリヌクレオチド末端結合から生じたのであろう(第
1図)。異なる翻訳相中にHBV、DNA挿入物を有す
る徂換えDNA分子はHBcAg遺伝子を表現せず、ま
たこの種の組換えI)NAA分子より変異された宿主に
はHBV抗原性を示すポリペプチドか検出されなかった
。勿論、この種の非遺伝子表決宿主および組換えDNA
分子も本発明によりHBV−DNAを生産するのに有用
でるる。
DNAを有したので、核抗原遺伝子はpBR322のペ
ニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された
。さらに、各種の組換え物において、HBV、DNA挿
入物はHBV順序における同じ位置の1個もしくは2個
のヌクレオチット内で始まった。これら組換えDNA分
子は各種の制限酵素(たとえば−シ!、・HIおよびμ
二・I)で消化されたHBV、DNAから生じたので、
この独特々付加は部具的でありかつティン粒子の内生D
NAにおける割目でのHBV−DNAの偶発的@断マた
はポリヌクレオチド末端結合から生じたのであろう(第
1図)。異なる翻訳相中にHBV、DNA挿入物を有す
る徂換えDNA分子はHBcAg遺伝子を表現せず、ま
たこの種の組換えI)NAA分子より変異された宿主に
はHBV抗原性を示すポリペプチドか検出されなかった
。勿論、この種の非遺伝子表決宿主および組換えDNA
分子も本発明によりHBV−DNAを生産するのに有用
でるる。
HBV−DNA挿入物の表現を介して生成されたHBc
Ag’にたけその断片は少数のグリシン残基金倉してベ
ニシリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物(β−ラクタ
マーゼ)K融合するであろうことが予」11され7’(
が、実際にはそうでなかった。寧ろ、各場合にβ−ラク
タマーゼはj 、 J個のグリシンを介して同一のペプ
チド順序に融合きれたが、この順序は2j個のアミノ酸
の後に終端した。この読み枠(枠l、第3図)において
、停市コドン(TAG)に次いで3個のヌクレオチット
がチさ、その後に開佑コドンが玩さ、そこから翻訳が妨
げられず、こ伏いてペプチドに/♂3個のアミノ酸の長
さを与える(第3〜r図)。
Ag’にたけその断片は少数のグリシン残基金倉してベ
ニシリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物(β−ラクタ
マーゼ)K融合するであろうことが予」11され7’(
が、実際にはそうでなかった。寧ろ、各場合にβ−ラク
タマーゼはj 、 J個のグリシンを介して同一のペプ
チド順序に融合きれたが、この順序は2j個のアミノ酸
の後に終端した。この読み枠(枠l、第3図)において
、停市コドン(TAG)に次いで3個のヌクレオチット
がチさ、その後に開佑コドンが玩さ、そこから翻訳が妨
げられず、こ伏いてペプチドに/♂3個のアミノ酸の長
さを与える(第3〜r図)。
したがって、核抗原活性は、組換えD N A分子から
転写された+n RN A内のHBV順序:Cより初め
から翻訳された約−2/、000ダルトンのポリペプチ
ド中に存在する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存
しない。何故なら、これはHB V −D N A挿入
物の停止コドンおよび開始コドン、の配置によシ分泌ペ
ニシリナーゼ担体蛋白質に結合されないからである。
転写された+n RN A内のHBV順序:Cより初め
から翻訳された約−2/、000ダルトンのポリペプチ
ド中に存在する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存
しない。何故なら、これはHB V −D N A挿入
物の停止コドンおよび開始コドン、の配置によシ分泌ペ
ニシリナーゼ担体蛋白質に結合されないからである。
2、肝炎3表面抗原
HBsAgに対する遺伝子のヌクレオチット順序および
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序(読み枠3)も、第6〜♂図においてヌクレオテッド
/弘37〜λ//≠間に示される。このポリペプチドの
アミノ酸順序′riN末端から始まって順序met−g
lu −asn −i le −thr −scrを有
する。この最初のアミノk 1iffl /″Fは、テ
ィー・エル・ヒーターンン等、「肝炎3表面抗原の2つ
の主成分ポリペプチドの部分的アミノ酸順序」、グロシ
ーデインク・ナンヨナル・アカデミ−・サイエンス、U
、S、A、 、第7≠巻第ir3゜〜lj3φ頁(/り
77)により、標準ひとHB s Agから決定された
。この蛋白質のアミノ酸順序は第6〜g図において停止
コドンまで226個のアミノ酸を続ける。この226ポ
リペプチド順序はλ5ti−ooダルトンの蛋白質に相
当する。
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序(読み枠3)も、第6〜♂図においてヌクレオテッド
/弘37〜λ//≠間に示される。このポリペプチドの
アミノ酸順序′riN末端から始まって順序met−g
lu −asn −i le −thr −scrを有
する。この最初のアミノk 1iffl /″Fは、テ
ィー・エル・ヒーターンン等、「肝炎3表面抗原の2つ
の主成分ポリペプチドの部分的アミノ酸順序」、グロシ
ーデインク・ナンヨナル・アカデミ−・サイエンス、U
、S、A、 、第7≠巻第ir3゜〜lj3φ頁(/り
77)により、標準ひとHB s Agから決定された
。この蛋白質のアミノ酸順序は第6〜g図において停止
コドンまで226個のアミノ酸を続ける。この226ポ
リペプチド順序はλ5ti−ooダルトンの蛋白質に相
当する。
HBsAgのアミノ酸および長さは、ピー・バレンツエ
ラ等、「肝炎Bビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第2♂O巻、第ざ/j−ざlり頁(/り7り)により、
適当な組換えDNA分子を順序決定することにより単独
に確認された。
ラ等、「肝炎Bビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第2♂O巻、第ざ/j−ざlり頁(/り7り)により、
適当な組換えDNA分子を順序決定することにより単独
に確認された。
本発明の組換えD N A分子について決定されたヌク
レオチット順序0序(4,Hat:Agに幻する遺伝子
を表現した検査されたもの全てか適当な宿主細胞内に表
現されることを期待する位置にHBsAgに対する遺伝
子を持ち得ないことを示す。事実、HBcAgに対する
遺伝子を表現することが見出されたプラスミドにより変
異させた細胞の抽出物には、HBsAgは検出されなか
った。しかしながら、上記したように、これら遺伝子の
ヌクレオチット順序の知見は、表現過程の改変が収率と
効果とを向上させかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは
検出されなかったポリペプチドの生産とを容易化するの
を可能にする。
レオチット順序0序(4,Hat:Agに幻する遺伝子
を表現した検査されたもの全てか適当な宿主細胞内に表
現されることを期待する位置にHBsAgに対する遺伝
子を持ち得ないことを示す。事実、HBcAgに対する
遺伝子を表現することが見出されたプラスミドにより変
異させた細胞の抽出物には、HBsAgは検出されなか
った。しかしながら、上記したように、これら遺伝子の
ヌクレオチット順序の知見は、表現過程の改変が収率と
効果とを向上させかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは
検出されなかったポリペプチドの生産とを容易化するの
を可能にする。
これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞当
シの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。
シの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。
蛋白質の生産レベルはλつの主要因子により支配される
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこnら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写訃よひ翻
訳(これは表現をも含む)の効率は、通常所望のコード
化用順序の前方(で位置するヌクレオチット順序に依存
する。これらのヌクレオチット順序または表現制m+;
i序:=、特にRNAポリメラーゼが相互反応して転写
(促進子順序)を開始しかつリボソームがmRNA(転
写の生成物)と結合かつ相互反応して翻訳を開始する位
置を規定する。この種の表現制御1!全てが同等の効率
をもって機能するものではない。したがって、隣接する
ヌクレオチット順序から所望蛋白質に対する特異的コー
ド化順序を分離し、これらを公知の表現制御順序に融合
させてよシ高度の表現レベルを得ることが有利である。
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこnら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写訃よひ翻
訳(これは表現をも含む)の効率は、通常所望のコード
化用順序の前方(で位置するヌクレオチット順序に依存
する。これらのヌクレオチット順序または表現制m+;
i序:=、特にRNAポリメラーゼが相互反応して転写
(促進子順序)を開始しかつリボソームがmRNA(転
写の生成物)と結合かつ相互反応して翻訳を開始する位
置を規定する。この種の表現制御1!全てが同等の効率
をもって機能するものではない。したがって、隣接する
ヌクレオチット順序から所望蛋白質に対する特異的コー
ド化順序を分離し、これらを公知の表現制御順序に融合
させてよシ高度の表現レベルを得ることが有利である。
これは達成されており、新たて処理されたD N A断
片を多コピープラスミドまたはバクテリオファージ訪導
体中に導入して、細胞内の遺伝子コピーの数を増加させ
それてより表現蛋白質の収率をさらに改善することがで
きる。
片を多コピープラスミドまたはバクテリオファージ訪導
体中に導入して、細胞内の遺伝子コピーの数を増加させ
それてより表現蛋白質の収率をさらに改善することがで
きる。
例示の目的で、HBcAgの遺伝子について決定した順
序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるHBc
AKの生産を改善した。その一つの過程を第1O図番て
示す。
序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるHBc
AKの生産を改善した。その一つの過程を第1O図番て
示す。
第3図におけるHBcAgについてのDNA順序を点検
すると、この遺伝子はヌクレオチット−26に、配ユ・
Iに対する目標(AGCT)を有シ、ヌクレオチット、
22および/!’?0に肚・RI*に対する目標を有し
、20りに旦二・R11に対する目標(CCTGG)、
λ♂OK旦已・■に対する目標(GGCC)また2≠6
および≠61に至上弓に対する目標(C,GACClG
GTCC)を有することが判る。この複雑性が与えられ
ると、核抗原コード化順序をより効果的な表現制御1!
頁序に2段階で移行させるのが便利である。
すると、この遺伝子はヌクレオチット−26に、配ユ・
Iに対する目標(AGCT)を有シ、ヌクレオチット、
22および/!’?0に肚・RI*に対する目標を有し
、20りに旦二・R11に対する目標(CCTGG)、
λ♂OK旦已・■に対する目標(GGCC)また2≠6
および≠61に至上弓に対する目標(C,GACClG
GTCC)を有することが判る。この複雑性が与えられ
ると、核抗原コード化順序をより効果的な表現制御1!
頁序に2段階で移行させるのが便利である。
たとえば、本発明により製造されて約2360塩基対(
ヌクレオチット)、すなわち第3図のヌクレオチット−
♂O〜約2270のHBV@D N A挿入物を有する
組換えDNA分子をΔ堕・1およびEco・Rf で消
化すると、特にヌクレオチット−26と22との間に断
片(断片A)を与える一方、以凸R1の単独消化はヌク
レオチット23〜/!rりに断片(断片B)を与えかつ
ヌクレオチット23〜よ76における断片(断片B′)
の収率を低くする。これらの断片は第3〜弘図を参照し
て容易−で確認することができ、第10図に図示する。
ヌクレオチット)、すなわち第3図のヌクレオチット−
♂O〜約2270のHBV@D N A挿入物を有する
組換えDNA分子をΔ堕・1およびEco・Rf で消
化すると、特にヌクレオチット−26と22との間に断
片(断片A)を与える一方、以凸R1の単独消化はヌク
レオチット23〜/!rりに断片(断片B)を与えかつ
ヌクレオチット23〜よ76における断片(断片B′)
の収率を低くする。これらの断片は第3〜弘図を参照し
て容易−で確認することができ、第10図に図示する。
断片AおよびBはゲル電気泳動により分別精製され、そ
れらのEco−R1”を介して端部結合し、合体断片(
断片C)を与える。次いで、必要に応じ断片Cを直接結
紮により新たな表現制御順序に付加させ、前記したよう
な3部端部結合法を介しまたは合成的オリゴ−ヌクレオ
チット結合を介して正しい翻訳相を維持する。この付加
はよシ良好な表現・制御順序を使用して蛋白質生産を改
善させるだけでなく、HBcAgをコード化する遺伝子
断片を表現制御順序自身により近接して付加させそれに
よりその遺伝子断片の表現の制御を向上させることも可
能にする。同様にして、断片AおよびB′を合体させ、
または多くの他の調製断片を合体させ、得られた断片を
上記のように使用することができる。この方法(り、特
定ポリペプチドをコード化する構造遺伝子の7部のみを
本発明の組換えDNA分子(pHBV//弘)に使用す
る需要があることを示している。
れらのEco−R1”を介して端部結合し、合体断片(
断片C)を与える。次いで、必要に応じ断片Cを直接結
紮により新たな表現制御順序に付加させ、前記したよう
な3部端部結合法を介しまたは合成的オリゴ−ヌクレオ
チット結合を介して正しい翻訳相を維持する。この付加
はよシ良好な表現・制御順序を使用して蛋白質生産を改
善させるだけでなく、HBcAgをコード化する遺伝子
断片を表現制御順序自身により近接して付加させそれに
よりその遺伝子断片の表現の制御を向上させることも可
能にする。同様にして、断片AおよびB′を合体させ、
または多くの他の調製断片を合体させ、得られた断片を
上記のように使用することができる。この方法(り、特
定ポリペプチドをコード化する構造遺伝子の7部のみを
本発明の組換えDNA分子(pHBV//弘)に使用す
る需要があることを示している。
選択された遺伝子断片の特定表現制御1序と開始コドン
との間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその末
端で7たは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼの
組合せ物により軽く処理するかまたはエキソヌクレアー
ゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片の
開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全てまた
は幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオチ
ット−2zおよび30で開裂して生するたとえばΔ巨・
1断片のような断片を同様にエキンヌクレアーゼ処理ま
たはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次いで
旦二・RI”で開裂させてヌクレオチット−26および
/とヌクレオチット22との間から断片をもたらし、断
片BK融合させた後に表現制御順序に付加さぜることが
できる。別の経路は断片Bまたは同等の+Vi片の交雑
化全包含し、これはDNAポリメラーゼおよび限られた
数のヌクレオシドトリホスフニートとの一連の反応にお
いて伸長の丸め元の組換えD N A分子から適当な単
一ストランド雛型に対して行なわれ、したがって断片ス
トランドにコード化順序の初めに再構成することができ
るであろう。次いで雛型ストランドを伸長断片ストラン
ドに関連する位置においてエンドヌクレアーゼS/によ
り開裂させ、そして得られた断片を表現制御順序に付加
させる。
との間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその末
端で7たは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼの
組合せ物により軽く処理するかまたはエキソヌクレアー
ゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片の
開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全てまた
は幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオチ
ット−2zおよび30で開裂して生するたとえばΔ巨・
1断片のような断片を同様にエキンヌクレアーゼ処理ま
たはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次いで
旦二・RI”で開裂させてヌクレオチット−26および
/とヌクレオチット22との間から断片をもたらし、断
片BK融合させた後に表現制御順序に付加さぜることが
できる。別の経路は断片Bまたは同等の+Vi片の交雑
化全包含し、これはDNAポリメラーゼおよび限られた
数のヌクレオシドトリホスフニートとの一連の反応にお
いて伸長の丸め元の組換えD N A分子から適当な単
一ストランド雛型に対して行なわれ、したがって断片ス
トランドにコード化順序の初めに再構成することができ
るであろう。次いで雛型ストランドを伸長断片ストラン
ドに関連する位置においてエンドヌクレアーゼS/によ
り開裂させ、そして得られた断片を表現制御順序に付加
させる。
幾つかの表現制御順序は、上記したように使用すること
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン(「士
ミ系」)の作動子、促進子およびリポソーム結合および
作用順序(たとえばシャインーク゛ゝルガ7J順序のよ
うな順序を含む)、イー・コリのトリ2[トファン合成
酵素系Crtrp系」)の対応する順序、?アージλの
主要作動子および促進子板(OLPLおよびO,P几I
)ならびOてファージcd被覆蛋白質の制御域を包含す
る1、これら順序金含有するDNA@片は。
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン(「士
ミ系」)の作動子、促進子およびリポソーム結合および
作用順序(たとえばシャインーク゛ゝルガ7J順序のよ
うな順序を含む)、イー・コリのトリ2[トファン合成
酵素系Crtrp系」)の対応する順序、?アージλの
主要作動子および促進子板(OLPLおよびO,P几I
)ならびOてファージcd被覆蛋白質の制御域を包含す
る1、これら順序金含有するDNA@片は。
±二もしくはtrpオペロンを担持する変換用ファージ
から単離されたDNAからまたはファージλもしくはf
dのDNAから制限酵素での開裂りこより創出される。
から単離されたDNAからまたはファージλもしくはf
dのDNAから制限酵素での開裂りこより創出される。
次いで、これら断片をHBV抗原頑序について記載した
ように処理して限られた数の分子を得、重要な制御順序
を断片Cについて上記したように所望抗原に対するコー
ド化順序の開始コドンに極めて近接してまたはこれに並
列させて結合させることができる。
ように処理して限られた数の分子を得、重要な制御順序
を断片Cについて上記したように所望抗原に対するコー
ド化順序の開始コドンに極めて近接してまたはこれに並
列させて結合させることができる。
゛次いで、融合生成物を上記のようにクローン用ベヒク
ル中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベル
を細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も
効果的な表現を与える細胞はこのように選択することが
できる。或いは、開始コドンに付加されたlac、
trpもしくはλPL制御系を担持するクローン用ベヒ
クルを使用して、これをHBV抗原性を示すポリペプチ
ドをコード化する順序を持った断片に融合させ、構造遺
伝子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確に
翻訳する。
ル中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベル
を細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も
効果的な表現を与える細胞はこのように選択することが
できる。或いは、開始コドンに付加されたlac、
trpもしくはλPL制御系を担持するクローン用ベヒ
クルを使用して、これをHBV抗原性を示すポリペプチ
ドをコード化する順序を持った断片に融合させ、構造遺
伝子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確に
翻訳する。
これらの実験を特にHBV核抗原の生産に関連させたが
、これらはたとえばHBsAgおよびHBeAg遺伝子
ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改良する
のにも使用することができる。
、これらはたとえばHBsAgおよびHBeAg遺伝子
ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改良する
のにも使用することができる。
こnら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に使
用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えDNA分
子を雛型バクテリオファージλ(NMりtり)中に挿入
することにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえば旦二・R1または一旦ind・mで消
化して線状分子を与え、次いでこれを制限ファージスク
ローン用ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレ−等、[
組換え体の試験管内(・ておける回収を簡易化するラム
ダ型ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネテイツク
、第1jO巻第j3〜61頁(lり77)およびエヌ・
イー・ムレ−等、「バクテリオ7アージT4tからのD
NAリガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ジャーナル・モ
レキュラー・バイオロジー、第132巻第≠り3〜SO
t頁(lり7り)に記載された1側と混合し、そして組
換えDNA分子をDNAIJガーゼとの培養によシ生成
させる。このような手順を第1/図に示す。次いで、所
望の徂換え7アージを、特定抗原に対する放射免疫分所
によシまたは放射ラベルしたHBV−DNA順序との交
雑化により選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化する
のに使用した。
用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えDNA分
子を雛型バクテリオファージλ(NMりtり)中に挿入
することにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえば旦二・R1または一旦ind・mで消
化して線状分子を与え、次いでこれを制限ファージスク
ローン用ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレ−等、[
組換え体の試験管内(・ておける回収を簡易化するラム
ダ型ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネテイツク
、第1jO巻第j3〜61頁(lり77)およびエヌ・
イー・ムレ−等、「バクテリオ7アージT4tからのD
NAリガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ジャーナル・モ
レキュラー・バイオロジー、第132巻第≠り3〜SO
t頁(lり7り)に記載された1側と混合し、そして組
換えDNA分子をDNAIJガーゼとの培養によシ生成
させる。このような手順を第1/図に示す。次いで、所
望の徂換え7アージを、特定抗原に対する放射免疫分所
によシまたは放射ラベルしたHBV−DNA順序との交
雑化により選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化する
のに使用した。
特に有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子clにお
ける感温性突然変異株および遺伝子旦における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あ夛、さらに遺伝子Eに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞を32℃にて成育せしめ、次いで4L
j℃に加熱してプロファージの創出を誘発させる。37
℃にて長期成育させると高レベルの抗原生産をもたらし
、これが細胞内(て保持される。何故なら、これらはフ
ァージ遺伝子生放物により通常のようには溶解されない
からでちゃ、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化さ
れないので、それは転写用として使用可能に留まるから
である。次いで、細胞の人工的溶解は抗原を高収率で遊
離させる(第1/図)。
ける感温性突然変異株および遺伝子旦における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あ夛、さらに遺伝子Eに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞を32℃にて成育せしめ、次いで4L
j℃に加熱してプロファージの創出を誘発させる。37
℃にて長期成育させると高レベルの抗原生産をもたらし
、これが細胞内(て保持される。何故なら、これらはフ
ァージ遺伝子生放物により通常のようには溶解されない
からでちゃ、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化さ
れないので、それは転写用として使用可能に留まるから
である。次いで、細胞の人工的溶解は抗原を高収率で遊
離させる(第1/図)。
これら実施例が原理的に関係するイー・コリ系に加え、
同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス・ズブチ
リス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビのよう
な他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞におい
て抗原生産レベルを増大させることができる。バチルス
−ズブチリスの場合、バチルスφリヒエニホルミスから
単離されたベニシリナーゼの決定子を担持するプラスミ
ドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供する。
同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス・ズブチ
リス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビのよう
な他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞におい
て抗原生産レベルを増大させることができる。バチルス
−ズブチリスの場合、バチルスφリヒエニホルミスから
単離されたベニシリナーゼの決定子を担持するプラスミ
ドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供する。
HBsAgについて決定した遺伝子およびアミラ醒順序
け、本発明の方法KJニジHBsAgK対する遺伝子の
表現を可能にする方法を設計する際に有用である。この
ような表現は、HBV抗原性を示すポリペプチドを生成
した組換えD N A分子により変異させた宿主におい
て従来観察されなかった。
け、本発明の方法KJニジHBsAgK対する遺伝子の
表現を可能にする方法を設計する際に有用である。この
ような表現は、HBV抗原性を示すポリペプチドを生成
した組換えD N A分子により変異させた宿主におい
て従来観察されなかった。
第6〜r図のヌクレオチット順序は、ヌクレオチットl
≠37と2//弘との間のHBsAgをコード化する遺
伝子を示す。この遺伝子は。
≠37と2//弘との間のHBsAgをコード化する遺
伝子を示す。この遺伝子は。
第3〜2図のHBVゲノムに2けるHBcAgをコード
化する遺伝子(読み枠/)とは異なる翻訳相(読み枠3
)にある。したがって、適当な宿主を変異させるために
使用された時HBcAgを生成しなかったが、約23よ
0個のヌクレオチット(第3〜を図の順序のヌクレオチ
ット−10,2270IICホホ相当する)のHBV−
DNA挿入物を含有する組換えDNA分子をHBsAg
生産に使用するため選択した。
化する遺伝子(読み枠/)とは異なる翻訳相(読み枠3
)にある。したがって、適当な宿主を変異させるために
使用された時HBcAgを生成しなかったが、約23よ
0個のヌクレオチット(第3〜を図の順序のヌクレオチ
ット−10,2270IICホホ相当する)のHBV−
DNA挿入物を含有する組換えDNA分子をHBsAg
生産に使用するため選択した。
選択された組換えDNA分子は、特(・てHBsAgを
コード化する全遺伝子を含有した。この徂換えDNA分
子のHBVφDNA挿入物のヌクレオチット順序を検査
すると、HBsAgをコード化する遺伝子を含有する断
片の創出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
目標が示される。たとえば、ヌクレオチットl弘Oり(
Xho)、ヌクレオチットl≠” (”g )% ヌク
レオチット/≠Oり(Aval)、およびヌクレオチッ
ト/≠2♂(Hha I ) (第6図)。これらのう
ち最後のもの(Hhal)は特に有用である。何故なら
、HBV、DNA挿入物の開裂はヌクレオチット/弘3
0とl弘37との間で起こシ、HBsAg自身に対する
遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)の前方に僅か6個の
ヌクレオチットが存在するからである。≠種の場合全て
において、創出された断片は、選択されたHBV−DN
A挿入物を越えて、組換えDNA分子の288322部
分のヌクレオチット項序内に位置する特定制限エンドヌ
クレアーゼに対する目標まで延在する。したがって、こ
れら制限エンドヌクレアーゼおよびその他同様に有用な
ものを単独または組合せて使用すると、開始コドンの近
辺であるかその前方と翻訳終末コドンの後とにおいてH
BsAgをコード化する遺伝子の創出が可能となる。勿
論、HBcAgに対する遺伝子の場合に示したように、
全遺伝子の断片のみを組換えDNA分子中に実際使用し
、適当な宿主においてHBsAg抗原性を示すポリヌク
レオチットを生成させうろことが了解さnよう。
コード化する全遺伝子を含有した。この徂換えDNA分
子のHBVφDNA挿入物のヌクレオチット順序を検査
すると、HBsAgをコード化する遺伝子を含有する断
片の創出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
目標が示される。たとえば、ヌクレオチットl弘Oり(
Xho)、ヌクレオチットl≠” (”g )% ヌク
レオチット/≠Oり(Aval)、およびヌクレオチッ
ト/≠2♂(Hha I ) (第6図)。これらのう
ち最後のもの(Hhal)は特に有用である。何故なら
、HBV、DNA挿入物の開裂はヌクレオチット/弘3
0とl弘37との間で起こシ、HBsAg自身に対する
遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)の前方に僅か6個の
ヌクレオチットが存在するからである。≠種の場合全て
において、創出された断片は、選択されたHBV−DN
A挿入物を越えて、組換えDNA分子の288322部
分のヌクレオチット項序内に位置する特定制限エンドヌ
クレアーゼに対する目標まで延在する。したがって、こ
れら制限エンドヌクレアーゼおよびその他同様に有用な
ものを単独または組合せて使用すると、開始コドンの近
辺であるかその前方と翻訳終末コドンの後とにおいてH
BsAgをコード化する遺伝子の創出が可能となる。勿
論、HBcAgに対する遺伝子の場合に示したように、
全遺伝子の断片のみを組換えDNA分子中に実際使用し
、適当な宿主においてHBsAg抗原性を示すポリヌク
レオチットを生成させうろことが了解さnよう。
このような消化物から生ずるHBV、DNAの断片を、
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したもの【て類似した一連の反応で処理した。たと
えば、遺伝子断片をpBRJ22のペニシリン討性をコ
ード化する遺伝子(たとえばPst l識別部位、第2
図)中に挿入してHBsAg抗原性を示すポリペプチド
をβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ遺伝子の生成物)
と融合させて生成させることができ、遺伝子断片をpB
R32−2におけるペニンリン討性をコード化する遺伝
子とテトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子との間
(Eco −R1iたはHind [1識別部位、第2
図)に挿入して、これをそこでまたは挿入前(で三基表
現mlt卸順序ンて結合することOでよりHBsAg抗
原性を示すポリペプチドを生成させてlac系のβ−ガ
ラクトシダーゼ蛋白質に融合させることができ、遺伝子
断片を、HBcAgをコード化する遺伝子について前記
したと同様に、選択された表現制御順序自身にできるだ
け近接してクローン用ベヒクル中に挿入することができ
、或いは遺伝子断片を本発明によシ記載したと同様に無
性増殖させることができる。
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したもの【て類似した一連の反応で処理した。たと
えば、遺伝子断片をpBRJ22のペニシリン討性をコ
ード化する遺伝子(たとえばPst l識別部位、第2
図)中に挿入してHBsAg抗原性を示すポリペプチド
をβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ遺伝子の生成物)
と融合させて生成させることができ、遺伝子断片をpB
R32−2におけるペニンリン討性をコード化する遺伝
子とテトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子との間
(Eco −R1iたはHind [1識別部位、第2
図)に挿入して、これをそこでまたは挿入前(で三基表
現mlt卸順序ンて結合することOでよりHBsAg抗
原性を示すポリペプチドを生成させてlac系のβ−ガ
ラクトシダーゼ蛋白質に融合させることができ、遺伝子
断片を、HBcAgをコード化する遺伝子について前記
したと同様に、選択された表現制御順序自身にできるだ
け近接してクローン用ベヒクル中に挿入することができ
、或いは遺伝子断片を本発明によシ記載したと同様に無
性増殖させることができる。
例示の目的で、一つのこの種の方法を第1J図に示す。
ここで、はぼヌクレオチット−♂Oと2270(第3〜
r図)との間に延在したHBV、DNA挿入物を有する
選択組換えDNA分子をHha −1での消化シてより
断片化させた。
r図)との間に延在したHBV、DNA挿入物を有する
選択組換えDNA分子をHha −1での消化シてより
断片化させた。
得られた断片を、前記した3′末端結合法によシpBR
j2−2のL隻【部位に挿入した。この組換えDNA分
子によシ変異させた宿主は、HBsAg抗原性を示すポ
リペプチドを生成した。
j2−2のL隻【部位に挿入した。この組換えDNA分
子によシ変異させた宿主は、HBsAg抗原性を示すポ
リペプチドを生成した。
他の断片(たとえばAval、Tag、 Xhoまたば
PstJ(部分消化))をも、pBRjJ−2における
Pst l識別部位ま念は他の部位て挿入して、HBs
Ag抗原性を示すポリペプチドまたばHBsAgをコー
ド化する遺伝子断片の生産に有用な組換えDNA分子を
生成させた。
PstJ(部分消化))をも、pBRjJ−2における
Pst l識別部位ま念は他の部位て挿入して、HBs
Ag抗原性を示すポリペプチドまたばHBsAgをコー
ド化する遺伝子断片の生産に有用な組換えDNA分子を
生成させた。
さらに、この種の遺伝子断片f Pst lにより開裂
されたpBRJ2−2に挿入し、次いで得られたベニシ
リナーゼをコード化する遺伝子の断片ヲ、ヘニシリナー
ゼまたはβ−ラクタマーゼのアミノi/♂2をコード化
するコドンから成る場合にはアミノ酸32をコード化す
るコドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミ
ノ酸13をコード化するコドンへと切シ離す。またpB
RJ22−PsL・I′のこれら誘導化プラスミドをヌ
クレオチット/弘≠7から/7り乙まで延在するHB
s Ag遺伝子断片(第6〜7図)と共に使用してHB
s A g抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
されたpBRJ2−2に挿入し、次いで得られたベニシ
リナーゼをコード化する遺伝子の断片ヲ、ヘニシリナー
ゼまたはβ−ラクタマーゼのアミノi/♂2をコード化
するコドンから成る場合にはアミノ酸32をコード化す
るコドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミ
ノ酸13をコード化するコドンへと切シ離す。またpB
RJ22−PsL・I′のこれら誘導化プラスミドをヌ
クレオチット/弘≠7から/7り乙まで延在するHB
s Ag遺伝子断片(第6〜7図)と共に使用してHB
s A g抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
HBsAgをコード化する構造遺伝子の直前(ておける
ヌクレオチツドタ≠♂〜/ 4tJ 71a’l ノヌ
クレオテソド順序を使用断片中に含ませて、 HBsA
g抗原性?示すポリペプチドおよびl(BsAgに対す
る構造遺伝子の遺伝子断片を生産するのに有用な組換え
D N A分子を生成させることもできる。このヌクレ
オチット順序は、遺伝子の先9厖本11迫序と(I+ば
れる。この先、枢体順序とHBsAばに対する構造遺伝
子との両者をきむ遺伝子断片をΔ坦・I(ヌクレオチツ
ドタ3り)、Hha−1(ヌクレオチツドタ00)また
はHae*ll(ヌクレオチット♂タタ)Kより割出す
ることができる。ム想・1およびHha・Iの場合、部
分消化と得られた断片のたとえばゲル電気泳動による分
離とが必要である。何故なら、これら酵素に対する識別
部位は、先駆体順序内において、AlumIについては
ヌクレオチット10り/にまた旦■・■についてはスク
レオチツド/弘2gにも生するからである。
ヌクレオチツドタ≠♂〜/ 4tJ 71a’l ノヌ
クレオテソド順序を使用断片中に含ませて、 HBsA
g抗原性?示すポリペプチドおよびl(BsAgに対す
る構造遺伝子の遺伝子断片を生産するのに有用な組換え
D N A分子を生成させることもできる。このヌクレ
オチット順序は、遺伝子の先9厖本11迫序と(I+ば
れる。この先、枢体順序とHBsAばに対する構造遺伝
子との両者をきむ遺伝子断片をΔ坦・I(ヌクレオチツ
ドタ3り)、Hha−1(ヌクレオチツドタ00)また
はHae*ll(ヌクレオチット♂タタ)Kより割出す
ることができる。ム想・1およびHha・Iの場合、部
分消化と得られた断片のたとえばゲル電気泳動による分
離とが必要である。何故なら、これら酵素に対する識別
部位は、先駆体順序内において、AlumIについては
ヌクレオチット10り/にまた旦■・■についてはスク
レオチツド/弘2gにも生するからである。
以上、本発明の多くの具体例について記載したが、この
基本構成を変化させて、本発明方法を使用する池の具体
例を与えることもできることが明白である。したがって
、本発明の範囲は例示した特定実施例によシ規定さるべ
きでなく、特許請求の範囲 ることが了解されよう。
基本構成を変化させて、本発明方法を使用する池の具体
例を与えることもできることが明白である。したがって
、本発明の範囲は例示した特定実施例によシ規定さるべ
きでなく、特許請求の範囲 ることが了解されよう。
本明細書中(・ζ記載した方法(/cよう調製した微生
物は、lタ7タ年7l月lタ日江ス;ントランド、アバ
ディーン在のザ・カルチャー・ニレク/ヨン@X7′1
ザーナショナルφニレクション争万ブ・インダストリア
ル・バクテリア ( TheCulture Coll
ection or The National Co
llectionof Industrial Bac
teria ) に寄託されかつpBRJ 2 2
−HBV−G−Lと同定された培養物によシ例示され、
次のような特性を有する。
物は、lタ7タ年7l月lタ日江ス;ントランド、アバ
ディーン在のザ・カルチャー・ニレク/ヨン@X7′1
ザーナショナルφニレクション争万ブ・インダストリア
ル・バクテリア ( TheCulture Coll
ection or The National Co
llectionof Industrial Bac
teria ) に寄託されかつpBRJ 2 2
−HBV−G−Lと同定された培養物によシ例示され、
次のような特性を有する。
G:イー・コリ88101 /pBR322一匣IdG
:HBV−1−1dC(以下、’ pHBV114 ”
): Tet’Amp’HBV÷ H:イー・コリHBIOL / pBR322一旦リ,
ビdG:pHBV114−Pst I : Tet”A
mp’HBV”VA”I:イー・コリI{8101 /
( (P812322一亜1?I。
:HBV−1−1dC(以下、’ pHBV114 ”
): Tet’Amp’HBV÷ H:イー・コリHBIOL / pBR322一旦リ,
ビdG:pHBV114−Pst I : Tet”A
mp’HBV”VA”I:イー・コリI{8101 /
( (P812322一亜1?I。
Ba+*旧: lac プロモータ配列)−l{i
nd IIIリンカー: HBV114−Hha IB
qm H[ : Tet’Amp”HBV”VA
ヤj:イー−)す1(8101/PIIR2Eco R
1: 1(BV114−Hha r Eco R1リジ
カー: Tet’Amp’HBV”VA十 に:イー・コリHBIOI /PBR322−Pst
I dG :pHBV114−Ava 1 dCTeL
”AmpsHBV”VA”L:イー・コリHBIOI
/ pBR322−Pst I dG :pHBV11
4−Taq dCTet”Am、p’HBV4VA”※
:テトラサイクリン討性ンζついてのポリペプチドを
コード化する遺伝子と含む DNA順序を持ったpBRJλλの誘導体を、イー・コ
リlac系を含むよシ小きいDNA順序で置き換えた。
nd IIIリンカー: HBV114−Hha IB
qm H[ : Tet’Amp”HBV”VA
ヤj:イー−)す1(8101/PIIR2Eco R
1: 1(BV114−Hha r Eco R1リジ
カー: Tet’Amp’HBV”VA十 に:イー・コリHBIOI /PBR322−Pst
I dG :pHBV114−Ava 1 dCTeL
”AmpsHBV”VA”L:イー・コリHBIOI
/ pBR322−Pst I dG :pHBV11
4−Taq dCTet”Am、p’HBV4VA”※
:テトラサイクリン討性ンζついてのポリペプチドを
コード化する遺伝子と含む DNA順序を持ったpBRJλλの誘導体を、イー・コ
リlac系を含むよシ小きいDNA順序で置き換えた。
第1図はディン粒子の内生DNAの構造を示す略図であ
シ、第2図は本発明方法の好適具体例の略説明図であシ
、第3〜り図は本発明により 肝炎Bビールスゲノムの
一部について決定したヌクレオチット順序の説明図であ
シ、第1O図は肝炎Bビールス核抗原を示すポリペプチ
ドを生産することのできる組換えDNA分子を断片化し
、その断片を改善表現制御項圧に結合させる本発明方法
の略説明図であり、 第”図は本発明方法の略説明図で
あり、第1.2図は不発明方法の他の具体例の略説明図
である。 LLl−1
シ、第2図は本発明方法の好適具体例の略説明図であシ
、第3〜り図は本発明により 肝炎Bビールスゲノムの
一部について決定したヌクレオチット順序の説明図であ
シ、第1O図は肝炎Bビールス核抗原を示すポリペプチ
ドを生産することのできる組換えDNA分子を断片化し
、その断片を改善表現制御項圧に結合させる本発明方法
の略説明図であり、 第”図は本発明方法の略説明図で
あり、第1.2図は不発明方法の他の具体例の略説明図
である。 LLl−1
Claims (2)
- (1)HBV抗原性を示す少なくとも1種のポリペプチ
ドをコードしかつB型肝炎ウィルス表面抗原をコードす
るDNA配列もしくはその断片、B型肝炎ウィルス核抗
原をコードする DNA配列もしくはその断片、および前記配列もしくは
断片を1部として有するDNA配列よりなる群から選択
されるDNA配列をクローン化ビークル中へ導入し、前
記DNA配列は組換えDNA分子における発現制御配列
に作用結合されかつ発現して、前記組換えDNA分子で
形質転換された単細胞宿主を培養する際にHBV抗原性
を示すポリペプチドを産生することを特徴とするDNA
配列をクローン化しかつ発現させる際に使用する組換え
DNA分子の製造方法。 - (2)HBV抗原性を示す少なくとも1種のポリペプチ
ドをコードするDNA配列を、クローン化ビークルの第
1および第2制限エンドヌクレアーゼ識別部位の間に挿
入して組換えDNA分子を生産することを特徴とする特
許請求の範囲第1項記載の方法。
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GB7849907 | 1978-12-22 | ||
GB50039 | 1978-12-27 | ||
GB7850039 | 1978-12-27 | ||
GB7937910 | 1979-11-01 | ||
GB37910 | 1979-11-01 |
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Family Applications After (2)
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