FI86437B - Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. Download PDFInfo
- Publication number
- FI86437B FI86437B FI794001A FI794001A FI86437B FI 86437 B FI86437 B FI 86437B FI 794001 A FI794001 A FI 794001A FI 794001 A FI794001 A FI 794001A FI 86437 B FI86437 B FI 86437B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- hbv
- dna
- gene
- polypeptide
- recombinant dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 12
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 68
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 34
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 19
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 claims description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 137
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 65
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 30
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 27
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 22
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 22
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 22
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 22
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 22
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 15
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- HODRFAVLXIFVTR-RKDXNWHRSA-N tevenel Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 HODRFAVLXIFVTR-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- -1 loss of replication Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000009482 thermal adhesion granulation Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(O)=O LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000283923 Marmota monax Species 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000868151 Rattus norvegicus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- JKMBMIMLVFMXRW-LYYFRFARSA-N epicocconone Chemical compound C1=C2C[C@@H](CO)OC=C2C(=O)[C@]2(C)C1=C(C(/O)=C/C(=O)/C=C/C=C/C=C/C)C(=O)O2 JKMBMIMLVFMXRW-LYYFRFARSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000004247 glycine and its sodium salt Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940029258 sodium glycinate Drugs 0.000 description 1
- WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetate Chemical compound [Na+].NCC([O-])=O WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
- Y10S930/223—Hepatitis related
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1 86437
Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, joilla on hepatitis B-virusantigeenien antigeenisyys
Keksinnön kohteena on menetelmä polypeptidien val-5 mistamiseksi, joilla on hepatitis B-virusantigeenien antigeenisyys. Erityisesti tämä keksintö liittyy polypepti-deihin, jotka on tuotettu ekspressoimalla rakennegeenejä tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat ainakin yhtä poly-peptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, sopivissa isäntä-10 organismeissa. Kuten seuraavasta selityksestä ilmenee, voidaan tämän keksinnön menetelmällä tuotettuja polypepti-dejä käyttää hepatitis B-viruksen havaitsemiseen ihmisessä ja vasta-aineiden stimuloimiseen ihmisillä tätä virusta vastaan.
15 Virus, joka aiheuttaa hepatitis B- tai seerumihepa- titiksen, näyttää tarttuvan ainoastaan ihmiseen. Hepatitis B-virus-("HBV")infektio ihmisissä on laajalle levinnyt.
Iso-Britanniassa, Yhdysvalloissa ja länsi-Euroopassa n.
0,1 % kaikista verenluovuttajista on kroonisia HBV:n kan- 20 tajia. Samalla kun virushepatitiksesta aiheutuva kuollei- suusmäärä ei ole suuri (1975 Iso-Britanniassa se oli 3/ ·"*: miljoona) on osoituksia, että niinkin paljon kuin 5 % väestöstä Iso-Britanniassa ja 15 % väestöstä Yhdysval- ;***; loissa on saanut tartunnan. Monissa Afrikan ja Aasian • · · 25 maissa 20 %:iin asti väestöstä on kroonisia HBV:n kantajia ja yli 50 % kaikista aikuisista näissä maissa on saanut .1 HBV-tartunnan tai on HBV:n tartuttamaa.
Hepatitis-tartunta siirtyy kolmella yleisellä mekanismilla; (1) infektoidun veren tai kehon nesteiden ruoan-30 sulatuskanavan ulkopuolisella ymppäyksellä, joko suurissa määrissä kuten verensiirroissa tai pienissä määrissä kuten satunnaisten ihopistojen kautta; (2) läheisellä perhe- tai .··. sukupuolisella kosketuksella; ja (3) joistakin äideistä, » · jotka ovat raskauden aikana saaneet tartunnan siirtäen • ·' 35 viruksen vastasyntyneisiin lapsiinsa. Luonnollisissa olo- 2 86437 suhteissa HBV ei ole erittäin tarttuva. Siirtymistä si-säänhengityksen välityksellä tapahtuu harvoin, jos koskaan.
Useimmat HBV-infektiot ovat subkliinisiä. Kliininen 5 sairaus kestää tavallisesti 3-6 viikkoa ja on vakavuudeltaan lievästä akuuttiin salamannopeaan hepatitikseen asti, mitä seuraa kirroosi tai kuolema. Toipuminen kliinisistä ja subkliinisistä HBV-infektioista on tavallisesti täydellinen. Joissakin tapauksissa tuloksina on kuitenkin 10 pitkäaikaisia seurauksia: (1) likimääräisesti 5 % akuuteista infektioista johtaa krooniseen hepatitis B-virusantigeenin kantamiseen, jolloin se jatkuvasti on tehokas tartuttamaan toisia ja edistämään maksavaurioita; ja 15 (2) on todennäköistä, että HBV-infektion jälkeen tämä voi olla täysin tai osittain vastuussa kroonisen aktiivisen hepatitiksen, kirroosin ja primaarin maksasyövän HBV-sero-negatiivisten tapausten merkittävän määrän alkamisesta.
Viime aikaiset edistysaskeleet molekyylibiologiassa 20 ovat tehneet mahdolliseksi viedä DNA'ta, joka koodaa spesifisiä ei-bakteeriperäisiä, eukaryoottisia proteiineja, :**: bakteerisoluihin. Yleensä muun kuin kemiallisella syntee- sillä valmistetun DNA:n rekombinantti-DNA-molekyylien ra-kentelu käsittää vaiheet, joissa tuotetaan puhdistetun 25 lähetti-(mRNA)-mallin yksisäikeinen DNA-kopio (cDNA) haluttua proteiinia varten; muutetaan cDNA kaksisäikeiseksi DNA:ksi; liitetään DNA sopivaan kohtaan sopivassa kloon-ausvälineessä ja transformoidaan sopiva isäntä tällä yh-distelmä-DNA-molekyylillä. Tällainen transformointi tekee 30 isännälle mahdolliseksi tuottaa haluttua proteiinia. Li-: säksi, ainakin ovalbumiini-DNA:n tapauksessa on tunnettua, että tietyn DNA:n sopiva yhdistäminen voimakkaaseen bak-teeripromoottoriin tai ekspression kontrollisekvenssiin tuottaa suuria määriä haluttua ovalbumiiniproteiinia, ts. 35 n. 0,5 - 1 %. E. coli-solun kokonaisproteiinimassasta (0.
3 86437
Mercereau-Puijalon et ai., "Synthesis of an Ovalbumin Like Protein by Escherichia coli K12 Harboring a Recombinant Plasmid", Nature, 275, sivut 505-510 (1978) ja T.H. Fraser ja B.J. Bruce, "Chicken Ovalbumin is Synthezized and Sec-5 retered by Escherichia coli; Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, 5936-5940 (1978)).
Useita ei-bakteeriperäisiä proteiineja ja geenejä on syntetisoitu käyttäen yhdistelmä-DNA-teknologiaa. Näitä ovat proteiini, jolla on rotan proinsuliliinin antigeeni-10 determinantteja (L. Villa-Komaroff et ai., "A Bacterial Clone Synthezlzing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A., 75, sivut 3727-3731 (1978), rotan kasvuhormoni (p.H. Seeburg et ai♦, "Synthesis of Growth Hormone by Bacteria", Nature, 276, sivut 795-798 (1978)), hiiren dihyd-15 rofolaattireduktaasi (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic
Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding for Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, sivut 617-624 (1978)), somatostatiini (K. Itakura et al., "Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthezized Gene for the 20 Hormon Somatostatin", Science, 198, 1056-1063 (1977), GB-patentit 2 007 675A, 2 007 676A ja 2 008 123A ja saman :--· kaltaiset patenttihakemukset muissa maissa), ja ihmisen insuliinin A- ja B-polypeptidiketjut (D.V. Goeddel et al ♦, .**·. "Expression in Escherichia coli of Chemically Syn-thezized 25 Genes for Human Insulin", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., ‘II! 76, sivut 106-110 (1979), ja GB- ja saman kaltaiset pate- ntit, supra).
Mikään edellä esitetyistä ei kuitenkaan kohdistu, kuten tämä keksintö, virusproteiinien, kuten hepatitis B-·: 30 virusantigeenien yhdistelmä-DNA-synteesiin. A. Fritsch et al., "Clonage du genome du virus de 1'hepatite B dans Escherichia coli", C.R. Acad. Sc. Paris, t. 287, Serie D, .···, (1978), s. 1453-56, ja FR-hakemusjulkaisu 7835588 kohdis- tuvat hepatitis B-viruksen koko genomin kloonaamiseen, 35 mutta niissä ei kuvata HBV-antigeenisyyden omaavien poly-peptidien ekspressiota.
* 86437
On tunnettua, että HBV-infektiot aiheuttavat vasta-aineiden kehittymistä viruksen antigeeneille. Nämä vasta-aineet ovat kehon puolustusmekanismi HBV-infektiota vastaan. Tällaisten vasta-aineiden kehittymisen ennen altis-5 tamista tai nopeasti voimakkaan altistuksen ollessa kysymyksessä tulisi olennaisesti pienentää ja torjua viruksen lisääntymistä ja leviämistä potilaassa.
Ongelmana keinotekoisesti stimuloitujen vasta-aineiden kehittämisessä hepatitis B-viruksen antigeeneille 10 on kuitenkin viruksen rajoitettu isäntämäärä. Esimerkiksi, vaikka tarttuvuus ihmiseen on hyvin suuri, on kokeellinen infektio hepatitis B-viruksella saatu aikaan ainoastaan muutamissa muissa kädellisissä. Eikä virus ole lisääntynyt kudosviljelyssä. Tämä rajoitettu isäntämäärä ja kykenemät-15 tömyys tartuttaa kudosviljelysoluja on vakavasti estänyt sekä viruksen luonnehtimisen että sen infektion patologian ja nopeiden havaitsemismenetelmien ja tehokkaiden infektion hillitsemis- ja estämismenetelmien kehittämisen.
Samalla kun on tehty joitakin yrityksiä käyttää 20 autenttisia HBV-virusantigeenejä, jotka on eristetty HBV-infektiotartunnan uhreista, vasta-aineiden ja infektion havaitsemisen kehittämiseksi, nämä käsittelyt eivät yleensä ole saatavissa, mikä johtuu aktiivisten lajien rajoitetusta tarjonnasta. Lisäksi ihmislähteiden käyttö näitä an-25 tigeeneja varten on epäedullista, mikä johtuu hyvin tunnetuista kontaminaatio-ongelmista ihmiseristeitä käytettäes-: sä.
Tämä keksintö ratkaisee ongelman, johon edellä viitattiin, antamalla keksinnön mukaisesti menetelmän poly-30 peptidien tuottamiseksi, joilla on hepatitis B-virusanti- .: : geenien antigeenisyys. Keksinnön mukaisesti viljellään ·.*. bakteeri-isäntä, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-mo- lekyylillä, jossa on rakennegeeni, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys ja johon on 35 toiminnallisesti liitetty ekspression säätelysekvenssi ja 5 86437 polypeptidi kerätään talteen viljelystä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.
Tämän keksinnön avulla on mahdollista saada näitä 5 HBV-antigeeneja suurissa ja kontaminoitumattomissa määrissä rokotusvalmisteita varten ja käytettäviksi virusinfektion toteamisessa ja sen patologian ja molekyylibiologian määrittämisessä. Tällaisia lähteitä ei tähän asti ole ollut käytettävissä, mikä johtuu viruksen kapeasta isäntä-10 spektristä ja sen kyvyttömyydestä tulla viljellyksi kudos-viljelyssä. Nämä tuotteet voidaan myös tunnistaa ja niitä voidaan luonnehtia ja ne ovat käyttökelpoisia joko sellaisena kuin ne isännässä tuotetaan tai sopivan johtamisen tai modifioinnin jälkeen yhdisteiksi ja menetelmiksi näi-15 den itse tuotteiden tuotannon parantamiseksi ja HBV-infek-tion havaitsemiseksi, sen patologian seurantaa varten ja HBV-vasta-aineiden tuotannon stimuloimiseksi ihmisessä.
Tämän keksinnön menetelmä on tunnettu myös Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta valmistetun DNA-sekvens-20 sin liittämisestä toiseen DNA-sekvenssiin, joka on valmistettu muusta lähteestä kuin Dane-hiukkasesta.
:··; Tämä menetelmä voidaan erottaa edellä mainituista tekniikan tason menetelmistä siinä, että mikään alan ai-kaisemmista menetelmistä ei käytä luonnollista geeniä tai 25 DNA'ta jotakin tiettyä proteiinia varten yhdistelmä-DNA-molekyylin rakentamiseen ja tuon proteiinin tai geenin tuottamiseen. Sen sijaan ne käyttävät joko synteettisiä geenejä, jotka on tehty kemiallisella synteesillä, tai keinotekoisia geenejä, jotka on tehty entsymaattisesti " 30 kopioimalla mRNA, joka on eristetty luovuttajasolusta cDNA-sekvenssien tuottamiseksi.
Yksi syy siihen, että luonnollista DNA'ta ei ole ·. aikaisemmin käytetty suoraan proteiinien yhdistelmä-DNA- synteesissä on, että luonnolliset DNA't useimmista kor-35 keimmista organismeista ja ainakin joistakin eläinviruk- 6 86437 sista sisältävät "introneja" eli lisänukleotidisekvenssejä geenin osana. Nämä intronit eivät muodosta osaa geenin lopullisesta sanomasta. Sen sijaan ne poistuvat in vivo korkeimmissa organismeissa erityisten käsittelyentsyymien 5 vaikutuksesta, jotka toimivat primaarisella transkriptio-tuotteella antamaan geenin lopullisen sanoman (mRNA). Bakteerien oletetaan olevan kykenemättömiä käsittelemään tällaisia introneja, niin että luonnollisen DNA:n ei voida odottaa ekspressoituvan bakteeri-isännissä ja näiden isän-10 tien ei voida odottaa tuottavan haluttuja proteiineja.
Kuva 1 on yksinkertaistettu kaavio, joka edustaa Dane-hiukkasen endogeenisen DNA:n rakennetta. Se esittää kaksi komplementaarista DNA-säiettä, säikeen a ja säikeen b, loven säikeessä a ja aukon säikessä b sekä aukon sul-15 keutumisen DNA-polymeraasireaktiolla.
Kuva 2 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön menetelmän edullisesta suoritusmuodosta: Dane-hiukkasesta eristetyn endogeenisen DNA:n fragmentteja on yhdistetty E. coli-penisillinaasigeeniin plasmidilla pBR322 Pstl-kohdas-20 sa. Transformoinnin jälkeen E. coli HB101:een yhdistelmä-DNA-molekyyli pBR322-Pst I dG: HBV-Kpnl dC ohjaa polypep-:··: tidien, joilla on HBV-antigeenisyys, synteesiä.
Kuvat 3-9 esittävät nukleotidisekvenssiä, joka on määritetty osalle hepatitis B-virusgenomia tämän keksinnön 25 mukaisesti. Sekvenssi on esitetty lopetus-kodonein kolmes-sa lukukehyksessä, jotka on merkitty sen yläpuolelle. Se on mielivaltaisesti numeroitu aloituskodonilta geenille, joka koodaa HBcAg'tä kuten tässä keksinnössä määritellään. Nukleotidit -80 - -1 edustavat johtosekvenssiä, joka edel-• *- 30 tää tätä geeniä. Nukleotidit 1 - 549 edustavat nukleotidi sekvenssiä geenille, joka koodaa hepatitis B-virusydinan- ·. tigeeniä, tämän antigeenin aminohapposekvenssin (lukukehys 1) ollessa kuvattu tämän sekvenssin yläpuolella. Nukleotidit 1437 - 2114 edustavat nukleotidisekvenssiä, joka on 35 määritetty hepatitis B-viruspinta-antigeenin geenille, 7 86437 tämän antigeenin aminohapposekvenssin (lukukehys 3) ollessa kuvattu tämän sekvenssin yläpuolella. Eri restrik-tioendonukleaasi-tunnistuskohdat näissä geeneissä on myös kuvattu kuvissa 3-9.
5 Kuva 10 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön me netelmästä, jossa yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka pystyy tuottamaan polypeptidin, jolla on hepatitis B-viruksen ydinantigeenisyys, pilkotaan ja fragmentti siitä on liitetty parannettuun ekspressiosäätelysekvenssiin, lac-sys-10 teemiin.
Kuva 11 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön menetelmästä, jossa tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyli on pilkottu ja yhdistetty faagi-DNA:n fragmenttiin käytettäväksi isäntäsolujen lysogenoinnissa ja siten lisäämään 15 geenikopioiden lukumäärää niissä.
Kuva 12 on kaavamainen luonnos toisesta tämän keksinnön menetelmän suoritusmuodosta: tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka ei tuota polypeptidiä, jolla on hepatitis B-virusydinantigeenisyys, pilkotaan rakennegee-20 nin HBsAg'ia varten ja tätä rakennegeeniä käytetään tuot tamaan yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka tuottaa HBsAg'tä sopivassa isännässä.
Jotta tässä selostettu keksintö tulisi täydellisem-.·*. min ymmärretyksi, esitetään seuraava yksityiskohtainen 25 selostus.
’!*.] Selostuksessa käytetään seuraavia termejä:
Nukleotidi -- DNA:n tai RNA:n monomeeriyksikkö, joka käsittää sokeriosan (pentoosin), fosfaatin ja hetero-syklisen typpiemäksen. Emäs on liittynyt sokeriosaan glu-30 kosidi-hiilen (pentoosin 1’-hiili) kautta ja tämä emäksen ·“ ja sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Emäs luonnehtii nuk- leotidiä. Neljä DNA-emästä ovat adeniini ("A"), guaniini *···. ("G"), sytosiini ( "C") ja tyrniini ("T"). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C ja urasiili ("U").
a 86437 DNA-sekvenssi -- Suoraviivainen sarja nukleotideja, jotka ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesteri-sidoksin vierekkäisten pentoosien 3' ja 5'-hiilien välissä.
Kodoni -- Kolmen nukleotidin (tripletin) DNA-sek-5 venssi, joka koodaa mRNA:n kautta aminohappoa, translaation aloitussignaalia tai translaation lopetussignaalia. Esimerkiksi nukleotiditripletit TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ja CTG koodaavat aminohappoa leusiini ("Leu"), TAG, TAA ja TGA ovat translaation lopetussignaaleja ja ATG on trans-10 laation aloitussignaali.
Lukukehys — Kodonien ryhmittymä mRNA:n translaation aikana aminohapposekvensseiksi. Translaation aikana oikea lukukehys täytyy ylläpitää. Esimerkiksi sekvenssi GCTGGTTGTAAG voidaan translatoida kolmessa lukukehyksessä 15 eli faasissa, joista jokainen antaa erilaisen aminohappo-sekvenssin: GCT GGT TGT AAG -- Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG -- Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA A — Trp-Leu-(lopetus) 20 Polypeptidi — Suoraviivainen sarja aminohappoja, jotka on kytketty toisiinsa peptidisidoksin vierekkäisten ·:-·· aminohappojen α-amino- ja karboksi-ryhmien välissä.
Genomi — Aineen ehyt DNA. Se sisältää muun muassa .*··. rakennegeenit, jotka koodaavat aineen polypeptidejä, sekä 25 myös operaattorin, promoottorin ja ribosomin sitovat ja vuorovaikutus-sekvenssit, jotka käsittävät sellaisia sekvenssejä kuin Shine-Dalgarno-sekvenssit.
Rakennegeeni -- DNA-sekvenssi, joka koodaa mallinsa tai lähetti-RNA:n (”mRNA":n) kautta aminohappojen sekvens-; 30 siä, joka on ominainen jollekin spesifiselle polypeptidil- . ! le.
Transkriptio -- Prosessi mRNA:n tuottamiseksi rakennegeeni s tä .
' Translaatio -- Prosessi polypeptidin tuottamiseksi 35 mRNA:sta.
9 86437
Ekspresslo -- Prosessi, jonka rakennegeeni käy läpi tuot-taakseen polypeptidin. Se on transkription ja translaation yhdistelmä.
Plasmidl — Ei-kromosomaalinen kaksisäkeinen DNA-5 sekvenssi, joka sisältää koskemattoman "repiikonin", niin että plasmidi monistuu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoitetaan yksisoluiseen organismiin, muuttuvat tämän organismin ominaispiirteet eli transformoituvat seurauksena plas-midin DNArsta. Esimerkiksi plasmidi, jolla on geeni tetra-10 sykliiniresistenssiä (TetR) varten transformoi solun, joka aikaisemmin on ollut herkkä tetrasykliinille, soluksi, joka on sille resistentti. Plasmidilla transformoitua solua nimitetään "transformantiksi".
Faagi eli bakteriofagi -- Bakteerivirus, joista 15 monet sisältävät DNA-sekvenssejä kapseloituina proteiini-vaippaan tai kapseliin ("kapsidi"). Yksisoluisessa organismissa faagi monistuu prosessilla, jota nimitetään transfektioksi.
Kloonausväline — Plasmidi, faagi-DNA tai muita 20 DNA-sekvenssejä, jotka pystyvät monistumaan isäntäsolussa, tunnettuja yhdestä tai pienestä lukumäärästä endonukleaa-si-tunnistuskohtia, joissa tällaiset DNA-sekvenssit voidaan leikata määriteltävällä tavalla ilman että tähän liittyy DNA:n olennaisen biologisen funktion häviötä, 25 esim. replikaation, vaippaproteiinien tai promoottorin tai sitomiskohtien häviötä ja jotka sisältävät markkerin, joka on sopiva käytettäväksi transformoitujen solujen tunnistamisessa, esim. tetrasykliiniresistenssin tai ampisilliini-resistenssin tunnistamisessa. Kloonausvälinettä nimitetään • 30 usein vektoriksi.
· Kloonaus — Suvuttoman lisääntymisen prosessi.
Yhdistelmä-DNA-molekyyli — Hybridi-DNA-sekvenssi, joka sisältää vähintäin kaksi nukleotidisekvenssiä, joista ensimmäistä sekvenssiä ei normaalisti löydy yhdessä toisen : 35 sekvenssin kanssa luonnossa.
10 86437
Ekspressoinnin säätelysekvenssi -- Nukleotidien DNA-sekvenssi, joka kontrolloi ja säätelee rakennegeenien ekspressiota, kun ne on toimivasti liitetty näihin geeneihin.
5 Viitaten nyt kuvaan 1, on siinä esitetty yksinker taistettu kaavio Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta. Dane-hiukkasia on havaittavissa joidenkin potilaiden, joilla on hepatitis B-virusinfektioita, veriplasmassa (D.S. Dane ja C.H. Cameron, "Virus-Like Particles in Serum 10 of Patients with Australia-Antigen Associated Hepatitis", The Lancet, 1, sivut 695-698 (1970)). Tämän hiukkasen ajatellaan olevan sama tai läheisesti sukua hepatitis B:n tartuttavalle virionille. Samalla kun sen koko tiedetään (42 nanometriä läpimitaltaan), sen rakenne ei ole täysin 15 tunnettu. Yleisesti Dane-hiukkasen uskotaan käsittävän ulkokerroksen ja sisemmän ytimen. Hiukkasen ulkokerros sisältää yleensä polypeptidin, joka tunnetaan hepatitis B-pinta-antigeeninä ("HBsAg"). Sisempi ydin läpimitaltaan 27 nanometriä) sisältää toisen polypeptidin hepatitis B-ydin-20 antigeenin ("HBcAg") sekä myös endogeenisen kaksisäikei-sen, pyöreän, 2,1 x 106 daltonin DNA-molekyylin, joka si-:··· sältää pituudeltaan vaihtelevan yksisäikeisen aukon. Myös kolmas polypeptidi, "e"-antigeeni ("HBeAg") voi liittyä Dane-hiukkasiin. Lisäksi DNA-hiukkasen uskotaan sisältä-" 25 vän endogeenista DNA:sta riippuvaisen DNA-polymeraasin, !'.l joka osittain sulkee yksisäikeisen aukon endogeenisessä DNA:ssa polymeraasireaktiolla käyttäen tätä DNA1ta aluk-keena/mallina. Dane-hiukkasen rakenne ja ominaisuudet ja erityisesti sen DNA ovat olleet useiden analyysien kohtee-30 na. Esim. W.S. Robinson, "The Genome of Hepatitis B Virus", : Ann. Rev. Microbiol. 31, T.A. Landers et ai., "Structure of Hepatitis B Dane Particle DNA and Nature of the Endo-•I genous DNA Polymerase Reaction", J. Virology, 23 (1977) 368-76; J. Summers et al., "Genome of Hepatitis B Virus; 35 Restriction Enzyme Cleavage and Structure of DNA Extracted li 86 437 from Dane Particles", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 72 (1975) 4597-601; J. Summers et al., "A Virus Similar to Hepatitis B Virus Associated with Hepatitis and Hepatoma in Woodchucks", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 5 4533-37, ja B.G. Werner et al., "Association of E Antigen with Dane Particle DNA in Sera from Asymptomatic Carriers of Hepatitis B Surface Antigen", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74 (1977) 2149-51. Eri antigeenien tai niiden geenien todellista rakennetta ei kuitenkaan ollut määritelty. 10 Dane-hiukkasen endogeeninen DNA on eristetty uutta malla Dane-hiukkasesta. Se käsittää yhden nukleotidisäi-keen, jolla on vakiopituus ja jossa on lovi tai aukko (kuva 1, säie a, » 3000 nukleotidia) ja toisen nukleotidiryh-män, jonka pituus jonkin verran vaihtelee (kuva 1, säie b, 15 * 2000 nukleotidia). Toinen ryhmä on komplementaarinen ensimmäisen säikeen kanssa ja peittää sen loven pyöreän rakenteen täydentämiseksi vetysidoksella komplementaaristen emästen välillä tavanomaisella Watson-Crick-tavalla. Tämä peitto käy ilmi kuvasta 1. Dane-hiukkasen DNA-polyme-20 raasi näyttää käyttävän endogeenisen DNA:n toista säieltä alukkeena ja ensimmäistä säieltä mallina muuttuvan aukon täyttämiseksi nukleotideillä, jotka ovat komplementaarisia ensimmäisen säikeen nukleotideille ja antavat kaksisäikei-. ··_ sen DNA:n, jossa on 3000 nukleotidiparia.
! 25 Suurta valikoimaa isäntä-kloonausväline-yhdistelmiä voidaan hyödyllisesti käyttää tämän keksinnön kaksisäi-keistä DNA'ta kloonattaessa. Esimerkiksi käyttökelpoiset kloonausvälineet voivat käsittää kromosomaalisia, ei-kro-mosomaalisia ja synteettisiä DNA-sekvenssejä, kuten eri-30 laisia tunnettuja bakteeri-plasmideja, kuten pBR322, muita : E. coli-plasmideja ja niiden johdannaisia ja suuremman isäntäspektrin plasmideja, kuten RP4, faagi DNA, kuten λ- ♦ » *-.! faagin lukuisia johdannaisia, esim. NM989, ja vektoreita, :* jotka on johdettu plasmidien ja faagi-DNA'iden yhdistel- 35 mistä, kuten plasmidideista, jotka on modifioitu käyttä- i2 86437 mään faagi-DNA:n ekspression säätelysekvenssejä. Käyttökelpoisia isäntiä ovat bakteeri-isännät, kuten E. coli X1776, E.coli X2282, E. coli HB101 ja E. coll MRC1 ja Pseudomonas ja Bacillussubtilis- ja muut basillikannat.
5 Kaikki isännät eivät tietenkään ole yhtä tehokkaita.
Lisäksi jokaisen spesifisen vektorin sisällä voidaan valita eri kohtia eristetyn kaksisäikeisen DNA:n in-sertiota varten. Nämä kohdat on tavallisesti merkitty res-triktioentsyymillä tai endonukleaasilla, joka leikkaa ne. 10 Esimerkiksi pBR322:ssa Pstl-kohta sijaitsee penisillinaa-sigeenissä nukleotiditriplettien välissä, jotka koodaavat penisillinaasiproteiinin aminohappoja 181 ja 182. Tätä kohtaa käyttivät Villa-Komaroff et ai., supra, syntetisoi-dessaan proteiinia, jolla oli rotan proinsuliinin antigee-15 nideterminantit. Hind II-endonukleaasi-tunnistuskohta on triplettien, jotka koodaavat aminohappoja 101 ja 102, ja Taq-kohdan välissä tripletissä, joka koodaa tämän proteiinin aminohappoa 45 pBR322:ssa. Samalla tavalla Eco Rl-en-donukleaasin tunnistuskohta tässä plasmidissa sijaitsee 20 geenien välissä, jotka koodaavat resistenssiä tetrasyklii-nille ja vastaavasti ampisilliinille. Tätä kohtaa käytti-vät Itakura et ai. ja Goeddel et ai. yhdistelmä-DNA-syn-teesikaavioissaan, supra. Kuvat 2 ja 11 esittävät valaise-"1 mistarkoituksessa joitakin restriktio-kohdista plasmidissa 25 pBR322 ja λ-faagissa NM989.
Tietyn kohdan, joka valitaan valikoidun DNA-hiukka-sen insertiota varten kloonausvälineen yhdistelmä-DNA-mo-·· lekyylin muodostamiseksi, määrää joukko eri tekijöitä.
Näitä ovat ekspressoitavan polypeptidin koko ja rakenne, 30 halutun polypeptidin herkkyys endoentsymaattiselle pilk- ·"". koutumiselle isäntäsolukomponenttien vaikutuksesta ja kon taminaatio sen proteiineilla, ekspressoitumisominaisuudet, kuten aloitus- ja lopetuskodonien sijainti, sekä muut alaan perehtyneiden tuntemat tekijät. Koska ekspressoitu-35 misprosessia ei täysin ymmärretä, mikään näistä tekijöistä i3 86437 yksinään ei absoluuttisesti säätele insertio-kohdan valintaa jollekin tietylle polypeptidille. Pikemminkin valittu kohta saa aikaan tasapainon näiden tekijöiden välille ja kaikki kohdat eivät ole yhtä tehokkaita jollekin tietylle 5 proteiinille.
Vaikka tekniikan tasolla tunnetaan useita menetelmiä vieraan DNA:n liittämiseksi kloonausvälineeseen yhdis-telmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, menetelmä, jota tämän keksinnön mukaisesti pidetään edullisena, on esitetty 10 kuvassa 2. Sille on luonteenomaista, että Dane-hiukkasen DNA pilkotaan restriktioendonukleaasilla, polydeoksiC-sekvenssit liitetään pilkotun DNA:n 3'-päätteisiin (nimitetty sopimuksella DNA-sokerirungon deoksiriboosihiilestä) ja pidennetty DNA liitetään kloonausvälineeseen, joka on 15 leikattu tietystä kohdasta restriktioendonukleaasilla ja pidennetty tämän leikkauksen 3'-päätteistä polydeoksiG-sekvensseillä, jotka ovat komplementaarisia pilkotun DNA:n polydC-sekvensseille. DNA:n ja kloonausvälineen 3'-häntien komplementaarinen luonne sallii näiden päätteiden tarttu-20 misen yhteen.
Ollakseen käyttökelpoinen tämän keksinnön menetel- ____: mässä restriktioentsyymin, joka on valittu pilkkomaan - HBV:n DNA, ei tulisi pilkkoa HBV:n DNA'ta HBV:n antigeeni- I" syyttä omaavia polypeptidejä koodaavan geenin oleellisessa "I 25 osassa ja sopivimmin sen tulisi pilkkoa DNA rajoitetussa määrässä kohtia. Restriktioentsyymejä, joita on käytetty tässä keksinnössä, ovat Κρη I, Bgl II, Bam HI, Ava I ja Eco Rl. Muut restriktioendonukleaasit voivat olla samalla tavalla käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisesti. Kuvat 30 3 - 9 esittävät joitakin restriktioendonukleaasi-tunnis- tuskohtia osassa HBV-genomia.
Tietenkin muut tunnetut menetelmät DNA-sekvenssien liittämiseksi kloonausvälineisiin yhdistelmä-DNA-molekyy- - · lien muodostamiseksi ovat yhtä lailla käyttökelpoisia täs-35 sä keksinnössä. Näitä ovat esimerkiksi suora liitäntä.
14 86437 jolloin samaa restriktioendonukleaasia käytetään pilkkomaan HBV:n DNA ja kloonausvälinettä. Tämä menettely antaa luonnostaan komplementaariset päät yhteentarttumista varten.
5 On tietenkin ymmärrettävä, että kloonausvälineen valittuun pilkontakohtaan liitetyn geeni fragment in nukleo-tidisekvenssi voi sisältää nukleotidejä, jotka eivät ole varsinaisen rakennegeenin osia haluttua proteiinia varten tai voivat sisältää ainoastaaan tämän rakennegeenin frag-10 mentin. Liitettävästä DNA-sekvenssistä välittämättä ainoa vaatimus on, että transformoitu isäntä tuottaa polypep-tidin, joka antaa HBV-antigeenisyyden.
Yhdistelmä-DNA-molekyyliä, joka sisältää hybridi-geenin, voidaan käyttää transformoimaan isäntä niin, että 15 se sallii isännän (transformantin) ekspressoida sen raken-negeeni tai sen fragmentti ja tuottamaan polypeptidin tai sen osan, jota hybridi-DNA koodaa. Yhdistelmä-DNA-molekyyliä voidaan myös käyttää transformoimaan isäntä niin, että isäntä lisääntyessään pystyy tuottamaan lisää yhdistelmä-20 DNA-molekyylejä HBV-rakennegeenien ja niiden fragmenttien lähteeksi. Sopivan isännän valintaa kumpaakin näitä kahta käyttötarkoitusta varten säätelee joukko alalla tunnettuja tekijöitä. Näitä ovat esimerkiksi yhteen sopivuus valitun vektorin kanssa, mukana olevien tuotteiden myrkyllisyys, "I 25 halutun polypeptidin talteenoton helppous, ekspressointi-• · · ·;;; ominaisuudet, bioturvallisuus ja kustannukset. Jälleen, koska ekspressoitumisen mekanismia ei täysin tunneta, ei • “ mitään isännän absoluuttista valintaa tulisi tehdä jotakin tiettyä yhdistelmä-DNA-molekyyliä tai peptidiä varten mis-: 30 tään näistä tekijöistä yksinään. Sen sijaan näiden teki- jöiden tasapainoon täytyy liittyä oivaltaminen, että kaik-. \ ki isännät eivät ole yhtä tehokkaita jonkun tietyn yhdis- telmä-DNA-molekyylin ekspressiota varten.
Tässä synteesissä edullinen kloonausväline on bak-35 teeriplasmidi pBR322 ja edullinen restriktioendonukleaasi- is 86437 kohta siinä on Pst I-kohta (kuva 2). Tämä plasmidi on pieni (molekyylipaino n. 2,6 megadaltöniä) plasmidi, jolla on resistenssigeenejä antibiooteille ampisilliini (Amp) ja tetrasykliini (Tet). Plasmidi on täysin luonnehdittu (F.
5 Bolivar et ai., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurprose Clonig System". Gene (1977) 95-113). Edullisen kloonausmenetelmän, bakteeri- plasmidin pBR322 ja siinä olevan Pst I-kohdan, joita käytetään keksinnön mukaisissa menetelmissä, ovat kuvanneet 10 R.P. Ambler ja G.K. Scott artikkelissa "Partial Amino Acid Sequence of Penicillinase Coded by Escherichia coli Plasmid R6K", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 3732-36 ja J. G. Sutcliffe, artikkelissa "Nucleotide Sequence of The Ampicillin Resistance Gene of Escherichia coli 15 Plasmid pBR322", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 3737-41. Edullinen isäntä tämän keksinnön mukaisesti on E. coli HB 101.
Keksinnön valaisemiseksi esitetään seuraavat esimerkit.
20 Esimerkki I
Ihmisseerumia yhdestä ainoasta HBsAg-positiivises-. ··*. ta, HBeAg, positiivisesta luovuttajasta (serotyyppi adym) laimennettiin yhtä suurella tilavuusmäärällä puskuria (0,1 M tris-HCl, 0,1 M suolaliuos (NaCl), 0,1 paino/tilavuus-"*j 25 %, kuten kauttaltaan on käytetty, 2-merkaptoetanolia, 0,1 ::: % naudan seerumialbumiinia, 0,001 M EDTA) pH 7,4:ssä. Tätä ’ sentrifugoitiin kierrosnopeudella 35 000 rpm 2 tuntia 4° : ** C:ssa. Näin saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 200 yl:aan samaa puskuria ja pantiin sentrifugiputken, joka 30 sisälsi 20 % sakkaroosia, yläpäähän. Suspensiota sentrifu-: goitiin kierrosnopeudella 40 000 rpm 2 tuntia 4 °C:ssa.
Näin saatu pelletti suspendoitiin jälleen uudelleen 100 pl:aan puskuria (0,1 M tris-HCl, 0,1 M suolaliuosta) pH "* 7,5:ssä.
35 Syntynyt DNA'ta sisältävä pelletti merkattiin sit- • * i6 86 437 ten 3H:lla tai 32P:llaa, kuten ovat kuvanneet P.M. Kaplan et ai., "DNA Polymerase Associated with Human Hepatitis B Antigen", J. Virol., 12, sivut 995-1005 (1973) sen seuraamisen helpottamiseksi prosessin myöhempien vaiheiden läpi.
5 Tämä merkkaus on tulos väkevöityjen Dane-hiukkasten ja 3H-tai 32P-merkattujen deoksinukleosiditrifosfaattien (dNTP' eiden) reaktiosta 4 tunnin aikana 37 °C:ssa. Tämän DNA-polymeraasireaktion jälkeen, mistä on tuloksena yksisäi-keisen aukon osittainen sulkeutuminen DNA:ssa (ks. kuva 10 1), merkattu DNA-aines pantiin sentrifugiputken, joka si sälsi 30 % sakkaroosia, yläpäähän ja sentrifugoitiin kier-rosnopeudella 42 000 rpm 3,5 tuntia 4 eC:ssa.
DNA uutettiin sitten fenolilla syntyneestä pelletistä käyttäen L.I. Lutwick'in ja W.S. Robinson'in mene-15 telmää, "DNA Synthesized in the Hepatitis B Dane Particle DNA Polymerase Reaction", J. Virol., 21, sivut 96-104 (1977). Uutettua DNA'ta dialysoitiin sitten liuosta vastaan, joka oli 0,01 M tris-HCl, 0,001 M EDTA (pH 8,0) fe-noliliuottimen poistamiseksi. Eristetty DNA oli sitten 20 valmis uuttoihin restriktioentsyymeillä. Sen spesifinen radioaktiivisuus oli noin 108 cpm/pg. Edellä selostettu me-:·· netelmä on kaavamaisesti esitetty kuvassa 2.
1. dC-pidennetyn Dane-hiukkasen DNA:n valmistus .·*. Sovellettaessa tämän keksinnön edullista suoritus- 25 muotoa käytännössä Dane-hiukkasista kuten edellä eristet-"X tyä DNA'ta uutettiin restriktioendonukleaasilla Κρη I (n.
20 ng DNA 10 pl:ssa 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanoli, 40 mM NaCl, 0,5 μΐ μΐ entsyymival-mistetta) 37 °C:ssa 90 minuuttia ja restriktioentsyymi in-30 aktivoitiin kuumentamalla 70 °C:ssa 5 minuuttia. Polydeok-siC-sekvenssejä (kuvaamistarkoituksessa ainoastaan kuvattu CCC:nä kuvassa 2) liitettiin uuttotuotteiden 3'-päätteisiin standardireaktiolla polynukleotidi-päätetransferaa-silla jäämäproteiinin poistamisen jälkeen fenolilla ja 35 kloroformilla uuttamalla (20 μΐ kumpaakin). Fenoli pois- i7 86437 tettiin vesipitoisesta faasista uuttamalla eetterillä ja DNA saostettiin lisäämällä 3M natriumasetaattia, pH 6,5 (5 μΐ) ja kylmää etanolia 0,1 ml. Yhden tunnin varastoinnin jälkeen -70 °C:ssa saostunut DNA otettiin talteen sentri-5 fugoimalla kierrosnopeudella 10 000 rpm 20 minuuttia ja pelletti liuotettiin 10 mM tris-HCl:ään pH 7,5 (10 μΐ). Tähän lisättiin 3 μΐ 400 mM kaliumkakodylaattia, pH 7,0, 4 mM kobolttikloridia, 4 mM deoksisytosiinitrifosfaattia (dCTP), 200 pg/ml naudan seerumialbumiinia, ja seosta in-10 kuboitiin 27 °C:ssa 10 minuuttia 0,5 μ1:η kanssa polynuk-leotidi-päätetransferaasia (6000 μ/ml) ja reaktio lopetettiin lisäämällä 50 mM EDTA (1 μΐ).
2. Pst Iillä pilkotun, dG-pidennetyn pBR322:n valmistus 15 Plasmidia pBR322 uutettiin restriktioendonukleaa- silla Pst I (jota varten plasmidi sisältää yhden kohteen) ja tuotteet puhdistettiin fenoliuutolla ja etanolisaostuksella tavalla, joka edellä kuvattiin HBV DNA:lie. Poly-dG-sekvenssejä (ainoastaan valaisemistarkoituksia varten 20 esitetty GGG:nä kuvassa 2) lisättiin lineaaristen pBR322-molekyylien 3’-päätteisiin päätetransferaasilla kuten on selostettu polydC-sekvenssien lisäämiselle HBV:hen, paitsi että reaktio saatettiin tapahtumaan 37 °C:ssa.
.··. 3. G-pidennetyn pBR322:n ja C-pidennetyn HBV DNA:n 25 yhteenliittäminen "" Ekvimolaarisia määriä pBR322-polydG ja HBV DNA- polydC sekoitettiin keskenään ja komplementaaristen sekvenssien annettiin sitoutua inkuboimalla 100 mM NaCl:ssa 50 mM tris-HCl:ssa, pH 7,5, 5 mM EDTA (TNE):ssa, (50 μΐ) 30 65 °C:ssa yksi tunti, ja sitten 47 °C:ssa 1 tunti, 37° C- :ssa yksi tunti ja 20 °C:ssa yksi tunti ja lisättiin yhtä suuri tilavuusmäärä TNE ja 20 μΐ 100 mM MgCl2, 100 mM CaCl2, 100 mM tris-HCl, pH 7,5.
18 86437 4. E. coll HB 101;n transformointi Transformaatioon kelpaavia E. coli HB 101 viljelyjä valmistettiin kuten E.M. Lederberg ja S.H. Cohen ovat kuvanneet , "Transformation of Salmonella typhimurium by 5 Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol, 119 sivut 1072-1074 (1974). 0,1 ml:n annoksia soluja sekoitettiin 25 μΐιη kanssa lämpökäsiteltyä DNA-valmistetta ja inkuboitiin 0 °C:ssa 20 minuuttia ja sitten 20 eC:ssa 10 minuuttia ennen levittämistä L-agarmaljoille, jotka sisälsivät tetra-10 sykliiniä (50 pg/ml) inkuboitaviksi yli yön 37 °C:ssa. Koska plasmidi pBR322 sisältää geenin tetrasykliiniresis-tenssiä varten, E. coli-pesäkkeet, jotka on transformoitu tällä plasmidilla, kasvavat viljelmissä, jotka sisältävät tätä antibioottia sulkien pois ne E. coli-pesäkkeet, jotka 15 eivät ole näin transformoituja. Siten kasvu tetrasykliiniä sisältävässä viljelyssä sallii sopivasti transformoitujen isäntien valikoimisen.
5. E. coli-pesäkkeiden seulonta hybridisoimalla Bakteeripesäkkeitä, jotka oli kasvatettu inkuboi- 20 duilla tetrasykliiniä sisältävillä L-agarmaljoilla, testattiin ampisilliiniherkkyyden suhteen. Plasmidi pBR322 :··: sisältää geenin ampisilliiniresistenssiä varten. Tämä gee- ni on ehdotettu kohta hybridigeeni-insertiota varten. Sen tähden pesäkkeet, jotka on transformoitu plasmidilla, jos-25 sa on DNA liitettynä valittuun tunnistuskohtaan, ovat ' i herkkiä ampisilliinille, mutta säilyttävät resistenssinsä tetrasykliinille. E. coli-pesäkkeet, jotka olivat herkkiä ampisilliinille mutta resistenttejä tetrasykliinille, poimittiin Millipore-selluloosanitraattisuodattimelle, joka 30 oli asetettu L-agarmaljoille, jotka sisälsivät tetrasyk-; : liiniä. Kasvattamisen jälkeen yli yön 37 °C:ssa Millipore- : .·. suodatin vaihdettiin tuoreille L-agarmaljoille, jotka si- sälsivät tetrasykliiniä ja kloramfenikolia, (150 pg/ml) ja inkuboitiin vielä useita tunteja 37 °C:ssa plasmidien ko-35 pioiden lukumäärän lisäämiseksi solujen sisällä (kuva 2).
i9 86437
Mllllpore-suodattlmia käytettiin sitten pesäke-hybridisaa-tiota varten, kuten ovat kuvanneet M. Grunstein ja D.S. Hogness, "Colony Hybridization: A Method for the Isolation of Cloned DNA's that contain a Specific Gene", Proc. Natl.
5 Acad. Sci. U.S.A., 72, sivut 3961-3965 (1975) 32P-leimatun HBV DNA:n kanssa, joka oli edellä valmistettu koettimeksi. Suodattimien radioautografia paljasti pesäkkeiden läsnäolon, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia autenttiselle HBV DNA:lie.
10 6. Pesäkkeiden havaitseminen, jotka syntetisoivat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys
Pesäkkeitä, jotka olivat resistenttejä tetrasyklii-nille, herkkiä ampisilliinille ja jotka oli hybridisoitu autenttisella HBV DNA:11a, testattiin kykynsä suhteen 15 tuottaa ainakin yksi polypeptidi, jolla on HBV-antigeeni-spesifisyys tai -antigeenisyys. Pesäkkeitä poimittiin jälleen Millipore-suodattimille, jotka oli sijoitettu L-agar-maljoille, jotka sisälsivät tetrasykliiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön. Toinen L-agar-malja peitettiin E. coli 20 C600:n viljelmällä (0,1 ml 2 ml:ssa pehmeätä agaria), joka oli infektoitu bakteriofagin λ vir elinvoimaisella kannal-I la (infektion moninkertaisuus n. 1) ja inkuboitiin myös 37® C:ssa yli yön, jona aikana bakteeripeite oli yhtyvästi .···. liuennut (ts. pääasiallisesti kaikki isäntäsoluseinistä 25 oli murtunut) faagin (λ-vir) vaikutuksesta. Millipore-suo-datin, joka sisälsi tämän keksinnön mukaisesti transformoidut solut, nostettiin maljaltaan ja sijoitettiin, pesäkkeet alaspäin, kosketukseen E. coli C600:n L-agar-mal-jan pinnan kanssa, jota oli liuotettu λ-vir:llä. Tätä kos-30 ketusta jatkettiin n. 10 minuuttia Millipore-suodattimessa : : olevien solujen infektion sallimiseksi λ-vir:llä. Millipo- re-suodatin siirrettiin sitten tuoreelle L-agarmaljalle ja ’..I inkuboitiin 37 ®C:ssa vielä 5 tuntia. Sillä välin pääl lystettiin polyvinyylikeikkoja HBV-vasta-aineilla (kuten \· 35 ovat selostaneet S. Broome ja W. Gilbert, "Immunological 20 86437
Screening Method to Detect Specific Translation Products", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, sivut 2746-2749 (1978). Milliporesuodattimet, joissa transformoidut bakteeripesäk-keet nyt ilmeisesti olivat liuenneet, sijoitettiin pääl-5 lystetyille polyvinyylikiekoille siten, että pesäkkeet koskivat niihin ja pidettiin 4 °C:ssa 3 tuntia. Tästä kosketuksesta oli seurauksena soluista liuenneiden kaikkien HBV-antigeenien Millipore-suodattimella sitoutuminen kiekon HBV-vasta-aineiden kanssa. Päällystetyt kiekot erotet-10 tiin Millipore-suodattimesta ja pestiin sitten ja inkuboi-tiin 125I-merkattujen HBV-vasta-aineiden kanssa. Tästä inku-boinnista oli seurauksena niiden kohtien merkkautuminen kiekolla, joissa HBV-antigeenit Millipore-suodattimesta olivat aikaisemmin tulleet sidotuiksi kiekon HBV-vasta-15 aineisiin. Pesun ja radioautografian jälkeen, kuten ovat selostaneet Broome ja Gilbert, supra, pesäkkeet, jotka olivat tuottaneet polypeptidejä, joilla on HBV-antigeeni-spesifisyys, paikannettiin radioautografiaan viitaten.
Esimerkki II
20 Antigeenisten polypeptidien, jotka on translatortu yhdistelmä-DNA-molekyylistä tämän keksinnön E. coli:ssa, biologisen aktiivisuuden testaamiseksi, injektoitiin bak-teerisolujen, joiden oli näytetty ekspressoivan HBcAg'tä, III steriilejä uutteita kaniineihin sekoittamisen jälkeen yhtä Ί 25 suuren tilavuusmäärän kanssa Freund'in apuainetta. Kaksi ·;;; eläintä sai raakaa bakteeriuutetta ja kahdelle annettiin saman uutteen näytteitä fraktioinnin jälkeen Sephadex G-50-pylväällä. Saman näytteen lisäinjektioita, jotka oli pakastettu ja varastoitu (säilyttäen täyden antigeenisen - 30 aktiivisuutensa) annettiin kaksi ja viisi viikkoa ensim- : mäisen injektoinnin jälkeen. Eläimistä otettiin verta tie- Λ tyin väliajoin useita viikkoja alkuinjektoinnin jälkeen.
'..I Immunodiffuusio-kokeet, käyttäen 0. Ouchterlony'n selostamaa menetelmää "Immunodiffusion and Immunoelectro-: \· 35 phoresis", käsikirjassa Handbook of Experimental Immu- 2i 86437 nology (D.W. Weir toim.) (Blackwell Scientific Publications, Oxford ja Edinburgh), luku 19 (1967), tehtiin kaniinin seerumien (vasta-aineiden) vertaamiseksi ihmisen hepatitis B-virusydin-vasta-aineeseen ("HBcAb") käyttäen 5 HBcAg'tä, joka oli johdettu ihmisen maksasta. (B.J. Cohen ja Y.E. Cossart, "Application of a Screening Test for Antibody to Hepatitis B Core Antigen", J. Clin. Path., 30, sivut 709-713 (1977)). Kaikki neljä kaniiniseerumia antoivat presipitiiniviivoja, joiden HBcAg oli samanlainen kuin 10 niillä, jotka oli muodostettu HBcAg:n ja HBcAbrn välillä, jotka oli muodostettu ihmislähteistä. Siten ydinantigeeni, joka on syntetisoitu E. colizssa tämän keksinnön yhdistel-mä-DNA-molekyyleillä, on serologisesti aktiivinen in vivo. Tämä aktiivisuus antaa käytettäväksi yhdistelmien ja mene-15 telmien toteutettavuuden käyttäen virusantigeenejä, jotka on syntetisoitu mikrobisoluissa, vasta-aineen muodostumisen stimuloimiseksi ihmisissä. Tällaisille yhdistelmille ja menetelmille ovat ominaisia polypeptidit, jotka on tuotettu isännissä, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-20 molekyyleillä, jotka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti. Näitä polypeptidejä voitaisiin käyttää yksinään tai ·:·*: hyvin tunnettujen farmaseuttisesti hyväksyttävien kanti- mien, kuten suolaliuosten tai muiden lisäaineiden, jotka .*··. alalla ovat hyvin tunnettuja, kanssa käytettäviksi yhdis- 25 telmissä ja menetelmissä virusinfektioiden hoitamiseksi ja 'II! estämiseksi ihmisillä.
.1 Kuten edellä todettiin, voidaan restriktioentsyyme- jä, muita kuin edellä selostettua Kpn I/Pst I-yhdistelmää hyödyllisesti käyttää tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-mole-. : 30 kyylien valmistamisessa. Muita pilkontakohtia plasmidissa : pBR322 ja osa HBV-genomista on kuvattu kuvissa 2 ja 3, vastaavasti. Näiden vaihtoehtoisten, mutta vähemmän edul-listen suoritusmuotojen valaisemiseksi esitetään seuraavat esimerkit.
22 86437
Esimerkki III
HBV DNA-osasia, jotka oli tuotettu käyttämällä Bam HI, Eco Rl ja Bgl II, toisin kuin niitä, jotka oli valmistettu Kpn I:llä, ei voitu tavanomaisesti suoraan muodostaa 5 hänniksi koossa pysymistä varten, mikä johtuu lyhyiden 5'-yksisäikeisten ulkonemien läsnäolosta. Niitä käsiteltiin sen tähden λ-eksonukleaasilla näiden ulkonemien poistamiseksi ennen polydC-sekvenssien lisäämistä 3'-päätteissä. Tämä tehtiin inkuboimalla pilkottua DNA'ta (10 pl liuosta 10 kuten edellä kuvattiin) 15 μ1:η kanssa 100 mM natriumgly-sinaattia, pH 9,5, 10 mM MgCl2, 100 pg/ml naudan seerumi-albumiinia, 5 μΐ λ-eksonukleaasia 0 eC:ssa 1,5 tuntia. Seosta uutettiin sitten fenolilla ja kloroformilla ja prosessia jatkettiin. Valmistuksen, jossa käytettiin Bam HI, 15 jälkeen tehty radioimmunoanalyysi vahvisti polypeptidien tuoton, joilla oli HBV-antigeenispesifisyys.
Esimerkki IV
DNA-fragmenttien häntien muodostamisen asemasta koossa pysymistä varten, kuten edellä on selostettu, voi-20 daan tämän keksinnön menetelmissä käyttää geenifragment-tien suoraa liitäntää. Esimerkiksi, kahdessa lisävalmis-tuksessa pilkottiin HBV DNA (20 ng) restriktioendonukleaa-silla Eco Rl tai Bam HI 10 mM tris-HCl:ssä, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanoli, 50 mM NaCl (10 μΐ), 37 °C-25 :ssa 1,5 tuntia ja sekoitettiin ylimäärin pBR322:n kanssa, jota oli inkuboitu samojen entsyymien kanssa samanlaisissa olosuhteissa. Väkevöity puskuriliuos (660 mM tris HC1, pH
7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 100 mM 2-merkaptoetanoli, 400 mM NaCl, 1 mM ATP) (2 μΐ) lisättiin ja seosta inku-·.: 30 boitiin T4 DNA-ligaasin (0,5 μΐ) kanssa 10 °C:ssa 3 tun tia, mitä seurasi ainakin 24 tuntia 0 °C:ssa. Liuos laimennettiin 0,1 ml:ksi 10 mM tris-HCl:llä, pH 7,5 ja käytettiin transformoimaan E. collHBlOlm kykeneviä viljelmiä kuten edellä selostettiin. Bam Hiillä valmistettujen yh-35 distelmä-DNA-molekyylien tapauksessa pesäkkeet testattiin.
23 86437 ennen seulontaa hybridisaatiota varten, herkkyyden suhteen tetrasykliinille eikä ampisilliinille, koska Bam HI:n kohde pBR322:ssa on geenissä, joka koodaa tetrasykliiniresis-tenssiä, ja sen tähden on menestyksellisestä insertiosta 5 tässä tunnistuskohdassa seurauksena tämän resistenssin häviö ampisilliiniresistenssin asemesta kuten insertion tapauksessa Pst I-kohdassa.
Yhdistelmä-DNA-molekyylien tapauksessa, jotka oli valmistettu Eco RI-kohdan kautta, pesäkkeet testattiin, 10 ennen seulontaa hybridisaatiota varten, resistenssin suhteen sekä ampisilliinille että tetrasykliinille, koska Eco Rl:n kohde pBR322:ssa on geenien välissä, jotka koodaavat tetrasykliini- ja ampisilliiniresistenssiä, niin että mitään geenien inaktivoitumista ampisilliini- tai tetrasyk-15 liiniresistenssille ei tapahdu hybridi-DNA-insertiossa tässä kohdassa.
Esimerkki V
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua HBV DNA'ta voidaan käyttää genomin nukleotidisekvenssin määrittämi-20 seen ja siitä geenin ja HBV-antigeenien aminohapposekvenssien ja itse rakennegeenien määrittämiseen. Näiden sek-**: venssien tunteminen auttaa hepatitis B-viruksen biologian ymmärtämisessä ja tekee mahdolliseksi edellä selostettujen -·*. modifiointien käyttämisen parhaaksi eduksi.
25 1. Hepatitis B-ydinantigeeni ·- Sarja yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka oli tehty edellä selostettujen menetelmien mukaisesti ja jotka antoivat isäntäsoluilleen kyvyn syntetisoida HBcAg'tä, kuten kiintofaasiradioimmunoanalyysillä havaittiin, valittiin 30 sekvenssianalyysiä varten. Näistä yhdistelmä-DNA-molekyy-. · leistä valmistettiin fragmentteja uuttamalla sopivilla :.·. restriktioentsyymeillä ja fragmentit leimattiin niiden 5'- .···, päätteissä [a-32P] ATP:lla ja T4-polynukleotidikinaasilla.
Jokaisen fragmentin nukleotidisekvenssit määritettiin sit-: .· 35 ten hyvin tunnetuin kemiallisin hajoamismenetelmin (A.M.
24 86437
Maxam ja W. Gilbert, "A New Method for Sequencing DNA", Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, sivut 560-564 (1977). Tuloksena saatu nukleotidisekvenssi on kuvattu kuvissa 3 - 9. Viittausta varten sekvenssi on numeroitu ydingeenin 5 ATG-translaatio-aloituskodonin A:sta. HBcAg-geenin nukleotidisekvenssi ja polypeptidin aminohapposekvenssi, joka seuraa tästä geenistä (koodikaava 1) on kuvattu kuvissa 3 - 9 nukleotidien 1 - 549 välissä. Tämän geenin koodaaman polypeptidin koko on lähellä molekyylipainoa 19 000, joka 10 on havaittu Dane-hiukkaisten ydinantigeenille. Tämä raken-nemääritys ei kuitenkaan sulje pois mahdollisuutta, että joitakin aminohappoja voidaan sovittaa tämän polypeptidin aminopäätteestä in vivo autenttisen antigeenin muodostumisen aikana. Tämä rakenne ei myöskään ota huomioon mitään 15 muuta tai muita modifikaatioita polypeptidiin, jotka aiheutuisivat sen vuorovaikutuksesta muiden ihmisen entsyymien, esim. niiden entsyymien, jotka glykosoloivat proteiineja, kanssa. Siten tässä määritetty polypeptidiraken-ne ei ole samanlainen kuin HBcAgrn rakenne, joka havaitaan 20 in vivo, mutta silti se saa aikaan hyvin samanlaisen, ellei identtisen immuunivasteen.
Kaikissa tutkituissa yhdistelmä-DNA-molekyyleissä oli HBV DNA liitetty niin, että ydinantigeenigeeni pidet-. ·· tiin samassa translaatiofaasissa kuin pBR322:n penisillii ni 25 niresistenssin geeni. Lisäksi erilaisissa rekombinanteissa *;;; HBV DNA-insertio alkoi yhdessä tai kahdessa nukleotidissä, joilla oli sama asema HBV-sekvenssissä. Koska nämä yhdis-telmä-DNA-molekyylit olivat peräisin HBV DNA:sta, jota oli uutettu eri restriktioentsyymeillä, esim. Bam HIrllä ja 30 Kpn I:llä, tämä ainutlaatuinen liittyminen on yllättävää t ja voi olla tulos HBV DNA:n polynukleotidi-hännänmuodos- tuksen huomaamattomasta murtumisesta Dane-hiukkasen endo-geenisen DNA:n lovessa (kuva 1). Yhdistelmä-DNA-molekyy-lit, joissa oli HBV DNA-insertio erilaisessa translaatio-35 faasissa, eivät ekspressoineet HBcAg-geeniä, eikä mitään 25 86437 polypeptidiä, jolla olisi HBV-antigeenisyys, havaittu isännissä, jotka oli transformoitu tällaisilla yhdistelmä-DNA-molekyyleillä. Tietenkin on ymmärrettävä, että tällaiset ei-geeniä ekspressoivat isännät ja yhdistelmä-DNA-5 molekyylit ovat vielä käyttökelpoisia HBV DNA:n tuottamiseksi tämän keksinnön mukaisesti.
Kun odotettiin, että HBcAg tai sen fragmentit, jotka on tuotettu HBV DNA-insertioiden ekspressoinnin kautta, yhdistyisivät penisillinaasiresistenssin geenin tuottee-10 seen (β-laktamaasiin) pienen määrän glysiini-jäännöksien kautta, näin ei tapahtunut. Sen sijaan B-laktamaasi yhdistyi kaikissa tapauksissa 5-8 glysiinien kautta samanlaiseen peptidisekvenssiin,mutta tämä sekvenssi loppui 25 aminohapon jälkeen. Tässä lukukehyksessä (kehys 1, kuva 3) 15 lopetuskodonia (TAG) seuraa kolme nukleotidia myöhemmin aloituskodoni, josta translaatio jatkuu estymättä antamaan polypeptidi, jonka pituus on 183 aminohappoa (kuvat 3 -8). Siten ydinantigeeninen aktiivisuus on n. 21 000 dalto-nin polypeptidissä, joka on translatoitu de novo HBV-sek-20 venssistä mRNA:n sisällä, joka on transkriboitu yhdistel-mä-DNA-molekyylistä. Tämä polypeptidi pysyy isäntäsolussa, koska se ei ole liittynyt erittyneeseen penisillinaasi-kanninproteiiniin, mikä johtuu HBV DNA-insertion lopetus-ja aloituskodonien järjestelystä.
25 2. Hepatitis B-plnta-antigeeni HBsAg-geenin nukleotidisekvenssi ja aminohapposek-: venssi polypeptidiä varten, joka saadaan tästä geenistä (lukukehys 3) on myös kuvattu kuvissa 6-8, nukleotidien 1437 - 2114 välissä. Tämän polypeptidin aminohapposek-' f 30 venssi alkaa N-päätteellä sekvenssillä met-glu-asn-ile-thr-ser. Tämän alkuaminohapposekvenssin määrittivät D.L. Peterson et ai. "Partial Amino Acid Sequence of two Major Component Polypeptides of Hepatitis B Surface Antigen", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 74, sivut 1530 - 1534 'V. 35 (1977) autenttisesta ihmis-HBsAg:stä. Tämän proteiinin 26 86 437 aminohapposekvenssi jatkuu kuvissa 6-8 lopetuskodoniin asti 226 aminohapon päässä. Tämä 226-polypeptidisekvenssi vastaa 25 400 daltonin proteiinia.
HBsAg-aminohapposekvenssin ja pituuden ovat riippu-5 mattomasti vahvistaneet sekvensoimalla sopivia yhdistelmä-DNA-molekyylejä P. Valenzuela et ai., "Nucleotide Sequence of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen; Nature 280, sivut 815 - 819 (1979).
Tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyleille määri-10 tetty nukleotidisekvenssi osoittaa, että millään tutkituista, HBcAg:n geeniä ekspressoivista yhdistelmä-DNA-mo-lekyyleistä ei voi olla HBsAg:n geeniä asemassa, josta sen myös voisi odottaa ekspressoituvan sopivassa isäntäsolus-sa. Itse asiassa mitään HBsAg'tä ei havaittu solujen uut-15 teissä, jotka solut oli transformoitu niiden plasmidien kanssa, joiden oli havaittu ekspressoivan HBcAg-geeniä. Kuitenkin, kuten edellä mainittiin, supra, tieto näiden geenien nukleotidisekvensseistä sallii ekspressointipro-sessin modifioinnin sen saannon ja tehon parantamiseksi ja 20 geenien sekä polypeptidien, joita aikaisemmin ei ole eks-pressoitu tai havaittu, tuotannon edistämiseksi.
·:··: Esimerkki VI
. ··. Näiden antigeenien geeni- ja aminohapposekvenssit •\ ovat käyttökelpoisia suunniteltaessa menetelmiä antigeenin ^ 25 tai geenin tuotantotason lisäämiseksi bakteerisolua kohti, ill Proteiinin tuotantotasoa kaksi päätekijää hallit see: sen geenin kopioiden lukumäärä solun sisällä ja tehokkuus, jolla nämä geenikopiot transkriboituvat ja trans-latoituvat. Transkription ja translaation, jotka yhdessä . 30 muodostavat ekspression, tehokkuus riippuu vuorostaan nuk- : leotidisekvensseistä, jotka normaalisti sijaitsevat halu tun koodaussekvenssin edellä. Nämä nukleotidisekvenssit tai ekspressointisäätelysekvenssit määrittävät muunmuassa sijainnin, jossa RNA-polymeraasi on vuorovaikutuksessa V 35 aloittaakseen transkription (promoottorisekvenssi) ja jos- 27 86437 sa ribosomit sitoutuvat ja ovat vuorovaikutuksessa mRNA:n kanssa (transkription tuote) aloittaakseen translaation.
Kaikki tällaiset ekspressoinnin säätelysekvenssit eivät toimi yhtäläisellä tehokkuudella. Siten on eduksi erottaa 5 spesifiset koodaussekvenssit haluttua proteiinia varten niiden vierekkäisistä nukleotidisekvensseistä ja yhdistää ne tunnettujen ekspressoinnin säätelysekvenssien kanssa ekspressoinnin korkeiden tasojen siten edistämiseksi. Kun tähän on päästy voidaan vasta aikaansaatu DNA-fragmentti 10 yhdistää monikopioplasmidiin tai bakteriofagijohdannai- seen geenikopioiden lukumäärän lisäämiseksi solussa ja siten edelleen ekspressoidun proteiinin saannon parantamiseksi .
Valaisemistarkoituksissa HBcAgrn geenille määritet-15 tyä sekvenssiä on käytetty tällä tavalla parantamaan HBcAg:n tuotantoa E. coli:ssa. Eräs tällainen menettely on kuvattu kuvassa 10.
DNA-sekvenssin HBcAG:tä varten tutkiminen kuvassa 3 paljastaa, että tätä geeniä edeltää kohta Alu I varten ' 20 nukleotidissa 26 (AGCT) ja sisältää kohdat Eco Ri* nukleotideissä 22 ja 1590, Eco RII:lle 209:ssä (CCTGG), Hae III varten 280:ssa (GGCC) ja Ava II varten 246:ssa ja 461:ssa (GGACC, GGTCC). Tästä monimutkaisuudesta tietoisena on sopivaa siirtää ydinantigeenia koodaava sekvenssi tehok-25 kaampiin ekspressiosäätelysekvensseihin kahdessa vaiheessa. Esimerkiksi, yhdistelmä-DNA-molekyylin (pHBV114), joka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti ja jossa on n.
2350 emäsparin (nukleotidin) HBV DNA-insertio, esim. nukleotideistä -80 - n. 2270 kuvassa 3, uutto sekä Alu I:lla '· 30 ja Eco Rl*:11a antaa muunmuassa fragmentin nukleotidien -26 ja 22 (fragmentti A) välissä, samalla kun Eco RI*-uut-to yksinään antaa fragmentin nukleotideistä 23 - 1589 • ··. (fragmentti B) ja pienet saannot fragmentista nukleoti deistä 23 - 576 (fragmentti B'). Nämä fragmentit voidaan : 35 helposti tunnistaa viittaamalla kuviin 3 - 4 ja ne on kaa- 28 86437 vamaisesti kuvattu kuvassa 10. Fragmentit A ja B on frak-tionoitu geelielektroforeesilla niiden puhdistamiseksi ja liitetty niiden Eco RI*-tarttuvien päidensä kautta antamaan yhdistetty fragmentti (fragmentti C). Fragmentti C 5 liitetään nyt uuteen ekspressiosäätelysekvenssiin, kuten on sopivaa, suoran liitännän kautta oikean translaatio-faasin ylläpitämiseksi, 3'-hännänmuodostusmenetelmän mukaisesti, joka edellä selostettiin, tai synteettisten oli-gonukleotidiliittäjien kautta. Tämä liittäminen ei ainoas-10 taan käytä parempaa ekspressiosäätelysekvenssiä proteiini-tuotannon parantamiseksi, vaan se sallii myös HBcAg'tä koodaavan geenifragmentin liittämisen lähemmäksi itse ekspressiosäätelysekvenssiä siten tämän geenifragmentin eks-pressoitumisen säätelyn parantamiseksi. Samaan tapaan voi-15 daan liittää fragmentit A ja B' tai lukuisia muita valmistettuja fragmentteja ja niiden seurauksena saatuja fragmentteja kuten edellä. Tämä prosessi osoittaa, että ainoastaan osa rakennegeenistä, joka koodaa jotakin tiettyä polypeptidiä, on tarpeen käyttää tämän keksinnön yhdistel-20 mä-DNA-molekyyleissä.
Välimatkan edelleen lyhentämiseksi tietyn ekspres- siosäätelysekvenssin ja valitun geenifragementin aloitus- kodonin välillä voidaan tiettyjä fragmenttia lievästi käsitellä nukleaasien yhdistelmällä, joka toimii spesifises-25 ti päätteessään tai sen lähellä tai jota käytetään ekso-nukleaasi- ja polymeraasi-sidotuissa korjausreaktioissa fragmenttien aloituskodonia edeltävän fragmentin nukleotidien joidenkin tai kaikkien poistamiseksi. Vaihtoehtoisesti voitaisiin fragmentti, kuten Alu I-fragmentti, joka 30 on saatu pilkonnasta nukleotideissä -26 ja 30, samalla tavalla lyhentää eksonukleaasikäsittelyllä tai polymeraa-si-sidoskorjausreaktioin ja sitten pilkkoa Eco Rl*:11a antamaan fragmentti nukleotidien -26 ja 1 ja nukleotidin 22 väliltä sallimaan fragmentin B yhdistäminen ennen liit-35 tämistä ekspressoinnin säätelysekvenssiin. Vielä eräs tie 29 8 6 4 3 7 saattaisi käsittää fragmentin B tai samanarvoisen fragmentin hybridisoinnin sopivaan yksisäikeiseen malliin emä-yhdistelmä-DNA-molekyylistä jatkamista varten sarjassa reaktioita DNA-polymeraasin ja rajoitetun määrän nukleo-5 siditrifosfaattien kanssa, niin että fragmenttisäie voi taisiin konstruoida uudelleen koodaussekvenssin alkuun. Mallisäie pilkottaisiin silloin yhdistämiskohdassaan pidennettyyn fragmenttisäikeeseen endonukleaasilla SI ja näin saatu fragmentti liitettäisiin ekspressoinnin sääte-10 lysekvenssiin.
Voidaan käyttää useita ekspressoinnin säätelysek-venssejä kuten edellä selostettiin. Näitä ovat E. coli:n laktoosi-operonin operaattori, promoottori ja ribosomia sitovat ja vuorovaikutussekvenssit (käsittää sellaisia 15 sekvenssejä kuin Shine-Dalgarno-sekvenssit) ("lac-systee- mi"), E. coli tryptofaanisynteesisysteemiä vastaavat sekvenssit ( "trp-systeemi"), faagin λ (0LPL ja 0RPj) operaattori- ja promoottori-alueet sekä faagi-fd-päällystepro-teiinin säätelyalue. Näitä sekvenssejä sisältävät DNA-20 fragmentit leikataan pilkkomalla restriktioentsyymeillä DNA:sta, jotka on eristetty siirtyvistä faageista, joilla on lac- tai trp-operoneja, tai faagin λ tai fd DNA: sta. Näitä fragmentteja käsitellään sitten HBV-antigeeni-sek-.·*·. vensseille esitetyllä tavalla rajoitetun molekyyli-popu- 25 laation saamiseksi niin, että olennaiset säätelysekvenssit 111 voidaan liittää hyvin läheisesti tai rinnakkaisasemaan halutun antigeenin koodaussekvenssin aloituskodonin kanssa kuten edellä fragmentille C selostettiin.
Fuusiotuote liitetään sitten kuten edellä kloo-30 nausvälineeseen sopivien isäntien transformointia varten ja antigeenituotanto mitataan radioimmunoanalyyttisesti solujen liuottamisen jälkeen. Solut, jotka antavat tehok-_··*_ kaimman ekspressoinnin, voidaan täten valita. Vaihtoehtoi sesti voidaan käyttää kloonausvälineitä, joissa on lac-, : V 35 trp- tai λ -PL-säätelyjärjestelmä liittyneenä aloituskodo- 30 86437 niin, ja yhdistää fragmenttiin, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys niin, että rakennegeenifragmentti on oikein translatoitu kloo-nausvälineen aloituskodonista.
5 Samalla kun nämä kokeet ovat kohdistuneet erityi sesti HBV-ydinantigeenin tuottamiseen, ne ovat käytettävissä parantamaan muiden geenien, kuten HBsAg- ja HBeAg-geenien ja niiden fragmenttien ekspressoitumista.
Näiden tiettyjen antigeenien lisäparannukset solu-10 saannossa riippuvat solussa hyväksi käytettävien geenien lukumäärän lisäyksestä. Tähän on valaisemistarkoituksissa päästy liittämällä yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka on rakennettu edellä kuvatulla tavalla, keskinkertaiseen bakteriofagiin λ (NM989), yksinkertaisimmin uuttamalla plas-15 midia restriktioentsyymillä, esim. Eco Rl:11a tai Hind III:11a antamaan suoraketjuinen molekyyli, joka sitten sekoitettiin pilkotun λ-faagi-kloonausvälineen kanssa (esim. joka on N.E. Murray'n et ai. tyyppiä. "Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in Vitro Recom-20 binants", Molec. gen. Genet., 150, sivut 53-61 (1977) ja N.E. Murray et ai., "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4", J ♦ Mol. Biol., 132, sivut 493-505 (1979)), ja tuotettu DNA-molekyyli on saatu inkuboimalla DNA-ligaasilla. Tällainen prosessi on kuvattu 25 kuvassa 11. Haluttu yhdistelmäfaagi valikoitiin sitten radioimuunianalyysillä tietyn antigeenin suhteen tai hyb-ridisoimalla radioaktiivisesti merkatuilla HBV DNA-sek-vensseillä ja sitä käytettiin E. coli:n isäntäkannan lyso-genoimiseen.
30 Erityisen käyttökelpoiset λ -kloonausvälineet si- : sältävät lämpötilaherkän mutaation repressiogeenissä cl ja vaimentuvia mutaatioita geenissä S, jonka tuote on tarpeen isäntäsolun liuottamiseen, ja geenin E, jonka tuote on viruksen pääkapsidiproteiini. Tällä systeemillä lysogeeni-’.· 35 siä soluja kasvatetaan 32 °C:ssa ja kuumennetaan sitten 3i 8 6 437 45 eC:seen profaagin leikkautumisen aiheuttamiseksi. Pitkitetty kasvatus 37 °C:ssa johtaa antigeenin suurien määrien tuotantoon, joka säilyy solujen sisällä, koska näitä ei liuoteta faagi-geeni-tuotteilla normaalilla tavalla ja 5 koska faagi-geeni-insertio ei ole kapseloitu se pysyy käytettävissä transkriptiota varten. Solujen keinotekoinen liuottaminen vapauttaa sitten antigeenin suurella saannolla (kuva 11).
E. coli-systeemien lisäksi, joita nämä esimerkit 10 ovat pääasiallisesti koskeneet, voidaan samantyyppisiä käsittelyjä suorittaa antigeeni-tuotannon lisäämiseksi muissa mikrobisoluissa, kuten B. subtilis:issa tai termo-fiilisissä bakteereissa. B. subtilis'in tapauksessa plas-midi, jolla on determinantteja penisillinaasia varten, 15 joka on eristetty lajista B. lichenformis, antaa käyttökelpoisen ekspressiosäätelysekvenssin näitä tarkoituksia varten.
Esimerkki VII
HBsAg:lle määrityt geeni- ja aminohapposekvenssit 20 ovat käyttökelpoisia suunniteltaessa menetelmiä HBsAg:n geenin ekspressointia varten tämän keksinnön menetelmällä. Tällaista ekspressointia ei aikaisemmin havaittu isännissä, jotka oli transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyyleillä, jotka tuottivat polypeptidejä, joilla oli HBV-antigeeni-25 syys.
Kuvien 6-8 nukleotidisekvenssi esittää geeniä, joka koodaa HBsAg'tä nukleotidien 1437 ja 2114 välissä. Tämä geeni on eri translationaalisessa faasissa (lukukehys 3) kuin geeni, joka koodaa HBcAg'tä (lukukehys 1) kuvien 30 3-9 HBV-genomissa. Sen tähden valittiin yhdistelmä-DNA- molekyyli, joka ei tuottanut HBcAg'tä, kun sitä käytettiin transformoimaan sopivaa isäntää, vaan sisälsi n. 2350 nukleotidin HBV DNA-insertion (joka vastaa sekvenssin nukleotidejä n. -80 - 2270 kuvissa 3-8) käytettäväksi HBsAg-35 tuotannossa.
32 86437
Valittu yhdistelmä-DNA-molekyyli sisälsi muunmuassa kokonaisen geenin, joka koodaa HBsAg'tä. Tämän yhdistelmä-DNA-molekyylin HBV DNA-insertion nukleotidisekvenssin tar-kastelupaljastaa useita pilkontaendonukleaasikohtia, jotka 5 tekevät mahdolliseksi fragmenttien leikkaamisen, jotka sisältävät HBsAg'tä koodaavan geenin. Esimerkiksi, nukleotidi 1409 (Xho), nukleotidi 1410 (TAq), nukleotidi 1409 (Ava I) ja nukleotidi 1428 (Hha I) (kuva 6). Näistä viimemainittu (Hha I) on erityisen hyödyllinen, koska HBV 10 DNA-insertion pilkkominen tapahtuu nukleotidien 1430 ja 1431 välissä, leikkauksena ainoastaan kuusi nukleotidia ennen itse HBsAg-aloituskodonia (ATG). Kaikissa neljässä tapauksessa leikattu fragmentti ulottuu yli valitun HBV DNA-insertion kohteeseen tiettyä restriktioendonukleaasia 15 varten yhdistelmä-DNA-molekyylin pBR322-osan nukleotidi- sekvenssissä. Siten näiden restriktioendonukleaasien ja muiden samalla tavalla käyttökelpoisten vastaavien endo-nukleaasien käyttö yksin tai yhdessä sallii geenin, joka koodaa HBsAg'tä, leikkaamisen lähellä, mutta sen aloitus-20 kodonin edellä ja sen translationaalisen päätekodonin jälkeen. Tietenkin, on ymmärrettävä, että kuten on esitetty HBcAg-geenin tapauksessa tarvitsee itse asiassa käyttää vain ehyen geenin fragmentteja yhdistelmä-DNA-molekyyleis-sä tuottamaan polypeptidejä, joilla on HBsAg-antigeenisyys 25 sopivissa isännissä.
HBV DNA:n fragmentteja, jotka on kehitetty tällaisista uutoista, on käsitelty sarjassa reaktioita, jotka ovat analogisia niiden kanssa, jotka on selostettu geenille ja geenifragmenteille, jotka koodaavat ydinantigeeniä. 30 Esimerkiksi geenifragmentti voidaan liittää geeniin, joka koodaa pBR322:n penisilliiniresistenssiä (esim. Pst I-tunnistuskohta, kuva 2), joka tuottaa polypeptidiä, jolla ; on HBsAg-antigeenisyys yhdessä β-laktamaasin kanssa (peni- sillinaasigeenin tuote), geenifragmentti voidaan liittää 35 geenien väliin, jotka koodaavat penisilliiniresistenssiä 33 86437 ja tetrasykliiniresistenssiä pBR322:ssa (Eco Rl tai Hind ΙΙΙ-tunnistuskohdat, kuva 2) ja liittää siinä tai ennen insertiota lac-systeemiekspresslosäätelysekvenssiin aikaansaaden siten polypeptidi, jolla on HBsAg-antigeeni-5 syys liittyneenä lac-systeemin S-galaktosidaasiproteii-niin, jolloin geenifragmentti voidaan liittää kloonausvä-lineeseen niin lähelle valittua ekspressiosäätelysekvens-siä itseään kuin mahdollista, kuten on edellä kuvattu geenille, joka koodaa HBcAg'tä, tai geenifragmentti voidaan 10 muulla tavalla kloonata kuten tämän keksinnön mukaisesti on esitetty.
Valaisemistarkoituksessa yksi tällainen kaavio on kuvattu kuvassa 12. Siinä valittu yhdistelmä-DNA-molekyy-li, jossa oli HBV DNA-insertio (pHBV114), joka ulottui 15 nukleotidien -80 ja 2270 väliin (kuvat 3 - 8, fragmen-toitiin uuttamalla Hha 1:11a. Syntynyt fragmentti liitettiin 3'-hännänmuodostamismenetelmän mukaisesti, joka edellä kuvattiin, pBR322:n Pst I-kohtaan. Isännät, jotka oli transformoitu tällä yhdistelmä-DNA-molekyylillä, tuottivat 20 polypeptidejä, joilla oli HBsAg-antigeenisyys.
Myös muita fragmentteja (esim. Ava I, Tag, Xho tai Pst I (osittaisuutto)) on liitetty Pst I-tunnistuskohtaan tai muihin kohtiin pBR322:ssa yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia polypeptidien ·' 25 tuottamiseen, joilla on HBsAg-antigeenisyys tai geenifrag-menttien tuottamiseksi, jotka koodaavat HBsAg'tä. Lisäksi tällaisia geeni-osasia on liitetty pBR322:een, joka oli pilkottu Pst I:llä ja syntynyt fragmentti geenistä, joka koodaa penisillinaasia, leikattiin sitten eroon kodonista, ·: 30 joka koodaa penisillinaasin eli β-laktamaasin aminohappoa 182 yhdessä tapauksessa kodoniin, joka koodaa aminohappoa 32, ja toisessa tapauksessa kodoniin, joka koodaa tämän polypeptidin aminohappoa 13. Näitä pBR322-Pst-I:n johdos-plasmideja on myös käytetty HBsAg-geenifragmenttien kans-V 35 sa, jotka ulottuivat nukleotideistä 1447 1796:een asti 34 86437 (kuvat 6-7) tuottamaan polypeptidejä, joilla on HBsAg-antigeenisyys.
Nukleotidisekvenssi nukleotidien 948 ja 1437 välissä, edeltäen välittömästi rakennegeeniä, Joka koodaa 5 HBsAg'tä, voidaan myös sisällyttää fragmentteihin, joita käytetään käyttökelpoisten yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseen polypeptidien valmistamiseksi, joilla on HBsAg-antigeenisyys, ja HBsAgrn rakennegeenin geenifrag-menttien. Tätä nukleotidisekvenssiä nimitetään geenin pre-10 kursorisekvenssiksi. Geenifragmentteja, jotka sisältävät sekä tämän prekursorisekvenssin että rakennegeenin HBsAg-:tä varten, voidaan leikata Alu I:lla (nukleotidi 939), Hha 1:11a (nukleotidi 900) ja Hae II:11a (nukleotidi 899). Alu I:n ja Hha I:n osittainen uutto ja syntyneiden frag-15 menttien erottaminen, esim. geelielektroforeesilla, on tarpeen, koska tunnistuskohtia näille entsyymeille esiintyy myös prekursorisekvenssissä nukleotidissä 1091 Alu I:tä ja nukleotidissä 1428 Hha II:ta varten.
Yleistä 20 Polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys ja ra- kennegeenejä ja fragmentteja, jotka koodaavat näitä, voidaan käyttää menetelmissä ja sarjoissa, jotka on tehty HBV-vasta-aineiden läsnäolon havaitsemiseksi ihmisissä ja siten tunnistamaan ihmiset ja verinäytteet, jotka ovat ·"’ 25 tämän viruksen tartuttamia.
Esimerkiksi HBcAg'tä, joka on tuotettu tämän kek-. : sinnön yhdistelmä-DNA-molekyyleillä transformoiduilla "·· isännillä, voidaan käyttää nykyisin käytettävissä olevissa immunologisissa diagnostisissa testeissä hepatitis B-vi-\: 30 ruksen havaitsemiseen, eli radioimmunonmäärityksessä tai ELISA:ssa (entsyymisidottu immuunosorbenttimääritys). Eräässä radioimmuniomääritystyypissä anti-ydinantigeeni-vasta-aine tuotetaan laboratorioeläimessä, kiinnitetään kiinteään faasiin, esimerkiksi koeputken sisäpinnalle. 35 HBcAg lisätään sitten putkeen niin, että se sitoutuu vas- 35 86437 ta-aineen kanssa. Antigeeni-vasta-ainekompleksilla päällystettyyn putkeen lisätään näyte potilaan seerumista yhdessä tunnetun määrän kanssa HBV anti-ydin-vasta-ainetta, joka on merkattu radioaktiivisella isotoopilla, kuten ra-5 dioaktiivisella jodilla. Kaikki HBV-vasta-aineista potilaan seerumista kilpailevat merkatun vasta-aineen kanssa vapaista sitoutumiskohdista antigeeni-vasta-ainekomplek-silla. Kun seerumin on annettu olla vuorovaikutuksessa, ylimäärä-neste poistetaan koeputki pestään ja radioaktii-10 visuus mitataan. Positiivinen tulos, ts. potilaan seerumi sisältää HBV-vasta-ainetta, käy ilmi matalasta radioaktiivisesta lukemasta. Yhdessä ELISA-tyyppisessä testissä mik-rotiitterilevy päällystetään HBcAg:lla ja tähän lisätään näyte potilaan seerumista. Inkubointijakson jälkeen, joka 15 sallii kaikkien vasta-aineiden vuorovaiktuksen antigeenin kanssa, levy pestään ja lisätään valmiste, jossa on anti-ihmisvasta-aineita, jotka on aikaansaatu laboratorioeläi-messä ja jotka on sidottu entsyymileimaan, inkuboidaan antamaan reaktion tapahtua ja levy pestään uudelleen. 20 Senjälkeen entsyymisubstraatti lisätään mikrotiitterile-vylle ja inkuboidaan ajanjakso, joka sallii entsyymin vaikuttaa substraattiin ja lopullisen valmisteen adsorbtio mitataan. Suuri muutos adsorbtiossa osoittaa positiivista .··*. tulosta.
25 Esimerkeissä I, II, III ja IV selostettujen mene telmien mukaisesti valmistetut mikro-organismit ovat esimerkinomaisesti tallennettu viljelminä kokoelmaan Culture Collection of the Microbiological Research Establishment at Porton Down, 15.12.1978 ja nimetty pBR322-HBV-A-F:ksi. 30 Spesifisesti näiden viljelmien tunnusmerkit ovat: A: E. coll HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Kpn I dC: :·!·. Tet* Amps HBV* VA* B: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bam HI dC: "·’ TetR Amps HBV* VA* 36 86437 C: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bgl II dC:
TetR Amp3 HBV* D: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Eco RI dC:
TetR Amp3 HBV+ 5 E: E. coli HB 101/pBR322-Bam HI:HBV-Bam HI:
Tets Amp” HBV+ F. E. coli HB 101/pBR322-Eco RI:HBV-Eco RI:
TetR Amp” HBV* Näytteitä näistä identtisistä viljelmistä on myös 10 talletettu kokoelmaan Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Skotlanti 19.12.1979 talletusnumeroilla NCIB 11548 - 11553.
Mikro-organismeista, jotka on valmistettu esimerkeissä V, VI ja VII selostetuin menetelmin, on esimerkkei-15 nä viljelmät, jotka on talletettu kokoelmaan Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Skotlanti, 19.12.1979 ja tunnistettu pBR322-HBV G-L:na (NCIB 11554 - 11560 ja luonnehdittu seuraavasti: G: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Kpn I dC: 20 (tämän jälkeen "pHBV114"): TetR Amps HBV* H: E. COli HB 101/pBR322-Pst I':pHBV114-Pst I:
TetR Amp3 HBV* VA* I: E. coll HB 101/(pBR322-Eco Rl, Bam HI:lac promoottori-. ··. sekvenssi)-Hind III liittäjät: pHBV114-Hha I, BamHI: 25 Tet3 AmpR HBV* VA* J: E. coll HB 101/pUR2*-Eco Rl: pHBV114-Hha I Eco Rl liittäjät:
Tets AmpR HBV* VA* K: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:pHBVH4-Ava I dC:
TetR Amp3 HBV* VA* 30 L: E.coli HB 101/pBR322-Pst I dG:pHBV114-Taq dC:
TetR Amp3 HBV* VA* * pBR322:n johdannainen, jossa on DNA-sekvenssi, ··· joka käsittää geenin, joka koodaa polypeptidille tetrasyk- liini-resistenssin, korvattuna pienellä määrällä DNA-sek-35 venssiä, joka sisältää E. coli lac-systeemin.
37 86 437
Edellä esitetty viljelmien nimistö on selostus viljelmästä seuraavasti: isäntä/kloonausväline - pilkontakoh-ta kloonausvälineessä osoittaen nukleotidin pidentyminen (jos on): hepatitis B-virus-pilkontakohta hepatitis B-vi-5 ruksessa osoittaen pidentymistä (jos on): resistenssi (R) tai herkkyys (S) tetrasykliinille (Tet) ja ampisilliinille (Amp), positiivinen hybridisaatio HBV DNA:n kanssa pesäke-hybridisaatiotestissä, supra, (HBV*) ja polypeptidin, jolla on HBV-antigeenisyys, tuotanto, supra, (V^). Tätä ni-10 mistöä käyttäen viljelmä pBR322-HBV-A E. coli HB 101 merkitsee viljelmää, joka sisältää plasmidina yhdistelmä-DNA-molekyylin, jossa on PBR322, joka on pilkottu Pst I-koh-dassa ja pidennetty polydC-hännällä 3'-päätteessä, joka on liittynyt HBV DNA, joka on pilkottu Kpn I:lla ja pidennet-15 ty polydC-hännällä 3'-päätteessään, jolloin viljelmä on resistentti tetrasykliinille, herkkä ampisilliinille, on positiivinen HBV DNA-hybridisaatiotestille ja tuottaa po-lypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys.
Tietenkin on ymmärrettävä, että tämän keksinnön 20 hybridimikro-organismit, yhdistelmä-DNA-molekyylit ja po-lypeptidit sekä menetelmät, jotka soveltuvat niihin, eivät rajoitu edellä selostettuihin edullisiin suoritusmuotoihin. Sen sijaan hybridi-organismeja, yhdistelmä-DNA-mole-kyylejä ja polypeptidejä voidaan modifioida valmistuksen 25 aikana tai sen jälkeen tunnetuin menetelmin hyvää tulosta varten. Esimerkiksi, tehokkaampia ekspressiosäätelysek-venssejä voidaan käyttää HBV-geenien transkriptiota tai hybridigeenejä, mutaatioita varten ei-toivottujen geeni-tuotteiden syntetisoitumisen pienentämiseksi, proteaasi-: 30 määriä isäntäsoluissa voidaan alentaa, lämpöindusoitavat lysogeenit, jotka sisältävät HBV-geenejä, voidaan yhdistää isäntäkromosoomiin tai muita modifiointeja ja menetelmiä voidaan toteuttaa geenikopioiden lukumäärän lisäämiseksi solussa tai solujen tuottavuuden lisäämiseksi haluttujen 35 polypeptidien valmistuksessa. Sen lisäksi, että näitä käy- 38 86437 tetään polypeptidien tuottamiseen, joilla on HBV-antigee-nisyys, tämän keksinnön hybridi-mikro-organismit ovat käyttökelpoisia myös suurien DNA-määrien tuottamiseen, jotka sisältävät kaiken tai osan genomista hepatitis B-5 virusta varten. Esimerkiksi amplifikaatio esim. lisäämällä kloramfenikolia kasvualustaan, kun solutiheys on saavuttanut sopivan tason, tai mutaatioiden käyttö hajoamisen estämiseksi bakteriofagi-hybrideissä, jotka sisältävät HBV-sekvenssejä, sallii HBV DNA:n valmistuksen määrissä, 10 joita aikaisemmin ei voitu tavoittaa.
Samalla kun tässä edellä on esitetty joukko tämän keksinnön suoritusmuotoja, on ilmeistä, että keksinnön perusrakennetta voidaan muuttaa antamaan muita suoritusmuotoja, joissa tämän keksinnön prosessia käytetään hyväk-15 si. Sentähden on selvää, että tämän keksinnön piiri määritellään oheisilla patenttivaatimuksilla eikä tässä esimerkinomaisesti edellä esitetyillä spesifisillä suoritusmuodoilla.
Claims (8)
1. Menetelmä ainakin yhden polypeptidin tuottamiseksi, jolla on hepatitis B-virusantigeenin antigeenisyys, 5 tunnettu siitä, että a) viljellään bakteeri-isäntää, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyylillä, jossa on DNA-sekvenssi, joka DNA-sekvenssi on toimivasti liittynyt mainitun yhdis-telmä-DNA-molekyylin ekspressiosäätelysekvenssiin ja joka 10 koodaa vähintään yhtä polypeptidiä, jolla on HBV-antigee-nisyys ja joka on valittu polypeptideistä, joilla on kaava (i) MetGluAsnlleThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGln AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglleLeuThrlleProGlnSerLeu AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCys
15 LeuGlyGlnAsnSerGlnSerProIleSerAsnHisSerProThrSer CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe IleilePheLeuPhelleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuVal LeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuIleProGly SerSerThrThrSerThrGlySerCysArgThrCysThrThrProAla 20 GlnGlylleSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAsp GlyAsnCysThrCysIleProIleProSerSerTrpAlaPheGlyLys PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeu ValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProIleValTrpLeu SerVallleTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlle - 25 LeuSerProPheLeuProLeuLeuProllePhePheCysLeuTrpAla Tyrlle, jolla on HBV-pinta-antigeenin antigeeninen spesifisyys (ii) MetAspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu-SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp : 30 ThrAlaAlaAlaLeuTyrArgAspAlaLeuGluSerProGluHisCys • -·. SerProHisHisThrAlaLeuArgGlnAlalleLeuCysTrpGlyAsp LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyThrAsnLeuGluAspProAla SerArgAspLeuValValSerTyrValAsnThrAsnValGlyLeuLys PheArgGlnLeuLeuTrpPheHisIleSerCysLeuThrPheGlyArg 35 GluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrpIleArgThr 40 86437 ProProAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuSerThrLeuPro GluThrThrValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThr ProSerProArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgaArgArgSer GlnSerArgGluSerGlnCys, jolla on HBV-ydinantigeenin 5 antigeeninen spesifisyys ja (iii) niiden fragmenteista, joilla on HBV-antigeenisyys; ja b) eristetään polypeptidi transformoidun bakteeri-isännän viljelystä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, valitaan Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta, sen fragmenteista, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys, 15 ja niiden synteettisesti valmistetuista ekvivalenteista, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri-isäntä on valittu 20 coli- kannoista.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me-netelmä, tunnettu siitä, että ekspressiosäätely- . ·*. sekvenssi on lac-systeemi.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen rae- 25 netelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, jo- ;; ka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, on DNA-sekvenssi, jolla on kaava ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTC GTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTACGAGATCTTCTAGATACCG 30 CCGCAGCTCTGTATCGGGATGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCT CACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGAGACTTAATGAC - ‘ ·, TCTAGCTACCTGGGTGGGTACTAATTTAGAAGATCCAGCATCTAGGGACC TAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATGTGGGCCTAAAGTTCAGACAATTA *: · TTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACGGTTCTAGA ’** 35 GTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGA 4i 86437 CCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACGCTTCCGGAGACTACTGTTGTTAG ACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAA GATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGT tai sen fragmentti, joka koodaa polypeptidiä, joilla on 5 HBV-antigeenisyys.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, on DNA-sekvenssi, jolla on kaava
10 ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGC GGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACT CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGC CAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCC AACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCC 15 TCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAT CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAG CACGGGATCCTGCAGAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGAATCTCTATGT ATCCCTCCTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGATGGAAACTGCACCTGTATT CCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTC 20 AGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCG TAGGGCTTTCCCCCATTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTAT ____: TGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACC AATTTTCTTTTGTCTTTGGGCATACATT tai sen fragmentti, joka koodaa polypeptidiä, jolla on 25 HBV-antigeenisyys.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-molekyyli on valittu yhdistelmä-DNA-molekyyleistä, jotka sisältyvät transformoituihin E. coli HB 101-kantoihin, 30 joilla on talletusnumero NCIB 11548, 11549, 11555, 11556, 11557, 11558, 11559 ja 11560.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu isäntä on transformoitu E. coli HB 101-kanta, jolla on talle- 35 tusnumero NCIB 11548, 11549, 11555, 11556, 11557, 11558, ; 11559 tai 11560. « 86437
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB7849907 | 1978-12-22 | ||
GB7849907 | 1978-12-22 | ||
GB7850039 | 1978-12-27 | ||
GB7850039 | 1978-12-27 | ||
GB7937910 | 1979-11-01 | ||
GB7937910 | 1979-11-01 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI794001A FI794001A (fi) | 1980-06-23 |
FI86437B true FI86437B (fi) | 1992-05-15 |
FI86437C FI86437C (fi) | 1992-08-25 |
Family
ID=27260648
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI794001A FI86437C (fi) | 1978-12-22 | 1979-12-20 | Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4710463A (fi) |
EP (2) | EP0374869A1 (fi) |
JP (5) | JP2530801B2 (fi) |
AT (1) | ATE26127T1 (fi) |
AU (1) | AU539535B2 (fi) |
BR (1) | BR7908410A (fi) |
CY (1) | CY1422A (fi) |
DD (1) | DD147855A5 (fi) |
DE (3) | DE2967652D1 (fi) |
DK (2) | DK171727B1 (fi) |
ES (1) | ES487106A0 (fi) |
FI (1) | FI86437C (fi) |
GR (1) | GR73675B (fi) |
HK (2) | HK26688A (fi) |
IE (1) | IE53176B1 (fi) |
IL (1) | IL59007A (fi) |
IN (1) | IN151589B (fi) |
LU (4) | LU88257I2 (fi) |
MX (1) | MX9202875A (fi) |
NL (2) | NL930013I1 (fi) |
NO (2) | NO794196L (fi) |
NZ (1) | NZ192465A (fi) |
PT (1) | PT70626B (fi) |
SG (1) | SG60387G (fi) |
YU (1) | YU44186B (fi) |
Families Citing this family (156)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
US6268122B1 (en) * | 1978-12-22 | 2001-07-31 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
USRE34705E (en) * | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
FR2480780B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1985-12-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
FR2495636B2 (fr) * | 1980-12-09 | 1989-10-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un fragment d'adn circulaire du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
US5145782A (en) * | 1980-12-08 | 1992-09-08 | The Regents Of The University Of California | DNA expression vector suitable for direct expression of a foreign gene |
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
EP0062286A1 (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-13 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Diagnostic test for hepatitis B virus |
US5332664A (en) * | 1981-07-15 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Human calcitonin precursor polyprotein structural gene |
US4769238A (en) | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
ATE53235T1 (de) * | 1981-08-04 | 1990-06-15 | Univ California | Synthese von menschlichen viralen antigenen mit hilfe von hefe. |
GR76274B (fi) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
US4803164A (en) * | 1981-08-31 | 1989-02-07 | Genentech, Inc. | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast |
ZW18282A1 (en) | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
JPS5890517A (ja) * | 1981-11-24 | 1983-05-30 | Japan Found Cancer | B型肝炎ウイルスの表面抗原を合成する新規な組換え体及びその製法 |
US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
US7767449B1 (en) * | 1981-12-24 | 2010-08-03 | Health Research Incorporated | Methods using modified vaccinia virus |
US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US4762708A (en) * | 1982-02-18 | 1988-08-09 | University Patents, Inc. | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
AU1678783A (en) * | 1982-07-20 | 1984-01-26 | Molecular Genetics, Inc. | Production of herpes simplex viral proteins |
IL69202A (en) * | 1982-09-08 | 1991-08-16 | Smith Kline Rit | Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof |
US4820642A (en) * | 1983-04-04 | 1989-04-11 | The Regents Of The University Of California | Amplified expression vector |
GB8321789D0 (en) * | 1983-08-12 | 1983-09-14 | Biogen Nv | Vaccines and compositions against hepatitis |
FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
IL75318A (en) * | 1984-05-31 | 1994-08-26 | Genentech Inc | Recombinant human memotoxin and methods for its recombinant production |
EP0171908A3 (en) * | 1984-07-11 | 1987-07-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
US4769239A (en) * | 1984-08-21 | 1988-09-06 | Merck & Co., Inc. | Vaccine against varicella-zoster virus |
US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
JPS6170989A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-04-11 | Takeda Chem Ind Ltd | 組み換えdnaおよびその用途 |
JPS6226300A (ja) * | 1984-10-10 | 1987-02-04 | セントコ−・インコ−ポレ−テツド | Htlv−3dnaのクロ−ニングおよび発現 |
GB8431171D0 (en) * | 1984-12-11 | 1985-01-23 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
US5853978A (en) * | 1985-12-04 | 1998-12-29 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use |
JPS61233700A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-10-17 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | 分子クロ−ンされたエイズ関連ポリペプチド |
US6534285B1 (en) | 1984-12-24 | 2003-03-18 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規dnaおよびポリペプチド |
JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | HBsAgの製造方法 |
CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
ES2061500T5 (es) * | 1986-06-17 | 2003-05-16 | Chiron Corp | Diagnosis y vacunas de la hepatitis delta, su preparacion y uso. |
JPS63214181A (ja) * | 1986-07-23 | 1988-09-06 | ベ−リングベルケ、アクチエンゲゼルシャフト | ヒト・パピロ−マ・ウイルス18型の発現生成物、これらのタンパク質に特異的な抗体およびこれらの抗体または対応するdnaを含む診断助剤 |
US4818688A (en) * | 1986-11-21 | 1989-04-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assays for antibody to hepatitis B core antigen |
NZ219515A (en) * | 1987-02-10 | 1989-09-27 | Wellcome Found | Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope |
DE286239T1 (de) * | 1987-03-10 | 1994-02-24 | New England Biolabs Inc | Herstellung und Reinigung eines Proteins, das mit einem Bindungsprotein fusioniert ist. |
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
US4880750A (en) * | 1987-07-09 | 1989-11-14 | Miragen, Inc. | Individual-specific antibody identification methods |
EP0402354A4 (en) * | 1987-08-10 | 1991-03-20 | The University Of Melbourne | Molecular cloning of human rotavirus serotype 4 gene 9 encoding vp7, the major outer capsid neutralisation specific glycoprotein and expression of vp7 and fragments thereof for use in a vaccine |
EP0311228A3 (en) * | 1987-10-09 | 1990-05-02 | Repligen Corporation | Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus |
JP2791418B2 (ja) | 1987-12-02 | 1998-08-27 | 株式会社ミドリ十字 | 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
DE4107612A1 (de) * | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
US5175094A (en) * | 1991-08-01 | 1992-12-29 | Becton Dickinson And Company | Increased expression of HBcAg |
US5175272A (en) * | 1991-08-01 | 1992-12-29 | Becton Dickinson And Company | DNA sequences with increased expression of HBcAg |
US5173427A (en) * | 1991-08-01 | 1992-12-22 | Becton Dickinson And Company | Vectors and hosts with increased expression of HBCAG |
US5780036A (en) * | 1991-08-26 | 1998-07-14 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus |
US6607727B1 (en) | 1991-08-26 | 2003-08-19 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus |
US6297048B1 (en) | 1992-02-04 | 2001-10-02 | Chiron Corporation | Hepatitis therapeutics |
EP0591548A4 (en) * | 1992-03-30 | 1999-04-28 | Suntory Ltd | Anti-hbs antibody gene and expression plasmid thereof |
US6235288B1 (en) | 1992-08-26 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
FR2711670B1 (fr) * | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
US5726011A (en) * | 1994-03-31 | 1998-03-10 | Virginia Commonwealth University | Method for diagnosing chronic hepatitis B virus infection |
WO1996017951A2 (en) * | 1994-12-09 | 1996-06-13 | Rpms Technology Limited | Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms |
US5993820A (en) * | 1996-11-12 | 1999-11-30 | Michigan State University | Chimeric LTB vaccines |
US20030100520A1 (en) * | 1997-01-21 | 2003-05-29 | Philip Needleman | Immunological process and constructs for increasing the hdl cholesterol concentration by dna vaccination |
GB9712370D0 (en) | 1997-06-14 | 1997-08-13 | Aepact Ltd | Therapeutic systems |
CZ302092B6 (cs) | 1998-02-12 | 2010-10-06 | Immune Complex, Corporation | Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, jeho cástice, inokulum a zpusob indukce protilátek |
CA2325560A1 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Chiron Corporation | Noncloning technique for expressing a gene of interest |
DK1108034T3 (da) * | 1998-09-04 | 2008-11-10 | Emergent Product Dev Uk Ltd | Svækkede salmonella SPI2-mutanter som antigenbærere |
WO2000032625A1 (en) | 1998-12-04 | 2000-06-08 | Biogen, Inc. | Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands |
EP1230257A4 (en) * | 1998-12-23 | 2003-08-13 | Thompson Boyce Plant Res | EXPRESSION OF IMMUNOGENOUS HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN TRANSGENIC PLANTS |
GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
US6268178B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-07-31 | Phage Biotechnology Corp. | Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides |
GB0008419D0 (en) * | 2000-04-05 | 2000-05-24 | Bioinvent Int Ab | A method for invitro molecular evolution of antibody function |
GB0008966D0 (en) * | 2000-04-13 | 2000-05-31 | Imp College Innovations Ltd | Vectors for gene therapy |
US7001760B2 (en) * | 2000-04-20 | 2006-02-21 | Wang-Schick Ryu | Hepatitis B virus vectors for gene therapy |
US6583279B1 (en) | 2001-01-26 | 2003-06-24 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detection of hepatitis B virus |
US7202354B2 (en) | 2001-03-30 | 2007-04-10 | Abbott Laboratories | Hepatitis B virus surface antigen mutant and methods of detection thereof |
GB0217033D0 (en) | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene and polypeptide sequences |
US8876532B2 (en) | 2002-07-31 | 2014-11-04 | Dentsply International Inc. | Bone repair putty |
GB0226105D0 (en) * | 2002-11-08 | 2002-12-18 | St Georges S Entpr Ltd | Pain relief agents |
GB0304993D0 (en) * | 2003-03-05 | 2003-04-09 | Univ Nottingham Trent | Novel screening method |
BRPI0408779A (pt) * | 2003-03-26 | 2006-04-04 | Wyeth Corp | uso de composições, composição imunogênica e kit |
EP1702069A2 (en) * | 2004-01-05 | 2006-09-20 | EMD Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
GB0420091D0 (en) * | 2004-09-10 | 2004-10-13 | Univ Nottingham Trent | Medical implant materials |
US20060193849A1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
GB0514661D0 (en) * | 2005-07-16 | 2005-08-24 | Medical Res Council | Methods |
JP4352032B2 (ja) | 2005-08-23 | 2009-10-28 | シャープ株式会社 | 携帯通信機器 |
EP1806359B1 (en) | 2005-09-05 | 2010-03-17 | Immatics Biotechnologies GmbH | Tumor-associated peptides binding promiscuously to human leukocyte antigen (HLA) class II molecules |
ATE440107T1 (de) | 2005-09-05 | 2009-09-15 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumorassoziierte peptide, die hla klasse i oder ii-moleküle binden, und anti-tumor impfstoffe |
GB0519398D0 (en) * | 2005-09-23 | 2005-11-02 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
GB0607354D0 (en) * | 2006-04-12 | 2006-05-24 | Bioinvent Int Ab | Agent, Composition And Method |
GB0607798D0 (en) * | 2006-04-20 | 2006-05-31 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
CN101657720A (zh) * | 2006-05-31 | 2010-02-24 | 荷兰联合利华有限公司 | 筛选改变皮肤和/或头发色素沉着的化合物的方法 |
KR100836745B1 (ko) * | 2007-01-31 | 2008-06-10 | (주)두비엘 | Hbv 백신 및 그의 제조 방법 |
SI2660248T1 (sl) | 2007-07-27 | 2015-10-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nova imunoterapija proti možganskim tumorjem |
EP2562182B1 (en) | 2007-07-27 | 2015-10-07 | Immatics Biotechnologies GmbH | Novel immunogenic epitopes for immunotherapy |
RU2506275C2 (ru) | 2007-11-01 | 2014-02-10 | Астеллас Фарма Инк. | Иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты |
EP2215473A1 (en) * | 2007-11-27 | 2010-08-11 | Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House | Screening methods |
CN102851313B (zh) * | 2008-01-28 | 2015-01-28 | 多贝尔有限公司 | 一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺 |
SI2105501T1 (sl) | 2008-03-27 | 2015-12-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nova imunoterapija proti nevronalnim in možganskim tumorjem |
DK2119726T5 (en) | 2008-05-14 | 2018-03-26 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel and powerful MHC class II peptides derived from survivin and neurocan |
US8703153B2 (en) | 2008-06-16 | 2014-04-22 | Prokarium Ltd. | Salmonella vectored vaccines against Chlamydia and methods of use |
RS53782B1 (en) | 2008-10-01 | 2015-06-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES PREPARED AND ANTI-CHANGE RESPONSE FOR GLIOBLASTOMA (GBM) AND OTHER CANCER TREATMENTS |
GB0905790D0 (en) | 2009-04-03 | 2009-05-20 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
EP2513146B1 (en) | 2009-12-18 | 2017-05-03 | Kancera AB | Antibodies against ror1 capable of inducing cell death of cll |
GB201004551D0 (en) | 2010-03-19 | 2010-05-05 | Immatics Biotechnologies Gmbh | NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer |
GB201019331D0 (en) | 2010-03-19 | 2010-12-29 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Methods for the diagnosis and treatment of cancer based on AVL9 |
GB201020995D0 (en) | 2010-12-10 | 2011-01-26 | Bioinvent Int Ab | Biological materials and uses thereof |
US9452212B2 (en) | 2011-04-14 | 2016-09-27 | Dynavax Technologies Corporation | Methods and compositions for eliciting an immune response against hepatitis B virus |
GB2490655A (en) | 2011-04-28 | 2012-11-14 | Univ Aston | Modulators of tissue transglutaminase |
GB201115280D0 (en) | 2011-09-05 | 2011-10-19 | Alligator Bioscience Ab | Antibodies, uses and methods |
GB201219678D0 (en) | 2012-11-01 | 2012-12-12 | Benf Ab | Ketone body inhibitors and uses thereof |
CN105026419B (zh) | 2013-03-01 | 2021-08-24 | 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 | 疫苗组合物定量 |
TWI777195B (zh) | 2013-08-05 | 2022-09-11 | 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 | 新穎肽類,細胞及其用於治療多種腫瘤的用途,其製造方法及包含其等之醫藥組成物(三) |
GB201319446D0 (en) | 2013-11-04 | 2013-12-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors |
GB201408255D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML) |
GB201411037D0 (en) | 2014-06-20 | 2014-08-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL) |
GB201501017D0 (en) | 2014-12-23 | 2015-03-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers |
IL254129B2 (en) | 2015-03-27 | 2023-10-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | New peptides and a combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors |
GB201505585D0 (en) | 2015-03-31 | 2015-05-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers |
GB201507030D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC |
GB201507719D0 (en) | 2015-05-06 | 2015-06-17 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers |
GB201511546D0 (en) | 2015-07-01 | 2015-08-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
PE20230321A1 (es) | 2015-07-01 | 2023-02-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cancer de ovario y otros tipos de cancer |
KR20180026758A (ko) | 2015-07-06 | 2018-03-13 | 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 | 식도암 및 기타 암에 대한 면역요법에 사용하기 위한 펩티드 및 펩티드의 조합 |
GB201513921D0 (en) | 2015-08-05 | 2015-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers |
GB201522667D0 (en) | 2015-12-22 | 2016-02-03 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers |
GB201602918D0 (en) | 2016-02-19 | 2016-04-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers |
MA54832A (fr) | 2016-03-01 | 2021-12-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides, combinaison de peptides et médicaments à base de cellules destinés à être utilisés en immunothérapie contre le cancer de la vessie et d'autres cancers |
DK3430030T3 (da) | 2016-03-16 | 2024-01-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Transficerede t-celler og t-cellereceptorer til anvendelse i immunoterapi mod cancer |
IL261787B2 (en) | 2016-03-16 | 2023-03-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nucleic acid-treated t-cells and receptor t-cells for use in immunotherapy against types of cancer |
MY197258A (en) | 2016-04-06 | 2023-06-08 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against aml and other cancers |
TW202304970A (zh) | 2016-08-26 | 2023-02-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架 |
MA47367B1 (fr) | 2017-01-27 | 2023-06-28 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers |
WO2018189148A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers |
CN111548405A (zh) | 2017-04-10 | 2020-08-18 | 伊玛提克斯生物技术有限公司 | 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物 |
WO2018189152A2 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers |
WO2019007974A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | NOVEL PEPTIDES AND COMBINATION OF PEPTIDES FOR USE IN IMMUNOTHERAPY OF LUNG CANCER, INCLUDING NSCLC, CPPC AND OTHER CANCERS |
CR20210168A (es) | 2017-07-07 | 2021-06-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de pulmón, incluyendo el nsclc, el sclc y otros cánceres |
DE102018107224A1 (de) | 2018-02-21 | 2019-08-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
TW202016131A (zh) | 2018-05-16 | 2020-05-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於抗癌免疫治療的肽 |
US10925947B2 (en) | 2018-06-29 | 2021-02-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
TW202019955A (zh) | 2018-07-31 | 2020-06-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法 |
US11945850B2 (en) | 2018-09-17 | 2024-04-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
TW202024121A (zh) | 2018-09-18 | 2020-07-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法 |
TW202039535A (zh) | 2018-12-18 | 2020-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法 |
DE102020125457A1 (de) | 2020-09-29 | 2022-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
TW202229312A (zh) | 2020-09-29 | 2022-08-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 由非hla-a*02顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物 |
TW202241925A (zh) | 2021-01-15 | 2022-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於不同類型癌症免疫治療的hla展示肽 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
US4241175A (en) * | 1978-12-18 | 1980-12-23 | Merck & Co., Inc. | Assay for hepatitis B core antibody |
FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
FR2444713A1 (fr) * | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
JPH0612193B2 (ja) * | 1985-08-23 | 1994-02-16 | 日立化成工業株式会社 | 給 湯 機 |
DE4326945C2 (de) * | 1993-08-11 | 1996-10-24 | Schott Glaswerke | Regeleinrichtung für die Gaszufuhr zu einer Gaskocheinrichtung mit unter einer durchgehenden Kochfläche angeordneten Gasstrahlungsbrennern |
-
1979
- 1979-12-20 IN IN1328/CAL/79A patent/IN151589B/en unknown
- 1979-12-20 NO NO794196A patent/NO794196L/no not_active Application Discontinuation
- 1979-12-20 IE IE2494/79A patent/IE53176B1/en not_active IP Right Cessation
- 1979-12-20 DD DD79217945A patent/DD147855A5/de unknown
- 1979-12-20 FI FI794001A patent/FI86437C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-12-20 IL IL59007A patent/IL59007A/xx unknown
- 1979-12-20 YU YU3127/79A patent/YU44186B/xx unknown
- 1979-12-20 GR GR60822A patent/GR73675B/el unknown
- 1979-12-20 NZ NZ192465A patent/NZ192465A/xx unknown
- 1979-12-20 ES ES487106A patent/ES487106A0/es active Granted
- 1979-12-20 DK DK548079A patent/DK171727B1/da not_active IP Right Cessation
- 1979-12-20 JP JP54164945A patent/JP2530801B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1979-12-20 BR BR7908410A patent/BR7908410A/pt unknown
- 1979-12-20 LU LU88257C patent/LU88257I2/xx unknown
- 1979-12-20 LU LU88258C patent/LU88258I2/xx unknown
- 1979-12-21 LU LU88259C patent/LU88259I2/xx unknown
- 1979-12-21 LU LU88256C patent/LU88256I2/xx unknown
- 1979-12-21 AT AT79303017T patent/ATE26127T1/de active
- 1979-12-21 DE DE7979303017T patent/DE2967652D1/de not_active Expired
- 1979-12-21 DE DE8585201908T patent/DE2967697D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1979-12-21 EP EP89123526A patent/EP0374869A1/en not_active Withdrawn
- 1979-12-21 PT PT70626A patent/PT70626B/pt unknown
- 1979-12-21 EP EP79303017A patent/EP0013828B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-12-21 DE DE198585201908T patent/DE182442T1/de active Pending
- 1979-12-24 AU AU54170/79A patent/AU539535B2/en not_active Expired
-
1982
- 1982-03-31 US US06/363,763 patent/US4710463A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-04-18 NO NO861548A patent/NO861548L/no not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-05-11 JP JP62112627A patent/JP2512746B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-11 JP JP62112630A patent/JP2511962B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-11 JP JP62112629A patent/JP2511961B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-11 JP JP62112628A patent/JP2527438B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-23 SG SG603/87A patent/SG60387G/en unknown
-
1988
- 1988-04-14 HK HK266/88A patent/HK26688A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-09-02 CY CY1422A patent/CY1422A/xx unknown
-
1991
- 1991-03-07 HK HK149/91A patent/HK14991A/xx not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 MX MX9202875A patent/MX9202875A/es unknown
-
1993
- 1993-02-17 NL NL930013C patent/NL930013I1/nl unknown
- 1993-02-17 NL NL930012C patent/NL930012I2/nl unknown
-
1994
- 1994-07-12 DK DK084194A patent/DK84194A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI86437B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. | |
US5436139A (en) | Non-passageable virus | |
GB2034323A (en) | Production of DNA Comprising B Hepatitis Viral Genome | |
EP0182442B1 (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
US4820642A (en) | Amplified expression vector | |
JPH01160998A (ja) | ポリペプチド | |
US6297355B1 (en) | Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity | |
US4859465A (en) | Vaccine capable of eliciting multivalent antibodies | |
JPH0543352B2 (fi) | ||
US20010034018A1 (en) | Hepatitis virus sentinel virus I (SVI) | |
CA1341644C (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
HRP940048A2 (en) | Process for the preparation of polypeptides having the antigenicity or antigen specificity of hepatitis b viral antigens | |
FI95045B (fi) | Menetelmä hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän proteiinin valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät yhdistelmä-DNA-vektorit ja -kontameerit sekä nisäkässolut | |
SI7913127A8 (sl) | Rekombinantne dna molekule in postopek za njihovo proizvodnjo | |
AU769292B2 (en) | Sentinel virus II | |
JPH0859695A (ja) | 新規dnaおよびポリペプチド | |
FI95726B (fi) | Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia | |
HU196236B (en) | Process for producing polypeptides showing hepatitis b virus antigenicity | |
BE890393A (fr) | Acide desoxyribonucleique synthetique et procede pour l'obtenir | |
JPH0824581B2 (ja) | 新規DNA、それを含む微生物、それを含むδ感染の診断薬およびその用途 | |
JPH0576382A (ja) | B型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MA | Patent expired |
Owner name: BIOGEN, INC. |