FI86437B - Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. Download PDF

Info

Publication number
FI86437B
FI86437B FI794001A FI794001A FI86437B FI 86437 B FI86437 B FI 86437B FI 794001 A FI794001 A FI 794001A FI 794001 A FI794001 A FI 794001A FI 86437 B FI86437 B FI 86437B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
hbv
dna
gene
polypeptide
recombinant dna
Prior art date
Application number
FI794001A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI86437C (fi
FI794001A (fi
Inventor
Kenneth Murray
Heinz Ernst Schaller
Original Assignee
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27260648&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI86437(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of FI794001A publication Critical patent/FI794001A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86437B publication Critical patent/FI86437B/fi
Publication of FI86437C publication Critical patent/FI86437C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
    • Y10S930/223—Hepatitis related

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

1 86437
Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, joilla on hepatitis B-virusantigeenien antigeenisyys
Keksinnön kohteena on menetelmä polypeptidien val-5 mistamiseksi, joilla on hepatitis B-virusantigeenien antigeenisyys. Erityisesti tämä keksintö liittyy polypepti-deihin, jotka on tuotettu ekspressoimalla rakennegeenejä tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat ainakin yhtä poly-peptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, sopivissa isäntä-10 organismeissa. Kuten seuraavasta selityksestä ilmenee, voidaan tämän keksinnön menetelmällä tuotettuja polypepti-dejä käyttää hepatitis B-viruksen havaitsemiseen ihmisessä ja vasta-aineiden stimuloimiseen ihmisillä tätä virusta vastaan.
15 Virus, joka aiheuttaa hepatitis B- tai seerumihepa- titiksen, näyttää tarttuvan ainoastaan ihmiseen. Hepatitis B-virus-("HBV")infektio ihmisissä on laajalle levinnyt.
Iso-Britanniassa, Yhdysvalloissa ja länsi-Euroopassa n.
0,1 % kaikista verenluovuttajista on kroonisia HBV:n kan- 20 tajia. Samalla kun virushepatitiksesta aiheutuva kuollei- suusmäärä ei ole suuri (1975 Iso-Britanniassa se oli 3/ ·"*: miljoona) on osoituksia, että niinkin paljon kuin 5 % väestöstä Iso-Britanniassa ja 15 % väestöstä Yhdysval- ;***; loissa on saanut tartunnan. Monissa Afrikan ja Aasian • · · 25 maissa 20 %:iin asti väestöstä on kroonisia HBV:n kantajia ja yli 50 % kaikista aikuisista näissä maissa on saanut .1 HBV-tartunnan tai on HBV:n tartuttamaa.
Hepatitis-tartunta siirtyy kolmella yleisellä mekanismilla; (1) infektoidun veren tai kehon nesteiden ruoan-30 sulatuskanavan ulkopuolisella ymppäyksellä, joko suurissa määrissä kuten verensiirroissa tai pienissä määrissä kuten satunnaisten ihopistojen kautta; (2) läheisellä perhe- tai .··. sukupuolisella kosketuksella; ja (3) joistakin äideistä, » · jotka ovat raskauden aikana saaneet tartunnan siirtäen • ·' 35 viruksen vastasyntyneisiin lapsiinsa. Luonnollisissa olo- 2 86437 suhteissa HBV ei ole erittäin tarttuva. Siirtymistä si-säänhengityksen välityksellä tapahtuu harvoin, jos koskaan.
Useimmat HBV-infektiot ovat subkliinisiä. Kliininen 5 sairaus kestää tavallisesti 3-6 viikkoa ja on vakavuudeltaan lievästä akuuttiin salamannopeaan hepatitikseen asti, mitä seuraa kirroosi tai kuolema. Toipuminen kliinisistä ja subkliinisistä HBV-infektioista on tavallisesti täydellinen. Joissakin tapauksissa tuloksina on kuitenkin 10 pitkäaikaisia seurauksia: (1) likimääräisesti 5 % akuuteista infektioista johtaa krooniseen hepatitis B-virusantigeenin kantamiseen, jolloin se jatkuvasti on tehokas tartuttamaan toisia ja edistämään maksavaurioita; ja 15 (2) on todennäköistä, että HBV-infektion jälkeen tämä voi olla täysin tai osittain vastuussa kroonisen aktiivisen hepatitiksen, kirroosin ja primaarin maksasyövän HBV-sero-negatiivisten tapausten merkittävän määrän alkamisesta.
Viime aikaiset edistysaskeleet molekyylibiologiassa 20 ovat tehneet mahdolliseksi viedä DNA'ta, joka koodaa spesifisiä ei-bakteeriperäisiä, eukaryoottisia proteiineja, :**: bakteerisoluihin. Yleensä muun kuin kemiallisella syntee- sillä valmistetun DNA:n rekombinantti-DNA-molekyylien ra-kentelu käsittää vaiheet, joissa tuotetaan puhdistetun 25 lähetti-(mRNA)-mallin yksisäikeinen DNA-kopio (cDNA) haluttua proteiinia varten; muutetaan cDNA kaksisäikeiseksi DNA:ksi; liitetään DNA sopivaan kohtaan sopivassa kloon-ausvälineessä ja transformoidaan sopiva isäntä tällä yh-distelmä-DNA-molekyylillä. Tällainen transformointi tekee 30 isännälle mahdolliseksi tuottaa haluttua proteiinia. Li-: säksi, ainakin ovalbumiini-DNA:n tapauksessa on tunnettua, että tietyn DNA:n sopiva yhdistäminen voimakkaaseen bak-teeripromoottoriin tai ekspression kontrollisekvenssiin tuottaa suuria määriä haluttua ovalbumiiniproteiinia, ts. 35 n. 0,5 - 1 %. E. coli-solun kokonaisproteiinimassasta (0.
3 86437
Mercereau-Puijalon et ai., "Synthesis of an Ovalbumin Like Protein by Escherichia coli K12 Harboring a Recombinant Plasmid", Nature, 275, sivut 505-510 (1978) ja T.H. Fraser ja B.J. Bruce, "Chicken Ovalbumin is Synthezized and Sec-5 retered by Escherichia coli; Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, 5936-5940 (1978)).
Useita ei-bakteeriperäisiä proteiineja ja geenejä on syntetisoitu käyttäen yhdistelmä-DNA-teknologiaa. Näitä ovat proteiini, jolla on rotan proinsuliliinin antigeeni-10 determinantteja (L. Villa-Komaroff et ai., "A Bacterial Clone Synthezlzing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A., 75, sivut 3727-3731 (1978), rotan kasvuhormoni (p.H. Seeburg et ai♦, "Synthesis of Growth Hormone by Bacteria", Nature, 276, sivut 795-798 (1978)), hiiren dihyd-15 rofolaattireduktaasi (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic
Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding for Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, sivut 617-624 (1978)), somatostatiini (K. Itakura et al., "Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthezized Gene for the 20 Hormon Somatostatin", Science, 198, 1056-1063 (1977), GB-patentit 2 007 675A, 2 007 676A ja 2 008 123A ja saman :--· kaltaiset patenttihakemukset muissa maissa), ja ihmisen insuliinin A- ja B-polypeptidiketjut (D.V. Goeddel et al ♦, .**·. "Expression in Escherichia coli of Chemically Syn-thezized 25 Genes for Human Insulin", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., ‘II! 76, sivut 106-110 (1979), ja GB- ja saman kaltaiset pate- ntit, supra).
Mikään edellä esitetyistä ei kuitenkaan kohdistu, kuten tämä keksintö, virusproteiinien, kuten hepatitis B-·: 30 virusantigeenien yhdistelmä-DNA-synteesiin. A. Fritsch et al., "Clonage du genome du virus de 1'hepatite B dans Escherichia coli", C.R. Acad. Sc. Paris, t. 287, Serie D, .···, (1978), s. 1453-56, ja FR-hakemusjulkaisu 7835588 kohdis- tuvat hepatitis B-viruksen koko genomin kloonaamiseen, 35 mutta niissä ei kuvata HBV-antigeenisyyden omaavien poly-peptidien ekspressiota.
* 86437
On tunnettua, että HBV-infektiot aiheuttavat vasta-aineiden kehittymistä viruksen antigeeneille. Nämä vasta-aineet ovat kehon puolustusmekanismi HBV-infektiota vastaan. Tällaisten vasta-aineiden kehittymisen ennen altis-5 tamista tai nopeasti voimakkaan altistuksen ollessa kysymyksessä tulisi olennaisesti pienentää ja torjua viruksen lisääntymistä ja leviämistä potilaassa.
Ongelmana keinotekoisesti stimuloitujen vasta-aineiden kehittämisessä hepatitis B-viruksen antigeeneille 10 on kuitenkin viruksen rajoitettu isäntämäärä. Esimerkiksi, vaikka tarttuvuus ihmiseen on hyvin suuri, on kokeellinen infektio hepatitis B-viruksella saatu aikaan ainoastaan muutamissa muissa kädellisissä. Eikä virus ole lisääntynyt kudosviljelyssä. Tämä rajoitettu isäntämäärä ja kykenemät-15 tömyys tartuttaa kudosviljelysoluja on vakavasti estänyt sekä viruksen luonnehtimisen että sen infektion patologian ja nopeiden havaitsemismenetelmien ja tehokkaiden infektion hillitsemis- ja estämismenetelmien kehittämisen.
Samalla kun on tehty joitakin yrityksiä käyttää 20 autenttisia HBV-virusantigeenejä, jotka on eristetty HBV-infektiotartunnan uhreista, vasta-aineiden ja infektion havaitsemisen kehittämiseksi, nämä käsittelyt eivät yleensä ole saatavissa, mikä johtuu aktiivisten lajien rajoitetusta tarjonnasta. Lisäksi ihmislähteiden käyttö näitä an-25 tigeeneja varten on epäedullista, mikä johtuu hyvin tunnetuista kontaminaatio-ongelmista ihmiseristeitä käytettäes-: sä.
Tämä keksintö ratkaisee ongelman, johon edellä viitattiin, antamalla keksinnön mukaisesti menetelmän poly-30 peptidien tuottamiseksi, joilla on hepatitis B-virusanti- .: : geenien antigeenisyys. Keksinnön mukaisesti viljellään ·.*. bakteeri-isäntä, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-mo- lekyylillä, jossa on rakennegeeni, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys ja johon on 35 toiminnallisesti liitetty ekspression säätelysekvenssi ja 5 86437 polypeptidi kerätään talteen viljelystä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.
Tämän keksinnön avulla on mahdollista saada näitä 5 HBV-antigeeneja suurissa ja kontaminoitumattomissa määrissä rokotusvalmisteita varten ja käytettäviksi virusinfektion toteamisessa ja sen patologian ja molekyylibiologian määrittämisessä. Tällaisia lähteitä ei tähän asti ole ollut käytettävissä, mikä johtuu viruksen kapeasta isäntä-10 spektristä ja sen kyvyttömyydestä tulla viljellyksi kudos-viljelyssä. Nämä tuotteet voidaan myös tunnistaa ja niitä voidaan luonnehtia ja ne ovat käyttökelpoisia joko sellaisena kuin ne isännässä tuotetaan tai sopivan johtamisen tai modifioinnin jälkeen yhdisteiksi ja menetelmiksi näi-15 den itse tuotteiden tuotannon parantamiseksi ja HBV-infek-tion havaitsemiseksi, sen patologian seurantaa varten ja HBV-vasta-aineiden tuotannon stimuloimiseksi ihmisessä.
Tämän keksinnön menetelmä on tunnettu myös Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta valmistetun DNA-sekvens-20 sin liittämisestä toiseen DNA-sekvenssiin, joka on valmistettu muusta lähteestä kuin Dane-hiukkasesta.
:··; Tämä menetelmä voidaan erottaa edellä mainituista tekniikan tason menetelmistä siinä, että mikään alan ai-kaisemmista menetelmistä ei käytä luonnollista geeniä tai 25 DNA'ta jotakin tiettyä proteiinia varten yhdistelmä-DNA-molekyylin rakentamiseen ja tuon proteiinin tai geenin tuottamiseen. Sen sijaan ne käyttävät joko synteettisiä geenejä, jotka on tehty kemiallisella synteesillä, tai keinotekoisia geenejä, jotka on tehty entsymaattisesti " 30 kopioimalla mRNA, joka on eristetty luovuttajasolusta cDNA-sekvenssien tuottamiseksi.
Yksi syy siihen, että luonnollista DNA'ta ei ole ·. aikaisemmin käytetty suoraan proteiinien yhdistelmä-DNA- synteesissä on, että luonnolliset DNA't useimmista kor-35 keimmista organismeista ja ainakin joistakin eläinviruk- 6 86437 sista sisältävät "introneja" eli lisänukleotidisekvenssejä geenin osana. Nämä intronit eivät muodosta osaa geenin lopullisesta sanomasta. Sen sijaan ne poistuvat in vivo korkeimmissa organismeissa erityisten käsittelyentsyymien 5 vaikutuksesta, jotka toimivat primaarisella transkriptio-tuotteella antamaan geenin lopullisen sanoman (mRNA). Bakteerien oletetaan olevan kykenemättömiä käsittelemään tällaisia introneja, niin että luonnollisen DNA:n ei voida odottaa ekspressoituvan bakteeri-isännissä ja näiden isän-10 tien ei voida odottaa tuottavan haluttuja proteiineja.
Kuva 1 on yksinkertaistettu kaavio, joka edustaa Dane-hiukkasen endogeenisen DNA:n rakennetta. Se esittää kaksi komplementaarista DNA-säiettä, säikeen a ja säikeen b, loven säikeessä a ja aukon säikessä b sekä aukon sul-15 keutumisen DNA-polymeraasireaktiolla.
Kuva 2 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön menetelmän edullisesta suoritusmuodosta: Dane-hiukkasesta eristetyn endogeenisen DNA:n fragmentteja on yhdistetty E. coli-penisillinaasigeeniin plasmidilla pBR322 Pstl-kohdas-20 sa. Transformoinnin jälkeen E. coli HB101:een yhdistelmä-DNA-molekyyli pBR322-Pst I dG: HBV-Kpnl dC ohjaa polypep-:··: tidien, joilla on HBV-antigeenisyys, synteesiä.
Kuvat 3-9 esittävät nukleotidisekvenssiä, joka on määritetty osalle hepatitis B-virusgenomia tämän keksinnön 25 mukaisesti. Sekvenssi on esitetty lopetus-kodonein kolmes-sa lukukehyksessä, jotka on merkitty sen yläpuolelle. Se on mielivaltaisesti numeroitu aloituskodonilta geenille, joka koodaa HBcAg'tä kuten tässä keksinnössä määritellään. Nukleotidit -80 - -1 edustavat johtosekvenssiä, joka edel-• *- 30 tää tätä geeniä. Nukleotidit 1 - 549 edustavat nukleotidi sekvenssiä geenille, joka koodaa hepatitis B-virusydinan- ·. tigeeniä, tämän antigeenin aminohapposekvenssin (lukukehys 1) ollessa kuvattu tämän sekvenssin yläpuolella. Nukleotidit 1437 - 2114 edustavat nukleotidisekvenssiä, joka on 35 määritetty hepatitis B-viruspinta-antigeenin geenille, 7 86437 tämän antigeenin aminohapposekvenssin (lukukehys 3) ollessa kuvattu tämän sekvenssin yläpuolella. Eri restrik-tioendonukleaasi-tunnistuskohdat näissä geeneissä on myös kuvattu kuvissa 3-9.
5 Kuva 10 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön me netelmästä, jossa yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka pystyy tuottamaan polypeptidin, jolla on hepatitis B-viruksen ydinantigeenisyys, pilkotaan ja fragmentti siitä on liitetty parannettuun ekspressiosäätelysekvenssiin, lac-sys-10 teemiin.
Kuva 11 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön menetelmästä, jossa tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyli on pilkottu ja yhdistetty faagi-DNA:n fragmenttiin käytettäväksi isäntäsolujen lysogenoinnissa ja siten lisäämään 15 geenikopioiden lukumäärää niissä.
Kuva 12 on kaavamainen luonnos toisesta tämän keksinnön menetelmän suoritusmuodosta: tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka ei tuota polypeptidiä, jolla on hepatitis B-virusydinantigeenisyys, pilkotaan rakennegee-20 nin HBsAg'ia varten ja tätä rakennegeeniä käytetään tuot tamaan yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka tuottaa HBsAg'tä sopivassa isännässä.
Jotta tässä selostettu keksintö tulisi täydellisem-.·*. min ymmärretyksi, esitetään seuraava yksityiskohtainen 25 selostus.
’!*.] Selostuksessa käytetään seuraavia termejä:
Nukleotidi -- DNA:n tai RNA:n monomeeriyksikkö, joka käsittää sokeriosan (pentoosin), fosfaatin ja hetero-syklisen typpiemäksen. Emäs on liittynyt sokeriosaan glu-30 kosidi-hiilen (pentoosin 1’-hiili) kautta ja tämä emäksen ·“ ja sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Emäs luonnehtii nuk- leotidiä. Neljä DNA-emästä ovat adeniini ("A"), guaniini *···. ("G"), sytosiini ( "C") ja tyrniini ("T"). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C ja urasiili ("U").
a 86437 DNA-sekvenssi -- Suoraviivainen sarja nukleotideja, jotka ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesteri-sidoksin vierekkäisten pentoosien 3' ja 5'-hiilien välissä.
Kodoni -- Kolmen nukleotidin (tripletin) DNA-sek-5 venssi, joka koodaa mRNA:n kautta aminohappoa, translaation aloitussignaalia tai translaation lopetussignaalia. Esimerkiksi nukleotiditripletit TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ja CTG koodaavat aminohappoa leusiini ("Leu"), TAG, TAA ja TGA ovat translaation lopetussignaaleja ja ATG on trans-10 laation aloitussignaali.
Lukukehys — Kodonien ryhmittymä mRNA:n translaation aikana aminohapposekvensseiksi. Translaation aikana oikea lukukehys täytyy ylläpitää. Esimerkiksi sekvenssi GCTGGTTGTAAG voidaan translatoida kolmessa lukukehyksessä 15 eli faasissa, joista jokainen antaa erilaisen aminohappo-sekvenssin: GCT GGT TGT AAG -- Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG -- Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA A — Trp-Leu-(lopetus) 20 Polypeptidi — Suoraviivainen sarja aminohappoja, jotka on kytketty toisiinsa peptidisidoksin vierekkäisten ·:-·· aminohappojen α-amino- ja karboksi-ryhmien välissä.
Genomi — Aineen ehyt DNA. Se sisältää muun muassa .*··. rakennegeenit, jotka koodaavat aineen polypeptidejä, sekä 25 myös operaattorin, promoottorin ja ribosomin sitovat ja vuorovaikutus-sekvenssit, jotka käsittävät sellaisia sekvenssejä kuin Shine-Dalgarno-sekvenssit.
Rakennegeeni -- DNA-sekvenssi, joka koodaa mallinsa tai lähetti-RNA:n (”mRNA":n) kautta aminohappojen sekvens-; 30 siä, joka on ominainen jollekin spesifiselle polypeptidil- . ! le.
Transkriptio -- Prosessi mRNA:n tuottamiseksi rakennegeeni s tä .
' Translaatio -- Prosessi polypeptidin tuottamiseksi 35 mRNA:sta.
9 86437
Ekspresslo -- Prosessi, jonka rakennegeeni käy läpi tuot-taakseen polypeptidin. Se on transkription ja translaation yhdistelmä.
Plasmidl — Ei-kromosomaalinen kaksisäkeinen DNA-5 sekvenssi, joka sisältää koskemattoman "repiikonin", niin että plasmidi monistuu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoitetaan yksisoluiseen organismiin, muuttuvat tämän organismin ominaispiirteet eli transformoituvat seurauksena plas-midin DNArsta. Esimerkiksi plasmidi, jolla on geeni tetra-10 sykliiniresistenssiä (TetR) varten transformoi solun, joka aikaisemmin on ollut herkkä tetrasykliinille, soluksi, joka on sille resistentti. Plasmidilla transformoitua solua nimitetään "transformantiksi".
Faagi eli bakteriofagi -- Bakteerivirus, joista 15 monet sisältävät DNA-sekvenssejä kapseloituina proteiini-vaippaan tai kapseliin ("kapsidi"). Yksisoluisessa organismissa faagi monistuu prosessilla, jota nimitetään transfektioksi.
Kloonausväline — Plasmidi, faagi-DNA tai muita 20 DNA-sekvenssejä, jotka pystyvät monistumaan isäntäsolussa, tunnettuja yhdestä tai pienestä lukumäärästä endonukleaa-si-tunnistuskohtia, joissa tällaiset DNA-sekvenssit voidaan leikata määriteltävällä tavalla ilman että tähän liittyy DNA:n olennaisen biologisen funktion häviötä, 25 esim. replikaation, vaippaproteiinien tai promoottorin tai sitomiskohtien häviötä ja jotka sisältävät markkerin, joka on sopiva käytettäväksi transformoitujen solujen tunnistamisessa, esim. tetrasykliiniresistenssin tai ampisilliini-resistenssin tunnistamisessa. Kloonausvälinettä nimitetään • 30 usein vektoriksi.
· Kloonaus — Suvuttoman lisääntymisen prosessi.
Yhdistelmä-DNA-molekyyli — Hybridi-DNA-sekvenssi, joka sisältää vähintäin kaksi nukleotidisekvenssiä, joista ensimmäistä sekvenssiä ei normaalisti löydy yhdessä toisen : 35 sekvenssin kanssa luonnossa.
10 86437
Ekspressoinnin säätelysekvenssi -- Nukleotidien DNA-sekvenssi, joka kontrolloi ja säätelee rakennegeenien ekspressiota, kun ne on toimivasti liitetty näihin geeneihin.
5 Viitaten nyt kuvaan 1, on siinä esitetty yksinker taistettu kaavio Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta. Dane-hiukkasia on havaittavissa joidenkin potilaiden, joilla on hepatitis B-virusinfektioita, veriplasmassa (D.S. Dane ja C.H. Cameron, "Virus-Like Particles in Serum 10 of Patients with Australia-Antigen Associated Hepatitis", The Lancet, 1, sivut 695-698 (1970)). Tämän hiukkasen ajatellaan olevan sama tai läheisesti sukua hepatitis B:n tartuttavalle virionille. Samalla kun sen koko tiedetään (42 nanometriä läpimitaltaan), sen rakenne ei ole täysin 15 tunnettu. Yleisesti Dane-hiukkasen uskotaan käsittävän ulkokerroksen ja sisemmän ytimen. Hiukkasen ulkokerros sisältää yleensä polypeptidin, joka tunnetaan hepatitis B-pinta-antigeeninä ("HBsAg"). Sisempi ydin läpimitaltaan 27 nanometriä) sisältää toisen polypeptidin hepatitis B-ydin-20 antigeenin ("HBcAg") sekä myös endogeenisen kaksisäikei-sen, pyöreän, 2,1 x 106 daltonin DNA-molekyylin, joka si-:··· sältää pituudeltaan vaihtelevan yksisäikeisen aukon. Myös kolmas polypeptidi, "e"-antigeeni ("HBeAg") voi liittyä Dane-hiukkasiin. Lisäksi DNA-hiukkasen uskotaan sisältä-" 25 vän endogeenista DNA:sta riippuvaisen DNA-polymeraasin, !'.l joka osittain sulkee yksisäikeisen aukon endogeenisessä DNA:ssa polymeraasireaktiolla käyttäen tätä DNA1ta aluk-keena/mallina. Dane-hiukkasen rakenne ja ominaisuudet ja erityisesti sen DNA ovat olleet useiden analyysien kohtee-30 na. Esim. W.S. Robinson, "The Genome of Hepatitis B Virus", : Ann. Rev. Microbiol. 31, T.A. Landers et ai., "Structure of Hepatitis B Dane Particle DNA and Nature of the Endo-•I genous DNA Polymerase Reaction", J. Virology, 23 (1977) 368-76; J. Summers et al., "Genome of Hepatitis B Virus; 35 Restriction Enzyme Cleavage and Structure of DNA Extracted li 86 437 from Dane Particles", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 72 (1975) 4597-601; J. Summers et al., "A Virus Similar to Hepatitis B Virus Associated with Hepatitis and Hepatoma in Woodchucks", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 5 4533-37, ja B.G. Werner et al., "Association of E Antigen with Dane Particle DNA in Sera from Asymptomatic Carriers of Hepatitis B Surface Antigen", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74 (1977) 2149-51. Eri antigeenien tai niiden geenien todellista rakennetta ei kuitenkaan ollut määritelty. 10 Dane-hiukkasen endogeeninen DNA on eristetty uutta malla Dane-hiukkasesta. Se käsittää yhden nukleotidisäi-keen, jolla on vakiopituus ja jossa on lovi tai aukko (kuva 1, säie a, » 3000 nukleotidia) ja toisen nukleotidiryh-män, jonka pituus jonkin verran vaihtelee (kuva 1, säie b, 15 * 2000 nukleotidia). Toinen ryhmä on komplementaarinen ensimmäisen säikeen kanssa ja peittää sen loven pyöreän rakenteen täydentämiseksi vetysidoksella komplementaaristen emästen välillä tavanomaisella Watson-Crick-tavalla. Tämä peitto käy ilmi kuvasta 1. Dane-hiukkasen DNA-polyme-20 raasi näyttää käyttävän endogeenisen DNA:n toista säieltä alukkeena ja ensimmäistä säieltä mallina muuttuvan aukon täyttämiseksi nukleotideillä, jotka ovat komplementaarisia ensimmäisen säikeen nukleotideille ja antavat kaksisäikei-. ··_ sen DNA:n, jossa on 3000 nukleotidiparia.
! 25 Suurta valikoimaa isäntä-kloonausväline-yhdistelmiä voidaan hyödyllisesti käyttää tämän keksinnön kaksisäi-keistä DNA'ta kloonattaessa. Esimerkiksi käyttökelpoiset kloonausvälineet voivat käsittää kromosomaalisia, ei-kro-mosomaalisia ja synteettisiä DNA-sekvenssejä, kuten eri-30 laisia tunnettuja bakteeri-plasmideja, kuten pBR322, muita : E. coli-plasmideja ja niiden johdannaisia ja suuremman isäntäspektrin plasmideja, kuten RP4, faagi DNA, kuten λ- ♦ » *-.! faagin lukuisia johdannaisia, esim. NM989, ja vektoreita, :* jotka on johdettu plasmidien ja faagi-DNA'iden yhdistel- 35 mistä, kuten plasmidideista, jotka on modifioitu käyttä- i2 86437 mään faagi-DNA:n ekspression säätelysekvenssejä. Käyttökelpoisia isäntiä ovat bakteeri-isännät, kuten E. coli X1776, E.coli X2282, E. coli HB101 ja E. coll MRC1 ja Pseudomonas ja Bacillussubtilis- ja muut basillikannat.
5 Kaikki isännät eivät tietenkään ole yhtä tehokkaita.
Lisäksi jokaisen spesifisen vektorin sisällä voidaan valita eri kohtia eristetyn kaksisäikeisen DNA:n in-sertiota varten. Nämä kohdat on tavallisesti merkitty res-triktioentsyymillä tai endonukleaasilla, joka leikkaa ne. 10 Esimerkiksi pBR322:ssa Pstl-kohta sijaitsee penisillinaa-sigeenissä nukleotiditriplettien välissä, jotka koodaavat penisillinaasiproteiinin aminohappoja 181 ja 182. Tätä kohtaa käyttivät Villa-Komaroff et ai., supra, syntetisoi-dessaan proteiinia, jolla oli rotan proinsuliinin antigee-15 nideterminantit. Hind II-endonukleaasi-tunnistuskohta on triplettien, jotka koodaavat aminohappoja 101 ja 102, ja Taq-kohdan välissä tripletissä, joka koodaa tämän proteiinin aminohappoa 45 pBR322:ssa. Samalla tavalla Eco Rl-en-donukleaasin tunnistuskohta tässä plasmidissa sijaitsee 20 geenien välissä, jotka koodaavat resistenssiä tetrasyklii-nille ja vastaavasti ampisilliinille. Tätä kohtaa käytti-vät Itakura et ai. ja Goeddel et ai. yhdistelmä-DNA-syn-teesikaavioissaan, supra. Kuvat 2 ja 11 esittävät valaise-"1 mistarkoituksessa joitakin restriktio-kohdista plasmidissa 25 pBR322 ja λ-faagissa NM989.
Tietyn kohdan, joka valitaan valikoidun DNA-hiukka-sen insertiota varten kloonausvälineen yhdistelmä-DNA-mo-·· lekyylin muodostamiseksi, määrää joukko eri tekijöitä.
Näitä ovat ekspressoitavan polypeptidin koko ja rakenne, 30 halutun polypeptidin herkkyys endoentsymaattiselle pilk- ·"". koutumiselle isäntäsolukomponenttien vaikutuksesta ja kon taminaatio sen proteiineilla, ekspressoitumisominaisuudet, kuten aloitus- ja lopetuskodonien sijainti, sekä muut alaan perehtyneiden tuntemat tekijät. Koska ekspressoitu-35 misprosessia ei täysin ymmärretä, mikään näistä tekijöistä i3 86437 yksinään ei absoluuttisesti säätele insertio-kohdan valintaa jollekin tietylle polypeptidille. Pikemminkin valittu kohta saa aikaan tasapainon näiden tekijöiden välille ja kaikki kohdat eivät ole yhtä tehokkaita jollekin tietylle 5 proteiinille.
Vaikka tekniikan tasolla tunnetaan useita menetelmiä vieraan DNA:n liittämiseksi kloonausvälineeseen yhdis-telmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, menetelmä, jota tämän keksinnön mukaisesti pidetään edullisena, on esitetty 10 kuvassa 2. Sille on luonteenomaista, että Dane-hiukkasen DNA pilkotaan restriktioendonukleaasilla, polydeoksiC-sekvenssit liitetään pilkotun DNA:n 3'-päätteisiin (nimitetty sopimuksella DNA-sokerirungon deoksiriboosihiilestä) ja pidennetty DNA liitetään kloonausvälineeseen, joka on 15 leikattu tietystä kohdasta restriktioendonukleaasilla ja pidennetty tämän leikkauksen 3'-päätteistä polydeoksiG-sekvensseillä, jotka ovat komplementaarisia pilkotun DNA:n polydC-sekvensseille. DNA:n ja kloonausvälineen 3'-häntien komplementaarinen luonne sallii näiden päätteiden tarttu-20 misen yhteen.
Ollakseen käyttökelpoinen tämän keksinnön menetel- ____: mässä restriktioentsyymin, joka on valittu pilkkomaan - HBV:n DNA, ei tulisi pilkkoa HBV:n DNA'ta HBV:n antigeeni- I" syyttä omaavia polypeptidejä koodaavan geenin oleellisessa "I 25 osassa ja sopivimmin sen tulisi pilkkoa DNA rajoitetussa määrässä kohtia. Restriktioentsyymejä, joita on käytetty tässä keksinnössä, ovat Κρη I, Bgl II, Bam HI, Ava I ja Eco Rl. Muut restriktioendonukleaasit voivat olla samalla tavalla käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisesti. Kuvat 30 3 - 9 esittävät joitakin restriktioendonukleaasi-tunnis- tuskohtia osassa HBV-genomia.
Tietenkin muut tunnetut menetelmät DNA-sekvenssien liittämiseksi kloonausvälineisiin yhdistelmä-DNA-molekyy- - · lien muodostamiseksi ovat yhtä lailla käyttökelpoisia täs-35 sä keksinnössä. Näitä ovat esimerkiksi suora liitäntä.
14 86437 jolloin samaa restriktioendonukleaasia käytetään pilkkomaan HBV:n DNA ja kloonausvälinettä. Tämä menettely antaa luonnostaan komplementaariset päät yhteentarttumista varten.
5 On tietenkin ymmärrettävä, että kloonausvälineen valittuun pilkontakohtaan liitetyn geeni fragment in nukleo-tidisekvenssi voi sisältää nukleotidejä, jotka eivät ole varsinaisen rakennegeenin osia haluttua proteiinia varten tai voivat sisältää ainoastaaan tämän rakennegeenin frag-10 mentin. Liitettävästä DNA-sekvenssistä välittämättä ainoa vaatimus on, että transformoitu isäntä tuottaa polypep-tidin, joka antaa HBV-antigeenisyyden.
Yhdistelmä-DNA-molekyyliä, joka sisältää hybridi-geenin, voidaan käyttää transformoimaan isäntä niin, että 15 se sallii isännän (transformantin) ekspressoida sen raken-negeeni tai sen fragmentti ja tuottamaan polypeptidin tai sen osan, jota hybridi-DNA koodaa. Yhdistelmä-DNA-molekyyliä voidaan myös käyttää transformoimaan isäntä niin, että isäntä lisääntyessään pystyy tuottamaan lisää yhdistelmä-20 DNA-molekyylejä HBV-rakennegeenien ja niiden fragmenttien lähteeksi. Sopivan isännän valintaa kumpaakin näitä kahta käyttötarkoitusta varten säätelee joukko alalla tunnettuja tekijöitä. Näitä ovat esimerkiksi yhteen sopivuus valitun vektorin kanssa, mukana olevien tuotteiden myrkyllisyys, "I 25 halutun polypeptidin talteenoton helppous, ekspressointi-• · · ·;;; ominaisuudet, bioturvallisuus ja kustannukset. Jälleen, koska ekspressoitumisen mekanismia ei täysin tunneta, ei • “ mitään isännän absoluuttista valintaa tulisi tehdä jotakin tiettyä yhdistelmä-DNA-molekyyliä tai peptidiä varten mis-: 30 tään näistä tekijöistä yksinään. Sen sijaan näiden teki- jöiden tasapainoon täytyy liittyä oivaltaminen, että kaik-. \ ki isännät eivät ole yhtä tehokkaita jonkun tietyn yhdis- telmä-DNA-molekyylin ekspressiota varten.
Tässä synteesissä edullinen kloonausväline on bak-35 teeriplasmidi pBR322 ja edullinen restriktioendonukleaasi- is 86437 kohta siinä on Pst I-kohta (kuva 2). Tämä plasmidi on pieni (molekyylipaino n. 2,6 megadaltöniä) plasmidi, jolla on resistenssigeenejä antibiooteille ampisilliini (Amp) ja tetrasykliini (Tet). Plasmidi on täysin luonnehdittu (F.
5 Bolivar et ai., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurprose Clonig System". Gene (1977) 95-113). Edullisen kloonausmenetelmän, bakteeri- plasmidin pBR322 ja siinä olevan Pst I-kohdan, joita käytetään keksinnön mukaisissa menetelmissä, ovat kuvanneet 10 R.P. Ambler ja G.K. Scott artikkelissa "Partial Amino Acid Sequence of Penicillinase Coded by Escherichia coli Plasmid R6K", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 3732-36 ja J. G. Sutcliffe, artikkelissa "Nucleotide Sequence of The Ampicillin Resistance Gene of Escherichia coli 15 Plasmid pBR322", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 3737-41. Edullinen isäntä tämän keksinnön mukaisesti on E. coli HB 101.
Keksinnön valaisemiseksi esitetään seuraavat esimerkit.
20 Esimerkki I
Ihmisseerumia yhdestä ainoasta HBsAg-positiivises-. ··*. ta, HBeAg, positiivisesta luovuttajasta (serotyyppi adym) laimennettiin yhtä suurella tilavuusmäärällä puskuria (0,1 M tris-HCl, 0,1 M suolaliuos (NaCl), 0,1 paino/tilavuus-"*j 25 %, kuten kauttaltaan on käytetty, 2-merkaptoetanolia, 0,1 ::: % naudan seerumialbumiinia, 0,001 M EDTA) pH 7,4:ssä. Tätä ’ sentrifugoitiin kierrosnopeudella 35 000 rpm 2 tuntia 4° : ** C:ssa. Näin saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 200 yl:aan samaa puskuria ja pantiin sentrifugiputken, joka 30 sisälsi 20 % sakkaroosia, yläpäähän. Suspensiota sentrifu-: goitiin kierrosnopeudella 40 000 rpm 2 tuntia 4 °C:ssa.
Näin saatu pelletti suspendoitiin jälleen uudelleen 100 pl:aan puskuria (0,1 M tris-HCl, 0,1 M suolaliuosta) pH "* 7,5:ssä.
35 Syntynyt DNA'ta sisältävä pelletti merkattiin sit- • * i6 86 437 ten 3H:lla tai 32P:llaa, kuten ovat kuvanneet P.M. Kaplan et ai., "DNA Polymerase Associated with Human Hepatitis B Antigen", J. Virol., 12, sivut 995-1005 (1973) sen seuraamisen helpottamiseksi prosessin myöhempien vaiheiden läpi.
5 Tämä merkkaus on tulos väkevöityjen Dane-hiukkasten ja 3H-tai 32P-merkattujen deoksinukleosiditrifosfaattien (dNTP' eiden) reaktiosta 4 tunnin aikana 37 °C:ssa. Tämän DNA-polymeraasireaktion jälkeen, mistä on tuloksena yksisäi-keisen aukon osittainen sulkeutuminen DNA:ssa (ks. kuva 10 1), merkattu DNA-aines pantiin sentrifugiputken, joka si sälsi 30 % sakkaroosia, yläpäähän ja sentrifugoitiin kier-rosnopeudella 42 000 rpm 3,5 tuntia 4 eC:ssa.
DNA uutettiin sitten fenolilla syntyneestä pelletistä käyttäen L.I. Lutwick'in ja W.S. Robinson'in mene-15 telmää, "DNA Synthesized in the Hepatitis B Dane Particle DNA Polymerase Reaction", J. Virol., 21, sivut 96-104 (1977). Uutettua DNA'ta dialysoitiin sitten liuosta vastaan, joka oli 0,01 M tris-HCl, 0,001 M EDTA (pH 8,0) fe-noliliuottimen poistamiseksi. Eristetty DNA oli sitten 20 valmis uuttoihin restriktioentsyymeillä. Sen spesifinen radioaktiivisuus oli noin 108 cpm/pg. Edellä selostettu me-:·· netelmä on kaavamaisesti esitetty kuvassa 2.
1. dC-pidennetyn Dane-hiukkasen DNA:n valmistus .·*. Sovellettaessa tämän keksinnön edullista suoritus- 25 muotoa käytännössä Dane-hiukkasista kuten edellä eristet-"X tyä DNA'ta uutettiin restriktioendonukleaasilla Κρη I (n.
20 ng DNA 10 pl:ssa 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanoli, 40 mM NaCl, 0,5 μΐ μΐ entsyymival-mistetta) 37 °C:ssa 90 minuuttia ja restriktioentsyymi in-30 aktivoitiin kuumentamalla 70 °C:ssa 5 minuuttia. Polydeok-siC-sekvenssejä (kuvaamistarkoituksessa ainoastaan kuvattu CCC:nä kuvassa 2) liitettiin uuttotuotteiden 3'-päätteisiin standardireaktiolla polynukleotidi-päätetransferaa-silla jäämäproteiinin poistamisen jälkeen fenolilla ja 35 kloroformilla uuttamalla (20 μΐ kumpaakin). Fenoli pois- i7 86437 tettiin vesipitoisesta faasista uuttamalla eetterillä ja DNA saostettiin lisäämällä 3M natriumasetaattia, pH 6,5 (5 μΐ) ja kylmää etanolia 0,1 ml. Yhden tunnin varastoinnin jälkeen -70 °C:ssa saostunut DNA otettiin talteen sentri-5 fugoimalla kierrosnopeudella 10 000 rpm 20 minuuttia ja pelletti liuotettiin 10 mM tris-HCl:ään pH 7,5 (10 μΐ). Tähän lisättiin 3 μΐ 400 mM kaliumkakodylaattia, pH 7,0, 4 mM kobolttikloridia, 4 mM deoksisytosiinitrifosfaattia (dCTP), 200 pg/ml naudan seerumialbumiinia, ja seosta in-10 kuboitiin 27 °C:ssa 10 minuuttia 0,5 μ1:η kanssa polynuk-leotidi-päätetransferaasia (6000 μ/ml) ja reaktio lopetettiin lisäämällä 50 mM EDTA (1 μΐ).
2. Pst Iillä pilkotun, dG-pidennetyn pBR322:n valmistus 15 Plasmidia pBR322 uutettiin restriktioendonukleaa- silla Pst I (jota varten plasmidi sisältää yhden kohteen) ja tuotteet puhdistettiin fenoliuutolla ja etanolisaostuksella tavalla, joka edellä kuvattiin HBV DNA:lie. Poly-dG-sekvenssejä (ainoastaan valaisemistarkoituksia varten 20 esitetty GGG:nä kuvassa 2) lisättiin lineaaristen pBR322-molekyylien 3’-päätteisiin päätetransferaasilla kuten on selostettu polydC-sekvenssien lisäämiselle HBV:hen, paitsi että reaktio saatettiin tapahtumaan 37 °C:ssa.
.··. 3. G-pidennetyn pBR322:n ja C-pidennetyn HBV DNA:n 25 yhteenliittäminen "" Ekvimolaarisia määriä pBR322-polydG ja HBV DNA- polydC sekoitettiin keskenään ja komplementaaristen sekvenssien annettiin sitoutua inkuboimalla 100 mM NaCl:ssa 50 mM tris-HCl:ssa, pH 7,5, 5 mM EDTA (TNE):ssa, (50 μΐ) 30 65 °C:ssa yksi tunti, ja sitten 47 °C:ssa 1 tunti, 37° C- :ssa yksi tunti ja 20 °C:ssa yksi tunti ja lisättiin yhtä suuri tilavuusmäärä TNE ja 20 μΐ 100 mM MgCl2, 100 mM CaCl2, 100 mM tris-HCl, pH 7,5.
18 86437 4. E. coll HB 101;n transformointi Transformaatioon kelpaavia E. coli HB 101 viljelyjä valmistettiin kuten E.M. Lederberg ja S.H. Cohen ovat kuvanneet , "Transformation of Salmonella typhimurium by 5 Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol, 119 sivut 1072-1074 (1974). 0,1 ml:n annoksia soluja sekoitettiin 25 μΐιη kanssa lämpökäsiteltyä DNA-valmistetta ja inkuboitiin 0 °C:ssa 20 minuuttia ja sitten 20 eC:ssa 10 minuuttia ennen levittämistä L-agarmaljoille, jotka sisälsivät tetra-10 sykliiniä (50 pg/ml) inkuboitaviksi yli yön 37 °C:ssa. Koska plasmidi pBR322 sisältää geenin tetrasykliiniresis-tenssiä varten, E. coli-pesäkkeet, jotka on transformoitu tällä plasmidilla, kasvavat viljelmissä, jotka sisältävät tätä antibioottia sulkien pois ne E. coli-pesäkkeet, jotka 15 eivät ole näin transformoituja. Siten kasvu tetrasykliiniä sisältävässä viljelyssä sallii sopivasti transformoitujen isäntien valikoimisen.
5. E. coli-pesäkkeiden seulonta hybridisoimalla Bakteeripesäkkeitä, jotka oli kasvatettu inkuboi- 20 duilla tetrasykliiniä sisältävillä L-agarmaljoilla, testattiin ampisilliiniherkkyyden suhteen. Plasmidi pBR322 :··: sisältää geenin ampisilliiniresistenssiä varten. Tämä gee- ni on ehdotettu kohta hybridigeeni-insertiota varten. Sen tähden pesäkkeet, jotka on transformoitu plasmidilla, jos-25 sa on DNA liitettynä valittuun tunnistuskohtaan, ovat ' i herkkiä ampisilliinille, mutta säilyttävät resistenssinsä tetrasykliinille. E. coli-pesäkkeet, jotka olivat herkkiä ampisilliinille mutta resistenttejä tetrasykliinille, poimittiin Millipore-selluloosanitraattisuodattimelle, joka 30 oli asetettu L-agarmaljoille, jotka sisälsivät tetrasyk-; : liiniä. Kasvattamisen jälkeen yli yön 37 °C:ssa Millipore- : .·. suodatin vaihdettiin tuoreille L-agarmaljoille, jotka si- sälsivät tetrasykliiniä ja kloramfenikolia, (150 pg/ml) ja inkuboitiin vielä useita tunteja 37 °C:ssa plasmidien ko-35 pioiden lukumäärän lisäämiseksi solujen sisällä (kuva 2).
i9 86437
Mllllpore-suodattlmia käytettiin sitten pesäke-hybridisaa-tiota varten, kuten ovat kuvanneet M. Grunstein ja D.S. Hogness, "Colony Hybridization: A Method for the Isolation of Cloned DNA's that contain a Specific Gene", Proc. Natl.
5 Acad. Sci. U.S.A., 72, sivut 3961-3965 (1975) 32P-leimatun HBV DNA:n kanssa, joka oli edellä valmistettu koettimeksi. Suodattimien radioautografia paljasti pesäkkeiden läsnäolon, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia autenttiselle HBV DNA:lie.
10 6. Pesäkkeiden havaitseminen, jotka syntetisoivat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys
Pesäkkeitä, jotka olivat resistenttejä tetrasyklii-nille, herkkiä ampisilliinille ja jotka oli hybridisoitu autenttisella HBV DNA:11a, testattiin kykynsä suhteen 15 tuottaa ainakin yksi polypeptidi, jolla on HBV-antigeeni-spesifisyys tai -antigeenisyys. Pesäkkeitä poimittiin jälleen Millipore-suodattimille, jotka oli sijoitettu L-agar-maljoille, jotka sisälsivät tetrasykliiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön. Toinen L-agar-malja peitettiin E. coli 20 C600:n viljelmällä (0,1 ml 2 ml:ssa pehmeätä agaria), joka oli infektoitu bakteriofagin λ vir elinvoimaisella kannal-I la (infektion moninkertaisuus n. 1) ja inkuboitiin myös 37® C:ssa yli yön, jona aikana bakteeripeite oli yhtyvästi .···. liuennut (ts. pääasiallisesti kaikki isäntäsoluseinistä 25 oli murtunut) faagin (λ-vir) vaikutuksesta. Millipore-suo-datin, joka sisälsi tämän keksinnön mukaisesti transformoidut solut, nostettiin maljaltaan ja sijoitettiin, pesäkkeet alaspäin, kosketukseen E. coli C600:n L-agar-mal-jan pinnan kanssa, jota oli liuotettu λ-vir:llä. Tätä kos-30 ketusta jatkettiin n. 10 minuuttia Millipore-suodattimessa : : olevien solujen infektion sallimiseksi λ-vir:llä. Millipo- re-suodatin siirrettiin sitten tuoreelle L-agarmaljalle ja ’..I inkuboitiin 37 ®C:ssa vielä 5 tuntia. Sillä välin pääl lystettiin polyvinyylikeikkoja HBV-vasta-aineilla (kuten \· 35 ovat selostaneet S. Broome ja W. Gilbert, "Immunological 20 86437
Screening Method to Detect Specific Translation Products", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, sivut 2746-2749 (1978). Milliporesuodattimet, joissa transformoidut bakteeripesäk-keet nyt ilmeisesti olivat liuenneet, sijoitettiin pääl-5 lystetyille polyvinyylikiekoille siten, että pesäkkeet koskivat niihin ja pidettiin 4 °C:ssa 3 tuntia. Tästä kosketuksesta oli seurauksena soluista liuenneiden kaikkien HBV-antigeenien Millipore-suodattimella sitoutuminen kiekon HBV-vasta-aineiden kanssa. Päällystetyt kiekot erotet-10 tiin Millipore-suodattimesta ja pestiin sitten ja inkuboi-tiin 125I-merkattujen HBV-vasta-aineiden kanssa. Tästä inku-boinnista oli seurauksena niiden kohtien merkkautuminen kiekolla, joissa HBV-antigeenit Millipore-suodattimesta olivat aikaisemmin tulleet sidotuiksi kiekon HBV-vasta-15 aineisiin. Pesun ja radioautografian jälkeen, kuten ovat selostaneet Broome ja Gilbert, supra, pesäkkeet, jotka olivat tuottaneet polypeptidejä, joilla on HBV-antigeeni-spesifisyys, paikannettiin radioautografiaan viitaten.
Esimerkki II
20 Antigeenisten polypeptidien, jotka on translatortu yhdistelmä-DNA-molekyylistä tämän keksinnön E. coli:ssa, biologisen aktiivisuuden testaamiseksi, injektoitiin bak-teerisolujen, joiden oli näytetty ekspressoivan HBcAg'tä, III steriilejä uutteita kaniineihin sekoittamisen jälkeen yhtä Ί 25 suuren tilavuusmäärän kanssa Freund'in apuainetta. Kaksi ·;;; eläintä sai raakaa bakteeriuutetta ja kahdelle annettiin saman uutteen näytteitä fraktioinnin jälkeen Sephadex G-50-pylväällä. Saman näytteen lisäinjektioita, jotka oli pakastettu ja varastoitu (säilyttäen täyden antigeenisen - 30 aktiivisuutensa) annettiin kaksi ja viisi viikkoa ensim- : mäisen injektoinnin jälkeen. Eläimistä otettiin verta tie- Λ tyin väliajoin useita viikkoja alkuinjektoinnin jälkeen.
'..I Immunodiffuusio-kokeet, käyttäen 0. Ouchterlony'n selostamaa menetelmää "Immunodiffusion and Immunoelectro-: \· 35 phoresis", käsikirjassa Handbook of Experimental Immu- 2i 86437 nology (D.W. Weir toim.) (Blackwell Scientific Publications, Oxford ja Edinburgh), luku 19 (1967), tehtiin kaniinin seerumien (vasta-aineiden) vertaamiseksi ihmisen hepatitis B-virusydin-vasta-aineeseen ("HBcAb") käyttäen 5 HBcAg'tä, joka oli johdettu ihmisen maksasta. (B.J. Cohen ja Y.E. Cossart, "Application of a Screening Test for Antibody to Hepatitis B Core Antigen", J. Clin. Path., 30, sivut 709-713 (1977)). Kaikki neljä kaniiniseerumia antoivat presipitiiniviivoja, joiden HBcAg oli samanlainen kuin 10 niillä, jotka oli muodostettu HBcAg:n ja HBcAbrn välillä, jotka oli muodostettu ihmislähteistä. Siten ydinantigeeni, joka on syntetisoitu E. colizssa tämän keksinnön yhdistel-mä-DNA-molekyyleillä, on serologisesti aktiivinen in vivo. Tämä aktiivisuus antaa käytettäväksi yhdistelmien ja mene-15 telmien toteutettavuuden käyttäen virusantigeenejä, jotka on syntetisoitu mikrobisoluissa, vasta-aineen muodostumisen stimuloimiseksi ihmisissä. Tällaisille yhdistelmille ja menetelmille ovat ominaisia polypeptidit, jotka on tuotettu isännissä, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-20 molekyyleillä, jotka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti. Näitä polypeptidejä voitaisiin käyttää yksinään tai ·:·*: hyvin tunnettujen farmaseuttisesti hyväksyttävien kanti- mien, kuten suolaliuosten tai muiden lisäaineiden, jotka .*··. alalla ovat hyvin tunnettuja, kanssa käytettäviksi yhdis- 25 telmissä ja menetelmissä virusinfektioiden hoitamiseksi ja 'II! estämiseksi ihmisillä.
.1 Kuten edellä todettiin, voidaan restriktioentsyyme- jä, muita kuin edellä selostettua Kpn I/Pst I-yhdistelmää hyödyllisesti käyttää tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-mole-. : 30 kyylien valmistamisessa. Muita pilkontakohtia plasmidissa : pBR322 ja osa HBV-genomista on kuvattu kuvissa 2 ja 3, vastaavasti. Näiden vaihtoehtoisten, mutta vähemmän edul-listen suoritusmuotojen valaisemiseksi esitetään seuraavat esimerkit.
22 86437
Esimerkki III
HBV DNA-osasia, jotka oli tuotettu käyttämällä Bam HI, Eco Rl ja Bgl II, toisin kuin niitä, jotka oli valmistettu Kpn I:llä, ei voitu tavanomaisesti suoraan muodostaa 5 hänniksi koossa pysymistä varten, mikä johtuu lyhyiden 5'-yksisäikeisten ulkonemien läsnäolosta. Niitä käsiteltiin sen tähden λ-eksonukleaasilla näiden ulkonemien poistamiseksi ennen polydC-sekvenssien lisäämistä 3'-päätteissä. Tämä tehtiin inkuboimalla pilkottua DNA'ta (10 pl liuosta 10 kuten edellä kuvattiin) 15 μ1:η kanssa 100 mM natriumgly-sinaattia, pH 9,5, 10 mM MgCl2, 100 pg/ml naudan seerumi-albumiinia, 5 μΐ λ-eksonukleaasia 0 eC:ssa 1,5 tuntia. Seosta uutettiin sitten fenolilla ja kloroformilla ja prosessia jatkettiin. Valmistuksen, jossa käytettiin Bam HI, 15 jälkeen tehty radioimmunoanalyysi vahvisti polypeptidien tuoton, joilla oli HBV-antigeenispesifisyys.
Esimerkki IV
DNA-fragmenttien häntien muodostamisen asemasta koossa pysymistä varten, kuten edellä on selostettu, voi-20 daan tämän keksinnön menetelmissä käyttää geenifragment-tien suoraa liitäntää. Esimerkiksi, kahdessa lisävalmis-tuksessa pilkottiin HBV DNA (20 ng) restriktioendonukleaa-silla Eco Rl tai Bam HI 10 mM tris-HCl:ssä, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanoli, 50 mM NaCl (10 μΐ), 37 °C-25 :ssa 1,5 tuntia ja sekoitettiin ylimäärin pBR322:n kanssa, jota oli inkuboitu samojen entsyymien kanssa samanlaisissa olosuhteissa. Väkevöity puskuriliuos (660 mM tris HC1, pH
7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 100 mM 2-merkaptoetanoli, 400 mM NaCl, 1 mM ATP) (2 μΐ) lisättiin ja seosta inku-·.: 30 boitiin T4 DNA-ligaasin (0,5 μΐ) kanssa 10 °C:ssa 3 tun tia, mitä seurasi ainakin 24 tuntia 0 °C:ssa. Liuos laimennettiin 0,1 ml:ksi 10 mM tris-HCl:llä, pH 7,5 ja käytettiin transformoimaan E. collHBlOlm kykeneviä viljelmiä kuten edellä selostettiin. Bam Hiillä valmistettujen yh-35 distelmä-DNA-molekyylien tapauksessa pesäkkeet testattiin.
23 86437 ennen seulontaa hybridisaatiota varten, herkkyyden suhteen tetrasykliinille eikä ampisilliinille, koska Bam HI:n kohde pBR322:ssa on geenissä, joka koodaa tetrasykliiniresis-tenssiä, ja sen tähden on menestyksellisestä insertiosta 5 tässä tunnistuskohdassa seurauksena tämän resistenssin häviö ampisilliiniresistenssin asemesta kuten insertion tapauksessa Pst I-kohdassa.
Yhdistelmä-DNA-molekyylien tapauksessa, jotka oli valmistettu Eco RI-kohdan kautta, pesäkkeet testattiin, 10 ennen seulontaa hybridisaatiota varten, resistenssin suhteen sekä ampisilliinille että tetrasykliinille, koska Eco Rl:n kohde pBR322:ssa on geenien välissä, jotka koodaavat tetrasykliini- ja ampisilliiniresistenssiä, niin että mitään geenien inaktivoitumista ampisilliini- tai tetrasyk-15 liiniresistenssille ei tapahdu hybridi-DNA-insertiossa tässä kohdassa.
Esimerkki V
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua HBV DNA'ta voidaan käyttää genomin nukleotidisekvenssin määrittämi-20 seen ja siitä geenin ja HBV-antigeenien aminohapposekvenssien ja itse rakennegeenien määrittämiseen. Näiden sek-**: venssien tunteminen auttaa hepatitis B-viruksen biologian ymmärtämisessä ja tekee mahdolliseksi edellä selostettujen -·*. modifiointien käyttämisen parhaaksi eduksi.
25 1. Hepatitis B-ydinantigeeni ·- Sarja yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka oli tehty edellä selostettujen menetelmien mukaisesti ja jotka antoivat isäntäsoluilleen kyvyn syntetisoida HBcAg'tä, kuten kiintofaasiradioimmunoanalyysillä havaittiin, valittiin 30 sekvenssianalyysiä varten. Näistä yhdistelmä-DNA-molekyy-. · leistä valmistettiin fragmentteja uuttamalla sopivilla :.·. restriktioentsyymeillä ja fragmentit leimattiin niiden 5'- .···, päätteissä [a-32P] ATP:lla ja T4-polynukleotidikinaasilla.
Jokaisen fragmentin nukleotidisekvenssit määritettiin sit-: .· 35 ten hyvin tunnetuin kemiallisin hajoamismenetelmin (A.M.
24 86437
Maxam ja W. Gilbert, "A New Method for Sequencing DNA", Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, sivut 560-564 (1977). Tuloksena saatu nukleotidisekvenssi on kuvattu kuvissa 3 - 9. Viittausta varten sekvenssi on numeroitu ydingeenin 5 ATG-translaatio-aloituskodonin A:sta. HBcAg-geenin nukleotidisekvenssi ja polypeptidin aminohapposekvenssi, joka seuraa tästä geenistä (koodikaava 1) on kuvattu kuvissa 3 - 9 nukleotidien 1 - 549 välissä. Tämän geenin koodaaman polypeptidin koko on lähellä molekyylipainoa 19 000, joka 10 on havaittu Dane-hiukkaisten ydinantigeenille. Tämä raken-nemääritys ei kuitenkaan sulje pois mahdollisuutta, että joitakin aminohappoja voidaan sovittaa tämän polypeptidin aminopäätteestä in vivo autenttisen antigeenin muodostumisen aikana. Tämä rakenne ei myöskään ota huomioon mitään 15 muuta tai muita modifikaatioita polypeptidiin, jotka aiheutuisivat sen vuorovaikutuksesta muiden ihmisen entsyymien, esim. niiden entsyymien, jotka glykosoloivat proteiineja, kanssa. Siten tässä määritetty polypeptidiraken-ne ei ole samanlainen kuin HBcAgrn rakenne, joka havaitaan 20 in vivo, mutta silti se saa aikaan hyvin samanlaisen, ellei identtisen immuunivasteen.
Kaikissa tutkituissa yhdistelmä-DNA-molekyyleissä oli HBV DNA liitetty niin, että ydinantigeenigeeni pidet-. ·· tiin samassa translaatiofaasissa kuin pBR322:n penisillii ni 25 niresistenssin geeni. Lisäksi erilaisissa rekombinanteissa *;;; HBV DNA-insertio alkoi yhdessä tai kahdessa nukleotidissä, joilla oli sama asema HBV-sekvenssissä. Koska nämä yhdis-telmä-DNA-molekyylit olivat peräisin HBV DNA:sta, jota oli uutettu eri restriktioentsyymeillä, esim. Bam HIrllä ja 30 Kpn I:llä, tämä ainutlaatuinen liittyminen on yllättävää t ja voi olla tulos HBV DNA:n polynukleotidi-hännänmuodos- tuksen huomaamattomasta murtumisesta Dane-hiukkasen endo-geenisen DNA:n lovessa (kuva 1). Yhdistelmä-DNA-molekyy-lit, joissa oli HBV DNA-insertio erilaisessa translaatio-35 faasissa, eivät ekspressoineet HBcAg-geeniä, eikä mitään 25 86437 polypeptidiä, jolla olisi HBV-antigeenisyys, havaittu isännissä, jotka oli transformoitu tällaisilla yhdistelmä-DNA-molekyyleillä. Tietenkin on ymmärrettävä, että tällaiset ei-geeniä ekspressoivat isännät ja yhdistelmä-DNA-5 molekyylit ovat vielä käyttökelpoisia HBV DNA:n tuottamiseksi tämän keksinnön mukaisesti.
Kun odotettiin, että HBcAg tai sen fragmentit, jotka on tuotettu HBV DNA-insertioiden ekspressoinnin kautta, yhdistyisivät penisillinaasiresistenssin geenin tuottee-10 seen (β-laktamaasiin) pienen määrän glysiini-jäännöksien kautta, näin ei tapahtunut. Sen sijaan B-laktamaasi yhdistyi kaikissa tapauksissa 5-8 glysiinien kautta samanlaiseen peptidisekvenssiin,mutta tämä sekvenssi loppui 25 aminohapon jälkeen. Tässä lukukehyksessä (kehys 1, kuva 3) 15 lopetuskodonia (TAG) seuraa kolme nukleotidia myöhemmin aloituskodoni, josta translaatio jatkuu estymättä antamaan polypeptidi, jonka pituus on 183 aminohappoa (kuvat 3 -8). Siten ydinantigeeninen aktiivisuus on n. 21 000 dalto-nin polypeptidissä, joka on translatoitu de novo HBV-sek-20 venssistä mRNA:n sisällä, joka on transkriboitu yhdistel-mä-DNA-molekyylistä. Tämä polypeptidi pysyy isäntäsolussa, koska se ei ole liittynyt erittyneeseen penisillinaasi-kanninproteiiniin, mikä johtuu HBV DNA-insertion lopetus-ja aloituskodonien järjestelystä.
25 2. Hepatitis B-plnta-antigeeni HBsAg-geenin nukleotidisekvenssi ja aminohapposek-: venssi polypeptidiä varten, joka saadaan tästä geenistä (lukukehys 3) on myös kuvattu kuvissa 6-8, nukleotidien 1437 - 2114 välissä. Tämän polypeptidin aminohapposek-' f 30 venssi alkaa N-päätteellä sekvenssillä met-glu-asn-ile-thr-ser. Tämän alkuaminohapposekvenssin määrittivät D.L. Peterson et ai. "Partial Amino Acid Sequence of two Major Component Polypeptides of Hepatitis B Surface Antigen", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 74, sivut 1530 - 1534 'V. 35 (1977) autenttisesta ihmis-HBsAg:stä. Tämän proteiinin 26 86 437 aminohapposekvenssi jatkuu kuvissa 6-8 lopetuskodoniin asti 226 aminohapon päässä. Tämä 226-polypeptidisekvenssi vastaa 25 400 daltonin proteiinia.
HBsAg-aminohapposekvenssin ja pituuden ovat riippu-5 mattomasti vahvistaneet sekvensoimalla sopivia yhdistelmä-DNA-molekyylejä P. Valenzuela et ai., "Nucleotide Sequence of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen; Nature 280, sivut 815 - 819 (1979).
Tämän keksinnön yhdistelmä-DNA-molekyyleille määri-10 tetty nukleotidisekvenssi osoittaa, että millään tutkituista, HBcAg:n geeniä ekspressoivista yhdistelmä-DNA-mo-lekyyleistä ei voi olla HBsAg:n geeniä asemassa, josta sen myös voisi odottaa ekspressoituvan sopivassa isäntäsolus-sa. Itse asiassa mitään HBsAg'tä ei havaittu solujen uut-15 teissä, jotka solut oli transformoitu niiden plasmidien kanssa, joiden oli havaittu ekspressoivan HBcAg-geeniä. Kuitenkin, kuten edellä mainittiin, supra, tieto näiden geenien nukleotidisekvensseistä sallii ekspressointipro-sessin modifioinnin sen saannon ja tehon parantamiseksi ja 20 geenien sekä polypeptidien, joita aikaisemmin ei ole eks-pressoitu tai havaittu, tuotannon edistämiseksi.
·:··: Esimerkki VI
. ··. Näiden antigeenien geeni- ja aminohapposekvenssit •\ ovat käyttökelpoisia suunniteltaessa menetelmiä antigeenin ^ 25 tai geenin tuotantotason lisäämiseksi bakteerisolua kohti, ill Proteiinin tuotantotasoa kaksi päätekijää hallit see: sen geenin kopioiden lukumäärä solun sisällä ja tehokkuus, jolla nämä geenikopiot transkriboituvat ja trans-latoituvat. Transkription ja translaation, jotka yhdessä . 30 muodostavat ekspression, tehokkuus riippuu vuorostaan nuk- : leotidisekvensseistä, jotka normaalisti sijaitsevat halu tun koodaussekvenssin edellä. Nämä nukleotidisekvenssit tai ekspressointisäätelysekvenssit määrittävät muunmuassa sijainnin, jossa RNA-polymeraasi on vuorovaikutuksessa V 35 aloittaakseen transkription (promoottorisekvenssi) ja jos- 27 86437 sa ribosomit sitoutuvat ja ovat vuorovaikutuksessa mRNA:n kanssa (transkription tuote) aloittaakseen translaation.
Kaikki tällaiset ekspressoinnin säätelysekvenssit eivät toimi yhtäläisellä tehokkuudella. Siten on eduksi erottaa 5 spesifiset koodaussekvenssit haluttua proteiinia varten niiden vierekkäisistä nukleotidisekvensseistä ja yhdistää ne tunnettujen ekspressoinnin säätelysekvenssien kanssa ekspressoinnin korkeiden tasojen siten edistämiseksi. Kun tähän on päästy voidaan vasta aikaansaatu DNA-fragmentti 10 yhdistää monikopioplasmidiin tai bakteriofagijohdannai- seen geenikopioiden lukumäärän lisäämiseksi solussa ja siten edelleen ekspressoidun proteiinin saannon parantamiseksi .
Valaisemistarkoituksissa HBcAgrn geenille määritet-15 tyä sekvenssiä on käytetty tällä tavalla parantamaan HBcAg:n tuotantoa E. coli:ssa. Eräs tällainen menettely on kuvattu kuvassa 10.
DNA-sekvenssin HBcAG:tä varten tutkiminen kuvassa 3 paljastaa, että tätä geeniä edeltää kohta Alu I varten ' 20 nukleotidissa 26 (AGCT) ja sisältää kohdat Eco Ri* nukleotideissä 22 ja 1590, Eco RII:lle 209:ssä (CCTGG), Hae III varten 280:ssa (GGCC) ja Ava II varten 246:ssa ja 461:ssa (GGACC, GGTCC). Tästä monimutkaisuudesta tietoisena on sopivaa siirtää ydinantigeenia koodaava sekvenssi tehok-25 kaampiin ekspressiosäätelysekvensseihin kahdessa vaiheessa. Esimerkiksi, yhdistelmä-DNA-molekyylin (pHBV114), joka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti ja jossa on n.
2350 emäsparin (nukleotidin) HBV DNA-insertio, esim. nukleotideistä -80 - n. 2270 kuvassa 3, uutto sekä Alu I:lla '· 30 ja Eco Rl*:11a antaa muunmuassa fragmentin nukleotidien -26 ja 22 (fragmentti A) välissä, samalla kun Eco RI*-uut-to yksinään antaa fragmentin nukleotideistä 23 - 1589 • ··. (fragmentti B) ja pienet saannot fragmentista nukleoti deistä 23 - 576 (fragmentti B'). Nämä fragmentit voidaan : 35 helposti tunnistaa viittaamalla kuviin 3 - 4 ja ne on kaa- 28 86437 vamaisesti kuvattu kuvassa 10. Fragmentit A ja B on frak-tionoitu geelielektroforeesilla niiden puhdistamiseksi ja liitetty niiden Eco RI*-tarttuvien päidensä kautta antamaan yhdistetty fragmentti (fragmentti C). Fragmentti C 5 liitetään nyt uuteen ekspressiosäätelysekvenssiin, kuten on sopivaa, suoran liitännän kautta oikean translaatio-faasin ylläpitämiseksi, 3'-hännänmuodostusmenetelmän mukaisesti, joka edellä selostettiin, tai synteettisten oli-gonukleotidiliittäjien kautta. Tämä liittäminen ei ainoas-10 taan käytä parempaa ekspressiosäätelysekvenssiä proteiini-tuotannon parantamiseksi, vaan se sallii myös HBcAg'tä koodaavan geenifragmentin liittämisen lähemmäksi itse ekspressiosäätelysekvenssiä siten tämän geenifragmentin eks-pressoitumisen säätelyn parantamiseksi. Samaan tapaan voi-15 daan liittää fragmentit A ja B' tai lukuisia muita valmistettuja fragmentteja ja niiden seurauksena saatuja fragmentteja kuten edellä. Tämä prosessi osoittaa, että ainoastaan osa rakennegeenistä, joka koodaa jotakin tiettyä polypeptidiä, on tarpeen käyttää tämän keksinnön yhdistel-20 mä-DNA-molekyyleissä.
Välimatkan edelleen lyhentämiseksi tietyn ekspres- siosäätelysekvenssin ja valitun geenifragementin aloitus- kodonin välillä voidaan tiettyjä fragmenttia lievästi käsitellä nukleaasien yhdistelmällä, joka toimii spesifises-25 ti päätteessään tai sen lähellä tai jota käytetään ekso-nukleaasi- ja polymeraasi-sidotuissa korjausreaktioissa fragmenttien aloituskodonia edeltävän fragmentin nukleotidien joidenkin tai kaikkien poistamiseksi. Vaihtoehtoisesti voitaisiin fragmentti, kuten Alu I-fragmentti, joka 30 on saatu pilkonnasta nukleotideissä -26 ja 30, samalla tavalla lyhentää eksonukleaasikäsittelyllä tai polymeraa-si-sidoskorjausreaktioin ja sitten pilkkoa Eco Rl*:11a antamaan fragmentti nukleotidien -26 ja 1 ja nukleotidin 22 väliltä sallimaan fragmentin B yhdistäminen ennen liit-35 tämistä ekspressoinnin säätelysekvenssiin. Vielä eräs tie 29 8 6 4 3 7 saattaisi käsittää fragmentin B tai samanarvoisen fragmentin hybridisoinnin sopivaan yksisäikeiseen malliin emä-yhdistelmä-DNA-molekyylistä jatkamista varten sarjassa reaktioita DNA-polymeraasin ja rajoitetun määrän nukleo-5 siditrifosfaattien kanssa, niin että fragmenttisäie voi taisiin konstruoida uudelleen koodaussekvenssin alkuun. Mallisäie pilkottaisiin silloin yhdistämiskohdassaan pidennettyyn fragmenttisäikeeseen endonukleaasilla SI ja näin saatu fragmentti liitettäisiin ekspressoinnin sääte-10 lysekvenssiin.
Voidaan käyttää useita ekspressoinnin säätelysek-venssejä kuten edellä selostettiin. Näitä ovat E. coli:n laktoosi-operonin operaattori, promoottori ja ribosomia sitovat ja vuorovaikutussekvenssit (käsittää sellaisia 15 sekvenssejä kuin Shine-Dalgarno-sekvenssit) ("lac-systee- mi"), E. coli tryptofaanisynteesisysteemiä vastaavat sekvenssit ( "trp-systeemi"), faagin λ (0LPL ja 0RPj) operaattori- ja promoottori-alueet sekä faagi-fd-päällystepro-teiinin säätelyalue. Näitä sekvenssejä sisältävät DNA-20 fragmentit leikataan pilkkomalla restriktioentsyymeillä DNA:sta, jotka on eristetty siirtyvistä faageista, joilla on lac- tai trp-operoneja, tai faagin λ tai fd DNA: sta. Näitä fragmentteja käsitellään sitten HBV-antigeeni-sek-.·*·. vensseille esitetyllä tavalla rajoitetun molekyyli-popu- 25 laation saamiseksi niin, että olennaiset säätelysekvenssit 111 voidaan liittää hyvin läheisesti tai rinnakkaisasemaan halutun antigeenin koodaussekvenssin aloituskodonin kanssa kuten edellä fragmentille C selostettiin.
Fuusiotuote liitetään sitten kuten edellä kloo-30 nausvälineeseen sopivien isäntien transformointia varten ja antigeenituotanto mitataan radioimmunoanalyyttisesti solujen liuottamisen jälkeen. Solut, jotka antavat tehok-_··*_ kaimman ekspressoinnin, voidaan täten valita. Vaihtoehtoi sesti voidaan käyttää kloonausvälineitä, joissa on lac-, : V 35 trp- tai λ -PL-säätelyjärjestelmä liittyneenä aloituskodo- 30 86437 niin, ja yhdistää fragmenttiin, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys niin, että rakennegeenifragmentti on oikein translatoitu kloo-nausvälineen aloituskodonista.
5 Samalla kun nämä kokeet ovat kohdistuneet erityi sesti HBV-ydinantigeenin tuottamiseen, ne ovat käytettävissä parantamaan muiden geenien, kuten HBsAg- ja HBeAg-geenien ja niiden fragmenttien ekspressoitumista.
Näiden tiettyjen antigeenien lisäparannukset solu-10 saannossa riippuvat solussa hyväksi käytettävien geenien lukumäärän lisäyksestä. Tähän on valaisemistarkoituksissa päästy liittämällä yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka on rakennettu edellä kuvatulla tavalla, keskinkertaiseen bakteriofagiin λ (NM989), yksinkertaisimmin uuttamalla plas-15 midia restriktioentsyymillä, esim. Eco Rl:11a tai Hind III:11a antamaan suoraketjuinen molekyyli, joka sitten sekoitettiin pilkotun λ-faagi-kloonausvälineen kanssa (esim. joka on N.E. Murray'n et ai. tyyppiä. "Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in Vitro Recom-20 binants", Molec. gen. Genet., 150, sivut 53-61 (1977) ja N.E. Murray et ai., "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4", J ♦ Mol. Biol., 132, sivut 493-505 (1979)), ja tuotettu DNA-molekyyli on saatu inkuboimalla DNA-ligaasilla. Tällainen prosessi on kuvattu 25 kuvassa 11. Haluttu yhdistelmäfaagi valikoitiin sitten radioimuunianalyysillä tietyn antigeenin suhteen tai hyb-ridisoimalla radioaktiivisesti merkatuilla HBV DNA-sek-vensseillä ja sitä käytettiin E. coli:n isäntäkannan lyso-genoimiseen.
30 Erityisen käyttökelpoiset λ -kloonausvälineet si- : sältävät lämpötilaherkän mutaation repressiogeenissä cl ja vaimentuvia mutaatioita geenissä S, jonka tuote on tarpeen isäntäsolun liuottamiseen, ja geenin E, jonka tuote on viruksen pääkapsidiproteiini. Tällä systeemillä lysogeeni-’.· 35 siä soluja kasvatetaan 32 °C:ssa ja kuumennetaan sitten 3i 8 6 437 45 eC:seen profaagin leikkautumisen aiheuttamiseksi. Pitkitetty kasvatus 37 °C:ssa johtaa antigeenin suurien määrien tuotantoon, joka säilyy solujen sisällä, koska näitä ei liuoteta faagi-geeni-tuotteilla normaalilla tavalla ja 5 koska faagi-geeni-insertio ei ole kapseloitu se pysyy käytettävissä transkriptiota varten. Solujen keinotekoinen liuottaminen vapauttaa sitten antigeenin suurella saannolla (kuva 11).
E. coli-systeemien lisäksi, joita nämä esimerkit 10 ovat pääasiallisesti koskeneet, voidaan samantyyppisiä käsittelyjä suorittaa antigeeni-tuotannon lisäämiseksi muissa mikrobisoluissa, kuten B. subtilis:issa tai termo-fiilisissä bakteereissa. B. subtilis'in tapauksessa plas-midi, jolla on determinantteja penisillinaasia varten, 15 joka on eristetty lajista B. lichenformis, antaa käyttökelpoisen ekspressiosäätelysekvenssin näitä tarkoituksia varten.
Esimerkki VII
HBsAg:lle määrityt geeni- ja aminohapposekvenssit 20 ovat käyttökelpoisia suunniteltaessa menetelmiä HBsAg:n geenin ekspressointia varten tämän keksinnön menetelmällä. Tällaista ekspressointia ei aikaisemmin havaittu isännissä, jotka oli transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyyleillä, jotka tuottivat polypeptidejä, joilla oli HBV-antigeeni-25 syys.
Kuvien 6-8 nukleotidisekvenssi esittää geeniä, joka koodaa HBsAg'tä nukleotidien 1437 ja 2114 välissä. Tämä geeni on eri translationaalisessa faasissa (lukukehys 3) kuin geeni, joka koodaa HBcAg'tä (lukukehys 1) kuvien 30 3-9 HBV-genomissa. Sen tähden valittiin yhdistelmä-DNA- molekyyli, joka ei tuottanut HBcAg'tä, kun sitä käytettiin transformoimaan sopivaa isäntää, vaan sisälsi n. 2350 nukleotidin HBV DNA-insertion (joka vastaa sekvenssin nukleotidejä n. -80 - 2270 kuvissa 3-8) käytettäväksi HBsAg-35 tuotannossa.
32 86437
Valittu yhdistelmä-DNA-molekyyli sisälsi muunmuassa kokonaisen geenin, joka koodaa HBsAg'tä. Tämän yhdistelmä-DNA-molekyylin HBV DNA-insertion nukleotidisekvenssin tar-kastelupaljastaa useita pilkontaendonukleaasikohtia, jotka 5 tekevät mahdolliseksi fragmenttien leikkaamisen, jotka sisältävät HBsAg'tä koodaavan geenin. Esimerkiksi, nukleotidi 1409 (Xho), nukleotidi 1410 (TAq), nukleotidi 1409 (Ava I) ja nukleotidi 1428 (Hha I) (kuva 6). Näistä viimemainittu (Hha I) on erityisen hyödyllinen, koska HBV 10 DNA-insertion pilkkominen tapahtuu nukleotidien 1430 ja 1431 välissä, leikkauksena ainoastaan kuusi nukleotidia ennen itse HBsAg-aloituskodonia (ATG). Kaikissa neljässä tapauksessa leikattu fragmentti ulottuu yli valitun HBV DNA-insertion kohteeseen tiettyä restriktioendonukleaasia 15 varten yhdistelmä-DNA-molekyylin pBR322-osan nukleotidi- sekvenssissä. Siten näiden restriktioendonukleaasien ja muiden samalla tavalla käyttökelpoisten vastaavien endo-nukleaasien käyttö yksin tai yhdessä sallii geenin, joka koodaa HBsAg'tä, leikkaamisen lähellä, mutta sen aloitus-20 kodonin edellä ja sen translationaalisen päätekodonin jälkeen. Tietenkin, on ymmärrettävä, että kuten on esitetty HBcAg-geenin tapauksessa tarvitsee itse asiassa käyttää vain ehyen geenin fragmentteja yhdistelmä-DNA-molekyyleis-sä tuottamaan polypeptidejä, joilla on HBsAg-antigeenisyys 25 sopivissa isännissä.
HBV DNA:n fragmentteja, jotka on kehitetty tällaisista uutoista, on käsitelty sarjassa reaktioita, jotka ovat analogisia niiden kanssa, jotka on selostettu geenille ja geenifragmenteille, jotka koodaavat ydinantigeeniä. 30 Esimerkiksi geenifragmentti voidaan liittää geeniin, joka koodaa pBR322:n penisilliiniresistenssiä (esim. Pst I-tunnistuskohta, kuva 2), joka tuottaa polypeptidiä, jolla ; on HBsAg-antigeenisyys yhdessä β-laktamaasin kanssa (peni- sillinaasigeenin tuote), geenifragmentti voidaan liittää 35 geenien väliin, jotka koodaavat penisilliiniresistenssiä 33 86437 ja tetrasykliiniresistenssiä pBR322:ssa (Eco Rl tai Hind ΙΙΙ-tunnistuskohdat, kuva 2) ja liittää siinä tai ennen insertiota lac-systeemiekspresslosäätelysekvenssiin aikaansaaden siten polypeptidi, jolla on HBsAg-antigeeni-5 syys liittyneenä lac-systeemin S-galaktosidaasiproteii-niin, jolloin geenifragmentti voidaan liittää kloonausvä-lineeseen niin lähelle valittua ekspressiosäätelysekvens-siä itseään kuin mahdollista, kuten on edellä kuvattu geenille, joka koodaa HBcAg'tä, tai geenifragmentti voidaan 10 muulla tavalla kloonata kuten tämän keksinnön mukaisesti on esitetty.
Valaisemistarkoituksessa yksi tällainen kaavio on kuvattu kuvassa 12. Siinä valittu yhdistelmä-DNA-molekyy-li, jossa oli HBV DNA-insertio (pHBV114), joka ulottui 15 nukleotidien -80 ja 2270 väliin (kuvat 3 - 8, fragmen-toitiin uuttamalla Hha 1:11a. Syntynyt fragmentti liitettiin 3'-hännänmuodostamismenetelmän mukaisesti, joka edellä kuvattiin, pBR322:n Pst I-kohtaan. Isännät, jotka oli transformoitu tällä yhdistelmä-DNA-molekyylillä, tuottivat 20 polypeptidejä, joilla oli HBsAg-antigeenisyys.
Myös muita fragmentteja (esim. Ava I, Tag, Xho tai Pst I (osittaisuutto)) on liitetty Pst I-tunnistuskohtaan tai muihin kohtiin pBR322:ssa yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia polypeptidien ·' 25 tuottamiseen, joilla on HBsAg-antigeenisyys tai geenifrag-menttien tuottamiseksi, jotka koodaavat HBsAg'tä. Lisäksi tällaisia geeni-osasia on liitetty pBR322:een, joka oli pilkottu Pst I:llä ja syntynyt fragmentti geenistä, joka koodaa penisillinaasia, leikattiin sitten eroon kodonista, ·: 30 joka koodaa penisillinaasin eli β-laktamaasin aminohappoa 182 yhdessä tapauksessa kodoniin, joka koodaa aminohappoa 32, ja toisessa tapauksessa kodoniin, joka koodaa tämän polypeptidin aminohappoa 13. Näitä pBR322-Pst-I:n johdos-plasmideja on myös käytetty HBsAg-geenifragmenttien kans-V 35 sa, jotka ulottuivat nukleotideistä 1447 1796:een asti 34 86437 (kuvat 6-7) tuottamaan polypeptidejä, joilla on HBsAg-antigeenisyys.
Nukleotidisekvenssi nukleotidien 948 ja 1437 välissä, edeltäen välittömästi rakennegeeniä, Joka koodaa 5 HBsAg'tä, voidaan myös sisällyttää fragmentteihin, joita käytetään käyttökelpoisten yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseen polypeptidien valmistamiseksi, joilla on HBsAg-antigeenisyys, ja HBsAgrn rakennegeenin geenifrag-menttien. Tätä nukleotidisekvenssiä nimitetään geenin pre-10 kursorisekvenssiksi. Geenifragmentteja, jotka sisältävät sekä tämän prekursorisekvenssin että rakennegeenin HBsAg-:tä varten, voidaan leikata Alu I:lla (nukleotidi 939), Hha 1:11a (nukleotidi 900) ja Hae II:11a (nukleotidi 899). Alu I:n ja Hha I:n osittainen uutto ja syntyneiden frag-15 menttien erottaminen, esim. geelielektroforeesilla, on tarpeen, koska tunnistuskohtia näille entsyymeille esiintyy myös prekursorisekvenssissä nukleotidissä 1091 Alu I:tä ja nukleotidissä 1428 Hha II:ta varten.
Yleistä 20 Polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys ja ra- kennegeenejä ja fragmentteja, jotka koodaavat näitä, voidaan käyttää menetelmissä ja sarjoissa, jotka on tehty HBV-vasta-aineiden läsnäolon havaitsemiseksi ihmisissä ja siten tunnistamaan ihmiset ja verinäytteet, jotka ovat ·"’ 25 tämän viruksen tartuttamia.
Esimerkiksi HBcAg'tä, joka on tuotettu tämän kek-. : sinnön yhdistelmä-DNA-molekyyleillä transformoiduilla "·· isännillä, voidaan käyttää nykyisin käytettävissä olevissa immunologisissa diagnostisissa testeissä hepatitis B-vi-\: 30 ruksen havaitsemiseen, eli radioimmunonmäärityksessä tai ELISA:ssa (entsyymisidottu immuunosorbenttimääritys). Eräässä radioimmuniomääritystyypissä anti-ydinantigeeni-vasta-aine tuotetaan laboratorioeläimessä, kiinnitetään kiinteään faasiin, esimerkiksi koeputken sisäpinnalle. 35 HBcAg lisätään sitten putkeen niin, että se sitoutuu vas- 35 86437 ta-aineen kanssa. Antigeeni-vasta-ainekompleksilla päällystettyyn putkeen lisätään näyte potilaan seerumista yhdessä tunnetun määrän kanssa HBV anti-ydin-vasta-ainetta, joka on merkattu radioaktiivisella isotoopilla, kuten ra-5 dioaktiivisella jodilla. Kaikki HBV-vasta-aineista potilaan seerumista kilpailevat merkatun vasta-aineen kanssa vapaista sitoutumiskohdista antigeeni-vasta-ainekomplek-silla. Kun seerumin on annettu olla vuorovaikutuksessa, ylimäärä-neste poistetaan koeputki pestään ja radioaktii-10 visuus mitataan. Positiivinen tulos, ts. potilaan seerumi sisältää HBV-vasta-ainetta, käy ilmi matalasta radioaktiivisesta lukemasta. Yhdessä ELISA-tyyppisessä testissä mik-rotiitterilevy päällystetään HBcAg:lla ja tähän lisätään näyte potilaan seerumista. Inkubointijakson jälkeen, joka 15 sallii kaikkien vasta-aineiden vuorovaiktuksen antigeenin kanssa, levy pestään ja lisätään valmiste, jossa on anti-ihmisvasta-aineita, jotka on aikaansaatu laboratorioeläi-messä ja jotka on sidottu entsyymileimaan, inkuboidaan antamaan reaktion tapahtua ja levy pestään uudelleen. 20 Senjälkeen entsyymisubstraatti lisätään mikrotiitterile-vylle ja inkuboidaan ajanjakso, joka sallii entsyymin vaikuttaa substraattiin ja lopullisen valmisteen adsorbtio mitataan. Suuri muutos adsorbtiossa osoittaa positiivista .··*. tulosta.
25 Esimerkeissä I, II, III ja IV selostettujen mene telmien mukaisesti valmistetut mikro-organismit ovat esimerkinomaisesti tallennettu viljelminä kokoelmaan Culture Collection of the Microbiological Research Establishment at Porton Down, 15.12.1978 ja nimetty pBR322-HBV-A-F:ksi. 30 Spesifisesti näiden viljelmien tunnusmerkit ovat: A: E. coll HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Kpn I dC: :·!·. Tet* Amps HBV* VA* B: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bam HI dC: "·’ TetR Amps HBV* VA* 36 86437 C: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bgl II dC:
TetR Amp3 HBV* D: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Eco RI dC:
TetR Amp3 HBV+ 5 E: E. coli HB 101/pBR322-Bam HI:HBV-Bam HI:
Tets Amp” HBV+ F. E. coli HB 101/pBR322-Eco RI:HBV-Eco RI:
TetR Amp” HBV* Näytteitä näistä identtisistä viljelmistä on myös 10 talletettu kokoelmaan Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Skotlanti 19.12.1979 talletusnumeroilla NCIB 11548 - 11553.
Mikro-organismeista, jotka on valmistettu esimerkeissä V, VI ja VII selostetuin menetelmin, on esimerkkei-15 nä viljelmät, jotka on talletettu kokoelmaan Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Skotlanti, 19.12.1979 ja tunnistettu pBR322-HBV G-L:na (NCIB 11554 - 11560 ja luonnehdittu seuraavasti: G: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Kpn I dC: 20 (tämän jälkeen "pHBV114"): TetR Amps HBV* H: E. COli HB 101/pBR322-Pst I':pHBV114-Pst I:
TetR Amp3 HBV* VA* I: E. coll HB 101/(pBR322-Eco Rl, Bam HI:lac promoottori-. ··. sekvenssi)-Hind III liittäjät: pHBV114-Hha I, BamHI: 25 Tet3 AmpR HBV* VA* J: E. coll HB 101/pUR2*-Eco Rl: pHBV114-Hha I Eco Rl liittäjät:
Tets AmpR HBV* VA* K: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:pHBVH4-Ava I dC:
TetR Amp3 HBV* VA* 30 L: E.coli HB 101/pBR322-Pst I dG:pHBV114-Taq dC:
TetR Amp3 HBV* VA* * pBR322:n johdannainen, jossa on DNA-sekvenssi, ··· joka käsittää geenin, joka koodaa polypeptidille tetrasyk- liini-resistenssin, korvattuna pienellä määrällä DNA-sek-35 venssiä, joka sisältää E. coli lac-systeemin.
37 86 437
Edellä esitetty viljelmien nimistö on selostus viljelmästä seuraavasti: isäntä/kloonausväline - pilkontakoh-ta kloonausvälineessä osoittaen nukleotidin pidentyminen (jos on): hepatitis B-virus-pilkontakohta hepatitis B-vi-5 ruksessa osoittaen pidentymistä (jos on): resistenssi (R) tai herkkyys (S) tetrasykliinille (Tet) ja ampisilliinille (Amp), positiivinen hybridisaatio HBV DNA:n kanssa pesäke-hybridisaatiotestissä, supra, (HBV*) ja polypeptidin, jolla on HBV-antigeenisyys, tuotanto, supra, (V^). Tätä ni-10 mistöä käyttäen viljelmä pBR322-HBV-A E. coli HB 101 merkitsee viljelmää, joka sisältää plasmidina yhdistelmä-DNA-molekyylin, jossa on PBR322, joka on pilkottu Pst I-koh-dassa ja pidennetty polydC-hännällä 3'-päätteessä, joka on liittynyt HBV DNA, joka on pilkottu Kpn I:lla ja pidennet-15 ty polydC-hännällä 3'-päätteessään, jolloin viljelmä on resistentti tetrasykliinille, herkkä ampisilliinille, on positiivinen HBV DNA-hybridisaatiotestille ja tuottaa po-lypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys.
Tietenkin on ymmärrettävä, että tämän keksinnön 20 hybridimikro-organismit, yhdistelmä-DNA-molekyylit ja po-lypeptidit sekä menetelmät, jotka soveltuvat niihin, eivät rajoitu edellä selostettuihin edullisiin suoritusmuotoihin. Sen sijaan hybridi-organismeja, yhdistelmä-DNA-mole-kyylejä ja polypeptidejä voidaan modifioida valmistuksen 25 aikana tai sen jälkeen tunnetuin menetelmin hyvää tulosta varten. Esimerkiksi, tehokkaampia ekspressiosäätelysek-venssejä voidaan käyttää HBV-geenien transkriptiota tai hybridigeenejä, mutaatioita varten ei-toivottujen geeni-tuotteiden syntetisoitumisen pienentämiseksi, proteaasi-: 30 määriä isäntäsoluissa voidaan alentaa, lämpöindusoitavat lysogeenit, jotka sisältävät HBV-geenejä, voidaan yhdistää isäntäkromosoomiin tai muita modifiointeja ja menetelmiä voidaan toteuttaa geenikopioiden lukumäärän lisäämiseksi solussa tai solujen tuottavuuden lisäämiseksi haluttujen 35 polypeptidien valmistuksessa. Sen lisäksi, että näitä käy- 38 86437 tetään polypeptidien tuottamiseen, joilla on HBV-antigee-nisyys, tämän keksinnön hybridi-mikro-organismit ovat käyttökelpoisia myös suurien DNA-määrien tuottamiseen, jotka sisältävät kaiken tai osan genomista hepatitis B-5 virusta varten. Esimerkiksi amplifikaatio esim. lisäämällä kloramfenikolia kasvualustaan, kun solutiheys on saavuttanut sopivan tason, tai mutaatioiden käyttö hajoamisen estämiseksi bakteriofagi-hybrideissä, jotka sisältävät HBV-sekvenssejä, sallii HBV DNA:n valmistuksen määrissä, 10 joita aikaisemmin ei voitu tavoittaa.
Samalla kun tässä edellä on esitetty joukko tämän keksinnön suoritusmuotoja, on ilmeistä, että keksinnön perusrakennetta voidaan muuttaa antamaan muita suoritusmuotoja, joissa tämän keksinnön prosessia käytetään hyväk-15 si. Sentähden on selvää, että tämän keksinnön piiri määritellään oheisilla patenttivaatimuksilla eikä tässä esimerkinomaisesti edellä esitetyillä spesifisillä suoritusmuodoilla.

Claims (8)

1. Menetelmä ainakin yhden polypeptidin tuottamiseksi, jolla on hepatitis B-virusantigeenin antigeenisyys, 5 tunnettu siitä, että a) viljellään bakteeri-isäntää, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyylillä, jossa on DNA-sekvenssi, joka DNA-sekvenssi on toimivasti liittynyt mainitun yhdis-telmä-DNA-molekyylin ekspressiosäätelysekvenssiin ja joka 10 koodaa vähintään yhtä polypeptidiä, jolla on HBV-antigee-nisyys ja joka on valittu polypeptideistä, joilla on kaava (i) MetGluAsnlleThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGln AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglleLeuThrlleProGlnSerLeu AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCys
15 LeuGlyGlnAsnSerGlnSerProIleSerAsnHisSerProThrSer CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe IleilePheLeuPhelleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuVal LeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuIleProGly SerSerThrThrSerThrGlySerCysArgThrCysThrThrProAla 20 GlnGlylleSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAsp GlyAsnCysThrCysIleProIleProSerSerTrpAlaPheGlyLys PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeu ValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProIleValTrpLeu SerVallleTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlle - 25 LeuSerProPheLeuProLeuLeuProllePhePheCysLeuTrpAla Tyrlle, jolla on HBV-pinta-antigeenin antigeeninen spesifisyys (ii) MetAspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu-SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp : 30 ThrAlaAlaAlaLeuTyrArgAspAlaLeuGluSerProGluHisCys • -·. SerProHisHisThrAlaLeuArgGlnAlalleLeuCysTrpGlyAsp LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyThrAsnLeuGluAspProAla SerArgAspLeuValValSerTyrValAsnThrAsnValGlyLeuLys PheArgGlnLeuLeuTrpPheHisIleSerCysLeuThrPheGlyArg 35 GluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrpIleArgThr 40 86437 ProProAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuSerThrLeuPro GluThrThrValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThr ProSerProArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgaArgArgSer GlnSerArgGluSerGlnCys, jolla on HBV-ydinantigeenin 5 antigeeninen spesifisyys ja (iii) niiden fragmenteista, joilla on HBV-antigeenisyys; ja b) eristetään polypeptidi transformoidun bakteeri-isännän viljelystä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, valitaan Dane-hiukkasen endogeenisestä DNA:sta, sen fragmenteista, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys, 15 ja niiden synteettisesti valmistetuista ekvivalenteista, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on HBV-antigeenisyys.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri-isäntä on valittu 20 coli- kannoista.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me-netelmä, tunnettu siitä, että ekspressiosäätely- . ·*. sekvenssi on lac-systeemi.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen rae- 25 netelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, jo- ;; ka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, on DNA-sekvenssi, jolla on kaava ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTC GTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTACGAGATCTTCTAGATACCG 30 CCGCAGCTCTGTATCGGGATGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCT CACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGAGACTTAATGAC - ‘ ·, TCTAGCTACCTGGGTGGGTACTAATTTAGAAGATCCAGCATCTAGGGACC TAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATGTGGGCCTAAAGTTCAGACAATTA *: · TTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACGGTTCTAGA ’** 35 GTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGA 4i 86437 CCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACGCTTCCGGAGACTACTGTTGTTAG ACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAA GATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGT tai sen fragmentti, joka koodaa polypeptidiä, joilla on 5 HBV-antigeenisyys.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on HBV-antigeenisyys, on DNA-sekvenssi, jolla on kaava
10 ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGC GGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACT CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGC CAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCC AACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCC 15 TCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAT CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAG CACGGGATCCTGCAGAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGAATCTCTATGT ATCCCTCCTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGATGGAAACTGCACCTGTATT CCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTC 20 AGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCG TAGGGCTTTCCCCCATTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTAT ____: TGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACC AATTTTCTTTTGTCTTTGGGCATACATT tai sen fragmentti, joka koodaa polypeptidiä, jolla on 25 HBV-antigeenisyys.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-molekyyli on valittu yhdistelmä-DNA-molekyyleistä, jotka sisältyvät transformoituihin E. coli HB 101-kantoihin, 30 joilla on talletusnumero NCIB 11548, 11549, 11555, 11556, 11557, 11558, 11559 ja 11560.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu isäntä on transformoitu E. coli HB 101-kanta, jolla on talle- 35 tusnumero NCIB 11548, 11549, 11555, 11556, 11557, 11558, ; 11559 tai 11560. « 86437
FI794001A 1978-12-22 1979-12-20 Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. FI86437C (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB7849907 1978-12-22
GB7849907 1978-12-22
GB7850039 1978-12-27
GB7850039 1978-12-27
GB7937910 1979-11-01
GB7937910 1979-11-01

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI794001A FI794001A (fi) 1980-06-23
FI86437B true FI86437B (fi) 1992-05-15
FI86437C FI86437C (fi) 1992-08-25

Family

ID=27260648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI794001A FI86437C (fi) 1978-12-22 1979-12-20 Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen.

Country Status (25)

Country Link
US (1) US4710463A (fi)
EP (2) EP0374869A1 (fi)
JP (5) JP2530801B2 (fi)
AT (1) ATE26127T1 (fi)
AU (1) AU539535B2 (fi)
BR (1) BR7908410A (fi)
CY (1) CY1422A (fi)
DD (1) DD147855A5 (fi)
DE (3) DE2967652D1 (fi)
DK (2) DK171727B1 (fi)
ES (1) ES487106A0 (fi)
FI (1) FI86437C (fi)
GR (1) GR73675B (fi)
HK (2) HK26688A (fi)
IE (1) IE53176B1 (fi)
IL (1) IL59007A (fi)
IN (1) IN151589B (fi)
LU (4) LU88257I2 (fi)
MX (1) MX9202875A (fi)
NL (2) NL930013I1 (fi)
NO (2) NO794196L (fi)
NZ (1) NZ192465A (fi)
PT (1) PT70626B (fi)
SG (1) SG60387G (fi)
YU (1) YU44186B (fi)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
US6268122B1 (en) * 1978-12-22 2001-07-31 Biogen, Inc. Recombinant DNA molecules and their method of production
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
USRE34705E (en) * 1979-08-30 1994-08-23 Institut Pasteur Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
FR2480780B1 (fr) * 1980-04-22 1985-12-06 Pasteur Institut Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn
EP0038765B1 (fr) * 1980-04-22 1987-09-02 Institut Pasteur Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin
FR2495636B2 (fr) * 1980-12-09 1989-10-06 Pasteur Institut Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un fragment d'adn circulaire du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn
FI83662C (fi) * 1980-07-17 1991-08-12 Scripps Clinic Res Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning.
US5145782A (en) * 1980-12-08 1992-09-08 The Regents Of The University Of California DNA expression vector suitable for direct expression of a foreign gene
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
EP0062286A1 (en) * 1981-03-31 1982-10-13 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Diagnostic test for hepatitis B virus
US5332664A (en) * 1981-07-15 1994-07-26 Celltech Limited Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
US4769238A (en) 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
ATE53235T1 (de) * 1981-08-04 1990-06-15 Univ California Synthese von menschlichen viralen antigenen mit hilfe von hefe.
GR76274B (fi) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
US4803164A (en) * 1981-08-31 1989-02-07 Genentech, Inc. Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast
ZW18282A1 (en) 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
NZ201705A (en) * 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
AU8746582A (en) * 1981-09-02 1983-03-10 Biogen N.V. Hepatitis b virus e type antigen
JPS5890517A (ja) * 1981-11-24 1983-05-30 Japan Found Cancer Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を合成する新規な組換え体及びその製法
US4741901A (en) * 1981-12-03 1988-05-03 Genentech, Inc. Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
US7767449B1 (en) * 1981-12-24 2010-08-03 Health Research Incorporated Methods using modified vaccinia virus
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4762708A (en) * 1982-02-18 1988-08-09 University Patents, Inc. Materials and methods for herpes simplex virus vaccination
AU1678783A (en) * 1982-07-20 1984-01-26 Molecular Genetics, Inc. Production of herpes simplex viral proteins
IL69202A (en) * 1982-09-08 1991-08-16 Smith Kline Rit Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof
US4820642A (en) * 1983-04-04 1989-04-11 The Regents Of The University Of California Amplified expression vector
GB8321789D0 (en) * 1983-08-12 1983-09-14 Biogen Nv Vaccines and compositions against hepatitis
FR2560890B1 (fr) * 1984-03-07 1987-10-16 Grp Genie Genetique Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention
AU579148B2 (en) * 1984-03-09 1988-11-17 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants
US5683688A (en) * 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
IL75318A (en) * 1984-05-31 1994-08-26 Genentech Inc Recombinant human memotoxin and methods for its recombinant production
EP0171908A3 (en) * 1984-07-11 1987-07-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof
US4769239A (en) * 1984-08-21 1988-09-06 Merck & Co., Inc. Vaccine against varicella-zoster virus
US9328391B1 (en) * 1984-08-22 2016-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cloning and expression of HIV-1 DNA
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
JPS6170989A (ja) * 1984-09-13 1986-04-11 Takeda Chem Ind Ltd 組み換えｄｎａおよびその用途
JPS6226300A (ja) * 1984-10-10 1987-02-04 セントコ−・インコ−ポレ−テツド Ｈｔｌｖ−３ｄｎａのクロ−ニングおよび発現
GB8431171D0 (en) * 1984-12-11 1985-01-23 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5853978A (en) * 1985-12-04 1998-12-29 Genentech, Inc. Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use
JPS61233700A (ja) * 1984-12-24 1986-10-17 ジエネンテク，インコ−ポレイテツド 分子クロ−ンされたエイズ関連ポリペプチド
US6534285B1 (en) 1984-12-24 2003-03-18 Genentech, Inc. Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use
FI861417A0 (fi) * 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
JPH084507B2 (ja) * 1985-10-03 1996-01-24 武田薬品工業株式会社 新規ｄｎａおよびポリペプチド
JPS62236496A (ja) * 1986-04-07 1987-10-16 Green Cross Corp:The ＨＢｓＡｇの製造方法
CA1310602C (en) * 1986-06-03 1992-11-24 Hajime Horii Yeast promoter and process for preparing heterologous protein
ES2061500T5 (es) * 1986-06-17 2003-05-16 Chiron Corp Diagnosis y vacunas de la hepatitis delta, su preparacion y uso.
JPS63214181A (ja) * 1986-07-23 1988-09-06 ベ−リングベルケ、アクチエンゲゼルシャフト ヒト・パピロ−マ・ウイルス１８型の発現生成物、これらのタンパク質に特異的な抗体およびこれらの抗体または対応するｄｎａを含む診断助剤
US4818688A (en) * 1986-11-21 1989-04-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Assays for antibody to hepatitis B core antigen
NZ219515A (en) * 1987-02-10 1989-09-27 Wellcome Found Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope
DE286239T1 (de) * 1987-03-10 1994-02-24 New England Biolabs Inc Herstellung und Reinigung eines Proteins, das mit einem Bindungsprotein fusioniert ist.
WO1988010300A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
US4880750A (en) * 1987-07-09 1989-11-14 Miragen, Inc. Individual-specific antibody identification methods
EP0402354A4 (en) * 1987-08-10 1991-03-20 The University Of Melbourne Molecular cloning of human rotavirus serotype 4 gene 9 encoding vp7, the major outer capsid neutralisation specific glycoprotein and expression of vp7 and fragments thereof for use in a vaccine
EP0311228A3 (en) * 1987-10-09 1990-05-02 Repligen Corporation Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus
JP2791418B2 (ja) 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
DE4107612A1 (de) * 1991-03-09 1992-09-10 Behringwerke Ag Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen
US5175094A (en) * 1991-08-01 1992-12-29 Becton Dickinson And Company Increased expression of HBcAg
US5175272A (en) * 1991-08-01 1992-12-29 Becton Dickinson And Company DNA sequences with increased expression of HBcAg
US5173427A (en) * 1991-08-01 1992-12-22 Becton Dickinson And Company Vectors and hosts with increased expression of HBCAG
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US6607727B1 (en) 1991-08-26 2003-08-19 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus
US6297048B1 (en) 1992-02-04 2001-10-02 Chiron Corporation Hepatitis therapeutics
EP0591548A4 (en) * 1992-03-30 1999-04-28 Suntory Ltd Anti-hbs antibody gene and expression plasmid thereof
US6235288B1 (en) 1992-08-26 2001-05-22 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
FR2711670B1 (fr) * 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
US5726011A (en) * 1994-03-31 1998-03-10 Virginia Commonwealth University Method for diagnosing chronic hepatitis B virus infection
WO1996017951A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Rpms Technology Limited Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms
US5993820A (en) * 1996-11-12 1999-11-30 Michigan State University Chimeric LTB vaccines
US20030100520A1 (en) * 1997-01-21 2003-05-29 Philip Needleman Immunological process and constructs for increasing the hdl cholesterol concentration by dna vaccination
GB9712370D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
CZ302092B6 (cs) 1998-02-12 2010-10-06 Immune Complex, Corporation Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, jeho cástice, inokulum a zpusob indukce protilátek
CA2325560A1 (en) * 1998-04-14 1999-10-21 Chiron Corporation Noncloning technique for expressing a gene of interest
DK1108034T3 (da) * 1998-09-04 2008-11-10 Emergent Product Dev Uk Ltd Svækkede salmonella SPI2-mutanter som antigenbærere
WO2000032625A1 (en) 1998-12-04 2000-06-08 Biogen, Inc. Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
EP1230257A4 (en) * 1998-12-23 2003-08-13 Thompson Boyce Plant Res EXPRESSION OF IMMUNOGENOUS HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN TRANSGENIC PLANTS
GB9910812D0 (en) * 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
US6268178B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Phage Biotechnology Corp. Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides
GB0008419D0 (en) * 2000-04-05 2000-05-24 Bioinvent Int Ab A method for invitro molecular evolution of antibody function
GB0008966D0 (en) * 2000-04-13 2000-05-31 Imp College Innovations Ltd Vectors for gene therapy
US7001760B2 (en) * 2000-04-20 2006-02-21 Wang-Schick Ryu Hepatitis B virus vectors for gene therapy
US6583279B1 (en) 2001-01-26 2003-06-24 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of hepatitis B virus
US7202354B2 (en) 2001-03-30 2007-04-10 Abbott Laboratories Hepatitis B virus surface antigen mutant and methods of detection thereof
GB0217033D0 (en) 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
US8876532B2 (en) 2002-07-31 2014-11-04 Dentsply International Inc. Bone repair putty
GB0226105D0 (en) * 2002-11-08 2002-12-18 St Georges S Entpr Ltd Pain relief agents
GB0304993D0 (en) * 2003-03-05 2003-04-09 Univ Nottingham Trent Novel screening method
BRPI0408779A (pt) * 2003-03-26 2006-04-04 Wyeth Corp uso de composições, composição imunogênica e kit
EP1702069A2 (en) * 2004-01-05 2006-09-20 EMD Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
GB0420091D0 (en) * 2004-09-10 2004-10-13 Univ Nottingham Trent Medical implant materials
US20060193849A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
GB0514661D0 (en) * 2005-07-16 2005-08-24 Medical Res Council Methods
JP4352032B2 (ja) 2005-08-23 2009-10-28 シャープ株式会社 携帯通信機器
EP1806359B1 (en) 2005-09-05 2010-03-17 Immatics Biotechnologies GmbH Tumor-associated peptides binding promiscuously to human leukocyte antigen (HLA) class II molecules
ATE440107T1 (de) 2005-09-05 2009-09-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassoziierte peptide, die hla klasse i oder ii-moleküle binden, und anti-tumor impfstoffe
GB0519398D0 (en) * 2005-09-23 2005-11-02 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
GB0607354D0 (en) * 2006-04-12 2006-05-24 Bioinvent Int Ab Agent, Composition And Method
GB0607798D0 (en) * 2006-04-20 2006-05-31 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and use thereof
CN101657720A (zh) * 2006-05-31 2010-02-24 荷兰联合利华有限公司 筛选改变皮肤和/或头发色素沉着的化合物的方法
KR100836745B1 (ko) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 Ｈｂｖ 백신 및 그의 제조 방법
SI2660248T1 (sl) 2007-07-27 2015-10-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija proti možganskim tumorjem
EP2562182B1 (en) 2007-07-27 2015-10-07 Immatics Biotechnologies GmbH Novel immunogenic epitopes for immunotherapy
RU2506275C2 (ru) 2007-11-01 2014-02-10 Астеллас Фарма Инк. Иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты
EP2215473A1 (en) * 2007-11-27 2010-08-11 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Screening methods
CN102851313B (zh) * 2008-01-28 2015-01-28 多贝尔有限公司 一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺
SI2105501T1 (sl) 2008-03-27 2015-12-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija proti nevronalnim in možganskim tumorjem
DK2119726T5 (en) 2008-05-14 2018-03-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel and powerful MHC class II peptides derived from survivin and neurocan
US8703153B2 (en) 2008-06-16 2014-04-22 Prokarium Ltd. Salmonella vectored vaccines against Chlamydia and methods of use
RS53782B1 (en) 2008-10-01 2015-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES PREPARED AND ANTI-CHANGE RESPONSE FOR GLIOBLASTOMA (GBM) AND OTHER CANCER TREATMENTS
GB0905790D0 (en) 2009-04-03 2009-05-20 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and use thereof
EP2513146B1 (en) 2009-12-18 2017-05-03 Kancera AB Antibodies against ror1 capable of inducing cell death of cll
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201019331D0 (en) 2010-03-19 2010-12-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Methods for the diagnosis and treatment of cancer based on AVL9
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
US9452212B2 (en) 2011-04-14 2016-09-27 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for eliciting an immune response against hepatitis B virus
GB2490655A (en) 2011-04-28 2012-11-14 Univ Aston Modulators of tissue transglutaminase
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201219678D0 (en) 2012-11-01 2012-12-12 Benf Ab Ketone body inhibitors and uses thereof
CN105026419B (zh) 2013-03-01 2021-08-24 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 疫苗组合物定量
TWI777195B (zh) 2013-08-05 2022-09-11 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（三）
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
GB201411037D0 (en) 2014-06-20 2014-08-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL)
GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
IL254129B2 (en) 2015-03-27 2023-10-01 Immatics Biotechnologies Gmbh New peptides and a combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
PE20230321A1 (es) 2015-07-01 2023-02-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cancer de ovario y otros tipos de cancer
KR20180026758A (ko) 2015-07-06 2018-03-13 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 식도암 및 기타 암에 대한 면역요법에 사용하기 위한 펩티드 및 펩티드의 조합
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
GB201602918D0 (en) 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
MA54832A (fr) 2016-03-01 2021-12-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides, combinaison de peptides et médicaments à base de cellules destinés à être utilisés en immunothérapie contre le cancer de la vessie et d'autres cancers
DK3430030T3 (da) 2016-03-16 2024-01-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Transficerede t-celler og t-cellereceptorer til anvendelse i immunoterapi mod cancer
IL261787B2 (en) 2016-03-16 2023-03-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Nucleic acid-treated t-cells and receptor t-cells for use in immunotherapy against types of cancer
MY197258A (en) 2016-04-06 2023-06-08 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against aml and other cancers
TW202304970A (zh) 2016-08-26 2023-02-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架
MA47367B1 (fr) 2017-01-27 2023-06-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
WO2018189148A1 (en) 2017-04-10 2018-10-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers
CN111548405A (zh) 2017-04-10 2020-08-18 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物
WO2018189152A2 (en) 2017-04-10 2018-10-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers
WO2019007974A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Immatics Biotechnologies Gmbh NOVEL PEPTIDES AND COMBINATION OF PEPTIDES FOR USE IN IMMUNOTHERAPY OF LUNG CANCER, INCLUDING NSCLC, CPPC AND OTHER CANCERS
CR20210168A (es) 2017-07-07 2021-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de pulmón, incluyendo el nsclc, el sclc y otros cánceres
DE102018107224A1 (de) 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
TW202016131A (zh) 2018-05-16 2020-05-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於抗癌免疫治療的肽
US10925947B2 (en) 2018-06-29 2021-02-23 Immatics Biotechnologies Gmbh A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
TW202019955A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法
US11945850B2 (en) 2018-09-17 2024-04-02 Immatics Biotechnologies Gmbh B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
TW202024121A (zh) 2018-09-18 2020-07-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法
TW202039535A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法
DE102020125457A1 (de) 2020-09-29 2022-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
TW202229312A (zh) 2020-09-29 2022-08-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 由非ｈｌａ－ａ*０２顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物
TW202241925A (zh) 2021-01-15 2022-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於不同類型癌症免疫治療的ｈｌａ展示肽

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4102996A (en) * 1977-04-20 1978-07-25 Merck & Co., Inc. Method of preparing hepatitis B core antigen
US4241175A (en) * 1978-12-18 1980-12-23 Merck & Co., Inc. Assay for hepatitis B core antibody
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
FR2444713A1 (fr) * 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
JPH0612193B2 (ja) * 1985-08-23 1994-02-16 日立化成工業株式会社 給 湯 機
DE4326945C2 (de) * 1993-08-11 1996-10-24 Schott Glaswerke Regeleinrichtung für die Gaszufuhr zu einer Gaskocheinrichtung mit unter einer durchgehenden Kochfläche angeordneten Gasstrahlungsbrennern

Also Published As

Publication number Publication date
LU88257I2 (fi) 1994-02-03
AU5417079A (en) 1980-06-26
FI86437C (fi) 1992-08-25
US4710463A (en) 1987-12-01
NL930013I1 (nl) 1993-05-03
JPS6352883A (ja) 1988-03-07
JP2527438B2 (ja) 1996-08-21
ATE26127T1 (de) 1987-04-15
EP0374869A1 (en) 1990-06-27
SG60387G (en) 1988-09-23
JP2530801B2 (ja) 1996-09-04
DE2967697D1 (de) 1990-08-16
ES8105035A1 (es) 1981-05-16
NO861548L (no) 1980-06-24
EP0013828A1 (en) 1980-08-06
FI794001A (fi) 1980-06-23
IE53176B1 (en) 1988-08-17
HK26688A (en) 1988-04-22
IL59007A0 (en) 1980-03-31
EP0013828B2 (en) 1996-03-20
NL930012I1 (nl) 1993-05-03
JP2512746B2 (ja) 1996-07-03
JP2511961B2 (ja) 1996-07-03
DK171727B1 (da) 1997-04-14
NL930012I2 (nl) 1994-08-16
DK548079A (da) 1980-06-23
JPS6356292A (ja) 1988-03-10
PT70626A (en) 1980-01-01
YU312779A (en) 1984-02-29
PT70626B (en) 1983-01-10
DE182442T1 (de) 1988-08-11
YU44186B (en) 1990-04-30
IL59007A (en) 1983-11-30
IE792494L (en) 1980-06-22
NO794196L (no) 1980-06-24
BR7908410A (pt) 1980-09-09
AU539535B2 (en) 1984-10-04
JP2511962B2 (ja) 1996-07-03
GR73675B (fi) 1984-03-29
JPS6366129A (ja) 1988-03-24
CY1422A (en) 1988-09-02
ES487106A0 (es) 1981-05-16
HK14991A (en) 1991-03-15
EP0013828B1 (en) 1987-03-25
LU88258I2 (fi) 1994-02-03
LU88256I2 (fi) 1994-02-03
LU88259I2 (fi) 1994-02-03
DE2967652D1 (en) 1987-04-30
IN151589B (fi) 1983-05-28
JPS63159397A (ja) 1988-07-02
DK84194A (da) 1994-07-12
DD147855A5 (de) 1981-04-22
MX9202875A (es) 1992-06-30
NZ192465A (en) 1983-09-30
JPS55104887A (en) 1980-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86437B (fi) Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen.
US5436139A (en) Non-passageable virus
GB2034323A (en) Production of DNA Comprising B Hepatitis Viral Genome
EP0182442B1 (en) Recombinant dna molecules and their method of production
US4820642A (en) Amplified expression vector
JPH01160998A (ja) ポリペプチド
US6297355B1 (en) Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity
US4859465A (en) Vaccine capable of eliciting multivalent antibodies
JPH0543352B2 (fi)
US20010034018A1 (en) Hepatitis virus sentinel virus I (SVI)
CA1341644C (en) Recombinant dna molecules and their method of production
HRP940048A2 (en) Process for the preparation of polypeptides having the antigenicity or antigen specificity of hepatitis b viral antigens
FI95045B (fi) Menetelmä hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän proteiinin valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät yhdistelmä-DNA-vektorit ja -kontameerit sekä nisäkässolut
SI7913127A8 (sl) Rekombinantne dna molekule in postopek za njihovo proizvodnjo
AU769292B2 (en) Sentinel virus II
JPH0859695A (ja) 新規ｄｎａおよびポリペプチド
FI95726B (fi) Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia
HU196236B (en) Process for producing polypeptides showing hepatitis b virus antigenicity
BE890393A (fr) Acide desoxyribonucleique synthetique et procede pour l'obtenir
JPH0824581B2 (ja) 新規ＤＮＡ、それを含む微生物、それを含むδ感染の診断薬およびその用途
JPH0576382A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: BIOGEN, INC.