JPH01160998A - ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＨＩＶ−２ウィルスのエンベロープタンパク
質（ｅ ｎ ｖ）の少なくともひとつの抗原決定基およ
び／または免疫原決定基からなる新規なポリペプチド、
これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列を含有する組換えベクター、これらの組換
えベクターで形質転換された微生物、および組換えＤＮ
Ａ技術によるそれらの製造方法に関する。本発明はまた
、ヒト血清または他の生物学的体液中のＨＩＶ抗体（Ｈ
ＩＶ−２抗体またｌ；！ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗
体）またはＨＩＶウィルス（ＨＩＶ−２ウィルスまたは
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウィルス）の検出方法に関
する。
質（ｅ ｎ ｖ）の少なくともひとつの抗原決定基およ
び／または免疫原決定基からなる新規なポリペプチド、
これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列を含有する組換えベクター、これらの組換
えベクターで形質転換された微生物、および組換えＤＮ
Ａ技術によるそれらの製造方法に関する。本発明はまた
、ヒト血清または他の生物学的体液中のＨＩＶ抗体（Ｈ
ＩＶ−２抗体またｌ；！ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗
体）またはＨＩＶウィルス（ＨＩＶ−２ウィルスまたは
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウィルス）の検出方法に関
する。
１９８６年に、ＨＩＶ−２と命名された新しいウィルス
が西部アフリカのＡＩＤＳ患者から単離された（ｃｌａ
ｖｅｌら：５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２３３ ： ３４３
〜３４６．１９８６ ；Ｃ１ａｖｅｌら： Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２３４ ：６９１〜６９５．１９８６）。その
形態、リンパ向性およびＴ４陽性細胞に対するｉｎ ｖ
Ｈ＋ｏ細胞変性活性に基づいて、このウィルスはＡＩＤ
Ｓ原因ＨＩＶ−１ウィルスと関連づけられた。しかしな
がら、これらの類似性にもかかわらず、ＨＩＶ−１とＨ
Ｉ Ｖ−２の遺伝子の比較では、限られた配列ホモロジ
ーを示すにすぎなかった（Ｇｕｙａｄｅｒ ら：Ｎａｔ
ｕｒｅ、３２６ ： ６６２〜６６９．１９８７）。
が西部アフリカのＡＩＤＳ患者から単離された（ｃｌａ
ｖｅｌら：５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２３３ ： ３４３
〜３４６．１９８６ ；Ｃ１ａｖｅｌら： Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２３４ ：６９１〜６９５．１９８６）。その
形態、リンパ向性およびＴ４陽性細胞に対するｉｎ ｖ
Ｈ＋ｏ細胞変性活性に基づいて、このウィルスはＡＩＤ
Ｓ原因ＨＩＶ−１ウィルスと関連づけられた。しかしな
がら、これらの類似性にもかかわらず、ＨＩＶ−１とＨ
Ｉ Ｖ−２の遺伝子の比較では、限られた配列ホモロジ
ーを示すにすぎなかった（Ｇｕｙａｄｅｒ ら：Ｎａｔ
ｕｒｅ、３２６ ： ６６２〜６６９．１９８７）。
これまでに２０種以上の異なるＨＩＶ−２ウィルスが、
西部アフリカのＡＩＤＳ患者ならびにヨーロッパのＡＩ
ＤＳ患者から単離されている（Ｇｕｙｉｄｅｒら：前出
； Ｂｒｕｎ−Ｖｅｘｉｎｅｊら： Ｌａｎｃｅｔ。
西部アフリカのＡＩＤＳ患者ならびにヨーロッパのＡＩ
ＤＳ患者から単離されている（Ｇｕｙｉｄｅｒら：前出
； Ｂｒｕｎ−Ｖｅｘｉｎｅｊら： Ｌａｎｃｅｔ。
１．１２８〜１３２．１９８７）。これらのＡＩＤＳ患
者の血清はＨＩＶ−Ｉ ＥＬＩＳＡではすべて陰性で
あった（Ｂｒｕｎ−Ｖｅｘｉｎｅｌら：前出）。
者の血清はＨＩＶ−Ｉ ＥＬＩＳＡではすべて陰性で
あった（Ｂｒｕｎ−Ｖｅｘｉｎｅｌら：前出）。
したがって、ヒト血液および他の体液中のＨＩＶ−２ウ
ィルスを正確かつ迅速に診断する方法の必要性はきわめ
て高い。
ィルスを正確かつ迅速に診断する方法の必要性はきわめ
て高い。
したがって、ＨＩＶ−２ウィルスのエンベロープタンパ
ク質（ｅｎｖ）の少なくともひとつの抗原決定基および
／または免疫原決定基に相当するアミノ酸配列を有する
新規なポリペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造し
た。これらのポリペプチドは、ヒト血清または他の生物
学的体液中のＨＩ Ｖ−２抗体またはＨＩＶ−２ウィル
スもしくはそのフラグメントの検出を可能にする。
ク質（ｅｎｖ）の少なくともひとつの抗原決定基および
／または免疫原決定基に相当するアミノ酸配列を有する
新規なポリペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造し
た。これらのポリペプチドは、ヒト血清または他の生物
学的体液中のＨＩ Ｖ−２抗体またはＨＩＶ−２ウィル
スもしくはそのフラグメントの検出を可能にする。
本発明はしたがって、ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパク質の少
なくともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定
基に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関す
る。
なくともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定
基に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関す
る。
さらに詳しくは、本発明は、ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパク
質の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原性決定基に相当する式ＳｅｒＡｌａＡｚｇＬｅｕＡｓ
ｎＳｅｃＴｒｐＧＩＶａｌＰｒｏＴ！：ｐＶａｌＡｓｎ
ＡｓｐＳｅｒＬｅＧＬｕＴｒｐＧｌｕＬｙｓＧｌｎＶａ
ｌＡｒｇＴｙＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｙ （ＥＮＶ（６
０））ｙＣｙｓＡｌａＰｈｅＡｒｇＧＬｎＶａＩＣｙｓ
ＨｉｓＴｈｒＴｈｒｕＡ１ａＰ！：ＯＡＳｐＴｃｐＡＳ
ｐＡＳｎＭｅＣτｈｃＴｒｐＧ１ｎｒＬｅｕＧ１ｕＡｌ
ａＡｓｎ工１ｅＳｅｆ”ＬＹＳＳｅｌ：Ｌｅｕに１ｕで
示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまたは
その機能的均等配列を有するポリペプチドに関する。本
発明はまた、さらにアフィニティーペプチドおよび担体
ポリペプチドが共有結合している上に定義したポリペプ
チド、フラグメントおよび機能的均等配列に関する。ア
フィニティーペプチドと、アミノ酸配列がＨＩＶ−１エ
ンベロープタンパク質（ｅｎｖ）および／またはＨＩＶ
−１コアタンパク質（ｇａｇ）の少なくともひとつの抗
原決定基および／または免疫原決定基に相当するポリペ
プチドがさらに共有結合している上に定義したポリペプ
チドも包含される。このような融合タンパク質はＨＩＶ
−１ウィルスのみでなく ＨＩ Ｖ−２ウィルスの抗原
決定基および／または免疫原決定基を有するので、これ
らの融合ポリペプチドは、ヒト血清または他の生物学的
体液中のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体またはＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２ウィルスもしくはそれらのフラグ
メントの有効な同時検出用ツールを提供する。
質の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原性決定基に相当する式ＳｅｒＡｌａＡｚｇＬｅｕＡｓ
ｎＳｅｃＴｒｐＧＩＶａｌＰｒｏＴ！：ｐＶａｌＡｓｎ
ＡｓｐＳｅｒＬｅＧＬｕＴｒｐＧｌｕＬｙｓＧｌｎＶａ
ｌＡｒｇＴｙＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｙ （ＥＮＶ（６
０））ｙＣｙｓＡｌａＰｈｅＡｒｇＧＬｎＶａＩＣｙｓ
ＨｉｓＴｈｒＴｈｒｕＡ１ａＰ！：ＯＡＳｐＴｃｐＡＳ
ｐＡＳｎＭｅＣτｈｃＴｒｐＧ１ｎｒＬｅｕＧ１ｕＡｌ
ａＡｓｎ工１ｅＳｅｆ”ＬＹＳＳｅｌ：Ｌｅｕに１ｕで
示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまたは
その機能的均等配列を有するポリペプチドに関する。本
発明はまた、さらにアフィニティーペプチドおよび担体
ポリペプチドが共有結合している上に定義したポリペプ
チド、フラグメントおよび機能的均等配列に関する。ア
フィニティーペプチドと、アミノ酸配列がＨＩＶ−１エ
ンベロープタンパク質（ｅｎｖ）および／またはＨＩＶ
−１コアタンパク質（ｇａｇ）の少なくともひとつの抗
原決定基および／または免疫原決定基に相当するポリペ
プチドがさらに共有結合している上に定義したポリペプ
チドも包含される。このような融合タンパク質はＨＩＶ
−１ウィルスのみでなく ＨＩ Ｖ−２ウィルスの抗原
決定基および／または免疫原決定基を有するので、これ
らの融合ポリペプチドは、ヒト血清または他の生物学的
体液中のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体またはＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２ウィルスもしくはそれらのフラグ
メントの有効な同時検出用ツールを提供する。
本発明の好ましいポリペプチドは一般式％式％
（式中、Ａはアフィニティーペプチドであり、Ｂは式■
のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、Ｃは担体
ポリペプチドまたはアミノ酸配列がＨＩＶ−１エンベロ
ープタンパク質（ｅｎｖ）および／またはＨＩＶ−１コ
アタンパク質（ｇ ａ ｇ）の少なくともひとつの抗原
決定基および／または免疫原決定基に相当するポリペプ
チドである）で定義される。
のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、Ｃは担体
ポリペプチドまたはアミノ酸配列がＨＩＶ−１エンベロ
ープタンパク質（ｅｎｖ）および／またはＨＩＶ−１コ
アタンパク質（ｇ ａ ｇ）の少なくともひとつの抗原
決定基および／または免疫原決定基に相当するポリペプ
チドである）で定義される。
本発明のとくに好ましいポリペプチドは、式で示される
アミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列を有する。
本発明のポリペプチドに関連して用いられる「機能的均
等配列」の語は、上述のアミノ酸配列からヌクレオチド
置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌク
レオチド付加によって誘導され、ＨＩＶ−２ｅｎｖタン
パク質の少なくともひとつの抗原決定基および／または
免疫原決定基に相当するアミノ酸配列のポリペプチドに
関する。
等配列」の語は、上述のアミノ酸配列からヌクレオチド
置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌク
レオチド付加によって誘導され、ＨＩＶ−２ｅｎｖタン
パク質の少なくともひとつの抗原決定基および／または
免疫原決定基に相当するアミノ酸配列のポリペプチドに
関する。
ポリペプチドのアミノ酸配列中のある種の置換はポリペ
プチドの生物学的活性に影響を与えない。
プチドの生物学的活性に影響を与えない。
このようなアミノ酸置換の例としては、Ａｆｆａ／Ｓｅ
ｒ、Ｖａｆｌ／Ｉｐｅ、Ａｓｐ／Ｇ［ｕ。
ｒ、Ｖａｆｌ／Ｉｐｅ、Ａｓｐ／Ｇ［ｕ。
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｆｆａ／ＧＱｙ、Ａｆｆａ／Ｔｈｒ
、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｆｆａ／Ｖａ、２゜Ｓｅｒ／ＧＱ
ｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、ＡＱａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ
、Ａｓｐ／Ａｓｎ。
、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｆｆａ／Ｖａ、２゜Ｓｅｒ／ＧＱ
ｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、ＡＱａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ
、Ａｓｐ／Ａｓｎ。
Ｌｅｕ／Ｉ （ｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａＱ、Ａ（ｌａ／ＧＱ
ｕおよびその逆を挙げることができる（Ｄｏｏｌｉｌｌ
ｌｅ ： Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ″、 Ｎｅｕ
ｒａｊｈ、 Ｈ。
ｕおよびその逆を挙げることができる（Ｄｏｏｌｉｌｌ
ｌｅ ： Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ″、 Ｎｅｕ
ｒａｊｈ、 Ｈ。
＆ Ｈｉｌｌ、 Ｒ，Ｌ、著、＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
ｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
１９７９）。
アフィニティーペプチドとは、アフィニティークロマト
グラフィー担体材料に好んで結合するアミノ酸配列を含
有するペプチドを意味する。この上うなアフィニティー
ペプチドの例は、少なくとも２個のヒスチジン残基を含
有するペプチドである（これに関してはヨーロッパ特許
出願公告第２８２ ０４２号参照）。このようなアフィ
ニティーペプチドはニトリロ三酢酸−ニッケルキレート
樹脂に選択的に結合する（Ｈｏｃｈｕｌｉ ＆ ＤＯｂ
ｅｌｉ ：Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 Ｈｏｐｐｅ−Ｓ
ｅ７１ｅ＋、 ３６８ ： ７４８゜１９８７、ヨー
ロッパ特許出願公告第２５３３０３号）。したがって、
このようなアフィニティーペプチドを含有するポリペプ
チドは他のペプチドから選択的に分離できる。このアフ
ィニティーペプチドは、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそ
のフラグメントまたはその機能的均等配列を有するポリ
ペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに結合させる
ことができる。
グラフィー担体材料に好んで結合するアミノ酸配列を含
有するペプチドを意味する。この上うなアフィニティー
ペプチドの例は、少なくとも２個のヒスチジン残基を含
有するペプチドである（これに関してはヨーロッパ特許
出願公告第２８２ ０４２号参照）。このようなアフィ
ニティーペプチドはニトリロ三酢酸−ニッケルキレート
樹脂に選択的に結合する（Ｈｏｃｈｕｌｉ ＆ ＤＯｂ
ｅｌｉ ：Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 Ｈｏｐｐｅ−Ｓ
ｅ７１ｅ＋、 ３６８ ： ７４８゜１９８７、ヨー
ロッパ特許出願公告第２５３３０３号）。したがって、
このようなアフィニティーペプチドを含有するポリペプ
チドは他のペプチドから選択的に分離できる。このアフ
ィニティーペプチドは、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそ
のフラグメントまたはその機能的均等配列を有するポリ
ペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに結合させる
ことができる。
本発明のポリペプチドに関連して用いられる「担体ポリ
ペプチド」の語は、それ自体はＨＩＶ−２ｅｎｖタンパ
ク質の抗原決定基および／または免疫原決定基を含まな
いが、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントま
たはその機能的均等配列を有するポリペプチドの発現に
必要なポリペプチドに関する。担体ポリペプチドとして
は、好ましくは、大腸菌クラロラムフエニコールアセチ
ルトランスフエラーゼ（ｃＡＴ）およびマウスジヒドロ
葉酸リダクターゼ（Ｄ ＨＦ Ｒ）が考えられる。
ペプチド」の語は、それ自体はＨＩＶ−２ｅｎｖタンパ
ク質の抗原決定基および／または免疫原決定基を含まな
いが、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントま
たはその機能的均等配列を有するポリペプチドの発現に
必要なポリペプチドに関する。担体ポリペプチドとして
は、好ましくは、大腸菌クラロラムフエニコールアセチ
ルトランスフエラーゼ（ｃＡＴ）およびマウスジヒドロ
葉酸リダクターゼ（Ｄ ＨＦ Ｒ）が考えられる。
本発明のポリペプチドは、その製造方法のために、最初
のＮ末端アミノ酸としてメチオニン（ＡＴＧをコードす
る）を含有することがある。
のＮ末端アミノ酸としてメチオニン（ＡＴＧをコードす
る）を含有することがある。
また微生物宿主が翻訳生成物を部分的または完全にプロ
セッシングできる場合は、Ｎ末端メチオニンは切断除去
される。
セッシングできる場合は、Ｎ末端メチオニンは切断除去
される。
本発明のポリペプチドは、マルチマーの形で、たとえば
ダイマー、トリマー、テトラマー等の形で存在すること
もできる。もちろん、本発明のポリペプチドは、さらに
アミノ酸配列がＨＩＶ−２コアタンパク質（ｇ ａ ｇ
）の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原決定基に相当するポリペプチドを共有結合することも
できる。
ダイマー、トリマー、テトラマー等の形で存在すること
もできる。もちろん、本発明のポリペプチドは、さらに
アミノ酸配列がＨＩＶ−２コアタンパク質（ｇ ａ ｇ
）の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原決定基に相当するポリペプチドを共有結合することも
できる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、これらのＤＮＡ配列を含有する組換えベクター
、本発明のポリペプチドを製造するための単細胞生物、
ならびにこのようなりＮＡ配列、組換えベクターおよび
単細胞生物の製造方法を提供する。本発明のポリペプチ
ドの発現、単離および精製方法も包含される。このよう
にして製造された本発明のポリペプチドは、本発明の方
法を用いる多くの重要な免疫学的操作に使用することが
できる。
Ａ配列、これらのＤＮＡ配列を含有する組換えベクター
、本発明のポリペプチドを製造するための単細胞生物、
ならびにこのようなりＮＡ配列、組換えベクターおよび
単細胞生物の製造方法を提供する。本発明のポリペプチ
ドの発現、単離および精製方法も包含される。このよう
にして製造された本発明のポリペプチドは、本発明の方
法を用いる多くの重要な免疫学的操作に使用することが
できる。
本発明のポリペプチドは、ヒト血清中のＨＩＶ−２ウィ
ルスに対する抗体の検出、またはヒト血清中のＨＩＶ−
１およびＨＩＶ−２ウィルスに対する抗体（以下、合わ
せてＨＩＶウィルスに対する抗体という）の同時検出の
ための診断剤として使用できる。これらは均一な形に製
造できるので、比較的粗製のウィルスＨＩＶタンパク質
分解物に基づく診断剤の使用における従来の限界であっ
た非特異的反応の問題は消失する。
ルスに対する抗体の検出、またはヒト血清中のＨＩＶ−
１およびＨＩＶ−２ウィルスに対する抗体（以下、合わ
せてＨＩＶウィルスに対する抗体という）の同時検出の
ための診断剤として使用できる。これらは均一な形に製
造できるので、比較的粗製のウィルスＨＩＶタンパク質
分解物に基づく診断剤の使用における従来の限界であっ
た非特異的反応の問題は消失する。
免疫原として使用する場合、本発明のポリペチドは、こ
れらのポリペプチドに含まれる抗原決定基に対する抗体
を動物に産生させるために使用できる。一方、このよう
な抗体は、適当に標識した本発明のポリペプチドと組合
せて、ヒト血清または生物学的液体たとえば涙液、***
、膣分泌液および唾液中におけるＨＩＶ−２ウィルスま
たはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２’フイルス（以下、合
わせてＨＩＶウィルスという）またはその粒子の存在を
検出するために、放射免疫検定（ＲＩ Ａ）または酵素
免疫検定（ＥＬＩＳＡ）に使用できる。
れらのポリペプチドに含まれる抗原決定基に対する抗体
を動物に産生させるために使用できる。一方、このよう
な抗体は、適当に標識した本発明のポリペプチドと組合
せて、ヒト血清または生物学的液体たとえば涙液、***
、膣分泌液および唾液中におけるＨＩＶ−２ウィルスま
たはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２’フイルス（以下、合
わせてＨＩＶウィルスという）またはその粒子の存在を
検出するために、放射免疫検定（ＲＩ Ａ）または酵素
免疫検定（ＥＬＩＳＡ）に使用できる。
これらの方法を用いて検出できるＨＩＶウィルスの粒子
（またはフラグメント）にはもちろん、ウィルスのＨＩ
Ｖエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）の断片も包含され
る。
（またはフラグメント）にはもちろん、ウィルスのＨＩ
Ｖエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）の断片も包含され
る。
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の慣用方法によ
り、液相または好ましくは固相中で、たとえばＭｅｒｒ
ｉｌｉｅｌｄの方法（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、
Ｓｏｃ、。
り、液相または好ましくは固相中で、たとえばＭｅｒｒ
ｉｌｉｅｌｄの方法（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、
Ｓｏｃ、。
８５：２１４９〜２１５４．１９６３）または本技術状
態の他の均等方法によって製造できる。
態の他の均等方法によって製造できる。
別法として、本発明のポリペプチドはまた、ＤＮＡ組換
え技術の方法を用いて製造することもできる（Ｍａｎｉ
ａｆｉｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａ＋ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−ＡＬａｂｏ「ａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ” 、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐ「ｉｎｇ Ｈａ「ｂｏ「Ｌａｂｏ＋ａｔ
ｏ＋７ 、１９８２） ｏたとえば、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列は慣用の化学的方法、たと
えばホスホトリエステル法（Ｎａｔａｎｇら：Ｍｅｔｈ
、 Ｅｎｘｙｍｏｌ、、 ６８ ： ９０〜１０８．１
９７９）またはホスホジエステル法（Ｂ＋ｏｗｎら：Ｍ
ｅｌｈ、 ＥｎＢｍｏｌ、、 ６８ ：
１０９ 〜１ ５ １． １９７９）によって合成で
きる。ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は天然の
ＨＩＶ−２またはＨＩＶ−１とＨＩ Ｖ−２ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列と同一であってもよい
。一方、遺伝暗号は退化するので、部分的にまたは完全
に異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコー
ドする可能性がある。所望により、ポリペプチドの発現
に際し宿主微生物によって好んで用いられるコドンのヌ
クレオチド配列を選択することもできる（（ｉｒｏｓｊ
ｅ’ａｎら：Ｇｅｎｅ、 １８ ： １９９〜２０９
．１９８２）。しかしながら、このようにして得られた
ＤＮＡ配列が発現ベクターの構築を困難にするような部
分配列を含まないように、たとえば望ましくない制限酵
素切断部位が導入されないように注意すべきである。
え技術の方法を用いて製造することもできる（Ｍａｎｉ
ａｆｉｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａ＋ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−ＡＬａｂｏ「ａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ” 、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐ「ｉｎｇ Ｈａ「ｂｏ「Ｌａｂｏ＋ａｔ
ｏ＋７ 、１９８２） ｏたとえば、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列は慣用の化学的方法、たと
えばホスホトリエステル法（Ｎａｔａｎｇら：Ｍｅｔｈ
、 Ｅｎｘｙｍｏｌ、、 ６８ ： ９０〜１０８．１
９７９）またはホスホジエステル法（Ｂ＋ｏｗｎら：Ｍ
ｅｌｈ、 ＥｎＢｍｏｌ、、 ６８ ：
１０９ 〜１ ５ １． １９７９）によって合成で
きる。ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は天然の
ＨＩＶ−２またはＨＩＶ−１とＨＩ Ｖ−２ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列と同一であってもよい
。一方、遺伝暗号は退化するので、部分的にまたは完全
に異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコー
ドする可能性がある。所望により、ポリペプチドの発現
に際し宿主微生物によって好んで用いられるコドンのヌ
クレオチド配列を選択することもできる（（ｉｒｏｓｊ
ｅ’ａｎら：Ｇｅｎｅ、 １８ ： １９９〜２０９
．１９８２）。しかしながら、このようにして得られた
ＤＮＡ配列が発現ベクターの構築を困難にするような部
分配列を含まないように、たとえば望ましくない制限酵
素切断部位が導入されないように注意すべきである。
さらに、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、単離プロウィルスＨＩ Ｖ−２ＤＮＡから、または
プロウィルスＨＩＶ−２ゲノムを組込みついでそのフラ
グメントを一最大Ａ−Ｂ−Ｃ，Ａ−Ｃ−ＢおよびＣ−Ｂ
−Ａの部分配列ＡおよびＣをコードする適当なベクター
中に導入した細胞のゲノムＤＮＡから単離することによ
っても製造できる。
は、単離プロウィルスＨＩ Ｖ−２ＤＮＡから、または
プロウィルスＨＩＶ−２ゲノムを組込みついでそのフラ
グメントを一最大Ａ−Ｂ−Ｃ，Ａ−Ｃ−ＢおよびＣ−Ｂ
−Ａの部分配列ＡおよびＣをコードする適当なベクター
中に導入した細胞のゲノムＤＮＡから単離することによ
っても製造できる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの製造後、こ
れらを公知の方法により、必要な発現シグナルを生成す
る適当な任意の発現ベクター中に導入することができる
。適当なベクターは、染色体性、非染色体性および合成
りＮＡ配列のセグメント、たとえば各種の公知プラスミ
ドおよびファージＤＮＡから構築できる。この関係では
、前述のＭａｎｉａｌｉｓらの参考書が参考になる。と
くに適当なベクターはｐＤＳ群のプラスミドである（Ｂ
ｕｊａｔｄら： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｘｙｍ
ｏｌｏｇ７． Ｗｕ ＆Ｇ＋ｏｓｓ＋ｎａｎ編、 人
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、、
１ ５ ５巻。
れらを公知の方法により、必要な発現シグナルを生成す
る適当な任意の発現ベクター中に導入することができる
。適当なベクターは、染色体性、非染色体性および合成
りＮＡ配列のセグメント、たとえば各種の公知プラスミ
ドおよびファージＤＮＡから構築できる。この関係では
、前述のＭａｎｉａｌｉｓらの参考書が参考になる。と
くに適当なベクターはｐＤＳ群のプラスミドである（Ｂ
ｕｊａｔｄら： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｘｙｍ
ｏｌｏｇ７． Ｗｕ ＆Ｇ＋ｏｓｓ＋ｎａｎ編、 人
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、、
１ ５ ５巻。
４１６〜４３３．１９８７）。
本発明の好ましい態様においては、式■のアミノ酸配列
（ｅ ｎ ｖ （６０）遺伝子）をコードする合成りａ
ｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳ
■、６ｘＨ４ｓのＢａｍＨＩもしくはＢｇｆｉｎ切断Ｄ
ＮＡおよびプラスミドｐＲＢｓＩＩ、−ｅｎｖ （８０
）−ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓのＢｇＦＩＩ切断
ＤＮＡと融合サセテ、本発明の式■〜■のとくに好まし
いポリペプチドの合成をコードする発現ベクターｐｅｎ
ｖ（６０）−ＤＨＦＲ，ｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）
およびｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａｇ （４
１９）ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉ ｓを単離する。合
成ｅｎｖ（６０）遺伝子の合成は例１に記載する。
（ｅ ｎ ｖ （６０）遺伝子）をコードする合成りａ
ｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳ
■、６ｘＨ４ｓのＢａｍＨＩもしくはＢｇｆｉｎ切断Ｄ
ＮＡおよびプラスミドｐＲＢｓＩＩ、−ｅｎｖ （８０
）−ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓのＢｇＦＩＩ切断
ＤＮＡと融合サセテ、本発明の式■〜■のとくに好まし
いポリペプチドの合成をコードする発現ベクターｐｅｎ
ｖ（６０）−ＤＨＦＲ，ｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）
およびｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａｇ （４
１９）ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉ ｓを単離する。合
成ｅｎｖ（６０）遺伝子の合成は例１に記載する。
そのヌクレオチド配列およびそれから誘導されるアミノ
酸配列（ＥＮＶ （６０）’）は第１図に示す。
酸配列（ＥＮＶ （６０）’）は第１図に示す。
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓ。
ｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲ，ｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ
（（３Ｑ）、ｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａ
ｇ （４１９）−６ｘＨｉｓおよびｐＲＢｓＩＩ−ｅｎ
ｖ （８０） ｇａｇ （４１９）−ｅｎｖ（６０）
−６ｘＨｉｓの構築については例２〜４゜６および７に
詳細に記載する。
（（３Ｑ）、ｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａ
ｇ （４１９）−６ｘＨｉｓおよびｐＲＢｓＩＩ−ｅｎ
ｖ （８０） ｇａｇ （４１９）−ｅｎｖ（６０）
−６ｘＨｉｓの構築については例２〜４゜６および７に
詳細に記載する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が発現制
御配列と有効に結合している発現ベクターは、それ自体
公知の方法により、任意の適当な宿主生物中に導入する
ことができる。適当な宿主生物の選択は、本技術分野に
おける熟練者には知られている様々の因子によって決定
される。すなわち、たとえば、選ばれたベクターとの適
合性、発現生成物の毒性、発現特性、必要な生物学的安
全性予防手段および経費が重要であり、これらの因子の
すべての間のバランスが見出されねばならない。
御配列と有効に結合している発現ベクターは、それ自体
公知の方法により、任意の適当な宿主生物中に導入する
ことができる。適当な宿主生物の選択は、本技術分野に
おける熟練者には知られている様々の因子によって決定
される。すなわち、たとえば、選ばれたベクターとの適
合性、発現生成物の毒性、発現特性、必要な生物学的安
全性予防手段および経費が重要であり、これらの因子の
すべての間のバランスが見出されねばならない。
適当な宿主生物としては、ダラム陰性菌およびダラム陽
性菌、たとえば大腸菌および枯草菌株が考慮される。本
発明のとくに好ましい宿主生物は、大腸菌Ｍ１５株（Ｖ
ｉｌｌａｔｅｉｏら： Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、。
性菌、たとえば大腸菌および枯草菌株が考慮される。本
発明のとくに好ましい宿主生物は、大腸菌Ｍ１５株（Ｖ
ｉｌｌａｔｅｉｏら： Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、。
１２０：４６６〜４７４．１９７４により、０Ｚ２９１
として記載されている）および大腸菌Ｗ３１１０株（Ａ
ＴＣＣＮα２７３２５）である。しかしながら、上述の
大腸菌株に加えて、他の一般に入手できる大腸菌株、た
とえば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣＮα３１４４６）およ
び大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣＮα３１３４３）も使用でき
る。
として記載されている）および大腸菌Ｗ３１１０株（Ａ
ＴＣＣＮα２７３２５）である。しかしながら、上述の
大腸菌株に加えて、他の一般に入手できる大腸菌株、た
とえば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣＮα３１４４６）およ
び大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣＮα３１３４３）も使用でき
る。
本発明のポリペプチドの発現方法は、選ばれた発現ベク
ター／宿主細胞系に依存する。通常、所望の発現ベクタ
ーを含有する宿主生物は、その宿主生物の生育に至適の
条件下に生育させる。単位時間あたりの細胞数の増加が
低下する対数生育期の終わりに、所望のポリペプチドの
発現を誘導する。すなわち、所望のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを転写させ、転写されたｍＲＮＡを翻訳さ
せる。この誘導は生育メジウムにインデューサーもしく
はデイプレッサ−を添加するか、または物理的パラメー
ターを変化させるたとえば温度を変化させることにより
行うことができる。本発明の好ましい態様において用い
られる発現ベクターでは、発現はｐａｃレプレッサーに
よって制御される。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、発現制御配列
を抑制すると、所望のポリペプチドの合成が誘導される
。
ター／宿主細胞系に依存する。通常、所望の発現ベクタ
ーを含有する宿主生物は、その宿主生物の生育に至適の
条件下に生育させる。単位時間あたりの細胞数の増加が
低下する対数生育期の終わりに、所望のポリペプチドの
発現を誘導する。すなわち、所望のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを転写させ、転写されたｍＲＮＡを翻訳さ
せる。この誘導は生育メジウムにインデューサーもしく
はデイプレッサ−を添加するか、または物理的パラメー
ターを変化させるたとえば温度を変化させることにより
行うことができる。本発明の好ましい態様において用い
られる発現ベクターでは、発現はｐａｃレプレッサーに
よって制御される。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、発現制御配列
を抑制すると、所望のポリペプチドの合成が誘導される
。
分析の目的で本発明のポリペプチドの少量をたとえばポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で単離するためには、宿
主生物を界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム（
Ｓ Ｄ Ｓ）で処理して破壊する。本発明のポリペプチ
ドの大量回収には、機械的方法（ｃｈａｒｍら： Ｍｅ
ｔｈ、 Ｅｎｘ７ｍｏ１．、 ２２ ： ４７６〜５５
６．１９７１）、酵素的方法（リゾチーム処理）もしく
は化学的方法（界面活性剤処理、尿素または塩化グアニ
ジニウム処理等）またはこれらの方法の組合せが使用で
きる。
リアクリルアミドゲル電気泳動で単離するためには、宿
主生物を界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム（
Ｓ Ｄ Ｓ）で処理して破壊する。本発明のポリペプチ
ドの大量回収には、機械的方法（ｃｈａｒｍら： Ｍｅ
ｔｈ、 Ｅｎｘ７ｍｏ１．、 ２２ ： ４７６〜５５
６．１９７１）、酵素的方法（リゾチーム処理）もしく
は化学的方法（界面活性剤処理、尿素または塩化グアニ
ジニウム処理等）またはこれらの方法の組合せが使用で
きる。
本発明のポリペプチドは、宿主生物から除いたのち、公
知の方法により、たとえば様々な速度での遠心分離、硫
酸アンモニウムによる沈殿、透析（常圧または減圧で）
、プレパラテイブ等電点電気泳動、プレパラテイブゲル
電気泳動または各種クロマトグラフィー法たとえばゲル
濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーお
よびアフィニティークロマトグラフィー（たとえば５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｂｌｕｅ ＣＱ −６Ｂ上または本
発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体結合担
体上）によって精製することができる。しかじながら、
本発明のポリペプチドは、−最大％式％ （式中、Ｘは２．３または４である）で示されるニトリ
ロ三酢酸（Ｎ Ｔ Ａ）樹脂上で精製するのが好ましい
。キャリアーマトリックスとしては、アフィニティーお
よびゲルクロマトグラフィーに使用される材料、たとえ
ば架橋デキストラン、アガロース（とくに、３ｅｐｈａ
τＯ８ｅ■の商品名で知られる形）またはポリアクリル
アミドが考慮される。
知の方法により、たとえば様々な速度での遠心分離、硫
酸アンモニウムによる沈殿、透析（常圧または減圧で）
、プレパラテイブ等電点電気泳動、プレパラテイブゲル
電気泳動または各種クロマトグラフィー法たとえばゲル
濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーお
よびアフィニティークロマトグラフィー（たとえば５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｂｌｕｅ ＣＱ −６Ｂ上または本
発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体結合担
体上）によって精製することができる。しかじながら、
本発明のポリペプチドは、−最大％式％ （式中、Ｘは２．３または４である）で示されるニトリ
ロ三酢酸（Ｎ Ｔ Ａ）樹脂上で精製するのが好ましい
。キャリアーマトリックスとしては、アフィニティーお
よびゲルクロマトグラフィーに使用される材料、たとえ
ば架橋デキストラン、アガロース（とくに、３ｅｐｈａ
τＯ８ｅ■の商品名で知られる形）またはポリアクリル
アミドが考慮される。
スペーサーとしては、アフィニティークロマトグラフィ
ーからすでに知られているスペーサー基が使用できる。
ーからすでに知られているスペーサー基が使用できる。
基
−０−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−および−〇−Ｃ
Ｏ−が好ましい。
Ｏ−が好ましい。
本発明のポリペプチドの精製にとくに好ましいＮＴＡ樹
脂は、式 ％式％ で示される樹脂である。
脂は、式 ％式％ で示される樹脂である。
上述のように、上述の方法に従って得られる本発明のポ
リペプチドは、ヒト血清中のＨＩＶウィルスに対する抗
体を検出するための診断用ツールとして使用できる。こ
の目的で本発明のポリペプチドは、多数の公知検出方法
に使用できる。
リペプチドは、ヒト血清中のＨＩＶウィルスに対する抗
体を検出するための診断用ツールとして使用できる。こ
の目的で本発明のポリペプチドは、多数の公知検出方法
に使用できる。
たとえば、本発明のポリペプチドは公知の方法に従って
標識することができ、これらの標識ポリペプチドはＨＩ
Ｖウィルスに対する抗体を含むことが疑われるヒト血清
に添加して、標識ポリペプチド／抗体複合体を生成させ
ることができる。このようにして生成した複合体はつい
で、それ自体公知の方法で検出することができる。さら
に例を示せば、本発明のポリペプチドはまた、固体支持
体上に固定化させ、ついでヒト血清サンプルと接触させ
ることができる。サンプル中のＨＩＶウィルスに対する
抗体はこの固定化ポリペプチドに結合し、非結合ポリペ
プチドと抗体を洗浄して除去したのち、このようにして
生成した複合体を、たとえば１ｔａｐｈ７１ｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓプロティンＡ（たとえば１２５−ヨ
ウ素で標識）または第二の抗−Ｉｇ抗体（たとえば放射
性同位元素またはワサビパーオキシダーゼで標識）のよ
うな試薬を用いて検出することができる。これらの上述
の検出方法には多くの修飾および可能が可能なことは、
本技術の熟練者には自明のとおりであるが、その一部を
以下に示す。
標識することができ、これらの標識ポリペプチドはＨＩ
Ｖウィルスに対する抗体を含むことが疑われるヒト血清
に添加して、標識ポリペプチド／抗体複合体を生成させ
ることができる。このようにして生成した複合体はつい
で、それ自体公知の方法で検出することができる。さら
に例を示せば、本発明のポリペプチドはまた、固体支持
体上に固定化させ、ついでヒト血清サンプルと接触させ
ることができる。サンプル中のＨＩＶウィルスに対する
抗体はこの固定化ポリペプチドに結合し、非結合ポリペ
プチドと抗体を洗浄して除去したのち、このようにして
生成した複合体を、たとえば１ｔａｐｈ７１ｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓプロティンＡ（たとえば１２５−ヨ
ウ素で標識）または第二の抗−Ｉｇ抗体（たとえば放射
性同位元素またはワサビパーオキシダーゼで標識）のよ
うな試薬を用いて検出することができる。これらの上述
の検出方法には多くの修飾および可能が可能なことは、
本技術の熟練者には自明のとおりであるが、その一部を
以下に示す。
ヒト血清または他の生物学的液体中のＨＩＶウィルスま
たはそのフラグメントを検出するための様々な診断試験
は、本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、抗−Ｈ
ＩＶ抗体という）を用いて発展させることができる。こ
のような抗体は、本発明のポリペプチドおよび生理的に
許容される担体材料からなる免疫原組成物を哺乳類また
は鳥類に注射することによって製造できる。注射に必要
なタンパク質の量は本技術の熟練者にはよ（知られてい
るし、また既知の方法に従って決定することができる。
たはそのフラグメントを検出するための様々な診断試験
は、本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、抗−Ｈ
ＩＶ抗体という）を用いて発展させることができる。こ
のような抗体は、本発明のポリペプチドおよび生理的に
許容される担体材料からなる免疫原組成物を哺乳類また
は鳥類に注射することによって製造できる。注射に必要
なタンパク質の量は本技術の熟練者にはよ（知られてい
るし、また既知の方法に従って決定することができる。
本発明に関連して用いられる「担体材料」の語は、ヒト
への投与に適している既知の組成物または動物への接種
に使用される既知のアジュバントを指す。ヒトおよび動
物に使用するのに適当なアジュバントは、本技術の熟練
者にはよく知られている（Ｗ）ＩＱ Ｔｅｃｂ、 Ｒａ
ｐ、 ５ｅｒｉｅｓ、 ５９５ ：１〜４００，１
９７６ ；Ｊｏｌｌｉｓら： Ｃｈｅｍｉｃａｌｘｎｄ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｄｊｕ
ｔａｎｔｓ、 Ｍｏｌ。
への投与に適している既知の組成物または動物への接種
に使用される既知のアジュバントを指す。ヒトおよび動
物に使用するのに適当なアジュバントは、本技術の熟練
者にはよく知られている（Ｗ）ＩＱ Ｔｅｃｂ、 Ｒａ
ｐ、 ５ｅｒｉｅｓ、 ５９５ ：１〜４００，１
９７６ ；Ｊｏｌｌｉｓら： Ｃｈｅｍｉｃａｌｘｎｄ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｄｊｕ
ｔａｎｔｓ、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｔｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｂ７．．１３ ： １〜
１４８． １９７３゜Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ、
Ｂｅｒｌｉｎ） 。しかしながら、本発明のポリペプ
チドはりポゾームまたは他の微小担体材料に導入したの
ち、または多糖、他のポリペプチドもしくは他のポリマ
ーにカップリングさせたのちに投与することもできる。
１４８． １９７３゜Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ、
Ｂｅｒｌｉｎ） 。しかしながら、本発明のポリペプ
チドはりポゾームまたは他の微小担体材料に導入したの
ち、または多糖、他のポリペプチドもしくは他のポリマ
ーにカップリングさせたのちに投与することもできる。
とくに代表的な例では、最初の接種から数週後に１回ま
たは２回以上の付加免疫を行うと、高含量の抗−ＨＩＶ
抗体が得られる。これらはそれ自体公知の方法によって
単離できる。
たは２回以上の付加免疫を行うと、高含量の抗−ＨＩＶ
抗体が得られる。これらはそれ自体公知の方法によって
単離できる。
上述の試験では、当然、モノクロナール抗体も使用でき
る。このような抗体の製造方法は本技術分野の熟練者に
はよく知られている（Ｋｉｉｈｌｅｒら：Ｎａｊｏｔｅ
、２５６ ： ４９５〜４９７．１９７５）。
る。このような抗体の製造方法は本技術分野の熟練者に
はよく知られている（Ｋｉｉｈｌｅｒら：Ｎａｊｏｔｅ
、２５６ ： ４９５〜４９７．１９７５）。
先に説明したように、前述の方法に従って得られる抗−
ＨＩＶ抗体は、ＨＩＶウィルスまたはそのフラグメント
の検出のための各種診断試験に使用することができる。
ＨＩＶ抗体は、ＨＩＶウィルスまたはそのフラグメント
の検出のための各種診断試験に使用することができる。
このような試験は、溶液中または固体支持体上において
放射線免疫検定の形で実施できる。また、酵素免疫検定
で行うこともできる。試験は直接または抗−ＨＩＶ抗体
に対する第二の抗体により間接的に実施できる。多数の
酵素活性、たとえばペルオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼを抗体にカップリングすることができ、基質溶
液後に着色を生じる。
放射線免疫検定の形で実施できる。また、酵素免疫検定
で行うこともできる。試験は直接または抗−ＨＩＶ抗体
に対する第二の抗体により間接的に実施できる。多数の
酵素活性、たとえばペルオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼを抗体にカップリングすることができ、基質溶
液後に着色を生じる。
これらの試験の多くの基盤になる原理は、ＨＩＶウィル
スまたはそのフラグメントの含有が疑われるヒト血清ま
たは他の生物学的液体が既知の力価の抗−ＨＩＶ抗体と
反応して抗原／抗体複合体を生成することにある。この
ようにして生成した複合体は、それ自体公知の方法で検
出される。
スまたはそのフラグメントの含有が疑われるヒト血清ま
たは他の生物学的液体が既知の力価の抗−ＨＩＶ抗体と
反応して抗原／抗体複合体を生成することにある。この
ようにして生成した複合体は、それ自体公知の方法で検
出される。
抗−ＨＩＶ抗血清を使用できる多くの他の検出方法、た
とえば各種の凝集試験があることもまた、本技術分野の
熟練者には自明のとおりであろう。
とえば各種の凝集試験があることもまた、本技術分野の
熟練者には自明のとおりであろう。
この場合、抗体とＨＩＶウィルスまたはそのフラグメン
トとの間の相互作用は、粒子が抗−ＨＩＶ抗体で被覆さ
れているシステムを用いて検出される。このような粒子
は、たとえばラテックスビーズ、リポゾーム、赤血球、
ポリアクリルアミドビーズまたは任意の多数の適当なポ
リマーである。
トとの間の相互作用は、粒子が抗−ＨＩＶ抗体で被覆さ
れているシステムを用いて検出される。このような粒子
は、たとえばラテックスビーズ、リポゾーム、赤血球、
ポリアクリルアミドビーズまたは任意の多数の適当なポ
リマーである。
ＨＩＶウィルスまたはＨＩＶウィルスに対する抗体を検
出するための前述の方法は、本発明のポリペプチドまた
は本発明の抗−ＨＩＶ抗体を含有する容器からなる適当
な試験キットで実施することができる。
出するための前述の方法は、本発明のポリペプチドまた
は本発明の抗−ＨＩＶ抗体を含有する容器からなる適当
な試験キットで実施することができる。
本明細書に添付した図面および以下の実施例は、本発明
の理解を容易にするために示すものであって、本発明を
限定するものではない。
の理解を容易にするために示すものであって、本発明を
限定するものではない。
例１
合成ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子の生成Ａ）原理
合成ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子は１４オリゴヌ
クレオチドフラグメントから構築した。その長さは１７
〜３１ヌクレオチドであった（第１図参照） Ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの合成オリゴヌク
レオチドフラグメント１〜１４は固体担体上、Ｂａ＋＋
ｎｖａｒｌｂ ＆ １ａｉｘａの記載した方法（ＤＮＡ
、互：４１３〜４１９．１９８６）に従って同時に合成
した。
クレオチドフラグメントから構築した。その長さは１７
〜３１ヌクレオチドであった（第１図参照） Ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの合成オリゴヌク
レオチドフラグメント１〜１４は固体担体上、Ｂａ＋＋
ｎｖａｒｌｂ ＆ １ａｉｘａの記載した方法（ＤＮＡ
、互：４１３〜４１９．１９８６）に従って同時に合成
した。
Ｃ）オリゴヌクレオチドフラグメントの組合せ各１００
１００ｐのオリゴヌクレオチドフラグメント２． ３．
８． ９． １０、ならびに４，５，６゜７、 １．
１． １．２． １３を、１００単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼおよび１００μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴ Ｐ
（５，０００Ｃｉ ／ｍｍｏｌ）を含むキナーゼ緩衝
液（Ｍａｎｉａｔｉｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌ＠ｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ。
１００ｐのオリゴヌクレオチドフラグメント２． ３．
８． ９． １０、ならびに４，５，６゜７、 １．
１． １．２． １３を、１００単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼおよび１００μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴ Ｐ
（５，０００Ｃｉ ／ｍｍｏｌ）を含むキナーゼ緩衝
液（Ｍａｎｉａｔｉｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌ＠ｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒａｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔ
ａｌｏｒｌ、 １９８２）１００μρ中、３７℃で
１５分間リン酸化した。
ａｌｏｒｌ、 １９８２）１００μρ中、３７℃で
１５分間リン酸化した。
ついで、反応混合物に１０倍過剰の冷ＡＴＰを加えた。
さらに９０分間インキュベーションしたのち、ポリヌク
レオチドキナーゼを熱失活させ（２分間、９０℃）、１
０μＱの５Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＯＡｃ）および１００
μＱのイソプロパツールを添加したのち、リン酸化され
たオリゴヌクレオチドフラグメントを３０分間−７８℃
に置いて沈殿させた。沈殿したオリゴヌクレオチドフラ
グメントを次にエタノールで洗浄し、乾燥させた。
レオチドキナーゼを熱失活させ（２分間、９０℃）、１
０μＱの５Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＯＡｃ）および１００
μＱのイソプロパツールを添加したのち、リン酸化され
たオリゴヌクレオチドフラグメントを３０分間−７８℃
に置いて沈殿させた。沈殿したオリゴヌクレオチドフラ
グメントを次にエタノールで洗浄し、乾燥させた。
リン酸化されたオリゴヌクレオチドフラグメント２．３
，８，９．１０および非リン酸化フラグメント１、なら
びにリン酸化オリゴヌクレオチドフラグメント４． ５
． ６． ７． １１． １２． １３および非リン酸
化フラグメント１４を、それぞれ、文献記載（Ｍａｎｉ
ａｊｉｓら：前出）の公知方法に従ってハイブリダイゼ
ーションし、ついで３１単位のＴ４リガーゼ含有のりガ
ーゼ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）１００μρ中
でリゲーションさせた。次に、得られた２種のサブフラ
グメントを前述のようにして沈殿させ、ついでエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。２種のサブフラグメントを次
に６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、標準
方法によって溶出しくＭａｎｉａｊｉｓら：前出） 、
５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムを用いて脱塩し、前述
のようにＴ４リガーゼを用いてたがいに結合させると所
望のＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）が得られた。ＨＩＶ−
２ｅｎｖ（６０）遺伝子を前述の操作（ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動および脱塩）によって精製したのち、
前述のようにリン酸化した。
，８，９．１０および非リン酸化フラグメント１、なら
びにリン酸化オリゴヌクレオチドフラグメント４． ５
． ６． ７． １１． １２． １３および非リン酸
化フラグメント１４を、それぞれ、文献記載（Ｍａｎｉ
ａｊｉｓら：前出）の公知方法に従ってハイブリダイゼ
ーションし、ついで３１単位のＴ４リガーゼ含有のりガ
ーゼ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）１００μρ中
でリゲーションさせた。次に、得られた２種のサブフラ
グメントを前述のようにして沈殿させ、ついでエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。２種のサブフラグメントを次
に６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、標準
方法によって溶出しくＭａｎｉａｊｉｓら：前出） 、
５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムを用いて脱塩し、前述
のようにＴ４リガーゼを用いてたがいに結合させると所
望のＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）が得られた。ＨＩＶ−
２ｅｎｖ（６０）遺伝子を前述の操作（ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動および脱塩）によって精製したのち、
前述のようにリン酸化した。
例２
６ｘＨｉｓの構築
プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｆｓの構築
には、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩを選択した。
には、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩを選択した。
このプラスミドならびにプラスミドｐＤＭＩ、１で形質
転換した大腸菌細胞は、ブダペスト条約に基づきドイツ
微生物寄託機関（Ｄｅｌｓｃｈｅｎ Ｓａｎ＋ｎ＋Ｉｕ
ｎｇ ｗｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉａｍｅｎ。
転換した大腸菌細胞は、ブダペスト条約に基づきドイツ
微生物寄託機関（Ｄｅｌｓｃｈｅｎ Ｓａｎ＋ｎ＋Ｉｕ
ｎｇ ｗｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉａｍｅｎ。
Ｇ１１ｌ＋ｉｎｇｅｎ ）に１９８７年９月３日に寄託
されている［Ｅ、ｃｏｌｉ Ｍ１５ （ｐＤｓ７５／Ｒ
ＢＳＩＩ。
されている［Ｅ、ｃｏｌｉ Ｍ１５ （ｐＤｓ７５／Ｒ
ＢＳＩＩ。
ｐＤＭＩ、１）、ＤＳＭ Ｎα４２３２］。
ＸｂａＩとＸｈｏＩの切断部位の間にあって、複製領域
と、細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマ
ーゼの遺伝子を含有するｐＤＳ７８／ＲＢＳｎの部分（
第２図および第３図）は、最初、プラスミドｐＢＲ３２
２から誘導する（Ｂｏｌｉｖａｒら：Ｇｅｎｅ、 ２
：９５〜１１３．１９７７ ； ５ｌｃｌｉｆｆｅ：
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｔｂｏｒ Ｓ７ｍｐ。
と、細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマ
ーゼの遺伝子を含有するｐＤＳ７８／ＲＢＳｎの部分（
第２図および第３図）は、最初、プラスミドｐＢＲ３２
２から誘導する（Ｂｏｌｉｖａｒら：Ｇｅｎｅ、 ２
：９５〜１１３．１９７７ ； ５ｌｃｌｉｆｆｅ：
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｔｂｏｒ Ｓ７ｍｐ。
Ｑｕｎｎｔ、 Ｂｉｏｌ、、 ４３ ： ７７〜９０
． １９７９）。
． １９７９）。
しかしながら、β−ラクタマーゼの遺伝子は一方、制限
酵素ＨｔｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断部位が除去され
ることで修飾される。ＤＮＡ配列におけるこれらの変化
は、しかし、β−ラクタマーゼのアミノ酸配列には影響
しない。プラスミドの残りの部分には、調節可能なプロ
モーター／オペレーター要素Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５ ０
Ｐ ２９およびリポソーム結合部位ＲＢＳｎがある。
酵素ＨｔｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断部位が除去され
ることで修飾される。ＤＮＡ配列におけるこれらの変化
は、しかし、β−ラクタマーゼのアミノ酸配列には影響
しない。プラスミドの残りの部分には、調節可能なプロ
モーター／オペレーター要素Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５ ０
Ｐ ２９およびリポソーム結合部位ＲＢＳｎがある。
このリポソーム結合部位は大腸菌ファージＴ５のプロモ
ーターＰＧ２５のリポソーム結合部位から誘導されて（
Ｇｅｎｔｘ、 Ｒ，： ハイデルベルグ大学、ＢＲＤ学
位論文、１９８４） 、ＤＮＡ合成によりＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨＩフラグメントとして得られる。これに続いて
、マウス細胞系ＡＴ−３０００のジヒドロ葉酸リダクタ
ーゼ遺伝子がある（ｃｈａｎｇら：Ｎａｔｕｒｅ、２７
５ ： ６１７〜６２４．１９７８ ；Ｍａｓｔｅｒｓ
ら：Ｇｅｎｅ、 ２１ ： ５９〜６３．１９８３）。
ーターＰＧ２５のリポソーム結合部位から誘導されて（
Ｇｅｎｔｘ、 Ｒ，： ハイデルベルグ大学、ＢＲＤ学
位論文、１９８４） 、ＤＮＡ合成によりＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨＩフラグメントとして得られる。これに続いて
、マウス細胞系ＡＴ−３０００のジヒドロ葉酸リダクタ
ーゼ遺伝子がある（ｃｈａｎｇら：Ｎａｔｕｒｅ、２７
５ ： ６１７〜６２４．１９７８ ；Ｍａｓｔｅｒｓ
ら：Ｇｅｎｅ、 ２１ ： ５９〜６３．１９８３）。
これは一方、制限酵素ＢｇｆｉＩ［の切断部位が翻訳の
停止コドンの直前に挿入されることによって変化してい
る。さらに、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩは大腸
菌ファージラムダのターミネータ−ｔ （Ｓｃｈｗ
ａｒｒ ら：Ｎａ＋ｕｒｅ、 ２７２ ：４１０
□０
〜４１４．１９７８）、プロモーターを含まないクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子（
Ｍａｒｃｏｌｉ ら： ＦＥＢＳ Ｌｅ口、、１１０：
１１〜１４．１９８０）および大腸菌ｒｒｎＢオペロン
のターミネータ−７１（Ｂｒｏｓｉｕｓ ら：Ｊ。
停止コドンの直前に挿入されることによって変化してい
る。さらに、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩは大腸
菌ファージラムダのターミネータ−ｔ （Ｓｃｈｗ
ａｒｒ ら：Ｎａ＋ｕｒｅ、 ２７２ ：４１０
□０
〜４１４．１９７８）、プロモーターを含まないクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子（
Ｍａｒｃｏｌｉ ら： ＦＥＢＳ Ｌｅ口、、１１０：
１１〜１４．１９８０）および大腸菌ｒｒｎＢオペロン
のターミネータ−７１（Ｂｒｏｓｉｕｓ ら：Ｊ。
Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、、１４８：１０７〜１２７．１
９８１）を含有する。
９８１）を含有する。
ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩは調節可能なプロモーター・／
オペレーター要素Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５０Ｐ ２９なら
びにリポソーム結合部位ＲＢＳｎを含有する。この発現
シグナルの高い効率のために、プラスミドｐＤＳ７８／
ＲＢＳＩＩおよびその誘導体たとえばプラスミドｐＤＳ
７８／ＲＢＳＩＩ。
オペレーター要素Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５０Ｐ ２９なら
びにリポソーム結合部位ＲＢＳｎを含有する。この発現
シグナルの高い効率のために、プラスミドｐＤＳ７８／
ＲＢＳＩＩおよびその誘導体たとえばプラスミドｐＤＳ
７８／ＲＢＳＩＩ。
６ｘＨｉｓは、プロモーター／オペレーター要素がオペ
レーターへのＱａｃリプレッサーの結合によって抑制さ
れている場合にのみ、大腸菌内に安定に維持される。Ｑ
ａｃリプレッサーはＱａｃＩ遺伝子によってコードされ
る。Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５ ０Ｐ ２９は、細胞内に
十分な数のリプレッサー分子が存在する場合にのみ効果
的に抑制される。したがって、リプレッサー遺伝子の発
現増加を導くプロモーター変異体を含有するρａｃＩＱ
対立遺伝子が使用された。この、９ａｃＩ”対立遺伝子
はプラスミドｐＤＭＩ、ｉ中に含有される（第４図およ
び第５図）。このプラスミドはＱａｃＩ遺伝子のほか、
細菌にカナマイシン抵抗を付与し、選択マーカーとして
使用されるｎｅｏ遺伝子ももっている。ｐＤＭＩ、１は
上述のプラスミド類と適合性を示す。このような発現ベ
クターで形質転換される大腸菌細胞は、発現ベクターが
細胞内で安定に維持されることを保証するためにはｐＤ
ＭＩ、１を含まねばならない。このシステムの誘導は、
所望の細胞濃度においてメジウムにＩ ＰＴＧを添加す
ることによって達成される。
レーターへのＱａｃリプレッサーの結合によって抑制さ
れている場合にのみ、大腸菌内に安定に維持される。Ｑ
ａｃリプレッサーはＱａｃＩ遺伝子によってコードされ
る。Ｎ２５ ０ＰＳＮ２５ ０Ｐ ２９は、細胞内に
十分な数のリプレッサー分子が存在する場合にのみ効果
的に抑制される。したがって、リプレッサー遺伝子の発
現増加を導くプロモーター変異体を含有するρａｃＩＱ
対立遺伝子が使用された。この、９ａｃＩ”対立遺伝子
はプラスミドｐＤＭＩ、ｉ中に含有される（第４図およ
び第５図）。このプラスミドはＱａｃＩ遺伝子のほか、
細菌にカナマイシン抵抗を付与し、選択マーカーとして
使用されるｎｅｏ遺伝子ももっている。ｐＤＭＩ、１は
上述のプラスミド類と適合性を示す。このような発現ベ
クターで形質転換される大腸菌細胞は、発現ベクターが
細胞内で安定に維持されることを保証するためにはｐＤ
ＭＩ、１を含まねばならない。このシステムの誘導は、
所望の細胞濃度においてメジウムにＩ ＰＴＧを添加す
ることによって達成される。
プラスミドｐＤＭＩ、１ （第４図および第５図）は、
大腸菌細胞にカナマイシン抵抗性を付与する、トランス
ポゾンＴｎ５からのネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼのｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら：Ｇｅｎｅ、 １９
：３２７〜３３６． １９８２）、およびプロモーター
変異体ＩＱを有しくＣａ１ｏｓ ： Ｎａｔｕｔｅ
、 ２７４ニア６２〜７６５． １９７８）１．Ｑａ
ｃリプレッサーをコードするＱａｃｌ遺伝子（Ｆａｒａ
ｂｏｕｇｈ ： Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４ニア６５
〜７６９． １９７８）をもっている。しかもプラスミ
ドｐＤＭＩ、１は、複製と娘細胞への安定な伝達に必要
なすべての情報を含むプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の領
域（ｃｈａｎｇら： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｔｉｏｌ、、
１３４：１１４１〜１１５６． １９７８） も含
有する。
大腸菌細胞にカナマイシン抵抗性を付与する、トランス
ポゾンＴｎ５からのネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼのｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら：Ｇｅｎｅ、 １９
：３２７〜３３６． １９８２）、およびプロモーター
変異体ＩＱを有しくＣａ１ｏｓ ： Ｎａｔｕｔｅ
、 ２７４ニア６２〜７６５． １９７８）１．Ｑａ
ｃリプレッサーをコードするＱａｃｌ遺伝子（Ｆａｒａ
ｂｏｕｇｈ ： Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４ニア６５
〜７６９． １９７８）をもっている。しかもプラスミ
ドｐＤＭＩ、１は、複製と娘細胞への安定な伝達に必要
なすべての情報を含むプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の領
域（ｃｈａｎｇら： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｔｉｏｌ、、
１３４：１１４１〜１１５６． １９７８） も含
有する。
プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳｎ、６ｘＨｉｓ（第６図
および第７図）の構築には、リポソーム結合部位ＲＢＳ
ＩＩからなるプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎのＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを６個のヒスチジンをコ
ードする領域と合体させた。
および第７図）の構築には、リポソーム結合部位ＲＢＳ
ＩＩからなるプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎのＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを６個のヒスチジンをコ
ードする領域と合体させた。
この目的には、まず、二本鎖ＤＮＡ配列として第６図に
示したヌクレオチド配列の２種の相補性オリゴヌクレオ
チドを前述（例１のＢ）のようにして合成した。凍結乾
燥したオリゴヌクレオチドを水に取り、４℃で１時間を
要して溶解した。
示したヌクレオチド配列の２種の相補性オリゴヌクレオ
チドを前述（例１のＢ）のようにして合成した。凍結乾
燥したオリゴヌクレオチドを水に取り、４℃で１時間を
要して溶解した。
ＤＮＡ濃度は１００ ｎｍｏｌ／ ｍｌとした。リン酸
化のためには２種のオリゴヌクレオチド各１５０ｐｍｏ
ｌを５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ／ＨＣＱ（ｐＨ８，５）お
よび１０ｍＭ ＭｇＣＱ２２ＯｔｔＱ中、２１１１１
１０１のγ−［”２Ｐ］ −ＡＴ Ｐ （５，０００Ｃ
ｉ ／ｍｍｏｌ）および１単位（Ｕ）のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼとともに、３７℃で２０分間インキュベ
ーションした。ついで５＋１ｍｏｌのＡＴＰを加え、さ
らに３７℃で２０分間インキュベーションしたのち、６
５℃に加熱して反応を停止させた。
化のためには２種のオリゴヌクレオチド各１５０ｐｍｏ
ｌを５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ／ＨＣＱ（ｐＨ８，５）お
よび１０ｍＭ ＭｇＣＱ２２ＯｔｔＱ中、２１１１１
１０１のγ−［”２Ｐ］ −ＡＴ Ｐ （５，０００Ｃ
ｉ ／ｍｍｏｌ）および１単位（Ｕ）のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼとともに、３７℃で２０分間インキュベ
ーションした。ついで５＋１ｍｏｌのＡＴＰを加え、さ
らに３７℃で２０分間インキュベーションしたのち、６
５℃に加熱して反応を停止させた。
２種のリン酸化オリゴヌクレオチドとリゲーションする
ためのプラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳｎのＤＮＡは、ま
ず２ｐｍｏｌのプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断することにより製造した。
ためのプラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳｎのＤＮＡは、ま
ず２ｐｍｏｌのプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断することにより製造した。
ＤＮＡをフェノールで抽出し、エーテルで洗浄し、つい
で前述したように酢酸リチウム／イソプロパツールを用
いて沈殿させた。沈降物を乾燥し、２０μＱのＴＥ緩衝
液に取った。リン酸化オリゴヌクレオチドとのリゲーシ
ョンは、ＢａｍＨＩで切断したプラスミドＤＮＡ１．５
ｐｍｏｌを、２単位の７４−ＤＮＡリガーゼを含有する
りガーゼ緩衝液中、リン酸化オリゴヌクレオチド各（３
Ｑｐｍｏｌと１５℃で２時間インキュベーションするこ
とにより行った。６５℃で５分間インキュベーションし
たのち、連結したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断した。ついで、調節可能プロモーターＮ２
５ ０ＰＳＮ２５ ０Ｐ ２９、リポソーム結合部位
ＲＢＳＩＩならびに６個のヒスチジンをコードする領域
を含有するＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（第６図
）をアガロースゲル電気泳動によって単離した。
で前述したように酢酸リチウム／イソプロパツールを用
いて沈殿させた。沈降物を乾燥し、２０μＱのＴＥ緩衝
液に取った。リン酸化オリゴヌクレオチドとのリゲーシ
ョンは、ＢａｍＨＩで切断したプラスミドＤＮＡ１．５
ｐｍｏｌを、２単位の７４−ＤＮＡリガーゼを含有する
りガーゼ緩衝液中、リン酸化オリゴヌクレオチド各（３
Ｑｐｍｏｌと１５℃で２時間インキュベーションするこ
とにより行った。６５℃で５分間インキュベーションし
たのち、連結したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断した。ついで、調節可能プロモーターＮ２
５ ０ＰＳＮ２５ ０Ｐ ２９、リポソーム結合部位
ＲＢＳＩＩならびに６個のヒスチジンをコードする領域
を含有するＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（第６図
）をアガロースゲル電気泳動によって単離した。
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ、６ｘＨｉｓの構築に
は、上述のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、プラ
スミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ中に組込み、このプラス
ミドの元のＸｈｏ Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントを置換
した（第７図）。
は、上述のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、プラ
スミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ中に組込み、このプラス
ミドの元のＸｈｏ Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントを置換
した（第７図）。
この目的では、まず、プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ
のＤＮＡｌｐｍｏｌを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断し、この大ＤＮＡフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。
のＤＮＡｌｐｍｏｌを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断し、この大ＤＮＡフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。
ついで、このフラグメント０． ０５μｍｏｌを、２単
位の７４−ＤＮＡリガーゼを含有するリゲーション緩衝
液中、単離ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントＱ、ｌｐ
ｍｏｌと１５℃で２時間インキュベーションした。プラ
スミドｐＤＭＩ、１を含有する大腸菌Ｍ１５細胞は、Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎの方法（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｘ７ｍｏ１
．、６８ ： ３２６〜３３１．１９７９）に従って形
質転換を行い、調製した。６５℃に７分間加熱したのち
、リゲーション混合物をこれらのコンピーテント細胞２
００μａに加えた。サンプルを水中に３０分間保持した
のち、４２℃で２分間インキュベーションし、ＬＢメジ
ウム０．５ｍｌを加え、さらに３７℃で９０分間インキ
ュベーションした。次に、細胞を１００μｇ ／ ｍｌ
のアンピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌのカナマイシ
ンを含有するＬＢアガールプレート上に接種し、プレー
トを３７℃で一夜インキユベーションした。各コロニー
を無菌のようじで採取し、１００μｇ ／ ｍｌのアン
ピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌのカナマイシン含有
ＬＢメジウム１０ｍ１を含む試験管に移し、振盪インキ
ュベーターで１２時間インキュベーションした。次に細
胞を沈降させ、プラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ
＆ Ｄｏ１７の方法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
。
位の７４−ＤＮＡリガーゼを含有するリゲーション緩衝
液中、単離ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントＱ、ｌｐ
ｍｏｌと１５℃で２時間インキュベーションした。プラ
スミドｐＤＭＩ、１を含有する大腸菌Ｍ１５細胞は、Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎの方法（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｘ７ｍｏ１
．、６８ ： ３２６〜３３１．１９７９）に従って形
質転換を行い、調製した。６５℃に７分間加熱したのち
、リゲーション混合物をこれらのコンピーテント細胞２
００μａに加えた。サンプルを水中に３０分間保持した
のち、４２℃で２分間インキュベーションし、ＬＢメジ
ウム０．５ｍｌを加え、さらに３７℃で９０分間インキ
ュベーションした。次に、細胞を１００μｇ ／ ｍｌ
のアンピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌのカナマイシ
ンを含有するＬＢアガールプレート上に接種し、プレー
トを３７℃で一夜インキユベーションした。各コロニー
を無菌のようじで採取し、１００μｇ ／ ｍｌのアン
ピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌのカナマイシン含有
ＬＢメジウム１０ｍ１を含む試験管に移し、振盪インキ
ュベーターで１２時間インキュベーションした。次に細
胞を沈降させ、プラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ
＆ Ｄｏ１７の方法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
。
７ ：１５１５〜１５２３．１９７９）に従って単離し
た。
た。
単離プラスミド各０．２μｇを、制限酵素ＸｈｏＩおよ
びＢａｍＨＩで切断して、調節可能オペレーター／レプ
レッサー要素Ｎ２５０ＰＳＮ２５ＰＯ２９，リポソーム
結合部位ＲＢＳＩＩならびに６個のヒスチジンをコード
する領域を含有するフラグメントがこれらのプラスミド
中に存在するか否かを調べた。このフラグメントを含む
プラスミドをｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉ ｓと
命名した（第７図）。
びＢａｍＨＩで切断して、調節可能オペレーター／レプ
レッサー要素Ｎ２５０ＰＳＮ２５ＰＯ２９，リポソーム
結合部位ＲＢＳＩＩならびに６個のヒスチジンをコード
する領域を含有するフラグメントがこれらのプラスミド
中に存在するか否かを調べた。このフラグメントを含む
プラスミドをｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉ ｓと
命名した（第７図）。
ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ１．６ｘＨｉｓ中に正しい配列が
存在することを明らかにするためには、γ−［３２Ｐ］
−ＡＴＰ標識スターター配列（プライマー）を用いて、
二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列決定を行った。スタ
ーター配列は、プラスミドｐ Ｄ Ｓ ７８ ／ ＲＢ
Ｓ ＩＩの位置８９〜１０８のヌクレオチドを含有す
る。この単離プラスミドＤＮＡ０． ３μｍｏｌをアル
コールで沈殿させ、沈降物を８０％エタノールで１回洗
浄し、乾燥し、最後に１／４ ７Ｅ緩衝液８μＱに溶解
した。サンプルを９５℃で５分間インキュベーションし
、０℃に冷却し、遠心分離した（エッペンドルフ・ベン
チ・セントリフエージ、２分、１２．０００ｒｐｍ ）
。スターター配列１． ５μｍｏｌを容量２μａとして
加え、サンプルを最初９５℃で２分間、ついで４２℃で
５分間インキュベーションした。ついで、ＤＮＡの配列
をＳａｎｇｅｒら（Ｐ＋ｏｃ、 Ｎａｐ。
存在することを明らかにするためには、γ−［３２Ｐ］
−ＡＴＰ標識スターター配列（プライマー）を用いて、
二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列決定を行った。スタ
ーター配列は、プラスミドｐ Ｄ Ｓ ７８ ／ ＲＢ
Ｓ ＩＩの位置８９〜１０８のヌクレオチドを含有す
る。この単離プラスミドＤＮＡ０． ３μｍｏｌをアル
コールで沈殿させ、沈降物を８０％エタノールで１回洗
浄し、乾燥し、最後に１／４ ７Ｅ緩衝液８μＱに溶解
した。サンプルを９５℃で５分間インキュベーションし
、０℃に冷却し、遠心分離した（エッペンドルフ・ベン
チ・セントリフエージ、２分、１２．０００ｒｐｍ ）
。スターター配列１． ５μｍｏｌを容量２μａとして
加え、サンプルを最初９５℃で２分間、ついで４２℃で
５分間インキュベーションした。ついで、ＤＮＡの配列
をＳａｎｇｅｒら（Ｐ＋ｏｃ、 Ｎａｐ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７４ ： ５
４６３〜６５６７゜１９７７）の方法に従って決定した
。放射性標識プライマーを使用したために、反応はすべ
て非標識デオキシヌクレオチド三リン酸を用いて実施し
た。ＤＮＡ配列解析の結果は、ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ
、６ｘＨｉｓが第６図に掲げた配列を含有することを示
している。
４６３〜６５６７゜１９７７）の方法に従って決定した
。放射性標識プライマーを使用したために、反応はすべ
て非標識デオキシヌクレオチド三リン酸を用いて実施し
た。ＤＮＡ配列解析の結果は、ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ
、６ｘＨｉｓが第６図に掲げた配列を含有することを示
している。
例３
プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲの構築＾）原
理 プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲの構築には、
制限酵素ＢａｍＨＩで線状化したプラスミドｐＤＳ７８
／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓを合成的に製造したｅｎｖ（
６０）遺伝子と連結させた（第８図）。
理 プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲの構築には、
制限酵素ＢａｍＨＩで線状化したプラスミドｐＤＳ７８
／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓを合成的に製造したｅｎｖ（
６０）遺伝子と連結させた（第８図）。
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ４ｐｍｏｌを制限酵
素ＢａｍＨＩで切断した。次に、このＤＮＡをｃｔｐ
（ウシ小腸ホスファターゼ）で処理した。
素ＢａｍＨＩで切断した。次に、このＤＮＡをｃｔｐ
（ウシ小腸ホスファターゼ）で処理した。
次に、酵素を熱失活させ、サンプル緩衝液を添加したの
ち、ＤＮＡを１％低融点アガロースゲル中で分離した。
ち、ＤＮＡを１％低融点アガロースゲル中で分離した。
エチジウムプロミドで染色したのち、相当するＤＮＡバ
ンドをＵＶ光線（３００ｎｍ）下に切り取り、標準方法
（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）に従ってＤＮＡを抽出し
た。
ンドをＵＶ光線（３００ｎｍ）下に切り取り、標準方法
（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）に従ってＤＮＡを抽出し
た。
ント２）の調製
この遺伝子の調製は例１に記載しである。
Ｄ）プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＨの製造
０．０５μｍｏｌのフラグメント１および０．１μｍｏ
Ｉのフラグメント２をＩＵのＴ４リガーゼとインキュ
ベーションした（１５℃、２時間）。酵素を熱失活させ
たのち、プラスミドｐＤＭＩ、１を含有する大腸菌株Ｍ
１５を、このＤＮＡで形質転換した。細胞を、１００μ
ｇ ／ ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌ
のカナマイシンを含有するＬＢアガールプレート上に接
種した。このプレートを３７℃で１５時間インキュベー
ションした。
Ｉのフラグメント２をＩＵのＴ４リガーゼとインキュ
ベーションした（１５℃、２時間）。酵素を熱失活させ
たのち、プラスミドｐＤＭＩ、１を含有する大腸菌株Ｍ
１５を、このＤＮＡで形質転換した。細胞を、１００μ
ｇ ／ ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ ／ ｍｌ
のカナマイシンを含有するＬＢアガールプレート上に接
種した。このプレートを３７℃で１５時間インキュベー
ションした。
リゲーションで約５００個のコロニーが得られた。
各コロニーをそれぞれ、１０ｍ１のＬＢメジウムに移し
、３７℃で一夜生育させ、ついでプラスミドＤＮＡを標
準方法（Ｍａｎｉａｊｉａら：前出）に従って単離した
。
、３７℃で一夜生育させ、ついでプラスミドＤＮＡを標
準方法（Ｍａｎｉａｊｉａら：前出）に従って単離した
。
（６０）遺伝子の配列解析
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉｓのＢａ
ｍＨＩ部位に正しいＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子
配列が正しい方向性で存在することを明らかにするため
、二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列を、［γ−３２Ｐ
］ −ＡＴＰで標識したスターター配列（プライマー）
を用いて決定した。
ｍＨＩ部位に正しいＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子
配列が正しい方向性で存在することを明らかにするため
、二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列を、［γ−３２Ｐ
］ −ＡＴＰで標識したスターター配列（プライマー）
を用いて決定した。
単離プラスミドＤＮＡ０．３ｐｍｏｌをアルコールで沈
殿させ、沈降物を１回８０％エタノールで洗浄し、乾燥
し、最後に１／４ＴＥ緩衝液８μａに溶解した。放射性
標識スターター配列２ｐｍｏｌを加えたのち、サンプル
を最初９５℃で２分間、ついで４２℃で５分間インキュ
ベーションした。次にＤＮＡをＳ＠ｎｇｅｔらの方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ、Ａｃａｄ。
殿させ、沈降物を１回８０％エタノールで洗浄し、乾燥
し、最後に１／４ＴＥ緩衝液８μａに溶解した。放射性
標識スターター配列２ｐｍｏｌを加えたのち、サンプル
を最初９５℃で２分間、ついで４２℃で５分間インキュ
ベーションした。次にＤＮＡをＳ＠ｎｇｅｔらの方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７４：５４６３〜６５６７．１９
７７）に従って配列決定した。配列解析の結果は、正し
いＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子配列が、プラスミ
ドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓのＢａｍＨＩ制
限部位に組込まれたことを示している。
７７）に従って配列決定した。配列解析の結果は、正し
いＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子配列が、プラスミ
ドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓのＢａｍＨＩ制
限部位に組込まれたことを示している。
胆
プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）の構築Ａ）原
理 プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）の構築には、
制限酵素Ｂｇｆｉｎで線状化したプラスミドｐＤｓ７８
／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉｓを合成的に製造したｅｎｖ（
６０）遺伝子と連結させた（第９図）。
理 プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）の構築には、
制限酵素Ｂｇｆｉｎで線状化したプラスミドｐＤｓ７８
／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉｓを合成的に製造したｅｎｖ（
６０）遺伝子と連結させた（第９図）。
製
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６ｘＨｉｓ４ｐｍ
ｏｌを制限酵素ＢｇＱＩ［で切断した。次に、このＤＮ
ＡをＣＩＰ （ウシ小腸ホスファターゼ）で処理した。
ｏｌを制限酵素ＢｇＱＩ［で切断した。次に、このＤＮ
ＡをＣＩＰ （ウシ小腸ホスファターゼ）で処理した。
次に、酵素を加熱失活させ、サンプル緩衝液を添加した
のち、ＤＮＡを１％低融点アガロースゲル中で分離した
。エチジウムプロミドで染色したのち、相当するＤＮＡ
バンドをＵＶ光線（３００１ｍ）下に切り取り、標準方
法（Ｍａｎｉａｆｉｓら：前出）に従ってＤＮＡを抽出
した。
のち、ＤＮＡを１％低融点アガロースゲル中で分離した
。エチジウムプロミドで染色したのち、相当するＤＮＡ
バンドをＵＶ光線（３００１ｍ）下に切り取り、標準方
法（Ｍａｎｉａｆｉｓら：前出）に従ってＤＮＡを抽出
した。
Ｃ）ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子（フラグメこの
遺伝子の調製は例１に記載しである。
遺伝子の調製は例１に記載しである。
Ｄ）プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）の製造
０．０５ｐｍｏｌのフラグメント１および０． １ｐｍ
ｏ ｌのフラグメント２をＩＵのＴ４リガーゼとともに
インキュベーションした（１５℃、２時間）。
ｏ ｌのフラグメント２をＩＵのＴ４リガーゼとともに
インキュベーションした（１５℃、２時間）。
酵素を熱失活させたのち、このＤＮＡで、プラスミドｐ
ＤＩ、１を含有する大腸菌株Ｍ１５を形質転換した。細
胞を１００μｇ ／ ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ ／ ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガールプ
レート上に接種した。プレートを３７℃で１５時間イン
キュベーションした。リゲーションにより約５００個の
コロニーが得られた。
ＤＩ、１を含有する大腸菌株Ｍ１５を形質転換した。細
胞を１００μｇ ／ ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ ／ ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガールプ
レート上に接種した。プレートを３７℃で１５時間イン
キュベーションした。リゲーションにより約５００個の
コロニーが得られた。
各コロニーをそれぞれＬＢメジウム１０ｍ１中、３７℃
で一夜生育させ、ついでプラスミドＤＮＡを標準方法（
Ｍａｎｉａｊｉｓら：前出）に従って単離した。
で一夜生育させ、ついでプラスミドＤＮＡを標準方法（
Ｍａｎｉａｊｉｓら：前出）に従って単離した。
遺伝子の配列解析
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘＨｉｓのＢｇ
ｆｉｎ部位に正しいＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子
配列が正しい方向性で存在することを明らかにするため
、二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列を、［γ−”２Ｐ
］ −ＡＴＰで標識したスターター配列（プライマー）
を用いて決定した。
ｆｉｎ部位に正しいＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子
配列が正しい方向性で存在することを明らかにするため
、二本鎖環状プラスミドＤＮＡの配列を、［γ−”２Ｐ
］ −ＡＴＰで標識したスターター配列（プライマー）
を用いて決定した。
単離プラスミドＤＮＡ０．３ｐｍｏｌをアルコールで沈
殿させ、沈降物を１回８０％エタノールで洗浄し、乾燥
し、最後に１／４７Ｅ緩衝液８μρに溶解した。放射性
標識スターター配列２ｐｍｏｌを加えたのち、サンプル
を最初９５℃で２分間、ついで４２℃で５分間インキュ
ベーションした。次にＤＮＡをＳａｎｇｅｒらの方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ。Ａｃａｄ。
殿させ、沈降物を１回８０％エタノールで洗浄し、乾燥
し、最後に１／４７Ｅ緩衝液８μρに溶解した。放射性
標識スターター配列２ｐｍｏｌを加えたのち、サンプル
を最初９５℃で２分間、ついで４２℃で５分間インキュ
ベーションした。次にＤＮＡをＳａｎｇｅｒらの方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ。Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５４６３〜６５６７．１．９７
７）に従って配列決定した。配列解析の結果は、正しい
ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子配列が、プラスミド
ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘｆ（ｉ ｓのＢｇＱｎ制
限酵素部位に組込まれたことを示している。
７）に従って配列決定した。配列解析の結果は、正しい
ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子配列が、プラスミド
ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩ［，６ｘｆ（ｉ ｓのＢｇＱｎ制
限酵素部位に組込まれたことを示している。
例５
反応性
＾）原理
ＨＩＶ−２に感染した患者の血清中の抗体によって認識
される抗原決定基がｅｎｖ（６０）遺伝子によりコード
されていることを明らかにするため、大腸菌内でポリペ
プチドＥＮＶ （６０）−ＤＨＦＲおよびＤＨＦＲ−Ｅ
ＮＶ （６０）を発現させ、ついでニトロセルロースフ
ィルターに遷移させ、適当な血清とインキュベーション
した。
される抗原決定基がｅｎｖ（６０）遺伝子によりコード
されていることを明らかにするため、大腸菌内でポリペ
プチドＥＮＶ （６０）−ＤＨＦＲおよびＤＨＦＲ−Ｅ
ＮＶ （６０）を発現させ、ついでニトロセルロースフ
ィルターに遷移させ、適当な血清とインキュベーション
した。
ＨＩＶ−ＩＥＮＶ （８０） −ＤＨＦＲポリヘプチド
（ｃｅｒｔａら：ＥＭＢＯＪ、、５：３０５１””３０
５６．１９８６）を対照として用いた。
（ｃｅｒｔａら：ＥＭＢＯＪ、、５：３０５１””３０
５６．１９８６）を対照として用いた。
プラスミドｐＤＭＩ、１を含有する大腸菌Ｍ１５細胞を
プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲまたはｐＤＨ
ＦＲ−ｅｎｖ （６０）で形質転換し、１００μｇ ／
ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンを含有するＬＢメジウム（Ｍａｎｉ＠ｔｉｔら：前
出）中で生育させた。培養液を光学密度０Ｄ６ｏｏ＝０
．７においてＩＰＴＧ（最終濃度２ｍＭ）で誘導し、さ
らに４時間生育させた。
プラスミドｐｅｎｖ （６０）−ＤＨＦＲまたはｐＤＨ
ＦＲ−ｅｎｖ （６０）で形質転換し、１００μｇ ／
ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンを含有するＬＢメジウム（Ｍａｎｉ＠ｔｉｔら：前
出）中で生育させた。培養液を光学密度０Ｄ６ｏｏ＝０
．７においてＩＰＴＧ（最終濃度２ｍＭ）で誘導し、さ
らに４時間生育させた。
ついで遠心分離によって細胞を収穫した。
の解析
細胞培養液５０μＱを、３％ＳＤＳ、３％β−メルカプ
トエタノールおよび２０％グリセロール含有１２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（１２，ｐＨ６，８に再懸濁した。こ
のサンプルを５分間煮沸し、ついで１２．５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（υ、に、 Ｌａｅｍｍｌｉ
：Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７ ： ６８０〜６８５．１
９７０）を用いて分離した。タンパク質バンドはクーマ
ツシーブルー染色を用いて発色させた（第１０図、上図
）。
トエタノールおよび２０％グリセロール含有１２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（１２，ｐＨ６，８に再懸濁した。こ
のサンプルを５分間煮沸し、ついで１２．５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（υ、に、 Ｌａｅｍｍｌｉ
：Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７ ： ６８０〜６８５．１
９７０）を用いて分離した。タンパク質バンドはクーマ
ツシーブルー染色を用いて発色させた（第１０図、上図
）。
誘導細胞培養液（上記Ｂ参照）、大腸菌対照溶解物およ
び精製ＨＩＶ−ＩＥＮＶ （８０）−ＤＨＦＲポリペプ
チド（各レーンに１μｇ）を上記Ｃに記載したようにし
て電気泳動で（２ゲル）分離した。非染色ゲルをそれぞ
れニトロセルロース膜で被覆した。被覆ゲルそれぞれを
次に２枚の濾紙で覆い、遷移チャンバー内に移した。こ
れを遷移緩衝液（１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタ
ノール含有２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，３）で満た
し、ポリペプチドの遷移は４℃、アンペア数１０ＱｍＡ
で１２時間実施した。次に、ニトロセルロース膜を、最
初、５％乾燥スキムミルク含有ＰＢＳ中室温で４時間イ
ンキュベーションした（Ｍａｎｉａｊｉｓら：前出）。
び精製ＨＩＶ−ＩＥＮＶ （８０）−ＤＨＦＲポリペプ
チド（各レーンに１μｇ）を上記Ｃに記載したようにし
て電気泳動で（２ゲル）分離した。非染色ゲルをそれぞ
れニトロセルロース膜で被覆した。被覆ゲルそれぞれを
次に２枚の濾紙で覆い、遷移チャンバー内に移した。こ
れを遷移緩衝液（１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタ
ノール含有２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，３）で満た
し、ポリペプチドの遷移は４℃、アンペア数１０ＱｍＡ
で１２時間実施した。次に、ニトロセルロース膜を、最
初、５％乾燥スキムミルク含有ＰＢＳ中室温で４時間イ
ンキュベーションした（Ｍａｎｉａｊｉｓら：前出）。
ついで、ニトロセルロース膜の一方は５％乾燥スキムミ
ルクと１：１０００希釈ＨＩＶ−１陽性血清を含むＰＢ
Ｓ中、室温で４時間インキュベーションし、他方の膜は
５％スキムミルクと１ ： １０００希釈ＨＩＶ−２陽
性血清を含むＰＢＳ中、室温で４時間インキュベーショ
ンした。次に、ニトロセルロース膜を０．３％ Ｔｗｅ
ｅｎ −２０含有ＰＢＳでまず３回洗浄したのち、０．
３％ Ｔｗｅｅｎ２０．５％ヤギ血清および１：２００
０希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ抱合体を含
むＰＢＳ中、室温で１時間インキュベーションした。Ｐ
ＢＳで３回洗浄したのち、抗体と反応したニトロセルロ
ース膜上のタンパク質バンドを、４−クロロ−１−ナフ
トール５μｇと３０％過酸化水素５μρを含むＰＢＳ２
５ｍｌ中でインキュベーションして発色させた。反応は
ＰＢＳを加えて停止させた。
ルクと１：１０００希釈ＨＩＶ−１陽性血清を含むＰＢ
Ｓ中、室温で４時間インキュベーションし、他方の膜は
５％スキムミルクと１ ： １０００希釈ＨＩＶ−２陽
性血清を含むＰＢＳ中、室温で４時間インキュベーショ
ンした。次に、ニトロセルロース膜を０．３％ Ｔｗｅ
ｅｎ −２０含有ＰＢＳでまず３回洗浄したのち、０．
３％ Ｔｗｅｅｎ２０．５％ヤギ血清および１：２００
０希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ抱合体を含
むＰＢＳ中、室温で１時間インキュベーションした。Ｐ
ＢＳで３回洗浄したのち、抗体と反応したニトロセルロ
ース膜上のタンパク質バンドを、４−クロロ−１−ナフ
トール５μｇと３０％過酸化水素５μρを含むＰＢＳ２
５ｍｌ中でインキュベーションして発色させた。反応は
ＰＢＳを加えて停止させた。
第１０図から明らかなように、ＥＮＶ （６０）−ＤＨ
ＦＲ＃よびＤＨＦＲ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドは
ＨＩＶ−２に感染した患者の血清中の抗体によってのみ
認識される。一方、ＥＮＶ （８Ｑ）−ＤＨＦＲポリペ
プチドはＨＩＶ−１に感染した患者の血清中の抗体によ
ってのみ認識される。
ＦＲ＃よびＤＨＦＲ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドは
ＨＩＶ−２に感染した患者の血清中の抗体によってのみ
認識される。一方、ＥＮＶ （８Ｑ）−ＤＨＦＲポリペ
プチドはＨＩＶ−１に感染した患者の血清中の抗体によ
ってのみ認識される。
例６
プラスミドｐＲＢｓＩＩ−６ｘＨｉ ｓの構築には、プ
ラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩを使用した。このプラ
スミドおよびプラスミドｐＤＭＩ、１で形質転換した大
腸菌細胞は、ブダペスト条約に基づき、ドイツ微生物寄
託機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇｖａｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｉｎ Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ ）に１９８７年１２月２３日付で寄託さ
れている［大腸菌Ｍ１５ （ｐＤＳ５６／ＢＳＩＩ ：
ｐＤＭＩ、１）。
ラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩを使用した。このプラ
スミドおよびプラスミドｐＤＭＩ、１で形質転換した大
腸菌細胞は、ブダペスト条約に基づき、ドイツ微生物寄
託機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇｖａｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｉｎ Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ ）に１９８７年１２月２３日付で寄託さ
れている［大腸菌Ｍ１５ （ｐＤＳ５６／ＢＳＩＩ ：
ｐＤＭＩ、１）。
ＤＳＭ Ｎａ４３３０］。
制限酵素ＸｂａＩとＸｈｏＩの切断部位の間にあって複
製領域ならびに細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ
−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有するｐＤＳ５
６／ＲＢＳＩＩの部分（第１１図及び第１２図）は、は
じめプラスミドｐＲＢ３２２ （Ｂｏｌｉｖｅ＋ら：前
出； ！１ｏｔｃｌＮＩｅ ：前出）から誘導する。
製領域ならびに細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ
−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有するｐＤＳ５
６／ＲＢＳＩＩの部分（第１１図及び第１２図）は、は
じめプラスミドｐＲＢ３２２ （Ｂｏｌｉｖｅ＋ら：前
出； ！１ｏｔｃｌＮＩｅ ：前出）から誘導する。
しかしながら、β−ラクタマーゼの遺伝子は他方、制限
酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断部位が消失する
ように修飾される。
酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断部位が消失する
ように修飾される。
ＤＮＡ配列におけるこの変化は、しかし、β−ラクタマ
ーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミドの残り
の部分は、調節可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９とそれに続くリポソーム結合
部位ＲＢＳＩＩを有し、これはＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
フラグメントの部分である。さらに続いて、大腸菌ファ
ージラムダのターミネータ−ｔ （Ｓｃｈｗａｒｘ
ら：前出）、プロモーターを含まないクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（Ｍａｒｃｏｌｉ
ら：前出）および大腸菌ｒｒｎＢオペロンのターミネー
タ−Ｔ Ｉ （Ｂｒｏｓｉｕｓ ら：前出）がある。
ーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミドの残り
の部分は、調節可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９とそれに続くリポソーム結合
部位ＲＢＳＩＩを有し、これはＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
フラグメントの部分である。さらに続いて、大腸菌ファ
ージラムダのターミネータ−ｔ （Ｓｃｈｗａｒｘ
ら：前出）、プロモーターを含まないクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（Ｍａｒｃｏｌｉ
ら：前出）および大腸菌ｒｒｎＢオペロンのターミネー
タ−Ｔ Ｉ （Ｂｒｏｓｉｕｓ ら：前出）がある。
発現シグナルＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９およびＲＢＳ
ｎの高い効率のために、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ
Ｉ［およびその誘導体たとえばプラスミドｐＲＢＳＩ！
−６ｘＨｔ ｓは、プロモーター／オペレーター要素が
オペレーターへのβａＣリプレッサーの結合によって抑
制されている場合にのみ、大腸菌細胞内で安定に維持さ
れる（この点については、例２、Ａ参照）。
ｎの高い効率のために、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ
Ｉ［およびその誘導体たとえばプラスミドｐＲＢＳＩ！
−６ｘＨｔ ｓは、プロモーター／オペレーター要素が
オペレーターへのβａＣリプレッサーの結合によって抑
制されている場合にのみ、大腸菌細胞内で安定に維持さ
れる（この点については、例２、Ａ参照）。
Ｂ）プラスミドｐＲＢＳＩＩ−６ｘＨｉｓの構築（１）
プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ２ｐｍｏｌを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。サンプルを後処理したの
ち、切断したプラスミドＤＮＡに５０ｐｍｏ ｌのリン
酸化アダプター（６個のヒスチジンをコードする）を加
え、サンプルを前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼとイン
キュベーションした。
プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ２ｐｍｏｌを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。サンプルを後処理したの
ち、切断したプラスミドＤＮＡに５０ｐｍｏ ｌのリン
酸化アダプター（６個のヒスチジンをコードする）を加
え、サンプルを前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼとイン
キュベーションした。
リゲーション混合物を後処理したのち、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＸｂａＩでＤＮＡを切断し、６個のヒスチジン、
ターミネータ−ｔ、ｃａｔ遺伝遺伝 子上びターミネータ−Ｔ１をコードする領域を含むＢａ
ｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した（第１３図）。
ＨＩとＸｂａＩでＤＮＡを切断し、６個のヒスチジン、
ターミネータ−ｔ、ｃａｔ遺伝遺伝 子上びターミネータ−Ｔ１をコードする領域を含むＢａ
ｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した（第１３図）。
（２）プラスミドＩ）ＤＳ５６／ＲＢＳＩ［２ｐｍｏｌ
を制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、複製領域、
ｂＱａ遺伝子、プロモーターＮ２５ ０ＰＳＮ２５ ０
Ｐ ２９とリポソーム結合部位ＲＢＳ■を含むＸｂａ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動
で単離した（第１４図）。
を制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、複製領域、
ｂＱａ遺伝子、プロモーターＮ２５ ０ＰＳＮ２５ ０
Ｐ ２９とリポソーム結合部位ＲＢＳ■を含むＸｂａ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動
で単離した（第１４図）。
（３）単離したフラグメント各０． ｌｐｍｏｌをリ
ゲーションさせ、ついで、前述（例２）のようにして大
腸菌株Ｍ１５ （ｐＤＭＩ、１）の形質転換を行った。
ゲーションさせ、ついで、前述（例２）のようにして大
腸菌株Ｍ１５ （ｐＤＭＩ、１）の形質転換を行った。
プレート上に置いてインキュベーションしたのち（例２
、Ｂ）、各コロニーを前述のようにして１０ｍ１のメジ
ウム中で生育させ、Ｂｉｔｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙの方
法（前出）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。酵素
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる制限解析の結果、プラ
スミドは２つの所望のフラグメントを含むことが明らか
にされた。これらのプラスミドをｐＲＢｓＩｒ−６ｘＨ
ｉ ｓと命名した（第１４図）。
、Ｂ）、各コロニーを前述のようにして１０ｍ１のメジ
ウム中で生育させ、Ｂｉｔｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙの方
法（前出）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。酵素
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる制限解析の結果、プラ
スミドは２つの所望のフラグメントを含むことが明らか
にされた。これらのプラスミドをｐＲＢｓＩｒ−６ｘＨ
ｉ ｓと命名した（第１４図）。
例７
の構築
＾）原理
プラスミドｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａｇ
（４１９）−ｅｎｖ （６０） −６ｘＨｉ ｓの構築
には、ＨＩＶ−２遺伝子ｅｎｖ（６０）ならびにＨＩＶ
−１遺伝子ｅ ｎ ｖ （８０）とｇａｇ（４１９）を
、発現ベクターｐＲＢＳＩＩ−６ｘＨｉｓで連結した。
（４１９）−ｅｎｖ （６０） −６ｘＨｉ ｓの構築
には、ＨＩＶ−２遺伝子ｅｎｖ（６０）ならびにＨＩＶ
−１遺伝子ｅ ｎ ｖ （８０）とｇａｇ（４１９）を
、発現ベクターｐＲＢＳＩＩ−６ｘＨｉｓで連結した。
Ｂ）プラスミドｐＲＢｓｎ−６ｘＨｉ ｓの制限酵プラ
スミドｐＲＢ Ｓ Ｉ！−６ｘＨｉ ｓ ２ｐｍｏｌを
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇ、ｆ２１１１０単位で切
断した。サンプル緩衝液を加えたのち、ＤＮＡを１％ア
ガロースゲル上で分離した。エチジウムプロミドで染色
したのち、プラスミドＤＮＡに相当するバンドをＵＶ光
線（３００＋＋ｍ）下に切り出し、電気溶出により溶出
した（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）。
スミドｐＲＢ Ｓ Ｉ！−６ｘＨｉ ｓ ２ｐｍｏｌを
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇ、ｆ２１１１０単位で切
断した。サンプル緩衝液を加えたのち、ＤＮＡを１％ア
ガロースゲル上で分離した。エチジウムプロミドで染色
したのち、プラスミドＤＮＡに相当するバンドをＵＶ光
線（３００＋＋ｍ）下に切り出し、電気溶出により溶出
した（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）。
ついで、精製ＤＮＡの末端をホスファターゼで脱リン酸
化した。次に、ＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１
，：１）で抽出し、エタノールで沈殿させ、１／４ ７
Ｅ緩衝液に溶解した。
化した。次に、ＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１
，：１）で抽出し、エタノールで沈殿させ、１／４ ７
Ｅ緩衝液に溶解した。
Ｃ）ＨＩＶ−Ｉｇａｇ （４１９）遺伝子の調製ＨＩＶ
−Ｉｇａｇ遺伝子の５ｓｔＩ／ＢｇＱ■フラグメント（
そのヌクレオチド配列は第１６図に示す）を含有するプ
ラスミドｐＵ−ＧＡＧ２ｐｍｏ ｌを１２単位の制限酵
素ＸｍｎＩで消化した。
−Ｉｇａｇ遺伝子の５ｓｔＩ／ＢｇＱ■フラグメント（
そのヌクレオチド配列は第１６図に示す）を含有するプ
ラスミドｐＵ−ＧＡＧ２ｐｍｏ ｌを１２単位の制限酵
素ＸｍｎＩで消化した。
次にＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１： １）で
抽出し、２容のエタノールにより一２０℃で沈殿させた
。ＤＮＡペレットを１０ｍＭ ＭｇＣＱ２．１０ｍＭ
ＤＴＴ、０． ５ｍＭ ＡＴＰ、１００１００ｐ
のリン酸化１０７−１０７−Ｂａリンカ−（５′−ＣＣ
ＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’ ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，６）５０μρ中に再懸濁した。１
単位の７４−ＤＮＡリガーゼを添加したのち、混合物を
１４℃で一夜インキユベーションした。ついで混合物を
６５℃で１０分間インキュベーションし、制限酵素緩衝
液で容量を１００μａとした。
抽出し、２容のエタノールにより一２０℃で沈殿させた
。ＤＮＡペレットを１０ｍＭ ＭｇＣＱ２．１０ｍＭ
ＤＴＴ、０． ５ｍＭ ＡＴＰ、１００１００ｐ
のリン酸化１０７−１０７−Ｂａリンカ−（５′−ＣＣ
ＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’ ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，６）５０μρ中に再懸濁した。１
単位の７４−ＤＮＡリガーゼを添加したのち、混合物を
１４℃で一夜インキユベーションした。ついで混合物を
６５℃で１０分間インキュベーションし、制限酵素緩衝
液で容量を１００μａとした。
１００単位のＢａｍＨＩと１０単位のＨｉｎｄ■を加え
、ついで混合物を３７℃で３時間インキュベーションし
た。次にＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、
エタノールで沈殿させた。
、ついで混合物を３７℃で３時間インキュベーションし
た。次にＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、
エタノールで沈殿させた。
ＤＮＡのペレットをサンプル緩衝液に溶解し、６％ポリ
アクリルアミドゲル上で分離した。エチジウムプロミド
で染色したのち、２５０塩基対をもつバンドを切り出し
、電気溶出で単離した。
アクリルアミドゲル上で分離した。エチジウムプロミド
で染色したのち、２５０塩基対をもつバンドを切り出し
、電気溶出で単離した。
ＨＩＶ−Ｉｇａｇ遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
（そのヌクレオチド配列は第１７図に示す）を含有する
プラスミドｐ２−３Ｕ／Ｈｉｎｄ■１０の２ｐｍｏｌを
１１単位のＢｇｐＩＩにより３７°Ｃで１時間消化し、
６５℃に１０分間加熱し、室温に冷却し、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼのフレノウフラグメントと４５分間インキ
ュベーションした。
（そのヌクレオチド配列は第１７図に示す）を含有する
プラスミドｐ２−３Ｕ／Ｈｉｎｄ■１０の２ｐｍｏｌを
１１単位のＢｇｐＩＩにより３７°Ｃで１時間消化し、
６５℃に１０分間加熱し、室温に冷却し、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼのフレノウフラグメントと４５分間インキ
ュベーションした。
次に、ＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）で
抽出し、エタノールで沈殿させ、１０ｍＭＭｇＣＱ２．
１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ。
抽出し、エタノールで沈殿させ、１０ｍＭＭｇＣＱ２．
１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ。
１、００ ｐｍｏｌのリン酸化１２７−ＢｇＦＩＩ−リ
ンカ−（５’ −ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’ ）
および１単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ（ｐＨ７，６）５０μρ中に取り
、１４°Ｃで一夜インキユベーションした。反応混合物
をついで６５℃に加熱し、制限酵素緩衝液で容量を１０
０μａとした。ＢｇｆｉｎｌＯＯ単位を加えたのち、混
合物を３７℃で３時間インキュベーションした。
ンカ−（５’ −ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’ ）
および１単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ（ｐＨ７，６）５０μρ中に取り
、１４°Ｃで一夜インキユベーションした。反応混合物
をついで６５℃に加熱し、制限酵素緩衝液で容量を１０
０μａとした。ＢｇｆｉｎｌＯＯ単位を加えたのち、混
合物を３７℃で３時間インキュベーションした。
ＮａＣＱ （最終濃度５０ｍＭ）を加えたのち、Ｈｉｎ
ｄｍｌＯ単位を加え、混合物を３７°Ｃで１時間インキ
ュベーションした。フェノール：クロロホルム（１：
１）で抽出したのち、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
ついて１％アガロースゲル上で分離した。１０２０塩基
対をもつフラグメントを切り出し、電気溶出によって単
離精製した。
ｄｍｌＯ単位を加え、混合物を３７°Ｃで１時間インキ
ュベーションした。フェノール：クロロホルム（１：
１）で抽出したのち、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
ついて１％アガロースゲル上で分離した。１０２０塩基
対をもつフラグメントを切り出し、電気溶出によって単
離精製した。
ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌｌ［フラグメントおよびＨｉｎ
ｄＴ［［−ＢｇＱ■フラグメント各１ｐｍｏｌを、１単
位の７４−ＤＮＡリガーゼを用いてたがいに連結した。
ｄＴ［［−ＢｇＱ■フラグメント各１ｐｍｏｌを、１単
位の７４−ＤＮＡリガーゼを用いてたがいに連結した。
リガーゼを熱失活させたのち、リゲーションしたフラグ
メントをＢａｍＨＩとＢｇＱＩＩで切断し、１％アガロ
ースゲル上で分離した。
メントをＢａｍＨＩとＢｇＱＩＩで切断し、１％アガロ
ースゲル上で分離した。
ＨＩＶｇａｇ （４１９）遺伝子に相当するフラグメン
トを電気溶出によって単離精製した。
トを電気溶出によって単離精製した。
Ｄ）ＨＩＶ−１，ｅ ｎｖ （８０）遺伝子の調製ＨＩ
Ｖ−１ｅｎｖ （８０）遺伝子の調製はＣｅｒｔａ ら
の記載（ＥＭＢＯＪ、、５：３０５１〜３０５６．１９
８６）に従って行った。
Ｖ−１ｅｎｖ （８０）遺伝子の調製はＣｅｒｔａ ら
の記載（ＥＭＢＯＪ、、５：３０５１〜３０５６．１９
８６）に従って行った。
Ｅ）ＨＩＶ−２ｅｎｖ （６０）遺伝子の調製ＨＩＶ−
２ｅｎｖ （６０）遺伝子の調製は例１に記載した。
２ｅｎｖ （６０）遺伝子の調製は例１に記載した。
プラスミドｐＲＢｓＨ−ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉ
ｓの構築には、ＢａｍＨＩとＢｇＱＩＩで線状化したベ
クターｐＲＢｓＩ！−６ｘＨｉｓ （上記Ｂ参照） ０
． １μｍｏｌをｇａｇ（４１９）遺伝子０、 ３μｍ
ｏｌと、１単位の７４−ＤＮＡリガーゼとともに１４℃
で一夜インキユベーションして連結させた。酵素を熱失
活さＰたのち、このＤＮＡで、プラスミドｐＤＭＩ、１
含有大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。細胞を１００
μｇ ／ ｍｌのアンピシリンと２５μｇ ／ ｍｌの
カナマイシンを含有するＬＢアガールプレート上に接種
した。プレートを３７℃で一夜インキユベーションした
。各コロニーを３７°Ｃで一夜生育させ、それらのプラ
スミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）
に従って単離した。
ｓの構築には、ＢａｍＨＩとＢｇＱＩＩで線状化したベ
クターｐＲＢｓＩ！−６ｘＨｉｓ （上記Ｂ参照） ０
． １μｍｏｌをｇａｇ（４１９）遺伝子０、 ３μｍ
ｏｌと、１単位の７４−ＤＮＡリガーゼとともに１４℃
で一夜インキユベーションして連結させた。酵素を熱失
活さＰたのち、このＤＮＡで、プラスミドｐＤＭＩ、１
含有大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。細胞を１００
μｇ ／ ｍｌのアンピシリンと２５μｇ ／ ｍｌの
カナマイシンを含有するＬＢアガールプレート上に接種
した。プレートを３７℃で一夜インキユベーションした
。各コロニーを３７°Ｃで一夜生育させ、それらのプラ
スミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）
に従って単離した。
プラスミドｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａｇ
（４１９）−６ｘＨｉ ｓの構築には、プラスミドｐＲ
ＢＳｎ−ｇａｇ （４１９） −６ｘＨｔｓをＢａｍＨ
Ｉで切断し、ＣＩＰで処理した。ＤＮＡをフェノール：
クロロホルム（１：１）で抽出し、２容のエタノールで
沈殿させた。
（４１９）−６ｘＨｉ ｓの構築には、プラスミドｐＲ
ＢＳｎ−ｇａｇ （４１９） −６ｘＨｔｓをＢａｍＨ
Ｉで切断し、ＣＩＰで処理した。ＤＮＡをフェノール：
クロロホルム（１：１）で抽出し、２容のエタノールで
沈殿させた。
ＢａｍＨＩで線状化されたｐＲＢＳＩＩ−ｇａｇ（４１
９） ６ｘＨｉｓプラスミドＤＮＡを０、 ３μｍ
ｏｌのＨＩＶ−１ｅｎｖ （８０）遺伝子および１単位
のＴ４−ＤＮＡリガーゼとともに１４００で一夜インキ
ユベーションした。酵素を熱失活させたのち、このＤＮ
Ａで、プラスミドｐＤＭＩ。
９） ６ｘＨｉｓプラスミドＤＮＡを０、 ３μｍ
ｏｌのＨＩＶ−１ｅｎｖ （８０）遺伝子および１単位
のＴ４−ＤＮＡリガーゼとともに１４００で一夜インキ
ユベーションした。酵素を熱失活させたのち、このＤＮ
Ａで、プラスミドｐＤＭＩ。
１を含有する大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。
細胞を１００μｇ ／ ｍｌのアンピシリンおよび２５
μｇ ／ ｍｌのカナマイシンを含むＬＢアガールプレ
ート上に接種した。プレートを３７℃で一夜インキユベ
ーションした。各コロニーを３７℃で一夜生育させ、つ
いでそれらのプラスミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら：前出）に従って単離した（第１９図）。
μｇ ／ ｍｌのカナマイシンを含むＬＢアガールプレ
ート上に接種した。プレートを３７℃で一夜インキユベ
ーションした。各コロニーを３７℃で一夜生育させ、つ
いでそれらのプラスミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら：前出）に従って単離した（第１９図）。
の構築
プラスミドｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）−ｇａｇ
（４１９）−ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉ ｓの構
築には、プラスミドｐＲＢｓｎ−ｅｎｖ （８０）
ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓをＢｇｌで切断し、Ｃ
ＩＰで処理した。ついでＤＮＡをフェノール：クロロホ
ルム（１： １）で抽出し、２容のエタノールで沈殿さ
せた。ＢｇＱＩＩで線状化したｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ
（８０） −ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓプラスミ
ドＤＮＡをついで、０、 ３μｍｏｌのＨＩＶ−２ｅｎ
ｖ （６０）遺伝子および１単位の７４−ＤＮＡリガー
ゼと一夜１４℃でインキュベーションした。酵素を熱失
活させたのち、このＤＮＡで、プラスミドｐＤＭ１．１
含有大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。細胞を１００
μｇ ／ ｍｌのアンピシリンと２５μｇ ／ ［＋１
１のカナマイシンを含むＬＢアガールプレート上に接種
した。プレートを３７℃で一夜インキユベーションした
。各コロニーを３７℃で一夜生育させ、それらのプラス
ミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａｆｉｓら：前出）に
従って単離した（第２０図）。
（４１９）−ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉ ｓの構
築には、プラスミドｐＲＢｓｎ−ｅｎｖ （８０）
ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓをＢｇｌで切断し、Ｃ
ＩＰで処理した。ついでＤＮＡをフェノール：クロロホ
ルム（１： １）で抽出し、２容のエタノールで沈殿さ
せた。ＢｇＱＩＩで線状化したｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ
（８０） −ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓプラスミ
ドＤＮＡをついで、０、 ３μｍｏｌのＨＩＶ−２ｅｎ
ｖ （６０）遺伝子および１単位の７４−ＤＮＡリガー
ゼと一夜１４℃でインキュベーションした。酵素を熱失
活させたのち、このＤＮＡで、プラスミドｐＤＭ１．１
含有大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した。細胞を１００
μｇ ／ ｍｌのアンピシリンと２５μｇ ／ ［＋１
１のカナマイシンを含むＬＢアガールプレート上に接種
した。プレートを３７℃で一夜インキユベーションした
。各コロニーを３７℃で一夜生育させ、それらのプラス
ミドＤＮＡを標準方法（Ｍａｎｉａｆｉｓら：前出）に
従って単離した（第２０図）。
例８
ＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ （４１９）−ＥＮＶ性
Ａ）原理
ＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ （４１９）−ＥＮＶ（６０
）ポリペプチドがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に感染し
た患者の血清と反応することを示すため、ＥＮＶ （８
０）−ＧＡＧ （４１９）、−ＥＮＶ（６０）ポリペプ
チドを大腸菌内で発現させ、ついで精製し、適当な血清
を用いて酵素免疫検定（Ｅ Ｉ Ａ）で試験した。
）ポリペプチドがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に感染し
た患者の血清と反応することを示すため、ＥＮＶ （８
０）−ＧＡＧ （４１９）、−ＥＮＶ（６０）ポリペプ
チドを大腸菌内で発現させ、ついで精製し、適当な血清
を用いて酵素免疫検定（Ｅ Ｉ Ａ）で試験した。
プラスミドＤＭＩ、１を含有する大腸菌Ｗ３１１０細胞
をプラスミドｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）ｇａｇ
（４１９）−ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉｓで形質転換
し、１００ ｕ ｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ
／ ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢメジウム中で生
育させた（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）。培養液を光学
密度０Ｄ６ｏｏ ” １． ０においてＩＰＴＧ（最終
濃度２ ｍＭ）により誘導し、さらに２時間生育させた
。ついで細胞を遠心分離によって収穫した。
をプラスミドｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ （８０）ｇａｇ
（４１９）−ｅｎｖ （６０）−６ｘＨｉｓで形質転換
し、１００ ｕ ｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ
／ ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢメジウム中で生
育させた（Ｍａｎｉａｌｉｓら：前出）。培養液を光学
密度０Ｄ６ｏｏ ” １． ０においてＩＰＴＧ（最終
濃度２ ｍＭ）により誘導し、さらに２時間生育させた
。ついで細胞を遠心分離によって収穫した。
収穫した細胞をＰＢＳ緩衝液（０，２ｇ／ＱＫＣＱ、、
８．０ｇ／Ｑ ＮａＣＲ，０，２ｇ／ＱＫ８２ Ｐ
０４．１．１４４ ｇ／ ＱＮ ａ ２ ＨＰ Ｏ４、
ｐＨ７，０）に再懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて
破壊した。得られた細胞ホモジネートを遠心分離し、ペ
レットを２回６Ｍグアニジン塩酸塩含有０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０で抽出した。
８．０ｇ／Ｑ ＮａＣＲ，０，２ｇ／ＱＫ８２ Ｐ
０４．１．１４４ ｇ／ ＱＮ ａ ２ ＨＰ Ｏ４、
ｐＨ７，０）に再懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて
破壊した。得られた細胞ホモジネートを遠心分離し、ペ
レットを２回６Ｍグアニジン塩酸塩含有０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０で抽出した。
不溶物質があれば遠心分離によって除去し、濾過した。
澄明な溶液をＮＴＡカラム（その構造および調製法はヨ
ーロッパ特許出願公告第２５３３０３号に記載されてい
る）に適用した。ついで、カラムを最初６Ｍグアニジン
塩酸塩含有０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１８
． ０）で、次に８Ｍ尿素含有０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄した。ＥＮＶ （８０）
−ＧＡＧ（４１９） −ＥＮＶ （６０）ポリペプチド
の溶出は８Ｍ尿素含有０．１Ｍｌン酸ナトナトリウム緩
衝液Ｈ４，０）で行った。
ーロッパ特許出願公告第２５３３０３号に記載されてい
る）に適用した。ついで、カラムを最初６Ｍグアニジン
塩酸塩含有０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１８
． ０）で、次に８Ｍ尿素含有０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄した。ＥＮＶ （８０）
−ＧＡＧ（４１９） −ＥＮＶ （６０）ポリペプチド
の溶出は８Ｍ尿素含有０．１Ｍｌン酸ナトナトリウム緩
衝液Ｈ４，０）で行った。
ＮＴＡカラムを用いて得られたＥＮＶ （６０）−ＧＡ
Ｇ （４１９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドを次に
、５ｅｐｈａｃｒＹＩ Ｓ −２００カラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ）上２回クロマトグラフィーに付した（溶
出緩衝液：５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ないし０．１
％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ，９゜ｐ
Ｈ７，０）。得られたＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ（４１
９）−ＥＮｖ（６０）ポリペプチドは、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動およびアミノ酸分析で純度８９
％を示した。
Ｇ （４１９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドを次に
、５ｅｐｈａｃｒＹＩ Ｓ −２００カラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ）上２回クロマトグラフィーに付した（溶
出緩衝液：５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ないし０．１
％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ，９゜ｐ
Ｈ７，０）。得られたＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ（４１
９）−ＥＮｖ（６０）ポリペプチドは、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動およびアミノ酸分析で純度８９
％を示した。
の反応性
精製ＥＮＶ （８０） −ＧＡＧ （４１９）−ＥＮＶ
（６０）ポリペプチド（７）ＨＩＶ−１おヨヒＨＩＶ
−２陽性血清との反応性を、ヨーロッパ特許第２７０１
１４号に記載された酵素免疫検定（Ｅ Ｉ Ａ） ニヨ
ッテ試験した。精製ＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ （４１
９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドおよび精製ＤＨＦ
Ｒ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチド（陽性ＨＩ Ｖ−２
対・照）によって得られたＥＩＡ値は次表のとおりであ
った。
（６０）ポリペプチド（７）ＨＩＶ−１おヨヒＨＩＶ
−２陽性血清との反応性を、ヨーロッパ特許第２７０１
１４号に記載された酵素免疫検定（Ｅ Ｉ Ａ） ニヨ
ッテ試験した。精製ＥＮＶ （８０）−ＧＡＧ （４１
９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドおよび精製ＤＨＦ
Ｒ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチド（陽性ＨＩ Ｖ−２
対・照）によって得られたＥＩＡ値は次表のとおりであ
った。
ＤＨＦＲ−ＥＮＶ（６０） ＥＮＶ（８０）−Ｇ
ＡＧ（４１９）−ＥＮＶ（６Ｇ）血清 １１１Ｖ−
２１１１Ｖ−１／ｌ（ＩＶ−２Ｍｉ１２３ ０．
１３２ １．６８４Ｍ１Ｑ２２ ０
．１０４ ２．０９４Ｍ１ｆｆ２４
０．１４０ ２．２４４Ｍ１Ｑ２６
０．０６２ ２．１９８Ｍ１ρ３０
０．０５９ ２．３４５）１１Ｖ
−２陽性血清ｌ） Ｓ Ｌ、 ２７１ ２．
０７２Ｋ Ｏ，９１０２，０５２Ｄ
１． ５５９ ２． ２５２Ｂ
１． ２３２ ２． １
０４陰性血清 Ｎ１０．０９６ ０．０９２Ｎ２０．０４７
１．１１ＯＮ３０．０６３ ０
．０７６Ｎ４０．０５６ ０．０８７Ｎ５０
．０６７ ０．０８８１） ウェスタンプロ
ット（ＷＢ）により確認表から明らかなように、ＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２陽性血清はすヘテ、ＥＮＶ （８
０）−ＧＡＧ （４１９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプ
チドによって認識される。
ＡＧ（４１９）−ＥＮＶ（６Ｇ）血清 １１１Ｖ−
２１１１Ｖ−１／ｌ（ＩＶ−２Ｍｉ１２３ ０．
１３２ １．６８４Ｍ１Ｑ２２ ０
．１０４ ２．０９４Ｍ１ｆｆ２４
０．１４０ ２．２４４Ｍ１Ｑ２６
０．０６２ ２．１９８Ｍ１ρ３０
０．０５９ ２．３４５）１１Ｖ
−２陽性血清ｌ） Ｓ Ｌ、 ２７１ ２．
０７２Ｋ Ｏ，９１０２，０５２Ｄ
１． ５５９ ２． ２５２Ｂ
１． ２３２ ２． １
０４陰性血清 Ｎ１０．０９６ ０．０９２Ｎ２０．０４７
１．１１ＯＮ３０．０６３ ０
．０７６Ｎ４０．０５６ ０．０８７Ｎ５０
．０６７ ０．０８８１） ウェスタンプロ
ット（ＷＢ）により確認表から明らかなように、ＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２陽性血清はすヘテ、ＥＮＶ （８
０）−ＧＡＧ （４１９）−ＥＮＶ （６０）ポリペプ
チドによって認識される。
図面中には、以下の略号および記号を使用する。
Ｂ、 Ｂｇ、 Ｅ、 Ｈ，Ｓａ、 Ｘおよびｘｂは
それぞれ、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇＱｎ、ＥｃｏＲＩ
、ＨｉｎｄＩ［、ＰｓｔＩ、５ａＱＩ、ＸｈｏＩおよび
ＸｂａＩの切断部位を示す。 区：遺伝子ｂ’、Ｑａ、Ｑａｅｌおよびｎｅ。 のプロモーター １）■：遺伝子す、Ｑａ、ｃａｔ、ｎｅｏおよびｐａｃ
Ｉのリポソーム結合部位 １１１：ターミネータ−ｔ。およびＴ１＠ｌ１ｉｉｉＪ
：調節可能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ２５０
ＰＳＮ２５０Ｐ２９ ０：リポソーム結合部位ＲＢＳｎ −東：このリポソーム結合部位の制御下にある暗号領域 ２：６個のヒスチジンをコードする領域□：複製を要す
る領域（＋ａｐｌ、 ）−〉ニジヒドロ葉酸リダクター
ゼ（ｄｈｌ＋）、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、Ｑａｃリプレッサー（ＱａｃＩ）、β−
ラクタマーゼ（ｂ Ｑ ａ）およびネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（ｎ ｅ ｏ）の暗号領域］：合成
ｅｎｖ（６０）遺伝子 ［Ｉ ＨＩＶ遺伝子フラグメント 第１図は、合成ｅｎｖ（６（Ｄ遺伝子のヌクレオチド配
列およびそれから誘導されるＥＮＶ （６０）ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す模式図である。合成ｅｎｖ（
６０）遺伝子が構築される各オリゴヌクレオチドフラグ
メントは１〜１４の番号が付されている。 第２図は、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩの構成図
である。 第３図は、プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのヌクレ
オチド配列を示す模式図である。配列中、第２図に示し
た制限酵素の認識部位には上線を付し、またβ−ラクタ
マーゼおよびジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする領
域には下線を付しである。 第４図は、プラスミドｐＤＭＩ、１の構成図である。 第５図は、プラスミドｐＤＭＩ、１のヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第４図に示した制限酵素
の認識部位には上線を付し、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼおよびＱａｃリプレツザーをコードする領
域には下線を付しである。 第６図は、調節可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９、リポソーム結合部位ＲＢＳ
ｎならびに６個のヒスチジンをコードする領域を含有す
るＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの製造を示す工程
図である。 第７図は、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩと、調節
可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ２５０ＰＳＮ２
５ ０Ｐ ２９、リポソーム結合部位ＲＢＳｎならび
に６個のヒスチジンをコードする領域を含有するＸｈｏ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントを用いるプラスミドｐＤＳ
７８／ＲＢＳＩＩ。 ６ｘＨｉｓの構築を示す工程図である。 第８図は、プラスミドｐｅｎｖ（６０）−ＤＨＦＲの構
築を示す工程図である。 第９図は、プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ（６０）の構
築を示す工程図である。 第１０図は、ＥＮＶ （６０）−ＤＨＦＲおよびＤＨＦ
Ｒ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドの反応性を示す図で
ある。上図は、プラスミドｐＤＳ７８／Ｒ８ＢＩ！、６
ｘＨｉｓ （レーンＡ）、ｐｅｎｖ（６０）−ＤＨＦ
Ｒ（レーンｂ）およびｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）（
レーンＣ）を含有する大腸菌Ｍ１５分解物の電気泳動解
析を示す。 レー：ｚｃＮ！精製ＨＩＶ−Ｉ ＥＮＶ （８０）−
ＤＨＦＲを含有する。下図は、ＨＩＶ−２（左）および
ＨＩＶ−１，（右）陽性血清で生成した相当するイムノ
プロットを示す。レーンＭは予め染色した分子量標準を
含有し、そのサイズはキロダルトンで与えられている。 第１１図は、プラスミドｐＤｓ５６／ＲＢＳＩＩの構成
図である。 第１２図は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳｆｆのヌク
レオチド配列を示す模式図である。配列中、第１１図に
示した制限酵素の認識部位には上線を、またＲＢＳｎの
制御下にある領域には下線を付しである。 第１３図は、６個のヒスチジンをコードする領域、ター
ミネータ−ｔ Ｓ ｃａｔ遺伝子およびターミネータ
−Ｔ１を含むＢａｍＨＩ／Ｘｂａｌフラグメントの構築
および単離を示す工程図であり、このフラグメントはプ
ラスミドｐＲＢＳｎ−６ｘＨｉｓの構築に用いられた。 第１４図は、第１３図に示したＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフ
ラグメントと、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩの複
製領域含有ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの結合に
よるプラスミドｐＲＢＳＩＩ−６ｘＨｉｓの構築を示す
工程図である。 第１５図は、ＨＩＶ−Ｉ ＢａｍＨＩ／ＢｇＱＩＩ
ｇａｇ（４１９）遺伝子フラグメントの製造るＨＩＶ
−Ｉｇａｇ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示
す模式図である。 第１７図は、プラスミドル２−３Ｕ／ＨｉｎｄＩＩ１１
０中に存在するＨＩＶ−Ｉｇａｇ遺伝子フラグメントの
ヌクレオチド配列を示す模式図である。 第１８図は、プラスミドｐＲＢＳＩＩ −ｇａｇ（４１
９） −６ｘＨｉ ｓの構築を示す工程図である。 第１９図は、プラスミドｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ（８０）
−ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓの構築を示す工程図
である。 第２０図は、プラスミドｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ（８０）
ｇａｇ （４１９）−ｅｎｖ （６０）−５ｘＨ
ｉｓの構築を示す工程図である。
それぞれ、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇＱｎ、ＥｃｏＲＩ
、ＨｉｎｄＩ［、ＰｓｔＩ、５ａＱＩ、ＸｈｏＩおよび
ＸｂａＩの切断部位を示す。 区：遺伝子ｂ’、Ｑａ、Ｑａｅｌおよびｎｅ。 のプロモーター １）■：遺伝子す、Ｑａ、ｃａｔ、ｎｅｏおよびｐａｃ
Ｉのリポソーム結合部位 １１１：ターミネータ−ｔ。およびＴ１＠ｌ１ｉｉｉＪ
：調節可能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ２５０
ＰＳＮ２５０Ｐ２９ ０：リポソーム結合部位ＲＢＳｎ −東：このリポソーム結合部位の制御下にある暗号領域 ２：６個のヒスチジンをコードする領域□：複製を要す
る領域（＋ａｐｌ、 ）−〉ニジヒドロ葉酸リダクター
ゼ（ｄｈｌ＋）、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、Ｑａｃリプレッサー（ＱａｃＩ）、β−
ラクタマーゼ（ｂ Ｑ ａ）およびネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（ｎ ｅ ｏ）の暗号領域］：合成
ｅｎｖ（６０）遺伝子 ［Ｉ ＨＩＶ遺伝子フラグメント 第１図は、合成ｅｎｖ（６（Ｄ遺伝子のヌクレオチド配
列およびそれから誘導されるＥＮＶ （６０）ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す模式図である。合成ｅｎｖ（
６０）遺伝子が構築される各オリゴヌクレオチドフラグ
メントは１〜１４の番号が付されている。 第２図は、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩの構成図
である。 第３図は、プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのヌクレ
オチド配列を示す模式図である。配列中、第２図に示し
た制限酵素の認識部位には上線を付し、またβ−ラクタ
マーゼおよびジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする領
域には下線を付しである。 第４図は、プラスミドｐＤＭＩ、１の構成図である。 第５図は、プラスミドｐＤＭＩ、１のヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第４図に示した制限酵素
の認識部位には上線を付し、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼおよびＱａｃリプレツザーをコードする領
域には下線を付しである。 第６図は、調節可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９、リポソーム結合部位ＲＢＳ
ｎならびに６個のヒスチジンをコードする領域を含有す
るＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの製造を示す工程
図である。 第７図は、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩと、調節
可能プロモーター／オペレーター要素Ｎ２５０ＰＳＮ２
５ ０Ｐ ２９、リポソーム結合部位ＲＢＳｎならび
に６個のヒスチジンをコードする領域を含有するＸｈｏ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントを用いるプラスミドｐＤＳ
７８／ＲＢＳＩＩ。 ６ｘＨｉｓの構築を示す工程図である。 第８図は、プラスミドｐｅｎｖ（６０）−ＤＨＦＲの構
築を示す工程図である。 第９図は、プラスミドｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ（６０）の構
築を示す工程図である。 第１０図は、ＥＮＶ （６０）−ＤＨＦＲおよびＤＨＦ
Ｒ−ＥＮＶ （６０）ポリペプチドの反応性を示す図で
ある。上図は、プラスミドｐＤＳ７８／Ｒ８ＢＩ！、６
ｘＨｉｓ （レーンＡ）、ｐｅｎｖ（６０）−ＤＨＦ
Ｒ（レーンｂ）およびｐＤＨＦＲ−ｅｎｖ （６０）（
レーンＣ）を含有する大腸菌Ｍ１５分解物の電気泳動解
析を示す。 レー：ｚｃＮ！精製ＨＩＶ−Ｉ ＥＮＶ （８０）−
ＤＨＦＲを含有する。下図は、ＨＩＶ−２（左）および
ＨＩＶ−１，（右）陽性血清で生成した相当するイムノ
プロットを示す。レーンＭは予め染色した分子量標準を
含有し、そのサイズはキロダルトンで与えられている。 第１１図は、プラスミドｐＤｓ５６／ＲＢＳＩＩの構成
図である。 第１２図は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳｆｆのヌク
レオチド配列を示す模式図である。配列中、第１１図に
示した制限酵素の認識部位には上線を、またＲＢＳｎの
制御下にある領域には下線を付しである。 第１３図は、６個のヒスチジンをコードする領域、ター
ミネータ−ｔ Ｓ ｃａｔ遺伝子およびターミネータ
−Ｔ１を含むＢａｍＨＩ／Ｘｂａｌフラグメントの構築
および単離を示す工程図であり、このフラグメントはプ
ラスミドｐＲＢＳｎ−６ｘＨｉｓの構築に用いられた。 第１４図は、第１３図に示したＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフ
ラグメントと、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩの複
製領域含有ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの結合に
よるプラスミドｐＲＢＳＩＩ−６ｘＨｉｓの構築を示す
工程図である。 第１５図は、ＨＩＶ−Ｉ ＢａｍＨＩ／ＢｇＱＩＩ
ｇａｇ（４１９）遺伝子フラグメントの製造るＨＩＶ
−Ｉｇａｇ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示
す模式図である。 第１７図は、プラスミドル２−３Ｕ／ＨｉｎｄＩＩ１１
０中に存在するＨＩＶ−Ｉｇａｇ遺伝子フラグメントの
ヌクレオチド配列を示す模式図である。 第１８図は、プラスミドｐＲＢＳＩＩ −ｇａｇ（４１
９） −６ｘＨｉ ｓの構築を示す工程図である。 第１９図は、プラスミドｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ（８０）
−ｇａｇ （４１９）−６ｘＨｉｓの構築を示す工程図
である。 第２０図は、プラスミドｐＲＢｓＩＩ−ｅｎｖ（８０）
ｇａｇ （４１９）−ｅｎｖ （６０）−５ｘＨ
ｉｓの構築を示す工程図である。
Claims (33)
- （１）ＨＩＶ−２ｅｎｖタンパク質の抗原決定基および
／または免疫原決定基の少なくともひとつに相当するア
ミノ酸配列からなるポリペプチド - （２）式 【遺伝子配列があります。】（ I ） で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまた
はそれらの機能的均等配列を有する特許請求の範囲第１
項のポリペプチド - （３）式（ I ）のアミノ酸配列を有する特許請求の範
囲第１項または第２項いずれか一つのポリペプチド - （４）アフイニテイーペプチドと担体ポリペプチドが共
有結合している特許請求の範囲第１項から第３項までの
いずれか一つのポリペプチド - （５）アフイニテイーペプチドと、アミノ酸配列がＨＩ
Ｖ−１エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）および／また
はＨＩＶ−１コアタンパク質 （ｇａｇ）の少なくともひとつの抗原決定基および／ま
たは免疫原決定基に相当するポリペプチドが共有結合し
ている特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか
一つのポリペプチド - （６）以下の式 【遺伝子配列があります。】（II） 【遺伝子配列があります。】（III） の一方のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項か
ら第４項までのいずれか一つのポリペプチド - （７）以下の式 【遺伝子配列があります。】（IV） のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項から第３
項までおよび第５項のいずれか一つのポリペプチド - （８）アミノ末端にさらにメチオニン残基を有する特許
請求の範囲第１項から第４項までおよび第５項のいずれ
か一つのポリペプチド - （９）細菌内で産生された特許請求の範囲第１項から第
８項までのいずれか一つのポリペプチド - （１０）大腸菌内で産生された特許請求の範囲第１項か
ら第８項までのいずれか一つのポリペプチド - （１１）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
か一つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 - （１２）式 【遺伝子配列があります。】 で示される核酸配列もしくはその部分配列またはこの核
酸配列もしくはこれらの部分配列の機能的均等配列を包
含する特許請求の範囲第１１項のＤＮＡ配列 - （１３）特許請求の範囲第１１項または第１２項のＤＮ
Ａ配列が発現制御配列と有効に結合している発現ベクタ
ー - （１４）大腸菌内で複製できる特許請求の範囲第１３項
の発現ベクター - （１５）プラスミドｐｅｎｖ（６０）−ＤＨＦＲ、ｐＤ
ＨＦＲ−ｅｎｖ（６０）またはｐＲＢＳＩＩ−ｅｎｖ（
８０）−ｇａｇ（４１９）−ｅｎｖ（６０）−６ｘＨｉ
ｓである特許請求の範囲第１４項の発現ベクター - （１６）特許請求の範囲第１３項から第１５項までのい
ずれかの発現ベクターで形質転換されたバクテリア - （１７）特許請求の範囲第１３項から第１５項までのい
ずれかの発現ベクターで形質転換された大腸菌株 - （１８）特許請求の範囲第１３項から第１５項までのい
ずれかの発現ベクターで形質転換された大腸菌Ｍ１５株 - （１９）抗原としての特許請求の範囲第１項から第１０
項までのいずれか一つのポリペプチド - （２０）バクテリアを特許請求の範囲第１３項から第１
５項までのいずれかの発現ベクターで形質転換し、つい
で形質転換されたバクテリアを適当な成長条件下に培養
し、ポリペプチドを単離し、所望により精製することか
らなる特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれ
か一つのポリペプチドの製造方法 - （２１）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドの十分量を哺乳類または鳥類に
注射し、この動物の血清から生成した抗体を単離するこ
とからなるＨＩＶ抗体の製造方法 - （２２）（ａ）特許請求の範囲第１項から第１０項まで
のいずれか一つのポリペプチドを標識し、（ｂ）この標
識ポリペプチドをヒト血清サンプルと反応させ、（ｃ）
反応混合物中の生成した標識ポリペプチド／抗体複合体
を検出することからなるヒト血清中のＨＩＶウィルスに
対する抗体の検出方法 - （２３）（ａ）特許請求の範囲第１項から第１０項まで
のいずれか一つのポリペプチドを固体担体材料上に固定
化し、（ｂ）ヒト血清サンプルをこの固定化タンパク質
と接触させ、（ｃ）非結合ポリペプチドと抗体を洗浄に
よつて除去し、（ｄ）洗浄固定化ポリペプチド／抗体複
合体を標識黄色ブドウ球菌プロテインＡの添加または標
識ヒト抗−Ｉｇ抗体の添加によつて検出することからな
るヒト血清中のＨＩＶウィルスに対する抗体の検出方法 - （２４）（ａ）ヒト血清サンプルまたは他の体液サンプ
ルを特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれか
一つのポリペプチドに対する抗体の既知量と反応させ、
（ｂ）反応混合物中に生成した抗原／抗体複合体を検出
するとからなるヒト血清または他の生物学的液体中のＨ
ＩＶ−２ウィルスまたはそのフラグメントの検出方法 - （２５）抗体は酵素で標識し、反応混合物中に生成した
抗原／抗体複合体は酵素免疫検定法によつて検出する特
許請求の範囲第２４項の方法 - （２６）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドに対する抗体 - （２７）モノクローナル抗体である特許請求の範囲第２
６項の抗体 - （２８）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れかのポリペプチドの、ＨＩＶ抗体製造のための使用 - （２９）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドの、ヒト血清または他の生物学
的液体中のＨＩＶ抗体の検出のための使用 - （３０）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドの、ヒト血清または他の生物学
的液体中のＨＩＶウィルスまたはそのフラグメントの検
出のための使用 - （３１）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドに対するＨＩＶ抗体を含有する
容器からなるＨＩＶウィルスまたはそのフラグメントの
定量用キット - （３２）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか一つのポリペプチドを含有する容器からなるＨＩＶ
抗体の定量用キット - （３３）特許請求の範囲第２０項の方法によつて製造さ
れた特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれか
一つのポリペプチド
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Patent Citations (1)
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