JPS6344895A - 抗アミロイドa蛋白質単クロ−ン性抗体 - Google Patents
抗アミロイドa蛋白質単クロ−ン性抗体Info
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- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒトのアミロイドA蛋白質に対する単クロー
ン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗体は続発性
アミロイド−シスの検出に有用である。
ン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗体は続発性
アミロイド−シスの検出に有用である。
従来技術
アミロイドA蛋白質に対する単クローン性抗体としては
、ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・エンド
・サイトケミストリー(J、Histochem。
、ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・エンド
・サイトケミストリー(J、Histochem。
Cytochem、) 32. 322〜328.1
984に報告があるが、アミロイド−シス患者組織から
精製したアミロイドA蛋白質を免疫源に用いており、抗
体の認識する抗原部位(エピトープ)は明らかでない。
984に報告があるが、アミロイド−シス患者組織から
精製したアミロイドA蛋白質を免疫源に用いており、抗
体の認識する抗原部位(エピトープ)は明らかでない。
発明が解決しようとする問題
アミロイド−シスは、不溶性のアミロイド蛋白質が種々
の組織に沈着し、アミロイド線維やアミロイド班を形成
し、その沈着した組織<m器)の機能障害を引き起こし
、進行性に病態が悪化し、ついには死に到る難病である
。昭和50年に厚生省特定疾患アミロイドーシス調査研
究班が組織され、病理学的に、(1)原発性アミロイド
−シス、(2)多発性骨髄腫に合併するアミロイド−シ
ス1、(3)続発性アミロイド−シス、(4)分類困難
なアミロイド−シス、(5)遺伝性アミロイド−シスお
よび、(6)限局性アミロイド−シスに分類されている
。その分類によって、沈着するアミロイド蛋白質の種類
も異なり、アミロイドA蛋白質は、続発性アミロイド−
シスのほとんどすべてと、家族性地中海熱に伴うアミロ
イド−シス(遺伝性アミロイド−シス)の一部に沈着が
認められる。一種類の単クローン性抗体によって、全て
のアミロイド−シスの病理診断を行うことは、原理的に
も不可能であるが、それぞれのアミロイド蛋白質に特異
的な単クローン性抗体を確立すれば、アミロイド−シス
の病理、。
の組織に沈着し、アミロイド線維やアミロイド班を形成
し、その沈着した組織<m器)の機能障害を引き起こし
、進行性に病態が悪化し、ついには死に到る難病である
。昭和50年に厚生省特定疾患アミロイドーシス調査研
究班が組織され、病理学的に、(1)原発性アミロイド
−シス、(2)多発性骨髄腫に合併するアミロイド−シ
ス1、(3)続発性アミロイド−シス、(4)分類困難
なアミロイド−シス、(5)遺伝性アミロイド−シスお
よび、(6)限局性アミロイド−シスに分類されている
。その分類によって、沈着するアミロイド蛋白質の種類
も異なり、アミロイドA蛋白質は、続発性アミロイド−
シスのほとんどすべてと、家族性地中海熱に伴うアミロ
イド−シス(遺伝性アミロイド−シス)の一部に沈着が
認められる。一種類の単クローン性抗体によって、全て
のアミロイド−シスの病理診断を行うことは、原理的に
も不可能であるが、それぞれのアミロイド蛋白質に特異
的な単クローン性抗体を確立すれば、アミロイド−シス
の病理、。
診断上有用である。
本発明者は、続発性アミロイド−シスを検出するのに有
用な単クローン性抗体を製造すべく研究″を行った。す
なわち、下記第1表で示′されるヒトのアミロイドA蛋
白質の中から、1〜12番目のアミノ酸配列で示される
ペプチド(以下ペプチド1という)、15〜25番目の
アミノ酸配列で示されるペプチド〈以下ペプチド2とい
う)、37〜47番目のアミノ酸配列で示されるペプチ
ド(以下ペプチド3という)、56〜66番目のアミノ
酸配列で示されるペプチド(以下ペプチド4という)お
よび66〜76番目のアミノ酸配列で示されるペプチド
(以下ペプチド5という)を合成し、これらをそれぞれ
担体蛋白質と結合させ、結合物を用いてマウスを免疫し
、常法に従って単りローン性抗体産、生ハイブリドーマ
細胞株を造成した。その結果、ペプチド3には反応する
が、ペプチド1.2.4および5には実質的に反応性を
示さない単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株を得、本発明を完成するに至った。
用な単クローン性抗体を製造すべく研究″を行った。す
なわち、下記第1表で示′されるヒトのアミロイドA蛋
白質の中から、1〜12番目のアミノ酸配列で示される
ペプチド(以下ペプチド1という)、15〜25番目の
アミノ酸配列で示されるペプチド〈以下ペプチド2とい
う)、37〜47番目のアミノ酸配列で示されるペプチ
ド(以下ペプチド3という)、56〜66番目のアミノ
酸配列で示されるペプチド(以下ペプチド4という)お
よび66〜76番目のアミノ酸配列で示されるペプチド
(以下ペプチド5という)を合成し、これらをそれぞれ
担体蛋白質と結合させ、結合物を用いてマウスを免疫し
、常法に従って単りローン性抗体産、生ハイブリドーマ
細胞株を造成した。その結果、ペプチド3には反応する
が、ペプチド1.2.4および5には実質的に反応性を
示さない単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株を得、本発明を完成するに至った。
第 1 表
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、アミロイドA蛋白質に反応し、His−Al
a−Arg−Gly−Asn−Tyr−Asp−Ala
−Ala−Lys−Argで示されるペプチドと反応し
、かツArg−8er−Phe−Phe−Ser−Ph
e−Leu−G Iy−G 1.u−A 1a−Phe
−^Sp、 Arg−ASp−M11!t−Trp−A
rg−Ala−Tyr−8er−Asn−Met−Ar
g、 Glu−Ala−Ile−Ser−Asp−Ar
a−Arg−Glu−Asn−Ile−GlnおよびG
ln−Arg−Phe−Phe−Gly−His−Gl
y−Ala−Glu−Asn−Setで示されるペプチ
ドとは実質的に反応しない単クローン性抗体を提供する
。
a−Arg−Gly−Asn−Tyr−Asp−Ala
−Ala−Lys−Argで示されるペプチドと反応し
、かツArg−8er−Phe−Phe−Ser−Ph
e−Leu−G Iy−G 1.u−A 1a−Phe
−^Sp、 Arg−ASp−M11!t−Trp−A
rg−Ala−Tyr−8er−Asn−Met−Ar
g、 Glu−Ala−Ile−Ser−Asp−Ar
a−Arg−Glu−Asn−Ile−GlnおよびG
ln−Arg−Phe−Phe−Gly−His−Gl
y−Ala−Glu−Asn−Setで示されるペプチ
ドとは実質的に反応しない単クローン性抗体を提供する
。
本発明の単クローン性抗体はIgGまたはIgMクラス
に属し、その具体例としてはKM−268およびKM−
196と名付けたものがそれぞれあげられる。
に属し、その具体例としてはKM−268およびKM−
196と名付けたものがそれぞれあげられる。
本発明の単クローン性抗体は、旧s−Ala−Arg−
G、1y−Asn−Tyr−Asp−Ala−Ala−
Lys−Argで示されるペプチドまたはその担体蛋白
質との結合物で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞
と哺乳動物め骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブ
リドーマ細胞株から該ペプチドに特異的に反応するハイ
ブリドーマ細胞株を選び、該細胞株を培地に培養するか
、哺乳動物の腹腔に投与して腹水化し、培養物または腹
水中に該ペプチドに特異的に反応する単クローン性抗体
を蓄積させ、該培養物または腹水から該単クローン性抗
体を採取することにより製造することができる。
G、1y−Asn−Tyr−Asp−Ala−Ala−
Lys−Argで示されるペプチドまたはその担体蛋白
質との結合物で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞
と哺乳動物め骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブ
リドーマ細胞株から該ペプチドに特異的に反応するハイ
ブリドーマ細胞株を選び、該細胞株を培地に培養するか
、哺乳動物の腹腔に投与して腹水化し、培養物または腹
水中に該ペプチドに特異的に反応する単クローン性抗体
を蓄積させ、該培養物または腹水から該単クローン性抗
体を採取することにより製造することができる。
哺乳動物としては、マウス、ラット、ウシ、ウマなどが
あげられる。
あげられる。
哺乳動物としてマウスを用いた本発明単クローン性抗体
の具体的製造法を以下に示す。
の具体的製造法を以下に示す。
(1)免疫動物脾細胞の調製
マウスを、ペプチド3または、その担体蛋白□質との結
合物で免疫して、そめ免疫マウ及から脾細胞を調製する
。
合物で免疫して、そめ免疫マウ及から脾細胞を調製する
。
ペプチド3の合成は、ペプチド合成機(アプライド・バ
イオシステム社製)で行う。
イオシステム社製)で行う。
免疫の方法は、8〜10週令のBALB/Cマウスの皮
下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロイントの完全アジュバント(Com
plete 、Freuncl’ 5Adjuvant
)あるいは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチ
ンなど〕とともにペプチド3またはその担体蛋白質との
結合物を10〜200■/匹投与し、以後1〜2週問お
きに初回免疫に使ったと同じ抗原を同量、2〜5回投与
する。
下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロイントの完全アジュバント(Com
plete 、Freuncl’ 5Adjuvant
)あるいは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチ
ンなど〕とともにペプチド3またはその担体蛋白質との
結合物を10〜200■/匹投与し、以後1〜2週問お
きに初回免疫に使ったと同じ抗原を同量、2〜5回投与
する。
各免疫後4〜7日目に、眼底静脈数より採血し、血清中
のアミロイドA蛋白質およびペプチド3に対する抗体価
を調べる。
のアミロイドA蛋白質およびペプチド3に対する抗体価
を調べる。
抗体価の測定は、面相酵素免疫測定法(酵素免疫測定法
:医学書院列19781年)により下記のとおり行う。
:医学書院列19781年)により下記のとおり行う。
96大のEIA用プレート[1?1owじaborat
ory社(米)製〕に、特異抗原(アミロイドA蛋白質
。
ory社(米)製〕に、特異抗原(アミロイドA蛋白質
。
ペプチド3.ペプチド3と担体蛋白質〔サイログロブリ
ン(以下Thyと略記する場合もある)またはキーホー
ルリンペットヘモシアニン(以下KL、Hと略記する場
合もある)〕との結合物、担体蛋白質の1〜50μg/
ml ’Jン酸バッファー・セライン(リン酸2ナトリ
ウム1.83g、 リン酸1カリウム0.21g、食
塩7.65 g 、蒸留水17゜pH7,2,以下PB
Sという)溶液)を501d!/穴ずつ分注し、4℃で
一晩放置して抗原をプレートにコートする。次いで、1
%牛血清アルブミン<BSA) −PBS 20 oJ
Ifl/穴を分注して底面上の蛋白質結合性残基をBS
Aでブロックする。
ン(以下Thyと略記する場合もある)またはキーホー
ルリンペットヘモシアニン(以下KL、Hと略記する場
合もある)〕との結合物、担体蛋白質の1〜50μg/
ml ’Jン酸バッファー・セライン(リン酸2ナトリ
ウム1.83g、 リン酸1カリウム0.21g、食
塩7.65 g 、蒸留水17゜pH7,2,以下PB
Sという)溶液)を501d!/穴ずつ分注し、4℃で
一晩放置して抗原をプレートにコートする。次いで、1
%牛血清アルブミン<BSA) −PBS 20 oJ
Ifl/穴を分注して底面上の蛋白質結合性残基をBS
Aでブロックする。
上記プレートをPBSでよく洗浄後、第1抗体として、
段階希釈した試料(マウス抗血清、ハイブリドーマ培養
上清、精製抗体)を50JI!l/穴分注し、4℃で一
晩または室温で3〜4時間放置する。
段階希釈した試料(マウス抗血清、ハイブリドーマ培養
上清、精製抗体)を50JI!l/穴分注し、4℃で一
晩または室温で3〜4時間放置する。
PBSで6回洗浄した後、第2抗体として、ウサギの抗
マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(D
AK○社製、販売:協和メデックス〕の400倍希釈液
を100m/大分注し、室温で2時間放置する。PBS
で洗浄後、ABTS基質液C2,2’−アジノビス(3
−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ニアンモ
ニウム550■を0.1Mクエン酸緩衝液(pH4,2
)1[に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素lJI
!l/mlを加えた溶液〕を用い、発色をOD、、’5
nmで吸光度を測定する。
マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(D
AK○社製、販売:協和メデックス〕の400倍希釈液
を100m/大分注し、室温で2時間放置する。PBS
で洗浄後、ABTS基質液C2,2’−アジノビス(3
−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ニアンモ
ニウム550■を0.1Mクエン酸緩衝液(pH4,2
)1[に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素lJI
!l/mlを加えた溶液〕を用い、発色をOD、、’5
nmで吸光度を測定する。
免疫に用いたペプチド3およびアミロイドA蛋白質に対
する抗体価が、正−常マウス血清の103倍以上(41
5nmでのOD値)になったマウスを免疫化動物細胞の
供給源として使う。−細胞融合に供するために、免疫マ
ウスに融合処理の3〜4日前に、ペプチド3と担体蛋白
質との結合物10〜20’Oxr/匹を腹腔内に投与し
、追加免疫後、肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。
する抗体価が、正−常マウス血清の103倍以上(41
5nmでのOD値)になったマウスを免疫化動物細胞の
供給源として使う。−細胞融合に供するために、免疫マ
ウスに融合処理の3〜4日前に、ペプチド3と担体蛋白
質との結合物10〜20’Oxr/匹を腹腔内に投与し
、追加免疫後、肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。
(2)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BA
LB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−Ul
(P3−01)(カレント・トピックス・イン・ミ
クロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ(Curre
nt Topics in Micro−b’iolo
gy and Immunology) 48. 1〜
7 (197B))、P3−NSI/1−Ag41
(Ns−1)(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロシイ(口uro−pean J、−’Immuno
logy)、 6.511〜519 (1976))
、SP210−Ag14 (SP−2)Cネイチャー(
Nature)、 276、269〜270 (197
8)−) 、P 3 =X63=Ag8653 (65
3)Cジャーナル・オブ・イムノロシイ(J、 Imm
unology)、旦1548〜1550 (1979
) ) 、P3−7X637Ag8 (X63)〔ネイ
チ+−(Nature)、 256. 495〜49
7 (1975)Eなどが用いられる。
用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BA
LB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−Ul
(P3−01)(カレント・トピックス・イン・ミ
クロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ(Curre
nt Topics in Micro−b’iolo
gy and Immunology) 48. 1〜
7 (197B))、P3−NSI/1−Ag41
(Ns−1)(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロシイ(口uro−pean J、−’Immuno
logy)、 6.511〜519 (1976))
、SP210−Ag14 (SP−2)Cネイチャー(
Nature)、 276、269〜270 (197
8)−) 、P 3 =X63=Ag8653 (65
3)Cジャーナル・オブ・イムノロシイ(J、 Imm
unology)、旦1548〜1550 (1979
) ) 、P3−7X637Ag8 (X63)〔ネイ
チ+−(Nature)、 256. 495〜49
7 (1975)Eなどが用いられる。
これらの細胞株は、8−アザグアニン培地CRPMI−
1640培地にグルタミン(15mM)、2−メルカー
プトエダノール(5×1・0−5M)、ジエンタマイシ
ン(10に/ml )および牛胎児血清(FC3L(1
0%)を加えた正常培地に、さらに8−アザグアニン(
15ttg 7m1.)を加えた培地〕で、継代するが
、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日
2X10’以上の細胞数を確保する。
1640培地にグルタミン(15mM)、2−メルカー
プトエダノール(5×1・0−5M)、ジエンタマイシ
ン(10に/ml )および牛胎児血清(FC3L(1
0%)を加えた正常培地に、さらに8−アザグアニン(
15ttg 7m1.)を加えた培地〕で、継代するが
、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日
2X10’以上の細胞数を確保する。
(3)細胞融合
(1)で免疫したマウスに10〜200■/匹のペプチ
ド3とサイログロブリンとの結合物を腹腔内に投与し、
3〜4日後に肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。この脾
細胞と(2)で得られる骨髄腫細胞株をMEM培地(日
永製薬社製)または、PBSでよく洗浄し、細胞数が、
脾細胞:骨髄腫細胞−5〜10:1になるように混合し
、遠心分離にかける。上清を捨て、沈殿した細胞群をほ
ぐした後、攪拌しながらポリエチレングリコール(PE
G1000〜4.000>1〜4gSMEM培地1〜4
ml、ジメチルスルホキシド(Dimethylsul
、fo、xide)0、5〜1.0mlの混液0.1〜
1..0;ml/10! Ijl!細胞を加え、O,、
、5〜、、 1.0分後にMEM培地0.5〜3mlを
加える。その後0.5〜2分毎にMEM培地0,5〜3
mlを数回加えた後、MEM培地を30〜60m1加え
る。
ド3とサイログロブリンとの結合物を腹腔内に投与し、
3〜4日後に肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。この脾
細胞と(2)で得られる骨髄腫細胞株をMEM培地(日
永製薬社製)または、PBSでよく洗浄し、細胞数が、
脾細胞:骨髄腫細胞−5〜10:1になるように混合し
、遠心分離にかける。上清を捨て、沈殿した細胞群をほ
ぐした後、攪拌しながらポリエチレングリコール(PE
G1000〜4.000>1〜4gSMEM培地1〜4
ml、ジメチルスルホキシド(Dimethylsul
、fo、xide)0、5〜1.0mlの混液0.1〜
1..0;ml/10! Ijl!細胞を加え、O,、
、5〜、、 1.0分後にMEM培地0.5〜3mlを
加える。その後0.5〜2分毎にMEM培地0,5〜3
mlを数回加えた後、MEM培地を30〜60m1加え
る。
遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地50〜20 Qmlを加え、メスピペットでゆる
やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養用プレートに
半容量/穴ずつ分注し、3〜7%C○2インキュベータ
ー中、35〜40℃で10〜30時間培養する。培養プ
レートに半容量/穴のHAT培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン(10−5〜10−3M)、チミジン(10−’
〜1.0−’M)およびアミノプテリン(10−8〜1
. O,−’ M )を加えた培地〕を加え、さらに1
0〜30時間培養する。
常培地50〜20 Qmlを加え、メスピペットでゆる
やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養用プレートに
半容量/穴ずつ分注し、3〜7%C○2インキュベータ
ー中、35〜40℃で10〜30時間培養する。培養プ
レートに半容量/穴のHAT培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン(10−5〜10−3M)、チミジン(10−’
〜1.0−’M)およびアミノプテリン(10−8〜1
. O,−’ M )を加えた培地〕を加え、さらに1
0〜30時間培養する。
以後1〜3日間日間10註30
清半容量を捨て、新たに同量のHAT培地を加え、C
O 2インキユベーター中、35〜40℃で10〜14
日間培養する。
O 2インキユベーター中、35〜40℃で10〜14
日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を捨て、HT培地(HAT培地からア
ミノプテリンを除いた培地)を同量加え、以後1〜3日
間日間10註30HT培地で3〜4日間培養後、培養上
清の一部をとり上記の酵素免疫測定法により、抗アミロ
イドA蛋白質抗体価を測定する。
いて、上清半容量を捨て、HT培地(HAT培地からア
ミノプテリンを除いた培地)を同量加え、以後1〜3日
間日間10註30HT培地で3〜4日間培養後、培養上
清の一部をとり上記の酵素免疫測定法により、抗アミロ
イドA蛋白質抗体価を測定する。
抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを2〜4回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗アミロイドA蛋白質単りローン性抗体産
生ハイブリドーマ株として選択する。
ーニングを2〜4回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗アミロイドA蛋白質単りローン性抗体産
生ハイブリドーマ株として選択する。
(4)単クローン性抗体の調製
ブリスタン(2. 6, 10. 14−テトラメチル
ペンタデカン)処理した8〜10週令BALB/C系マ
ウスに(3)で得られた抗アミロイドA蛋白質単りロー
ン性抗体産生ハイブリドーマ細胞2〜4X10’〜7個
/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマ
は腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分
離して固形分を除去後、50%硫安、40%硫安塩析し
、PBS (pH7、2)で1〜2日間透析する。この
透析画分を粗精装車クローン性抗体として精製、定量用
に供することができる。
ペンタデカン)処理した8〜10週令BALB/C系マ
ウスに(3)で得られた抗アミロイドA蛋白質単りロー
ン性抗体産生ハイブリドーマ細胞2〜4X10’〜7個
/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマ
は腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分
離して固形分を除去後、50%硫安、40%硫安塩析し
、PBS (pH7、2)で1〜2日間透析する。この
透析画分を粗精装車クローン性抗体として精製、定量用
に供することができる。
さらに精製が必要な場合には、DEAE−セファロース
カラム、プロティンへーカラムあるいはセファクリル5
=300カラムなどに通塔し、活性画分(IgGS I
gMあるいはIgA画分)を集める。
カラム、プロティンへーカラムあるいはセファクリル5
=300カラムなどに通塔し、活性画分(IgGS I
gMあるいはIgA画分)を集める。
抗体のイソタイプ、サブクラスの決定はロuchーte
rtony法(免疫学実験入門、生物化学実験法15。
rtony法(免疫学実験入門、生物化学実験法15。
学会出版センター刊、p.74. 1981年)によっ
て行つ〇 蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmの吸光
度より算出する。
て行つ〇 蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmの吸光
度より算出する。
本発明の単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株KM−1 9 6,KM−2 6 8は英国、Bu
ropean CoIlection of Anim
al Ce1l Cu1ture(ECACC)に19
86年7月3日付でそれぞれECACC Nα860
70305および86070303として寄託しである
。
胞株KM−1 9 6,KM−2 6 8は英国、Bu
ropean CoIlection of Anim
al Ce1l Cu1ture(ECACC)に19
86年7月3日付でそれぞれECACC Nα860
70305および86070303として寄託しである
。
(5)ペプチド3と担体蛋白質の結合法(i)担体蛋白
質として牛サイログロブリンを用いる場合: ペプチド3(2mg/ml蒸溜水)0.5mlと牛サイ
ログロブリン(以下Thyという) (Sigma社
製、(10■/ml蒸溜水))0.5mlを混ぜ、I
M C H3 C O O N H4を加えてpHを
7.Ojトする。0. 0 2 ’Mゲルタールアルデ
ヒド(glutaraldehyde) 0. 5 ’
4mlを加え、室温にて5時間攪拌し、室温で50〜1
00容の蒸溜水で1日間透析する。この透析界を超音波
破砕〔超音波洗浄機(サンヨーS’UW− 1 5 0
)で10分間〕して、免疫あるいは酵素免疫測定法に
供した〔参考文献:Proc.Soc, Bxp, B
iol。
質として牛サイログロブリンを用いる場合: ペプチド3(2mg/ml蒸溜水)0.5mlと牛サイ
ログロブリン(以下Thyという) (Sigma社
製、(10■/ml蒸溜水))0.5mlを混ぜ、I
M C H3 C O O N H4を加えてpHを
7.Ojトする。0. 0 2 ’Mゲルタールアルデ
ヒド(glutaraldehyde) 0. 5 ’
4mlを加え、室温にて5時間攪拌し、室温で50〜1
00容の蒸溜水で1日間透析する。この透析界を超音波
破砕〔超音波洗浄機(サンヨーS’UW− 1 5 0
)で10分間〕して、免疫あるいは酵素免疫測定法に
供した〔参考文献:Proc.Soc, Bxp, B
iol。
led, 、14g.7,84〜?39 (1975
)]。
)]。
( ii )担体蛋白質としてキーホールリンペットヘ
モシアニン(、 K L H )を用いる場合:20m
gのK L H (Sigma社)を12.5mlの1
0mMリン酸バッフy−(pH7.2)に溶かし、温浴
中で超音波にかけた後、1 2. 0 0 Orpm。
モシアニン(、 K L H )を用いる場合:20m
gのK L H (Sigma社)を12.5mlの1
0mMリン酸バッフy−(pH7.2)に溶かし、温浴
中で超音波にかけた後、1 2. 0 0 Orpm。
10分間遠沈した上清に、M B S (m−male
imid。
imid。
−benzoyl−N−hydroxysuccini
mide ester,半井化学)4.3mgを、10
0JdlのN − N ’ −dimethylfor
mamide ’(半井化学)に溶解し、その81ρ
を加え、室温で30分間攪拌した。その溶液を5eph
adex G −25 (ファルマシア製)に通塔し
、50mMリン酸バッファーで溶出し、KLH−MBの
fractionを取り、その100Il!!とペプチ
ド3 5■を0.1Mリン酸バッファー(pH7.5)
1mlに溶解した溶液0.5〜2.5mlを加え、室温
で3時間攪拌し、100容のPBSで透析したものをK
LH−結合物として用いる□〔参考文献:Ce11.
28. 477 =487 (1982):l。
mide ester,半井化学)4.3mgを、10
0JdlのN − N ’ −dimethylfor
mamide ’(半井化学)に溶解し、その81ρ
を加え、室温で30分間攪拌した。その溶液を5eph
adex G −25 (ファルマシア製)に通塔し
、50mMリン酸バッファーで溶出し、KLH−MBの
fractionを取り、その100Il!!とペプチ
ド3 5■を0.1Mリン酸バッファー(pH7.5)
1mlに溶解した溶液0.5〜2.5mlを加え、室温
で3時間攪拌し、100容のPBSで透析したものをK
LH−結合物として用いる□〔参考文献:Ce11.
28. 477 =487 (1982):l。
本発明の単クローン性抗体は、通常の免疫組織化学的手
法などにより、続発性アミロイド−シスの検出に用いる
ことができる。
法などにより、続発性アミロイド−シスの検出に用いる
ことができる。
実施例1゜
〔1)免疫マウス牌細胞の調製
8週令のBALB/c雌マウス(静岡県実験動物農業協
同組合)にアジユバントとして水酸化アルミニウムゲル
2mg/匹および百日咳菌死菌ワクチン(千葉県血清研
究所)1’X10s細胞/匹と抗原としてペプチド3と
サイログロブリンとの結合物1100I1/匹を腹腔内
投与し免疫した。
同組合)にアジユバントとして水酸化アルミニウムゲル
2mg/匹および百日咳菌死菌ワクチン(千葉県血清研
究所)1’X10s細胞/匹と抗原としてペプチド3と
サイログロブリンとの結合物1100I1/匹を腹腔内
投与し免疫した。
以後、1ないし2週問おきに、ペプチド3とサイログロ
ブリンの結合物100g/匹を腹腔内に投与し、2回目
以降の免疫をかけた。3回目の免疫以降、免疫の5〜7
日後に眼底静脈束より採血し、血清中の抗−アミロイド
A蛋白質抗体価を面相法による酵素免疫測定法で調べた
。血清中のアミロイドA蛋白質に対する抗体価が、正常
マウス血清の103倍以上のマウスに、更にペプチド3
とサイログロブリンとの結合物100■/mlを腹腔内
投与して追加免疫し、3日後このマウスから脾細胞を調
製して細胞融合に用いた。
ブリンの結合物100g/匹を腹腔内に投与し、2回目
以降の免疫をかけた。3回目の免疫以降、免疫の5〜7
日後に眼底静脈束より採血し、血清中の抗−アミロイド
A蛋白質抗体価を面相法による酵素免疫測定法で調べた
。血清中のアミロイドA蛋白質に対する抗体価が、正常
マウス血清の103倍以上のマウスに、更にペプチド3
とサイログロブリンとの結合物100■/mlを腹腔内
投与して追加免疫し、3日後このマウスから脾細胞を調
製して細胞融合に用いた。
(2)マウス骨髄腫細胞の調製
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞P3−Ulを正
常培地(RP’MI−1640にグルタミン1.5mM
、2−メルカプトエタノ−J115 X I Q−5M
1ジ工ンタマイシン10■/mlおよび牛胎児血清0、
l ml /mlを加えた培地〕に培養(37℃、Co
、5%通気)し、4日後に2X10’以上の細胞を得る
。
常培地(RP’MI−1640にグルタミン1.5mM
、2−メルカプトエタノ−J115 X I Q−5M
1ジ工ンタマイシン10■/mlおよび牛胎児血清0、
l ml /mlを加えた培地〕に培養(37℃、Co
、5%通気)し、4日後に2X10’以上の細胞を得る
。
(3)ハイブリドーマの作製
MEM (日永製薬社製)でよく洗浄した免疫マウス牌
細胞lXIO3個とマウス骨髄腫細胞2×107個とを
混合し、1,20Qrpmで5分間遠心分離にかける。
細胞lXIO3個とマウス骨髄腫細胞2×107個とを
混合し、1,20Qrpmで5分間遠心分離にかける。
沈殿として得られた脾細胞とP3−01の混合した細胞
群をよくほぐした後、攪拌しながら37℃、ポリエチレ
ングリコール−1000(PEG−1000)2gSM
EM2mlおよびDMSOO,7mlの混液Q、5ml
を加え、1分後にMEMlmlを加えた。その後MEM
1mlを1分毎に5回加えた後、MEMを全容量が50
m1となるよう加える。
群をよくほぐした後、攪拌しながら37℃、ポリエチレ
ングリコール−1000(PEG−1000)2gSM
EM2mlおよびDMSOO,7mlの混液Q、5ml
を加え、1分後にMEMlmlを加えた。その後MEM
1mlを1分毎に5回加えた後、MEMを全容量が50
m1となるよう加える。
900rpmで遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細
胞をほぐした後、HAT培地〔上記正常培地にヒポキサ
ンチン′10−4M1チミジン1.5×i o−’M、
およびアミノプテリン4X10−7Mを加えた培地11
00mlを加え、10m1メスピペツトでゆるやかに細
胞を懸濁する。
胞をほぐした後、HAT培地〔上記正常培地にヒポキサ
ンチン′10−4M1チミジン1.5×i o−’M、
およびアミノプテリン4X10−7Mを加えた培地11
00mlを加え、10m1メスピペツトでゆるやかに細
胞を懸濁する。
懸濁液を96穴培養用プレー) (falcon、
ベクトン・ディッキンソン社製〕に20011tl/穴
ずつ分注し、5%C02インキニベ一ター中37℃で、
10〜14日間培養する。
ベクトン・ディッキンソン社製〕に20011tl/穴
ずつ分注し、5%C02インキニベ一ター中37℃で、
10〜14日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上清100AI!を捨て、HT培地〔上記HAT培
地よりアミノプテリンを除いた培地〕を100p加え、
37℃で培養する。以後2日間同様にHT培地への交換
を行い、培養を続け4日後、培養上清の一部を採取し、
抗アミロイドA蛋白質抗体価を上記の同相酵素免疫測定
法により測定する。
て、上清100AI!を捨て、HT培地〔上記HAT培
地よりアミノプテリンを除いた培地〕を100p加え、
37℃で培養する。以後2日間同様にHT培地への交換
を行い、培養を続け4日後、培養上清の一部を採取し、
抗アミロイドA蛋白質抗体価を上記の同相酵素免疫測定
法により測定する。
抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを2回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンKM−196,KM−268を抗アミロイド
A蛋白質単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株として
選択する。
ローニングを2回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンKM−196,KM−268を抗アミロイド
A蛋白質単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株として
選択する。
(4)単クローン性抗体の製造
プリスタン処理(2,6,10,14−テトラメチルペ
ンタデカン0.5ml/匹を腹腔内投与し、1〜2週間
飼育する。〕した8週令タードマウス(BALB/cn
u−/nu−)雌マウスに上記で得られたハイプリドー
マ株各4X106細胞/匹を腹腔的注射する。
ンタデカン0.5ml/匹を腹腔内投与し、1〜2週間
飼育する。〕した8週令タードマウス(BALB/cn
u−/nu−)雌マウスに上記で得られたハイプリドー
マ株各4X106細胞/匹を腹腔的注射する。
10〜21日後にハイプリドーマ株は腹水癌化する。1
0〜21日後に腹水のたまったマウスから腹水(4〜1
0ffll/匹)を採取し、遠心分離して固形分を除去
した。上清を50%硫安塩析、40%硫安塩析し、PB
S(p)(7,2>で2日間透析する。これを粗精製単
クローン性抗体とする。粗精製単クローン性抗体をDE
AE−セファロースカラムに通塔後、溶出し、IgG画
分を集め、精製単クローン性抗体とする。
0〜21日後に腹水のたまったマウスから腹水(4〜1
0ffll/匹)を採取し、遠心分離して固形分を除去
した。上清を50%硫安塩析、40%硫安塩析し、PB
S(p)(7,2>で2日間透析する。これを粗精製単
クローン性抗体とする。粗精製単クローン性抗体をDE
AE−セファロースカラムに通塔後、溶出し、IgG画
分を集め、精製単クローン性抗体とする。
(5)単クローン性抗体の抗原特異性
面相酵素免疫測定法により、精製単クローン性抗体の特
異性を検討した。抗原としては、アミロイドA蛋白質、
ペプチド1〜5.ペプチド1〜5とサイログロブリンと
の結合物、ペプチド1〜5トキーホールリンペツトヘモ
シアニンの結合物。
異性を検討した。抗原としては、アミロイドA蛋白質、
ペプチド1〜5.ペプチド1〜5とサイログロブリンと
の結合物、ペプチド1〜5トキーホールリンペツトヘモ
シアニンの結合物。
サイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン
、および牛血清アルブミンを用いた。その結果を第2表
に示す。
、および牛血清アルブミンを用いた。その結果を第2表
に示す。
第 2 表
注: +++1tOD4+sが0.300以上、++ハ
OD4+sが0、200〜0.299、士はOD 41
Sが0.199〜0.100、−はOD 415が0
.099以下を示す。
OD4+sが0、200〜0.299、士はOD 41
Sが0.199〜0.100、−はOD 415が0
.099以下を示す。
実施例2゜
ミクロトームで5IInにスライスした続発性アミロイ
ド−シス患者由来の肝や腎のホルマリン固定パラフィン
包埋組織切片を、卵白アルブミンでコートしたスライド
グラスに固定し、キシレンで脱パラフイン後、アルコー
ル−水で段階的に親水化した。レジン水で5分間すすぎ
、0.3%H2O2を含むメタノール中で室温30分間
静置し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次に
切片を20分間PBSで洗浄後、希釈したウマ正常血清
中で室温20分間静置した。切片から過剰の血清を吸い
取り、第1抗体(抗−アミロイド単クローン性抗体KM
−268、20xr/ml)と300分間反応せた。
ド−シス患者由来の肝や腎のホルマリン固定パラフィン
包埋組織切片を、卵白アルブミンでコートしたスライド
グラスに固定し、キシレンで脱パラフイン後、アルコー
ル−水で段階的に親水化した。レジン水で5分間すすぎ
、0.3%H2O2を含むメタノール中で室温30分間
静置し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次に
切片を20分間PBSで洗浄後、希釈したウマ正常血清
中で室温20分間静置した。切片から過剰の血清を吸い
取り、第1抗体(抗−アミロイド単クローン性抗体KM
−268、20xr/ml)と300分間反応せた。
洗浄後、希釈ビオチン化抗体(ビオチン化ウサギ抗Ig
G抗体)を300分間反応せ、さらに洗浄後、アビジン
−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体(ベクター社製)
を300分間反応せた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ
基質(0,02%H202を含む0.1 M ) !J
スス−酸バッファー(p H7,2)で調整した0、1
%ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(dia
minobenzidinetetrahydroch
loride) )を2分間反応させ、水冷中で反応を
停止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール−水およ
びキシレンで脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡し
た。
G抗体)を300分間反応せ、さらに洗浄後、アビジン
−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体(ベクター社製)
を300分間反応せた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ
基質(0,02%H202を含む0.1 M ) !J
スス−酸バッファー(p H7,2)で調整した0、1
%ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(dia
minobenzidinetetrahydroch
loride) )を2分間反応させ、水冷中で反応を
停止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール−水およ
びキシレンで脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡し
た。
その結果、続発性アミロイド−シス患者の肝や腎では、
水沢に、アミロイドA蛋白質の沈着像が観察された。
水沢に、アミロイドA蛋白質の沈着像が観察された。
一方、健常人の肝や腎組織切片は、同様の処響をほどこ
しても、全く染色像は認められなかった。
しても、全く染色像は認められなかった。
発明の効果
本発明によれば、続発性アミロイド−シスの検出に有用
な単クローン性抗体が提供され、続発性アミロイド−シ
スの病理診断が効率よく行うことができる。
な単クローン性抗体が提供され、続発性アミロイド−シ
スの病理診断が効率よく行うことができる。
Claims (3)
- (1)アミロイドA蛋白質に反応し、His−Ala−
Arg−Gly−Asn−Tyr−Asp−Ala−A
la−Lys−Argで示されるペプチドと反応し、か
つArg−Ser−Phe−Phe−Ser−Phe−
Leu−Gly−Glu−Ala−Phe−Asp,A
rg−Asp−Met−Trp−Arg−Ala−Ty
r−Ser−Asn−Met−Arg,Glu−Ala
−Ile−Ser−Asp−Ala−Arg−Glu−
Asn−Ile−GlnおよびGln−Arg−Phe
−Phe−Gly−His−Gly−Ala−Glu−
Asn−Serで示されるペプチドとは実質的に反応し
ない単クローン性抗体。 - (2)IgGまたはIgMクラスに属する特許請求の範
囲第1項記載の単クローン性抗体。 - (3)His−Ala−Arg−Gly−Asn−Ty
r−Asp−Ala−Ala−Lys−Argで示され
るペプチドまたはその担体蛋白質との結合物で哺乳動物
を免疫し、該免疫動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞
とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞株から該ペ
プチドに反応するハイブリドーマ細胞株を選び、該細胞
株を培地に培養するか、哺乳動物の腹腔に投与して腹水
化し、培養物または腹水中に該ペプチドに反応する単ク
ローン性抗体を蓄積させ、該培養物または腹水から該単
クローン性抗体を採取することによって得られる特許請
求の範囲第1項記載の単クローン性抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61189810A JPS6344895A (ja) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | 抗アミロイドa蛋白質単クロ−ン性抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61189810A JPS6344895A (ja) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | 抗アミロイドa蛋白質単クロ−ン性抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6344895A true JPS6344895A (ja) | 1988-02-25 |
JPH0570438B2 JPH0570438B2 (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=16247585
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61189810A Granted JPS6344895A (ja) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | 抗アミロイドa蛋白質単クロ−ン性抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6344895A (ja) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BE1003316A5 (fr) * | 1990-11-27 | 1992-02-25 | Will L F & Cie Sa | Anticorps monoclonal utile pour le diagnostic de la maladie d'alzheimer, hybridome secreteur d'un tel anticorps monoclonal et procede pour sa preparation. |
WO1997004317A1 (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-06 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | Method for the quantitative measurement of human acute phase serum amyloid a protein; recombinant protein; specific antibody |
EP1534310A4 (en) * | 2002-01-31 | 2006-05-31 | Univ Tel Aviv Future Tech Dev | PEPTIDES, ANTIBODIES AGAINST DISEASES ASSOCIATED WITH AMYLOID AND METHODS USING SAID PEPTIDES AND ANTIBODIES TO DIAGNOSE AND TREAT THESE DISEASES |
US7491699B2 (en) | 2002-12-09 | 2009-02-17 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Peptide nanostructures and methods of generating and using the same |
US7504383B2 (en) | 2003-01-07 | 2009-03-17 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Peptide nanostructures encapsulating a foreign material and method of manufacturing same |
US7732479B2 (en) | 2004-08-19 | 2010-06-08 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Compositions for treating amyloid associated diseases |
US7786086B2 (en) | 2004-09-08 | 2010-08-31 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Peptide nanostructures containing end-capping modified peptides and methods of generating and using the same |
JP2011510913A (ja) * | 2007-12-28 | 2011-04-07 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | アミロイドーシスの処置および予防 |
US8372880B2 (en) | 2003-09-25 | 2013-02-12 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Compositions and methods using same for treating amyloid-associated diseases |
US8563273B2 (en) | 2002-09-06 | 2013-10-22 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Method of screening for compounds that disaggregate amyloid aggregates |
US8697634B2 (en) | 2002-01-31 | 2014-04-15 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Peptides and methods using same for diagnosis and treatment of amyloid-associated disease |
US9096645B2 (en) | 2010-11-15 | 2015-08-04 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Dipeptide analogs for treating conditions associated with amyloid fibril formation |
-
1986
- 1986-08-13 JP JP61189810A patent/JPS6344895A/ja active Granted
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US7732479B2 (en) | 2004-08-19 | 2010-06-08 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Compositions for treating amyloid associated diseases |
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JP2011510913A (ja) * | 2007-12-28 | 2011-04-07 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | アミロイドーシスの処置および予防 |
US9096645B2 (en) | 2010-11-15 | 2015-08-04 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Dipeptide analogs for treating conditions associated with amyloid fibril formation |
US9630989B2 (en) | 2010-11-15 | 2017-04-25 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Dipeptide analogs for treating conditions associated with amyloid fibril formation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0570438B2 (ja) | 1993-10-05 |
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