JPS63273060A - 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 - Google Patents
生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
倉果上旦机且分国
本発明は、共有結合にてラテックス粒子に生理活性物質
を固定化するための生理活性物f同定化用ラテックス、
及びこのラテックスを用いて製造されるラテックス免疫
比濁法のためのラテックス試薬に関する。
を固定化するための生理活性物f同定化用ラテックス、
及びこのラテックスを用いて製造されるラテックス免疫
比濁法のためのラテックス試薬に関する。
獲米皇茨■
担体に生理活性物質を固定化してなる固定化生理活性物
質は、その生化学的反応を利用して種々利用されている
。その代表例として、酵素を水不溶性の担体に固定化さ
せてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固定化させてな
る免疫学的診断試薬が知られており、前者は近年、工業
的な酵素反応に実用化され、また後者は従来より種々の
診断に広く実用化されている。
質は、その生化学的反応を利用して種々利用されている
。その代表例として、酵素を水不溶性の担体に固定化さ
せてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固定化させてな
る免疫学的診断試薬が知られており、前者は近年、工業
的な酵素反応に実用化され、また後者は従来より種々の
診断に広く実用化されている。
酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。前記した固定化
酵素はかかる問題を解決するために実用化されたもので
あり、この固定化酵素に基質を反応させることによって
、酵素反応が行なわれる。
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。前記した固定化
酵素はかかる問題を解決するために実用化されたもので
あり、この固定化酵素に基質を反応させることによって
、酵素反応が行なわれる。
このような固定化酵素の製造方法として、代表的には、
水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理
吸着によって結合させる担体結合法が知られている。し
かし、従来、用いられている担体は、通常、セルロース
、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、ポリ
アクリルアミドゲル、多孔性ガラス等の径1mm乃至数
寵の粒子であり、このような粒子に酵素が固定化された
同定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場合、固
定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間を要すると共
に、反応収率が低いという問題がある。
水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理
吸着によって結合させる担体結合法が知られている。し
かし、従来、用いられている担体は、通常、セルロース
、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、ポリ
アクリルアミドゲル、多孔性ガラス等の径1mm乃至数
寵の粒子であり、このような粒子に酵素が固定化された
同定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場合、固
定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間を要すると共
に、反応収率が低いという問題がある。
そこで、担体としてラテックス粒子を用いることも提案
されている。例えば、従来の代表的なラテックスは、乳
化剤及び水溶性ラジカル重合開始剤の存在下に、例えば
スチレンのような水難溶性ラジカル重合性単量体を乳化
重合させて製造されている。
されている。例えば、従来の代表的なラテックスは、乳
化剤及び水溶性ラジカル重合開始剤の存在下に、例えば
スチレンのような水難溶性ラジカル重合性単量体を乳化
重合させて製造されている。
ここに、上記乳化剤は、一般に、乳化重合時における重
合安定性を確保すると共に、粒径が小さく、分散安定性
のよい重合体粒子を得るのに効果がある。乳化剤がこの
ようにして得られる重合体粒子の分散安定性を高める作
用については、必ずしも明らかではないが、−aには、
乳化剤の一部が重合体粒子に吸着されており、残余は媒
体中に遊離の状態で存在し、このように水分散型高分子
重合体粒子の水分散液中において、これら重合体粒子に
吸着された乳化剤と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡
が存在し、かかる平衡の結果として、重合体粒子の分散
安定化が達成されるとされている。
合安定性を確保すると共に、粒径が小さく、分散安定性
のよい重合体粒子を得るのに効果がある。乳化剤がこの
ようにして得られる重合体粒子の分散安定性を高める作
用については、必ずしも明らかではないが、−aには、
乳化剤の一部が重合体粒子に吸着されており、残余は媒
体中に遊離の状態で存在し、このように水分散型高分子
重合体粒子の水分散液中において、これら重合体粒子に
吸着された乳化剤と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡
が存在し、かかる平衡の結果として、重合体粒子の分散
安定化が達成されるとされている。
従って、このように乳化剤を含むラテックスは、重合体
粒子に酵素等の生理活性物質を固定化するために、これ
を緩衝液や生理食塩水中に分散させたとき、乳化剤の前
記したような吸着脱着平衡がくずれる結果、重合体粒子
の分散安定性が損なわれて、重合体粒子が凝集、沈降し
、粒子の自由度が奪われ、生化学的反応性が低下する。
粒子に酵素等の生理活性物質を固定化するために、これ
を緩衝液や生理食塩水中に分散させたとき、乳化剤の前
記したような吸着脱着平衡がくずれる結果、重合体粒子
の分散安定性が損なわれて、重合体粒子が凝集、沈降し
、粒子の自由度が奪われ、生化学的反応性が低下する。
また、遊離の乳化剤は、酵素反応等の生化学的反応の妨
害物質となることが多い。
害物質となることが多い。
このため、近年、それ自体が乳化能を有する単量体、例
えば、スチレンスルホン酸ナトリウムやポリエチレング
リコールモノメタクリレート等を乳化剤の不存在下にス
チレンと乳化共重合させて、ラテックスを得る方法も提
案されているが、かかるラテックスを用いるときは、ラ
テックス粒子が反応性を有する官能基をもたないために
、生理活性物質をラテックス粒子に吸着法にて固定化し
なければならず、その結果、同定化し得る生理活性物質
が限定されるほか、かかる固定化生理活性物質を実用に
供し得るpH範囲もまた限定され、更には、一般に、保
存安定性が悪い等、種々の問題を有している。
えば、スチレンスルホン酸ナトリウムやポリエチレング
リコールモノメタクリレート等を乳化剤の不存在下にス
チレンと乳化共重合させて、ラテックスを得る方法も提
案されているが、かかるラテックスを用いるときは、ラ
テックス粒子が反応性を有する官能基をもたないために
、生理活性物質をラテックス粒子に吸着法にて固定化し
なければならず、その結果、同定化し得る生理活性物質
が限定されるほか、かかる固定化生理活性物質を実用に
供し得るpH範囲もまた限定され、更には、一般に、保
存安定性が悪い等、種々の問題を有している。
他方、スチレンとメタクリル酸とを共重合させてなる所
謂カルボキシル化ポリスチレン等のようなカルボキシル
化ラテックスに生理活性物質を共有結合にて固定化する
方法も提案されている。しかし、上記従来より知られて
いるカルボキシル化ラテックスは、一般に、分散安定性
や保存安定性に劣り、特に、ラテックス粒子に多量の生
理活性物質を固定化した場合や、或いはラテックスと共
に多量の生理活性物質が共存する環境下では、ラテック
ス粒子が容易に凝集沈降し、その生化学的活性が著しく
低下する。特に、生理活性物質を固定化したラテックス
を生理食塩水や有機質溶質を含有する緩衝液に分散させ
た場合に、この傾向が著しい。
謂カルボキシル化ポリスチレン等のようなカルボキシル
化ラテックスに生理活性物質を共有結合にて固定化する
方法も提案されている。しかし、上記従来より知られて
いるカルボキシル化ラテックスは、一般に、分散安定性
や保存安定性に劣り、特に、ラテックス粒子に多量の生
理活性物質を固定化した場合や、或いはラテックスと共
に多量の生理活性物質が共存する環境下では、ラテック
ス粒子が容易に凝集沈降し、その生化学的活性が著しく
低下する。特に、生理活性物質を固定化したラテックス
を生理食塩水や有機質溶質を含有する緩衝液に分散させ
た場合に、この傾向が著しい。
他方、前記した免疫学的診断試薬は、血液、尿その他の
被検液としての体液中の生理活性物質が有する免疫活・
性を利用する免疫学的診断のために用いられる試薬であ
って、かかる免疫学的診断方法には、例えば、免疫学的
な反応を起こす抗原、抗体のいずれか一方、又は両者を
組合せて体液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、
これらに対応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、
即ち、抗原抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応
によって、上記のような免疫活性成分の存在を測定する
方法等がある。この場合、肉眼や光学的方法による測定
を容易にするために、一般に、抗原又は抗体は水不溶性
の微粒子状の担体、例えば、ラテックス、赤血球等に担
持されて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応を
利用して、血清等の体液中の被検成分が測定される。
被検液としての体液中の生理活性物質が有する免疫活・
性を利用する免疫学的診断のために用いられる試薬であ
って、かかる免疫学的診断方法には、例えば、免疫学的
な反応を起こす抗原、抗体のいずれか一方、又は両者を
組合せて体液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、
これらに対応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、
即ち、抗原抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応
によって、上記のような免疫活性成分の存在を測定する
方法等がある。この場合、肉眼や光学的方法による測定
を容易にするために、一般に、抗原又は抗体は水不溶性
の微粒子状の担体、例えば、ラテックス、赤血球等に担
持されて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応を
利用して、血清等の体液中の被検成分が測定される。
このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質が微量に
でも被検液中に存在すれば、これを検出し得る高い感度
と、目的とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性
を有することが要求される。
でも被検液中に存在すれば、これを検出し得る高い感度
と、目的とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性
を有することが要求される。
更に、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異
性を保持することが要求される。
性を保持することが要求される。
このような免疫学的診断試薬としては、従来、前述した
ように、ポリスチレンラテックス粒子を担体として用い
、その表面に抗原や抗体を物理吸着により固定化してな
る診断試薬や、カルボキシル化ラテックス粒子にカルボ
ジイミド、ジアルデヒド等を用いて抗原や抗体を共有結
合により同定化してなる診断試薬等が提案されている。
ように、ポリスチレンラテックス粒子を担体として用い
、その表面に抗原や抗体を物理吸着により固定化してな
る診断試薬や、カルボキシル化ラテックス粒子にカルボ
ジイミド、ジアルデヒド等を用いて抗原や抗体を共有結
合により同定化してなる診断試薬等が提案されている。
しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、前述した
ように、分散安定性や保存安定性に劣る等の問題を有す
るほか、特に、被検液と反応させたとき、対応する陽性
物質のみならず、陰性物質に対しても凝集反応を起こす
ことがある。このような凝集反応は非特異的凝集反応と
呼ばれている。このような非特異的凝集反応を起こすこ
とは、診断試薬として致命的な欠点である。
ように、分散安定性や保存安定性に劣る等の問題を有す
るほか、特に、被検液と反応させたとき、対応する陽性
物質のみならず、陰性物質に対しても凝集反応を起こす
ことがある。このような凝集反応は非特異的凝集反応と
呼ばれている。このような非特異的凝集反応を起こすこ
とは、診断試薬として致命的な欠点である。
そこで、近年、このようなラテックスの非特異的凝集反
応を防ぐために、例えば、血清や尿のような被検液を数
百倍乃至数千倍にも希釈し、光学セル中でラテックスと
反応させ、抗原抗体反応に基づくラテックス凝集反応を
可視光、近赤外光、紫外光、レーザー光等の吸光度や、
濁度、散乱等の光学的変化によって測定するラテックス
免疫比濁法が開発されている。
応を防ぐために、例えば、血清や尿のような被検液を数
百倍乃至数千倍にも希釈し、光学セル中でラテックスと
反応させ、抗原抗体反応に基づくラテックス凝集反応を
可視光、近赤外光、紫外光、レーザー光等の吸光度や、
濁度、散乱等の光学的変化によって測定するラテックス
免疫比濁法が開発されている。
しかし、この方法においては、上記のような被検液の大
幅な希釈は、当然に感度の著しい低下を招き、更には、
上記光学的変化のばらつきを大きくし、従って、測定の
再現性に劣ることとなる。
幅な希釈は、当然に感度の著しい低下を招き、更には、
上記光学的変化のばらつきを大きくし、従って、測定の
再現性に劣ることとなる。
他方、ラテックス試薬の感度を高めるために、ラテック
スへの抗原抗体等の固定化量を多くすれば、光学的変化
のばらつきが増幅され、測定可能な被検液中の抗体抗原
濃度の範囲も極めて限られることとなる。また、前述し
たように、却って非特異的凝集反応も起こりやすくなる
。
スへの抗原抗体等の固定化量を多くすれば、光学的変化
のばらつきが増幅され、測定可能な被検液中の抗体抗原
濃度の範囲も極めて限られることとなる。また、前述し
たように、却って非特異的凝集反応も起こりやすくなる
。
「が解・“ しようとする、R点
従って、本発明は、固定化生理活性物質のための水不溶
性担体としてラテックスにおける上述したような問題を
解決するためになされたものであって、ラテックスの製
造時において、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現
性にて重合を行なうことができ、しかも、得られるラテ
ックス粒子がその粒径分布が狭(、且つ、分散安定性及
び保存安定性にすぐれ、更に、生理活性物質を安定確実
に共有結合にて固定化することができ、このようにして
得られる固定化生理活性物質が分散安定性及び保存安定
性にすぐれる生理活性物質固定化用ラテックスを提供す
ることを目的とする。
性担体としてラテックスにおける上述したような問題を
解決するためになされたものであって、ラテックスの製
造時において、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現
性にて重合を行なうことができ、しかも、得られるラテ
ックス粒子がその粒径分布が狭(、且つ、分散安定性及
び保存安定性にすぐれ、更に、生理活性物質を安定確実
に共有結合にて固定化することができ、このようにして
得られる固定化生理活性物質が分散安定性及び保存安定
性にすぐれる生理活性物質固定化用ラテックスを提供す
ることを目的とする。
更に、本発明は、上記のラテックス粒子に、特に、抗原
、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化し、分散安定
性及び保存安定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応
を起こさずに、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検
液中の抗原抗体量を正確に再現性よく測定することがで
きるラテックス免疫比濁法のためのラテックス試薬及び
その製造方法を提供することを目的とする。
、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化し、分散安定
性及び保存安定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応
を起こさずに、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検
液中の抗原抗体量を正確に再現性よく測定することがで
きるラテックス免疫比濁法のためのラテックス試薬及び
その製造方法を提供することを目的とする。
シラを解決するための 段
本発明による生理活性物質固定化用ラテックスは、
(al 芳香族ビニル単量体100重量部、(b)ス
ルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量部、 (c) α、β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重
量部、及び (dl 内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量
部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させて得られる
平均粒子径0.03〜2.0μmの共重合体粒子からな
ることを特徴とする。
ルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量部、 (c) α、β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重
量部、及び (dl 内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量
部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させて得られる
平均粒子径0.03〜2.0μmの共重合体粒子からな
ることを特徴とする。
以下に本発明による生理活性物質固定化用ラテックスに
ついて、詳細に説明する。
ついて、詳細に説明する。
先ず、本発明において用いる芳香族ビニル単量体の具体
例としては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、
ビニルトルエン等を挙げることができるが、好ましくは
、スチレンが用いられる。
例としては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、
ビニルトルエン等を挙げることができるが、好ましくは
、スチレンが用いられる。
本発明によれば、かかる芳香族ビニル単量体を単量体組
成における主成分とするために、与テックス粒子は約1
.05の比重を有し、分散媒である水や緩衝液の比重に
近いので、得られるラテックスは、分散安定性にすぐれ
、特に、長期間にわたる保存においても、粒子が凝集沈
降しない。
成における主成分とするために、与テックス粒子は約1
.05の比重を有し、分散媒である水や緩衝液の比重に
近いので、得られるラテックスは、分散安定性にすぐれ
、特に、長期間にわたる保存においても、粒子が凝集沈
降しない。
スルホン酸基を有するビニル単量体としては、エチレン
スルホン酸のようなアルキレンスルホン酸や、一般式 %式% (但し、R1は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、R2は炭素数1〜6のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数2〜3のアルキレン基を示し、
Mは水素、アルカリ金属又はアンモニウムを示す。) で表わされるスルホアルキルアクリレート、例えば、ス
ルホプロピル(メタ)アクリレートやそのアルカリ金属
塩、一般式 (但し、R3は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、Mは前記と同じである。) で表わされるスチレンスルホン酸、その誘導体、これら
のアルカリ金属塩、例えば、スチレンスルホン酸ナトリ
ウム、一般式 %式% (但し、R4は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、RSは炭素数1〜6のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数3〜4のアルキレン基を示し、
Mは前記と同じである。)で表わされる2−アクリルア
ミドアルカンスルホン酸、その誘導体及びこれらのアル
カリ金属塩、例えば、2−アクリルアミド−2−メチル
プロパ゛ンスルホン酸等が用いられる。
スルホン酸のようなアルキレンスルホン酸や、一般式 %式% (但し、R1は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、R2は炭素数1〜6のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数2〜3のアルキレン基を示し、
Mは水素、アルカリ金属又はアンモニウムを示す。) で表わされるスルホアルキルアクリレート、例えば、ス
ルホプロピル(メタ)アクリレートやそのアルカリ金属
塩、一般式 (但し、R3は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、Mは前記と同じである。) で表わされるスチレンスルホン酸、その誘導体、これら
のアルカリ金属塩、例えば、スチレンスルホン酸ナトリ
ウム、一般式 %式% (但し、R4は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、RSは炭素数1〜6のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数3〜4のアルキレン基を示し、
Mは前記と同じである。)で表わされる2−アクリルア
ミドアルカンスルホン酸、その誘導体及びこれらのアル
カリ金属塩、例えば、2−アクリルアミド−2−メチル
プロパ゛ンスルホン酸等が用いられる。
このようなスルホン酸基を有するビニル単量体は、乳化
剤の不存在下での前記芳香族ビニル単量体の乳化共重合
時の重合安定性と、得られるラテックスの分散安定性を
高める効果を有する。かかる効果を有効に発現させるた
めに、本発明においては、単量体組成において、上記ス
ルホン酸基を有するビニル単量体は、前記芳香族ビニル
単量体100重量部に対して、0.01重量部以上の範
囲で含まれる。しかし、過多に用いるときは、却って、
重合安定性と得られるラテックスの分散安定性、特に、
保存安定性を劣化させるので、前記芳香族ビニル単量体
100重量部に対して、5重量部以下の範囲で含まれる
。
剤の不存在下での前記芳香族ビニル単量体の乳化共重合
時の重合安定性と、得られるラテックスの分散安定性を
高める効果を有する。かかる効果を有効に発現させるた
めに、本発明においては、単量体組成において、上記ス
ルホン酸基を有するビニル単量体は、前記芳香族ビニル
単量体100重量部に対して、0.01重量部以上の範
囲で含まれる。しかし、過多に用いるときは、却って、
重合安定性と得られるラテックスの分散安定性、特に、
保存安定性を劣化させるので、前記芳香族ビニル単量体
100重量部に対して、5重量部以下の範囲で含まれる
。
更に、本発明において用いられるα、β−不飽和カルボ
ン酸は、好ましくは、一般式 %式% (但し、R6は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、好ましくは水素又はメチル基、R7は水素又
は低級アルキル基を示し、好ましくは水素又はメチル基
を示し、R6が水素又は低級アルキル基のときは、R7
はカルボ低級アルコキシ基であつてもよい。) で表わされるアクリル酸誘導体である。
ン酸は、好ましくは、一般式 %式% (但し、R6は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、好ましくは水素又はメチル基、R7は水素又
は低級アルキル基を示し、好ましくは水素又はメチル基
を示し、R6が水素又は低級アルキル基のときは、R7
はカルボ低級アルコキシ基であつてもよい。) で表わされるアクリル酸誘導体である。
このようなアクリル酸誘導体の好ましい具体例として、
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロ
トン酸、マレイン酸、フマル酸、モノアルキルマレイン
酸、モノアルキルフマル酸、モノアルキルイタコン酸等
を挙げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリ
ル酸及びイタコン酸の1種又は2種以上の混合物が好ま
しく用いられる。
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロ
トン酸、マレイン酸、フマル酸、モノアルキルマレイン
酸、モノアルキルフマル酸、モノアルキルイタコン酸等
を挙げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリ
ル酸及びイタコン酸の1種又は2種以上の混合物が好ま
しく用いられる。
このようなアクリル酸誘導体は、得られるラテックス粒
子に生理活性物質を共有結合にて固定化するための官能
基であるカルボキシル基を与えるために必須であると共
に、本発明において、単量体混合物の乳化共重合時の重
合安定性を高め、また、得られるラテックスに水性媒体
中での分散安定性を高める効果を有する。ラテックス粒
子に実用量の生理活性物質を固定化し得ると共に、上記
効果を有効に得るためには、本発明においては、アクリ
ル酸誘導体は、単量体組成において、芳香族ビニル単量
体100重量部について、少なくとも1重量部を必要と
する。しかし、過多に共重合単量体成分として用いると
きは、却って重合安定性と、得られるラテックス分散安
定性を損なうので、アクリル酸誘導体は、単量体組成に
おいて、芳香族ビニル単量体100重量部について、2
0重量部以下の範囲で用いられる。特に好ましい範囲は
、2〜1(lffi部である。
子に生理活性物質を共有結合にて固定化するための官能
基であるカルボキシル基を与えるために必須であると共
に、本発明において、単量体混合物の乳化共重合時の重
合安定性を高め、また、得られるラテックスに水性媒体
中での分散安定性を高める効果を有する。ラテックス粒
子に実用量の生理活性物質を固定化し得ると共に、上記
効果を有効に得るためには、本発明においては、アクリ
ル酸誘導体は、単量体組成において、芳香族ビニル単量
体100重量部について、少なくとも1重量部を必要と
する。しかし、過多に共重合単量体成分として用いると
きは、却って重合安定性と、得られるラテックス分散安
定性を損なうので、アクリル酸誘導体は、単量体組成に
おいて、芳香族ビニル単量体100重量部について、2
0重量部以下の範囲で用いられる。特に好ましい範囲は
、2〜1(lffi部である。
更に、本発明においては、単量体成分として、内部架橋
用多官能性単量体が用いられる。この内部架橋用多官能
性単量体は、共重合体に架橋構造を導入するので、存在
する場合には好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、ラテックス粒子を非膨潤化して、重合体粒子
の水性媒体中での分散安定性を高めるのに効果がある。
用多官能性単量体が用いられる。この内部架橋用多官能
性単量体は、共重合体に架橋構造を導入するので、存在
する場合には好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、ラテックス粒子を非膨潤化して、重合体粒子
の水性媒体中での分散安定性を高めるのに効果がある。
かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ(メタ)アクリレートが好ま
しく用いられる。具体例として、例えば、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタ
クリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート
、ジプロピレングリコールジメタクリレート、1.3−
ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリ
メタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレ
ート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等が
好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやN、N
’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架橋
用単量体として用いることができる。
肪族多価アルコールのポリ(メタ)アクリレートが好ま
しく用いられる。具体例として、例えば、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタ
クリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート
、ジプロピレングリコールジメタクリレート、1.3−
ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリ
メタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレ
ート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等が
好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやN、N
’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架橋
用単量体として用いることができる。
内部架橋用多官能性単量体は、本発明においては、前記
芳香族ビニル単量体100重量部について、0.05〜
5重量部の範囲で用いられる。0.05重量部よりも少
ないときは、ラテックス粒子における架橋密度が小さす
ぎ、他方、5重量部を越えるときは、却って重合安定性
と得られるラテックスの分散安定性を損ない、好ましく
ないからである。
芳香族ビニル単量体100重量部について、0.05〜
5重量部の範囲で用いられる。0.05重量部よりも少
ないときは、ラテックス粒子における架橋密度が小さす
ぎ、他方、5重量部を越えるときは、却って重合安定性
と得られるラテックスの分散安定性を損ない、好ましく
ないからである。
本発明によれば、以上のような各単量体を水中にて、水
溶性のラジカル重合開始剤を用いて、乳化剤の不存在下
に乳化共重合させることにより、粒径が均一であり、且
つ、水中での分散安定性及び保存安定性にすぐれるラテ
ックスを得ることができる。このように、本発明による
前記単量体組成によれば、乳化剤を要せずして、安定に
共重合させることができると共に、得られるラテックス
の分散状態が安定に保持されるのが大きい特徴をなす。
溶性のラジカル重合開始剤を用いて、乳化剤の不存在下
に乳化共重合させることにより、粒径が均一であり、且
つ、水中での分散安定性及び保存安定性にすぐれるラテ
ックスを得ることができる。このように、本発明による
前記単量体組成によれば、乳化剤を要せずして、安定に
共重合させることができると共に、得られるラテックス
の分散状態が安定に保持されるのが大きい特徴をなす。
上記乳化共重合において、単量体成分混合物の水中での
濃度は、得られるラテックスにおける重合体粒子の平均
粒径とも関連するが、通常、5〜40重量%の範囲であ
る。
濃度は、得られるラテックスにおける重合体粒子の平均
粒径とも関連するが、通常、5〜40重量%の範囲であ
る。
重合開始剤としては、前述したように、水溶性ラジカル
重合開始剤が用いられる。通常、過硫酸カリウム、過硫
酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、こ
れら過硫酸塩と千オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム
、チオ硫酸水素ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又は
亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリ
ウム等のような亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が
好ましく用いられるが、これらに限定されるものではな
い。これら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対し
て0.1〜1重量%の範囲が好適である。重合の雰囲気
も特に制限されないが、安定した重合反応の開始のため
には、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が用い
られる。また、重合温度は、特に制限されないが、通常
、20−100℃、好ましくは40〜90℃の範囲であ
る。
重合開始剤が用いられる。通常、過硫酸カリウム、過硫
酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、こ
れら過硫酸塩と千オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム
、チオ硫酸水素ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又は
亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリ
ウム等のような亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が
好ましく用いられるが、これらに限定されるものではな
い。これら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対し
て0.1〜1重量%の範囲が好適である。重合の雰囲気
も特に制限されないが、安定した重合反応の開始のため
には、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が用い
られる。また、重合温度は、特に制限されないが、通常
、20−100℃、好ましくは40〜90℃の範囲であ
る。
本発明においそば、ラテックス粒子の平均粒径は0.0
3〜2.0μm、好ましくは0.05〜1.0μmであ
る。粒径が小さすぎると、ラテックス粒子の種々の処理
や操作において、その回収が困難となり、一方、粒径が
大きすぎると、水中での安定な分散状態を確保すること
が困難となる。
3〜2.0μm、好ましくは0.05〜1.0μmであ
る。粒径が小さすぎると、ラテックス粒子の種々の処理
や操作において、その回収が困難となり、一方、粒径が
大きすぎると、水中での安定な分散状態を確保すること
が困難となる。
本発明によるラテックスに固定化される生理活性物質は
、特に、限定されるものではない。具体例として、例え
ば、種々の酵素、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加
水分解酵素、リア゛−ゼ、異性化酵素、リガーゼ等や、
補酵素、ポリペプチド、抗原、抗体、ハプテン、ホルモ
ン類等を挙げることができる。
、特に、限定されるものではない。具体例として、例え
ば、種々の酵素、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加
水分解酵素、リア゛−ゼ、異性化酵素、リガーゼ等や、
補酵素、ポリペプチド、抗原、抗体、ハプテン、ホルモ
ン類等を挙げることができる。
本発明によるラテックス粒子には、生理活性物質は、ラ
テックス粒子の存するカルボキシル基を利用して、共有
結合にて固定化される。この場合、生理活性物質は、共
有結合にて直接にラテックス粒子に結合されていてもよ
く、又はラテックス粒子に共有結合にてスペーサ基が結
合され、このスペーサ基に生理活性物質が共有結合にて
結合されていてもよい。後者におけるように、生理活性
物質がスペーサ基を介してラテックス粒子に固定化され
るときは、固定化された生理活性物質のラテックス粒子
上での自由度が高められる利点がある。
テックス粒子の存するカルボキシル基を利用して、共有
結合にて固定化される。この場合、生理活性物質は、共
有結合にて直接にラテックス粒子に結合されていてもよ
く、又はラテックス粒子に共有結合にてスペーサ基が結
合され、このスペーサ基に生理活性物質が共有結合にて
結合されていてもよい。後者におけるように、生理活性
物質がスペーサ基を介してラテックス粒子に固定化され
るときは、固定化された生理活性物質のラテックス粒子
上での自由度が高められる利点がある。
しうち、本発明によるラテックス粒子は、このように、
ラテックス粒子にスペーサ基を結合しても、その分散安
定性や保存安定性が損なわれることがないのである。
ラテックス粒子にスペーサ基を結合しても、その分散安
定性や保存安定性が損なわれることがないのである。
前記スペーサ基として用い得る化合物は、少な(とも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
る゛ものではないが、特に、炭素数1〜12の炭素鎖基
を有する二官能性の有機化合物が好ましい。このような
スペーサ基として機能する化合物の具体例として、例え
ば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン
、キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−
アミノプロピオン酸、T−アミノ酪酸、ε−アミノカプ
ロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカル
ボン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギ
ニン、グリシルグリシルグリジン等のアミノ酸類等が好
ましく用いられるが、これらに限定されるものではない
。
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
る゛ものではないが、特に、炭素数1〜12の炭素鎖基
を有する二官能性の有機化合物が好ましい。このような
スペーサ基として機能する化合物の具体例として、例え
ば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン
、キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−
アミノプロピオン酸、T−アミノ酪酸、ε−アミノカプ
ロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカル
ボン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギ
ニン、グリシルグリシルグリジン等のアミノ酸類等が好
ましく用いられるが、これらに限定されるものではない
。
カルボキシル基を有するラテックス粒子に直接に生理活
性物質を共有結合にて固定化し、或いはラテックス粒子
にスペーサ基を共有結合にて結合し、このスペーサ基に
生理活性物質を共有結合にて固定化するための方法は、
特に制限されず、従来より知られている任意の方法によ
ることができる。
性物質を共有結合にて固定化し、或いはラテックス粒子
にスペーサ基を共有結合にて結合し、このスペーサ基に
生理活性物質を共有結合にて固定化するための方法は、
特に制限されず、従来より知られている任意の方法によ
ることができる。
例えば、好ましい方法の一つとして、架橋剤と。
して水溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げることが
できる。例えば、ジアミンをスペーサ基として用いる場
合であれば、水溶性カルボジイミドの存在下に、ジアミ
ンの有するアミノ基とラテックス粒子の有するカルボキ
シル基とを反応させ、アミド結合を形成させることによ
り、スペーサ基を重合体粒子に結合させ、次いで、同様
に水溶性カルボジイミドを用いて、このスペーサ基の有
するアミノ基を利用して、生理活性物質を共有結合にて
固定化することができる。
できる。例えば、ジアミンをスペーサ基として用いる場
合であれば、水溶性カルボジイミドの存在下に、ジアミ
ンの有するアミノ基とラテックス粒子の有するカルボキ
シル基とを反応させ、アミド結合を形成させることによ
り、スペーサ基を重合体粒子に結合させ、次いで、同様
に水溶性カルボジイミドを用いて、このスペーサ基の有
するアミノ基を利用して、生理活性物質を共有結合にて
固定化することができる。
かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ
ロピル)カルボジイミド塩酸塩、1−シクロへキシル−
3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド−メト−
p−トルエンスルホネート等を挙げることができる。
は、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ
ロピル)カルボジイミド塩酸塩、1−シクロへキシル−
3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド−メト−
p−トルエンスルホネート等を挙げることができる。
また、本発明においては、固定化すべき生理活性物質の
有する官能基や、前述した結合試薬の種類に応じて、ス
ペーサ基を用いて、ラテックス粒子のカルボキシル基の
一部又はすべてをカルボキシル基以外の官能基、例えば
、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等に変換してもよい
。
有する官能基や、前述した結合試薬の種類に応じて、ス
ペーサ基を用いて、ラテックス粒子のカルボキシル基の
一部又はすべてをカルボキシル基以外の官能基、例えば
、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等に変換してもよい
。
更に、スペーサ基の有する官能基、例えば、アミノ基で
あれば、これをジアルデヒドにて活性化した後、遊離の
アルデヒド基を利用して、これに生理活性物質のアミノ
基を結合させることができる。ジアルデヒドとしては、
特に限定されるものではないが、例えば、グルタルアル
デヒドやグリオキザール等を用いることができる。
あれば、これをジアルデヒドにて活性化した後、遊離の
アルデヒド基を利用して、これに生理活性物質のアミノ
基を結合させることができる。ジアルデヒドとしては、
特に限定されるものではないが、例えば、グルタルアル
デヒドやグリオキザール等を用いることができる。
本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテックス
試薬は、これまでに説明したラテックス粒子を担体とし
、これに抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化
することによって得ることができる。
試薬は、これまでに説明したラテックス粒子を担体とし
、これに抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化
することによって得ることができる。
即ち、本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテ
ックス試薬は、 (al 芳香族ビニル単量体100重量部、(b)
スルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量
部、 (c) α、β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重
量部、及び (d) 内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量
からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させてなる平均
粒子径0.03〜2.0μmの共重合体粒子を含むラテ
ックスに抗原′、抗体又はハプテンを共有結合にて固定
化してなることを特徴とする。
ックス試薬は、 (al 芳香族ビニル単量体100重量部、(b)
スルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量
部、 (c) α、β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重
量部、及び (d) 内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量
からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させてなる平均
粒子径0.03〜2.0μmの共重合体粒子を含むラテ
ックスに抗原′、抗体又はハプテンを共有結合にて固定
化してなることを特徴とする。
上記抗原、抗体又はハプテンは、特に、限定されるもの
ではないが、例えば、IgG、IgM、C+、Ca、C
RP、F(ab)、F (ab) ’、ホルモン、ポリ
ペプチド等を挙げることができる。
ではないが、例えば、IgG、IgM、C+、Ca、C
RP、F(ab)、F (ab) ’、ホルモン、ポリ
ペプチド等を挙げることができる。
発明の効果
以上のように、本発明による生理活性物質固定化用ラテ
ックスは、スチレンを主成分とする所定の単量体混合物
を共重合させてなり、平均粒径0゜03〜2.0μm1
比重約1.05、屈折率約1.6の重合体粒子を含むラ
テックスであって、先ず、ラテックスの製造時において
、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現性にて重合を
行なうことができ、しかも、得られるラテックス粒子が
その粒径分布が狭く、且つ、分散安定性及び保存安定性
にすぐれ、従って、その種類や固定化量に限定されるこ
となく、生理活性物質を安定に且つ再現性よく共有結合
にて固定化することができる・従って、また、このラテ
ックス粒子を担体として生理活性物質を共存結合にて固
定化してなる固定化生理活性物質もまた、分散安定性及
び保存安定性にすぐれる。
ックスは、スチレンを主成分とする所定の単量体混合物
を共重合させてなり、平均粒径0゜03〜2.0μm1
比重約1.05、屈折率約1.6の重合体粒子を含むラ
テックスであって、先ず、ラテックスの製造時において
、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現性にて重合を
行なうことができ、しかも、得られるラテックス粒子が
その粒径分布が狭く、且つ、分散安定性及び保存安定性
にすぐれ、従って、その種類や固定化量に限定されるこ
となく、生理活性物質を安定に且つ再現性よく共有結合
にて固定化することができる・従って、また、このラテ
ックス粒子を担体として生理活性物質を共存結合にて固
定化してなる固定化生理活性物質もまた、分散安定性及
び保存安定性にすぐれる。
特に、本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテ
ックス試薬は、上記したようなすぐれた特性を有するラ
テックス粒子に抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて
固定化してなるものであるので、分散安定性及び保存安
定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応を起こさずに
、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検液中の抗原抗
体量を正確に再現性よく測定することができる。
ックス試薬は、上記したようなすぐれた特性を有するラ
テックス粒子に抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて
固定化してなるものであるので、分散安定性及び保存安
定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応を起こさずに
、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検液中の抗原抗
体量を正確に再現性よく測定することができる。
更に、−Cに、メタクリル酸メチルを主成分とする重合
体粒子の場合は、比重が大きく、1.2に近いうえに、
屈折率が約1.4〜1.5の範囲にあって、このように
、屈折率が小さいときは、ラテックス免疫比濁法におい
て、吸光度や濁度の変化率が小さく、感度が小さい。こ
れに対して、本発明によれば、前述したように、ラテッ
クス粒子がスチレンのような芳香族ビニル単量体を主成
分とするので、重合体粒子が約1.6程度の屈折率を有
し、ラテックス免疫比濁法において感度の高い測定を可
能とする。
体粒子の場合は、比重が大きく、1.2に近いうえに、
屈折率が約1.4〜1.5の範囲にあって、このように
、屈折率が小さいときは、ラテックス免疫比濁法におい
て、吸光度や濁度の変化率が小さく、感度が小さい。こ
れに対して、本発明によれば、前述したように、ラテッ
クス粒子がスチレンのような芳香族ビニル単量体を主成
分とするので、重合体粒子が約1.6程度の屈折率を有
し、ラテックス免疫比濁法において感度の高い測定を可
能とする。
尖施開
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。尚、以下に
おいて、部は重量部を表わす。
れら実施例により限定されるものではない。尚、以下に
おいて、部は重量部を表わす。
実施例1
スチレン100部、スチレンスルホン酸ナトリウム0.
5部、アクリル酸5.0部、トリエチレングリコールジ
メタクリレート0.2部及び蒸留水410部を反応容器
に仕込み、窒素ガスにて十分に置換した後、70℃に昇
温し、300rpmにて30分間攪拌した。この後、同
様の撹拌下に過硫酸アンモニウム0.5部を蒸留水20
部に溶解した重合開始剤水溶液を加え、70℃の温度で
8時間重合させた。重合率は98.6%であった。
5部、アクリル酸5.0部、トリエチレングリコールジ
メタクリレート0.2部及び蒸留水410部を反応容器
に仕込み、窒素ガスにて十分に置換した後、70℃に昇
温し、300rpmにて30分間攪拌した。この後、同
様の撹拌下に過硫酸アンモニウム0.5部を蒸留水20
部に溶解した重合開始剤水溶液を加え、70℃の温度で
8時間重合させた。重合率は98.6%であった。
このようにして得られたラテックスにおける重合体粒子
は、コールタ−社製サブミクロン・パーティクル・アナ
ライザーにて測定した結果、平均粒子径は0.12μm
1粒径の変動係数は8%であった。また、重合体粒子の
表面のカルボキシル基量をアルカリ電導度滴定法によっ
て測定した結果、6.2μモル/dであった。
は、コールタ−社製サブミクロン・パーティクル・アナ
ライザーにて測定した結果、平均粒子径は0.12μm
1粒径の変動係数は8%であった。また、重合体粒子の
表面のカルボキシル基量をアルカリ電導度滴定法によっ
て測定した結果、6.2μモル/dであった。
上記と同様にして、第1表に示す単量体組成にて、番号
2〜6のラテックスを得た。
2〜6のラテックスを得た。
比較例1
実施例1と同様にして、第1表に示す単量体組成にて、
比較例1番号1〜6のラテックスを得た。
比較例1番号1〜6のラテックスを得た。
以上のようにして得た実施例1及び比較例1のそれぞれ
ラテックスについて、その乳化共重合時の重合安定性及
び得られたラテックス粒子の平均粒径を第1表に示す。
ラテックスについて、その乳化共重合時の重合安定性及
び得られたラテックス粒子の平均粒径を第1表に示す。
また、ラテックスを40℃においてpH9,0で48時
間放置した。このように処理したときのラテックス粒子
上のカルボキシル基量の変化率をラテックス安定性とし
て第1表に示す。このカルボキシル基量の変化率もアル
カリ電導度滴定法によった。
間放置した。このように処理したときのラテックス粒子
上のカルボキシル基量の変化率をラテックス安定性とし
て第1表に示す。このカルボキシル基量の変化率もアル
カリ電導度滴定法によった。
更に、ラテックス粒子の生理食塩水中での分散安定性及
び種々の方法にてラテックス粒子にスペーサ基を結合し
た後のラテックスの分散安定性を第2表に示す。分散安
定性の評価は、光学顕微鏡(200倍)にて観察し、次
のA、B及びCの3段階評価によった。
び種々の方法にてラテックス粒子にスペーサ基を結合し
た後のラテックスの分散安定性を第2表に示す。分散安
定性の評価は、光学顕微鏡(200倍)にて観察し、次
のA、B及びCの3段階評価によった。
A 均一であって、凝集は認められない。
B 肉眼では凝集は認められないが、顕微鏡観察によれ
ば凝集が認められる。
ば凝集が認められる。
C肉眼でも凝集が認められる。
ラテックス粒子の生理食塩水中での分散安定性の評価方
法及びスペーサ化の方法を以下に示す。
法及びスペーサ化の方法を以下に示す。
生食水での 性
0.9重量%の塩化ナトリウムを含むホウ酸緩衝液(p
H8,0,0,OIM)にラテックス粒子を5%濃度と
なるように分散させ、その直後及び2か列後の分散安定
性を評価した。
H8,0,0,OIM)にラテックス粒子を5%濃度と
なるように分散させ、その直後及び2か列後の分散安定
性を評価した。
m−キシリレンジアミンによるスペーサ化ラテックス粒
子をホウ酸緩衝液(pH7,5,0,OIM>に5重量
%濃度となるように分散させ、この分散液10m1をm
−キシリレンジアミン水溶液(0,03M)10…I及
び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液(40mg/ml) 2m
lと混合し、PH7,5,10℃で24時間反応させた
後、ホウ酸緩衝液(pH8,0,0,OIM)にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分5重量%になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。
子をホウ酸緩衝液(pH7,5,0,OIM>に5重量
%濃度となるように分散させ、この分散液10m1をm
−キシリレンジアミン水溶液(0,03M)10…I及
び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液(40mg/ml) 2m
lと混合し、PH7,5,10℃で24時間反応させた
後、ホウ酸緩衝液(pH8,0,0,OIM)にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分5重量%になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。
シスタミンによるスペーサ化
ラテックス粒子をホウ酸緩衝液(pH7,5,0,OI
M)に5重量%濃度となるように分散させ、この分散液
10m1をシスタミン水溶液(0,03M>10m1及
び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液(40mg/ml) 2ml
と混合し、pH7,5,10℃で24時間反応させた後
、ホウ酸緩衝液(pl(8,0,0,01M)にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分5重量%になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。
M)に5重量%濃度となるように分散させ、この分散液
10m1をシスタミン水溶液(0,03M>10m1及
び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液(40mg/ml) 2ml
と混合し、pH7,5,10℃で24時間反応させた後
、ホウ酸緩衝液(pl(8,0,0,01M)にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分5重量%になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。
±土二土化
上記シスタミンにてスペーサ化したラテックス粒子の有
するジスルフィド結合を2−メルカプトエチルアミンに
て完全にチオール基に還元し、その直後の分散安定性を
評価した。
するジスルフィド結合を2−メルカプトエチルアミンに
て完全にチオール基に還元し、その直後の分散安定性を
評価した。
次に、本発明によるラテックス粒子を担体とする固定化
生理活性物質の具体例を挙げる。
生理活性物質の具体例を挙げる。
文乞ヱニ丸皿足化
第1表に示す種々のラテックス粒子を5重量%濃度で含
有するホウ酸緩衝液(ρ■7.5.0.01M)3ml
をホウ酸緩衝液(pH7,5,0,01M)、ウレアー
ゼ水溶液(5mg/ml) 2.5 ml及びl−エチ
ル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液(5mg/ml) 0.6 mlと混合
し、4℃で24時間反応させた後、遠心分離し、ホウ酸
緩衝液(pn’r、o、0.01M)にて洗浄して、ウ
レアーゼが固定化されたラテックスを得た。
有するホウ酸緩衝液(ρ■7.5.0.01M)3ml
をホウ酸緩衝液(pH7,5,0,01M)、ウレアー
ゼ水溶液(5mg/ml) 2.5 ml及びl−エチ
ル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液(5mg/ml) 0.6 mlと混合
し、4℃で24時間反応させた後、遠心分離し、ホウ酸
緩衝液(pn’r、o、0.01M)にて洗浄して、ウ
レアーゼが固定化されたラテックスを得た。
このようなウレアーゼの固定化処理前後の280nmに
おける吸光度の変化からラテックス粒子におけるウレア
ーゼ同定化量を求め、次に、ラテックスの単位重量当り
に固定化されたウレアーゼの活性を同じ量の遊離のウレ
アーゼの活性にて除した値を比活性とし、これを第3表
に示す。
おける吸光度の変化からラテックス粒子におけるウレア
ーゼ同定化量を求め、次に、ラテックスの単位重量当り
に固定化されたウレアーゼの活性を同じ量の遊離のウレ
アーゼの活性にて除した値を比活性とし、これを第3表
に示す。
また、ラテックス粒子の初期活性も示す。ウレアーゼの
活性は、次のようにして測定した。即ち、3重量%尿素
水溶液を基質として、35℃にて酵素反応させ、生成し
たアンモニア量を0.2 N塩酸にて滴定し、アンモニ
ア1mmolを1分間に生成する活性を1単位とした。
活性は、次のようにして測定した。即ち、3重量%尿素
水溶液を基質として、35℃にて酵素反応させ、生成し
たアンモニア量を0.2 N塩酸にて滴定し、アンモニ
ア1mmolを1分間に生成する活性を1単位とした。
次に、ウレアーゼを固定化したラテックスをホウ酸緩衝
液(pH7,0,0,OIM)にて遠心洗浄し、再度、
同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度に分散させ、このよう
にして、10回の洗浄を繰り返した後、上記と同様にし
て、ラテックスのウレアーゼ活性を測定した。これを相
対活性として、第3表に示す。
液(pH7,0,0,OIM)にて遠心洗浄し、再度、
同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度に分散させ、このよう
にして、10回の洗浄を繰り返した後、上記と同様にし
て、ラテックスのウレアーゼ活性を測定した。これを相
対活性として、第3表に示す。
ウサギIgGの 電化
第1表に示す実施例1番号1〜6及び比較例1番号1及
び3のm−キシリレンジアミンにてスペーサ化したラテ
ックスをホウ酸緩衝液(pH8,0,0、OIM)に固
形分5重量%となるように分散させた。
び3のm−キシリレンジアミンにてスペーサ化したラテ
ックスをホウ酸緩衝液(pH8,0,0、OIM)に固
形分5重量%となるように分散させた。
上記スペーサ化うテックス31111%ホウ酸緩衝液(
pH8,0、0,OI M) 1.8 ml 1−エチ
ル−3=(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液(5mg/ml) 0.6 ml及びウ
サギIgG水溶液(5■/ml) 2.1mlを混合し
、10℃で200時間反応せた後、上記と同じホウ酸緩
衝液にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度
に分散させた。
pH8,0、0,OI M) 1.8 ml 1−エチ
ル−3=(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液(5mg/ml) 0.6 ml及びウ
サギIgG水溶液(5■/ml) 2.1mlを混合し
、10℃で200時間反応せた後、上記と同じホウ酸緩
衝液にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度
に分散させた。
このようにして、ウサギIgGをラテックス粒子1g当
り40■を固定化したラテックス試薬を得た。
り40■を固定化したラテックス試薬を得た。
第1表に示す比較例1番号のラテックスについては、こ
れにウサギIgGを吸着法にて同定化させた。固定化量
は、ラテックス粒子1g当り42mgであった。
れにウサギIgGを吸着法にて同定化させた。固定化量
は、ラテックス粒子1g当り42mgであった。
0.9重量%の塩化ナトリウムを含むホウ酸緩衝液(p
H8,2,0,OIM)に(ヤギ)抗ウサギIgGを溶
解させ、これを被検液として、その50μlを上記ラテ
ックス試薬50μlとガラス板上で混合し、その凝集を
観察した。結果を第4表に示す。
H8,2,0,OIM)に(ヤギ)抗ウサギIgGを溶
解させ、これを被検液として、その50μlを上記ラテ
ックス試薬50μlとガラス板上で混合し、その凝集を
観察した。結果を第4表に示す。
実施例2
ラテックス粒 へのスペーサ のl
実施例1と同じ単量体混合物を同じ方法にて乳化剤の不
存在下で乳化共重合させ、得られたラテックス粒子をホ
ウ酸緩衝液(pH7,5,0,01M)に5重量%濃度
となるように分散させた。この分散液100m1とε−
アミノカプロン酸水溶液(0゜03M) 100Il
lと1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド塩酸塩水溶液(38u/ml) 20m
lとを混合し、25℃で3時間、次いで、4℃で17時
間反応させた。この後、ホウ酸緩衝液(pH8,0,0
,OIM)にて遠心洗浄して、スペーサ基の結合された
重合体粒子を得、これを上記と同じ緩衝液に固形分濃度
5重量%となるように再分散させて、スペーサ化ラテッ
クスとした。
存在下で乳化共重合させ、得られたラテックス粒子をホ
ウ酸緩衝液(pH7,5,0,01M)に5重量%濃度
となるように分散させた。この分散液100m1とε−
アミノカプロン酸水溶液(0゜03M) 100Il
lと1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド塩酸塩水溶液(38u/ml) 20m
lとを混合し、25℃で3時間、次いで、4℃で17時
間反応させた。この後、ホウ酸緩衝液(pH8,0,0
,OIM)にて遠心洗浄して、スペーサ基の結合された
重合体粒子を得、これを上記と同じ緩衝液に固形分濃度
5重量%となるように再分散させて、スペーサ化ラテッ
クスとした。
ウサギIgGの固定化
上記スペーサ化ラテックス3ml、ホウ酸緩衝液(pH
8,0,0,01M) 1.8ml、 1−エチル−3
−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸
塩水溶液(5mg/ml) 0.6 ml及びウサギI
gG水溶液(5■/ml) 2.1 mlを混合し、1
0℃で20時間反応させた後、上記と同じホウ酸緩衝液
にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度に分
散させた。
8,0,0,01M) 1.8ml、 1−エチル−3
−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸
塩水溶液(5mg/ml) 0.6 ml及びウサギI
gG水溶液(5■/ml) 2.1 mlを混合し、1
0℃で20時間反応させた後、上記と同じホウ酸緩衝液
にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に5重量%濃度に分
散させた。
次に、このラテックスをウシ血清アルブミン0゜2%と
塩化ナトリウム0.9%を含むホウ酸緩衝液(pH8,
0,0,OIM)に0.5重量%となるように分散させ
て、ラテックス粒子1g当りウサギIgG43■を固定
化したラテックス試薬を得た。
塩化ナトリウム0.9%を含むホウ酸緩衝液(pH8,
0,0,OIM)に0.5重量%となるように分散させ
て、ラテックス粒子1g当りウサギIgG43■を固定
化したラテックス試薬を得た。
ラテックス試薬の活性の測
抗つサギIgG血清をウシ血清アルブミンホウ酸緩衝液
(ウシ血清アルブミン0.2%、塩化ナトリウム0.9
%、pus、o、0.01M)に溶解させ、AIgGと
した。
(ウシ血清アルブミン0.2%、塩化ナトリウム0.9
%、pus、o、0.01M)に溶解させ、AIgGと
した。
セルに前記ウサギIgG固定化ラテックス試薬30μl
と上記と同じウシ血清アルブミンホウ酸緩衝液450μ
lを入れ、次いで、上記AIgG溶液150μ2を入れ
、20秒間攪拌した後、分光光度計に据え付け、30秒
後の600nmにおける吸光度T0及び100秒後の6
00nmにおける吸光度T1 とをそれぞれ測定した。
と上記と同じウシ血清アルブミンホウ酸緩衝液450μ
lを入れ、次いで、上記AIgG溶液150μ2を入れ
、20秒間攪拌した後、分光光度計に据え付け、30秒
後の600nmにおける吸光度T0及び100秒後の6
00nmにおける吸光度T1 とをそれぞれ測定した。
吸光度変化ΔT =TI−T、とAIgG溶液の濃度と
の関係を第1図に示す。
の関係を第1図に示す。
本発明のラテックスによれば、高濃度を含むArgc溶
液の広い濃度範囲について、吸光度変化との間に直線性
を得ることができる。
液の広い濃度範囲について、吸光度変化との間に直線性
を得ることができる。
上記において、抗つサギIgG血清に代えて、リウマチ
陽性及び陰性の血清(非希釈)を用いた場合は、陰性血
清ついてはΔTは0、陽性血清についてはΔTは0.1
04であった。
陽性及び陰性の血清(非希釈)を用いた場合は、陰性血
清ついてはΔTは0、陽性血清についてはΔTは0.1
04であった。
また、AIgG活性は、ラテックス試薬を室温で6か月
間放置した後も、全く変わらなかった。
間放置した後も、全く変わらなかった。
比較例2
実施例1において、スチレンスルホン酸ナトリウムを単
量体成分として用いない以外は、実施例1と同じ方法に
て平均粒径0.18μmのカルボキシル化ポリスチレン
ラテックスを得た。
量体成分として用いない以外は、実施例1と同じ方法に
て平均粒径0.18μmのカルボキシル化ポリスチレン
ラテックスを得た。
このラテックスを用い、前記と同様にして、これにε−
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギIgGを固定化させた。 ゛実施例2と同
様にして、これをラテックス試薬として、リウマチ陽性
及び陰性の血清(非希釈)を用いて、その活性を評価し
たところ、陰性血清ついてはΔTは0.180、陽性血
清についてはΔTは0.171であって、非特異凝集性
が顕著であった。
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギIgGを固定化させた。 ゛実施例2と同
様にして、これをラテックス試薬として、リウマチ陽性
及び陰性の血清(非希釈)を用いて、その活性を評価し
たところ、陰性血清ついてはΔTは0.180、陽性血
清についてはΔTは0.171であって、非特異凝集性
が顕著であった。
また、AIgG溶液の場合は、第2図に示すように、5
〜70μg/mlの濃度範囲においてのみ、直線性が認
められるにすぎなかった。
〜70μg/mlの濃度範囲においてのみ、直線性が認
められるにすぎなかった。
比較例3
実施例1において、トリエチレングリコールジメタクリ
レートを単量体成分として用いない以外は、実施例1と
同じ方法にて平均粒径0.14μmのカルボキシル化ポ
リスチレンラテックスを得た。
レートを単量体成分として用いない以外は、実施例1と
同じ方法にて平均粒径0.14μmのカルボキシル化ポ
リスチレンラテックスを得た。
実施例2と同様にして、このラテックスにε−アミノカ
プロン酸をスペーサ基として結合させた後、これにウサ
ギIgG固定化して、ウサギIgG固定化ラテックス試
薬を得た。
プロン酸をスペーサ基として結合させた後、これにウサ
ギIgG固定化して、ウサギIgG固定化ラテックス試
薬を得た。
実施例2と同様にして、このウサギIgG同定化ラテッ
クス試薬のAIgG活性を試薬の調製の直後と6か月後
とにおいて測定したところ、ΔTの変動が著しく、6か
月後のΔTは試薬の調製直後の約l/10に減少してい
た。
クス試薬のAIgG活性を試薬の調製の直後と6か月後
とにおいて測定したところ、ΔTの変動が著しく、6か
月後のΔTは試薬の調製直後の約l/10に減少してい
た。
実施例3
実施例1において、単量体成分として、スチレンスルホ
ン酸のナトリウム塩に代えて、スルホプロビルメタタリ
レートを用いた以外は、実施例1と同じ方法にて平均粒
径0.21μmのカルボキシル化ポリスチレンラテック
スを得た。
ン酸のナトリウム塩に代えて、スルホプロビルメタタリ
レートを用いた以外は、実施例1と同じ方法にて平均粒
径0.21μmのカルボキシル化ポリスチレンラテック
スを得た。
このラテックスを用い、前記と同様にして、これにε−
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギIgC,に代えて、抗ヒト胎盤性性腺刺激ホ
ルモン抗体(hcG)を同様にして固定化して、抗hc
G固定化ラテックス試薬を得た。
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギIgC,に代えて、抗ヒト胎盤性性腺刺激ホ
ルモン抗体(hcG)を同様にして固定化して、抗hc
G固定化ラテックス試薬を得た。
標準hcG溶液を用いて、同様にΔTを測定した。
結果を第5表に示す。
第5表
第1図は、本発明によるラテックス粒子を担体とするラ
テックス試薬を用いたときの抗つサギIgG抗体の濃度
と吸光度変化との関係の一例を示すグラフ、第2図は、
比較例としての担体を用いたときの同様の抗体の濃度と
吸光度変化との関係の一例を示すグラフである。
テックス試薬を用いたときの抗つサギIgG抗体の濃度
と吸光度変化との関係の一例を示すグラフ、第2図は、
比較例としての担体を用いたときの同様の抗体の濃度と
吸光度変化との関係の一例を示すグラフである。
Claims (2)
- (1)(a)芳香族ビニル単量体100重量部、(b)
スルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量部
、 (c)α,β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重量部
、及び (d)内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させて得られる
平均粒子径0.03〜2.0μmの共重合体粒子からな
る生理活性物質固定化用ラテックス。 - (2)(a)芳香族ビニル単量体100重量部、(b)
スルホン酸基を有するビニル単量体0.01〜5重量部
、 (c)α,β−不飽和カルボン酸単量体1〜20重量部
、及び (d)内部架橋用多官能性単量体0.05〜5重量部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させてなる平均
粒子径が0.03〜2.0μmの共重合体粒子を含むラ
テックスに抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて固定
化してなることを特徴とするラテックス免疫比濁法のた
めのラテックス試薬。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62108701A JPH0810224B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
DE8888106859T DE3869670D1 (de) | 1987-04-30 | 1988-04-28 | Latex fuer die immobilisierung von physiologisch aktiven verbindungen und reaktiver latex, der diesen latex verwendet. |
EP88106859A EP0295402B1 (en) | 1987-04-30 | 1988-04-28 | Latex for immobilization of physiologically active substance and latex reagent using the latex |
CA000565416A CA1301647C (en) | 1987-04-30 | 1988-04-28 | Latex for immobilization of physiologically active substance and latexreagent using the latex |
US07/540,384 US5166077A (en) | 1987-04-30 | 1990-06-19 | Latex for immobilization of physiologically active substances for immuno nephelometry |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62108701A JPH0810224B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63273060A true JPS63273060A (ja) | 1988-11-10 |
JPH0810224B2 JPH0810224B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=14491433
Family Applications (1)
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JP62108701A Expired - Lifetime JPH0810224B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0295402B1 (ja) |
JP (1) | JPH0810224B2 (ja) |
CA (1) | CA1301647C (ja) |
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WO2007063616A1 (ja) * | 2005-11-30 | 2007-06-07 | Nihon University | 超高感度c-反応性タンパク質測定試薬及び測定方法 |
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WO2018216784A1 (ja) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | 積水化学工業株式会社 | 測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬 |
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EP0054685B1 (de) * | 1980-12-23 | 1986-07-09 | Roche Diagnostics GmbH | Hydrophile Latexpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
-
1987
- 1987-04-30 JP JP62108701A patent/JPH0810224B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-28 EP EP88106859A patent/EP0295402B1/en not_active Expired
- 1988-04-28 DE DE8888106859T patent/DE3869670D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 CA CA000565416A patent/CA1301647C/en not_active Expired - Lifetime
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WO2018216784A1 (ja) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | 積水化学工業株式会社 | 測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬 |
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JPWO2018216784A1 (ja) * | 2017-05-24 | 2020-03-26 | 積水化学工業株式会社 | 測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬 |
CN110637232B (zh) * | 2017-05-24 | 2023-08-18 | 积水医疗株式会社 | 测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂 |
US11867694B2 (en) | 2017-05-24 | 2024-01-09 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Latex particles for measurement reagents, sensitized latex particles, and measurement reagent for turbidimetric immunoassay |
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---|---|
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EP0295402A3 (en) | 1989-02-15 |
EP0295402A2 (en) | 1988-12-21 |
JPH0810224B2 (ja) | 1996-01-31 |
CA1301647C (en) | 1992-05-26 |
EP0295402B1 (en) | 1992-04-01 |
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