JPH0372261A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童栗±生旦里光互 本発明は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法に関
し、詳しくは、特に、簡単確実にＢ／Ｆ分離を行なって
、短時間に簡単に且つ高感度高精度にて被検液中に含ま
れる所定の免疫活性物質を検出することができる免疫学
的測定法に関する。

夫来少挟査 体液に含まれる所定の被検物質を免疫学的手法によって
測定する方法としては、従来、この被検物質に特異的な
抗原又は抗体を担持させた赤血球やポリスチレン粒子と
被検物質を接触させて、その凝集反応を目視にて、又は
光学的若しくは機械的に測定する方法が知られているが
、しかし、この方法によれば、一般に、高感度にて所定
の被検物質を検出することが困難であるので、従来、更
に、高感度の方法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）や
放射性免疫測定法（ＲＩＡ）が利用されている。

これらの方法においては、被検物質に特異的に反応する
所定の免疫活性物質を水不溶性の担体に結合してなる固
相を用いる固相法が好適に利用されており、特に、サン
ドイツチ法や競合法がよく知られている。

例えば、サンドイツチ法において、被検物質が所定の抗
原であるときは、不活性固相担体に所定の抗体を結合さ
せて固相化抗体とし、これに被検物質である抗原を加え
て、抗原抗体反応（−次反応）を行なわせる。次いで、
固相に過剰の標識化抗体を加え、固相化抗体に結合した
抗原に更に標識化抗体を抗原抗体反応（二次反応）にて
特異的に結合させる。かくして、被検物質である抗原は
、固相化抗体と標識化抗体との間にサンドイッチ状に結
合される。

そこで、次いで、上記反応に関与しなかった余剰の標識
化抗体を洗浄等の手段によって、固相から除去した後（
Ｂ／Ｆ分離）、固相上の標識化抗体を検出することによ
って、被検物質である抗原を定量する。

かかるサンドイツチ法において、ＥＩＡの場合には、上
記標識化抗体として酵素にて標識化した抗体が用いられ
る。従って、かかる酵素標識化抗体の定量には、標識物
質である酵素に基質を反応させ、その酵素反応による反
応結果を例えば比色定量する。

このように、免疫学的測定法において、固相法を採用す
るときは、特に、固相に結合した標識化抗体と、固相に
結合しなかった標識化抗体とを分離、即ち、Ｂ／Ｆ分離
するために煩雑な操作を必要とし、従って、測定に長時
間を必要とする。

ｌが”しよ゛とする量 そこで、例えば、特開昭６２−９８２５８号公報や特開
昭６２−９８２５９号公報には、粒子径０．０２μｍ乃
至１帥の高分子重合体粒子に抗体を結合させた重合体粒
子の固相の水性分散液を調製し、これに過剰の標識化抗
体を反応させた後、多孔質膜を用いてＢ／Ｆ分離し、こ
の後、多孔質膜上の固相の標識を検出する方法が提案さ
れている。

この方法によれば、Ｂ／Ｆ分離は簡単化されるものの、
用いる前記粒子状固相が、一般にラテックス免疫凝集法
にて用いられる抗体固定化ラテックスに似るため、被検
物質との反応時に固相化粒子の凝集が生し、かかる膜面
での固相の不均一性に起因するとみられる非特異反応が
生じることがあり、かくして、測定の定量性や再現性に
、尚、幾つかの問題が残されており、更に、定量域が比
較的限られる等の問題もある。

本発明は、従来の免疫学的測定法における上記した問題
を解決するためになされたものであって、特に、固相法
によるＥＩＡやＲＩＡにおいて、簡単な操作にて短時間
に高感度高精度にて所定の被検物質を検出し得る免疫学
的測定法を提供することを目的とする。

晋　を”パ　るための 本発明による免疫学的測定法は、 表面にスルホン酸基及びカルボキシル基を有する粒子径
０．５〜５００ｔＩｍの重合体粒子に上記カルボキシル
基を介して免疫活性物質を共有結合にて結合させてなる
免疫活性物質固相化粒子の水性分散液に被検液を加えて
、この被検液中の所定の被検物質を上記免疫活性物質に
特異的に結合させる第１工程、及び 上記被検物質に特異的に結合する標識化物質を上記被検
物質に特異的に結合させる第２工程を含み、 次いで、このようにして得た固相化粒子の分散液を上記
固相化粒子の粒子径の２倍以上の平均保留粒子径を有す
る第１の濾材にて濾過する第３工程、 得られた濾液を前記固相化粒子の粒子径以下で、且つ、
０．２μｍ以上の平均保留粒子径を有する第２の濾材に
て濾過する第４工程、次いで、上記第２の濾材上に捕捉
した固相化粒子に結合した標識を検出する第５工程から
なることを特徴とする。

本発明による免疫学的測定法においては、表面にスルホ
ン酸基及びカルボキシル基を有する粒子径０．５〜５０
０　ｐｍ（Ｄ重合体粒子に上記カルボキシル基を介して
免疫活性物質を共有結合にて結合させてなる固相化粒子
が固相として用いられる。

上記重合体粒子は、スルホン酸基を有する単量体とカル
ボキシル基を有する単量体、又はスルホン酸基とカルボ
キシル基を併せ有する単量体を、必要に応じてこれら単
量体と共重合し得るビニル単量体と共に、乳化（共）重
合させることによって得ることができる。このようなス
ルホン酸基を有する単量体やカルボキシル基を有する単
量体、及びこれらに共重合し得るビニル単量体は、既に
種々のものが知られており、また、かかる単量体の乳化
（共）重合も既に知られている。

上記スルホン酸基を有する単量体としては、例えば、−
形式 ％式％： （式中、Ｒ′は水素又はアルキル基を示し、Ｒ２はアル
キレン基を示し、Ｍは水素又はアルカリ金属を示す。） で表わされるスルホアルキルアクリレートやそのアルカ
リ金属塩、−形式 （式中、Ｒ３はアルキル基、Ｍは水素又はアルカリ金属
を示す。） で表わされるスチレンスルホン酸誘導体やそのアルカリ
金属塩、−形式 ％式％ （式中、Ｒ４はアルキル基、Ｒ５はアルキレン基を示し
、Ｍは水素又はアルカリ金属を示す。）で表わされるア
クリルア旦ドアルカンスルホン酸やそのアルカリ金属塩
を挙げることができる。

従って、スルホン酸基を有するビニル単量体の具体例と
して、例えば、スチレンスルホン酸ナトリウムやナトリ
ウムスルホプロピルメタクリレート等を挙げることがで
きる。

かかるスルホン酸基を有するビニル単量体は、乳化剤の
不存在下での乳化共重合によって生成する共重合体粒子
の分散安定性を高める。

また、カルボキシル基を有するビニル単量体としては、
好ましくは、−形式 ％式％ （式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立にアルキル基を示
す。） で表わされるアクリル酸誘導体が用いられる。具体例と
しては、例えば、アクリル酸やメタクリル酸を挙げるこ
とができる。また、ビニル酢酸やフマル酸、マレイン酸
等もカルボキシル基を有するビニル単量体として用いる
ことができる。

かかるアクリル酸誘導体は、得られる乳化共重合体粒子
に免疫活性物質を共有結合にて固定化するための官能基
であるカルボキシル基を与えるために必須であると共に
、得られる乳化共重合体粒子の分散安定性を高める効果
も有する。

これらスルホン酸基やカルボキシル基を有する単量体に
共重合性を有するビニル単量体としては、特に限定され
るものではないが、例えば、スチレン、ビニルトルエン
等の芳香族ビニル単量体、（メタ）アクリル酸メチル、
（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピ
ル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル等の（メタ
）アクリル酸アルキルエステル、酢酸ビニル、ブタジェ
ン、イソプレン、（メタ）アクリロニトリル等を挙げる
ことができる。

更に、上記共重合性ビニル単量体としては、併せて、多
官能性単量体も同時に用いることが好ましい。このよう
な多官能性単量体を用いることによって、内部架橋によ
って、得られる共重合粒子のガラス転移点を高めること
ができる。また、前述したようなスルホン酸基やカルボ
キシル基を有する単量体を乳化共重合させるとき、好ま
しくない水溶性の重合体が副生されることがあるが、乳
化重合時、かかる多官能性単量体を併用することによっ
て、好ましくない水溶性重合体の副生を抑制することが
できる。

このような多官能性単量体としては、例えば、エチレン
グリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタ
クリレート、プロピレングリコールジアクリレート、プ
ロピレングリコールジメタクリレート、ポリエチレング
リコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメ
タクリレート、ジビニルベンゼン、グリセリントリアク
リレート等を挙げることができる。

本発明において用いるかかる重合体粒子は、粒子径が０
．５〜５００μｍの範囲にあることが必要である。重合
体粒子の粒子径が０．５μｍよりも小さいときは、後述
する第４工程の濾過時に、濾材上に重合体粒子を捕捉す
ることが困難である。また、かかる重合体粒子を捕捉し
得る濾材を用いても、濾過が極めて遅く、また、標識化
物質が濾過され難くなるため、非特異反応の原因となる
ので、好ましくない。

他方、重合体粒子が粒子径が５００μｍよりも大きいと
きは、単位容量当りの粒子の総表面積が小さく、感度が
低い。また、保存中に粒子が沈降し、均一分散し難いた
め、保存安定性と測定の再現性が悪化する。

本発明においては、このようにして得られる乳化共重合
体粒子は、その表面にカルボキシル基を０．３〜３０μ
モル／ｎｆの範囲で有することが好ましく、特に、１〜
２０μモル／ボの範囲で有することが好ましい。乳化共
重合体粒子表面におけるカルボキシル基が０．３μモル
／ｍ２よりも少ないときは、これに結合し得る抗体量が
少なすぎて、感度が低く、更に、かかる固相化粒子に被
検液を加えたときに、固相化粒子に凝集が生じ、測定精
度を低くする。他方、乳化共重合体粒子表面におけるカ
ルボキシル基が３０μモル／ボよりも多いときは、固相
化粒子が分散安定性に劣るようになり、測定の再現性が
損なわれることとなる。

また、本発明において用いる重合体粒子は、その表面に
スルホン酸基を０．００１〜１０μモル／ボの範囲にて
有することが好ましく、特に、０．０１〜１．０μモル
／ボの範囲にて有することが好ましい。重合体粒子の有
するスルホン酸基量が上記よりも少ないときは、重合体
粒子の分散安定性が悪く、第１及び第２工程において凝
集を生じやすい。他方、上記よりも多いときは、粒子が
膨潤しやすく、保存安定性に劣ることとなると共に、第
１及び第２工程において、十分に高い反応性を有しない
こととなる。

本発明において用いる固相化粒子は、このように、表面
にカルボキシル基と共にスルホン酸基を有するので、例
えば、抗体を水溶性カルボジイミドを用いて、粒子の有
するカルボキシル基を利用して、粒子に固定化するとき
、スルホン酸基は、遊離のままにて残存するので、固相
化粒子の分散安定性を保持しつつ、抗体を高密度にて粒
子に結合することができる。上記カルボジイミドとして
は、例えば、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−
３−（２−モノホリノエチル）カルボシイごドーメトー
Ｐ−）ルエンスルホネート等が好ましく用いられる。

本発明の方法は、常法に従って、第１工程として、かか
る固相化粒子の水性分散液に所定の被検物質を含む尿等
、適宜の被検液を加え、数分から数十分、反応させて、
上記被検物質を上記固相化粒子に特異的に結合させ、次
いで、第２工程として、上記被検物質に特異的に反応す
る標識化免疫活性物質を加えて、同様に、数分から数十
分、反応させて、上記標識化免疫活性物質を被検物質に
特異的に結合させる。

次いで、第３工程として、かかる反応後の固相化粒子の
水性分散液をこの固相化粒子の粒子径の２倍以上の平均
保留粒子径を有する第１の濾材にて濾過する。しかし、
本発明によれば、前記第１及び第２の工程はほぼ同時に
行なってもよい。即ち、固相化粒子に水分散液に被検物
質と標識化物質とをほぼ同時にを加えて、数分から数十
分、反応させた後、分散液を第１の濾材にて濾過しても
よい。

本発明において、平均保留粒子径とは、ポリスチレン粒
子懸濁液の希釈液を調製し、これを濾過して、その漏洩
度を顕微鏡計測法にて調べて、濾過されなった最小の粒
子径をいう。

本発明においては、第１の濾材は、固相粒子を透過させ
るように、固相化粒子の粒子径の２倍以上の平均保留粒
子径を有することが必要であり、１０倍以上の平均保留
粒子径を有することが好ましい。第１の濾材の平均保留
粒子径が固相化粒子の粒子径の２倍よりも小さいときは
、保留される粒子量が多くなるからである。しかし、２
０倍を越えるときは、後述するように、被検物質中に共
存する微粒子状物質やコロイド状物質等を濾過する効果
が少なくなる。

本発明によれば、このような第３工程によって、非特異
反応を著しく減少させることができる。特に、被検物質
中に所定の免疫活性物質を含まない陰性検体における擬
陽性化がなく、ブランクの値を極めて低くすることがで
きる。このような理由は必ずしも明らかではないが、被
検物質中に共存する微粒子状物質やコロイド状物質が濾
別されることや、ミクロ凝集した固相粒子間に標識化抗
体が存在し、この状態でミクロ凝集が第１の濾材にて除
去されるためであるとみられる。

第１の濾材は、被検液中の抗原や抗体等のタンパク質を
非特異的に吸着してはならないので、親水性材料、例え
ば、再生セルロース、濾紙、ガラス繊維フィルター等か
らなるのが好ましい。

次いで、本発明の方法によれば、第４工程として、得ら
れた濾液を第２の濾材にて濾過して、固相化粒子を第２
の濾材上に捕捉する。従って、第２の濾材は、固相化粒
子の粒径以下であって、且つ、０．２μｍ以上の平均保
留粒子径を有することが必要である。第２の濾材の平均
保留粒子径が０゜２μｍよりも小さいときは、非特異反
応が増したり、或いは濾過に不必要に長時間を要する。

また、第２の濾材の平均保留粒子径が固相化粒子の粒子
径よりも大きいときは、固相化粒子が濾材を透過する。

第２の濾材の平均保留粒子径は、好ましくは、固相化粒
子の粒径の８０％以下である。

第２の濾材も、第１の濾材と同様に、被検液中の抗原や
抗体等のタンパク質を非特異的に吸着してはならないの
で、親水性材料、例えば、再生セルロース、濾紙、ガラ
ス繊維フィルター等からなるのが好ましい。

次に、本発明の方法を用いて、サンドイツチ法にて被検
物質を測定する場合を例として具体的に説明する。

先ず、被検物質に特異的な抗原又は抗体を調製し、これ
を重合体粒子に固定化させる。例えば、被検物質がＣＲ
Ｐであるときは、このＣＲＰに特異的な抗体としての抗
ＣＲＰ抗体を重合体粒子にそのカルボキシル基を介して
共有結合法にて結合させる。被検物質に特異的な抗原又
は抗体等の免疫活性物質の重合体粒子への結合量は、そ
れら免疫活性物質によっても異なるが、通常、重合体粒
子１ｇ当りにｌ〜５００■の範囲である。このように、
免疫活性物質を固定化した重合体粒子は、免疫活性物質
の失活がないように、適宜の緩衝液に０．５〜２０重量
％、好ましくは１〜１０重量％の濃度にて分散される。

緩衝液としては、通常、適当なｐＨ及び濃度に調整した
グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等が用い
られる。例えば、前記抗ＣＲＰ抗体を重合体粒子に結合
させたときは、重合体粒子は、グリシン緩衝液中に分散
されることが好ましい。

次いで、抗ＣＲＰ抗体固相化粒子を含むかかる分散液に
ＣＲＰを含有する被検液を加え、通常、１〜６０分間反
応させ、被検液中のＣＲＰを上記抗ＣＲＰ抗体に特異的
に結合させる。次に、アルカリホスファターゼ等にて標
識化した過剰量の抗ＣＲＰ抗体を加えて更に反応させ、
標識化抗ＣＲＰ抗体を上記固相に結合したＣＲＰに特異
的に結合させる。

この反応系を前記第１の濾材にて濾過し、更に、得られ
た濾液を第２の濾材にて濾過し、洗浄して、Ｂ／Ｆ分離
を行なう。ここに、第２の濾材は、自然濾過にて十分な
濾過性を有するので、吸引濾過等のような強制濾過は必
要でなく、むしろ、強制濾過は、目詰まりや凝集を生じ
させて、非特異反応の惹起やブランク値の上昇を招くの
で、好ましくない。

このようにして、第２の濾材上に残留した固相化粒子の
標識を検出することによって、ＣＲＰｉを求めることが
できる。例えば、アルカリホスファターゼにて標識化し
た抗ＣＲＰ抗体を用いたときは、アルカリホスファター
ゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウム、ＴＮＢＳ
　（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフ
ェート−ｐ−ｔ−ルイジン塩）及び塩化マグネシウムを
含有するジェタノールアミン溶液を上記第２の濾材上の
固相化粒子に滴下すれば、約３分後には、固相化粒子が
褐色に着色するので、目視又は反射光を測定することに
よって、標識を検出することができる。

競合法によるときも、同様に、標識を検出することがで
きる。

発１しｌ■果 以上のように、本発明の方法によれば、用いる重合体粒
子が微粒子であるので、抗原又は抗体を結合し得る表面
積が非常に大きく、しかも、固相化粒子の分散性がよく
、且つ、抗原抗体反応を阻害しないので、抗原抗体反応
は、均一系に近い状態にて行なわれる。また、仮にごク
ロ的な凝集反応が生しても、その凝集物は、第１の濾材
にて濾別され、更に、第２の濾材にて過剰の標識化抗体
が確実にＢ／Ｆ分離されるので、従来の固相ＥＩＡ法に
比べて、短時間にて、且つ、簡単な操作にて、高感度高
精度にて、しかも、非特異反応を抑制しつつ、再現性高
く免疫学的測定を行なうことができる。

夫豊明 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

（ａ）　　ラテックスの調製 スチレン１００重１部、スチレンスルホン酸ナトリウム
２．０重量部、アクリル酸５．０重量部及びを蒸留水４
１０重量部を反応容器に仕込み、窒素ガスにて十分に置
換した後、７０°Ｃに昇温し、３００ｒｐｍにて３０分
間攪拌した。

次いで、過硫酸アンモニウム０．５重量部を蒸留水２０
重量部に溶解した重合開始剤水溶液を上記単量体混合物
に加え、攪拌下に７０°Ｃで８時間重合させた。

このようにして得られたラテックスを蒸留水を用いて、
３回、遠心分離による精製を行なった後、固形分濃度１
０重量％に調整した。このラテックスの平均粒径は、０
．１５μｍであった。

次に、上記で得た精製ラテックス１５．０重量部、スチ
レン１００重量部、アクリル酸４．０重量部、ジビニル
ベンゼン０．２重量部及びを蒸留水３９５重量部を反応
容器に仕込み、窒素ガスにて十分に置換した後、７０°
Ｃに昇温し、３００ｒｐｍにて３０分間攪拌した。

この後、過硫酸アンモニウム０．５重量部を蒸留水２０
重量部に溶解した重合開始剤水溶液を上記ラテックスと
単量体とを含む混合物に加え、攪拌下に７０°Ｃで１２
時間重合させた。

このようにして得られたスルホン化カルボキシル化ポリ
スチレンラテックスをホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２，０，
０１モル／ｌ）を用いて、５回、遠心分離による精製を
行なった後、固形分濃度５重量％に調整した。このラテ
ックスの平均粒径は０．６２μｍ１粒子表面のカルボキ
シル基量は９．２μモル／ボ、スルホン酸基量は０．１
３μモル／ボであった。

（ｂ）　　抗体結合ラテックスの調製 上記（ａ）にて得たスルホン化カルボキシル化ポリスチ
レンラテックス溶液５ｎ＋１にホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
２，０，１モル／ｆｉ）２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混
合し、これに１−エチル−３−（３−ジメチルア箋ノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）
　２ｍｌを加え、１０分後にｈＣＧ抗体（４ｍｇ／ｍｌ
）５ｍｌを加え、１０℃で２４時間反応させた。

次に、得られた反応混合物に１０重量％アルギニン水溶
液（ｐＨ８，２）　５　ｍｌを加えて、反応混合物中に
残存する過剰の上記カルボジイミドを消費させ、１時間
インキュベートした。この後、トリス緩衝液（ｐｉ（８
，２，０，０１モル／ｆｆ１）にて遠心洗浄を３回行な
った後、同じ緩衝液に再分散させ、全ｌｔ５ｍｌとして
、抗ｈＣＧ抗体結合ラテックスを得た。このラテックス
において、抗体結合量は３５ｍｇ／ｇであった。

（Ｃ）　　酵素標識抗体の調製 ペルオキシダーゼ（シグマ社製、タイプＶｌ）　４０■
を蒸留水１０ｍ１に溶解させ、これにメタ過ヨウ素酸ナ
トリウム水？８液（４０ｍｇ／ｍｌ　）　０．５　ｍｌ
を加え、室温で１０分間攪拌した。

この溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−
２５に展開し、ペルオキシダーゼ溶液を分画し、水酸化
ナトリウムにてｐＨを９．５に調整した。これに予め炭
酸緩衝液（ｐ）１９．５．０．０１モル／ｆｆ１）にて
透析した抗ｈＣＧ抗体（ダコ（Ｄａｋｏ）社製、ウサギ
ＩｇＧ、１０■／ｎ＋１）　１０ｍｌを加え、４°Ｃに
て２４時間静置した後、水素化ホウ素ナトリウム（５■
／ｍｌ）　１ｍｌを加え、４°Ｃで２時間静置した。そ
の後、トリス緩衝液（ｐＨ８，２，０，０１モル／ｌ）
にて透析し、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ
　−２００に展開して、第１ピークを分取して、酵素標
識抗体分画を得た。上記第１ピーク中には、ペルオキシ
ダーゼと未反応の抗体とが残存するため、コンカナバリ
ンＡ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　、ファルマ
シア社製）によるアフイニテイ・クロマトグラフィーに
て精製して、ペルオキシダーゼ標識抗ｈｃｃ抗体を得た
。

（ｄ）ｈＣＧの測定 抗ｈＣＧ抗体結合スルホン化カルボキシル化ポリスチレ
ン系ラテックス（５重量％）溶液５０μ２に健常男子尿
で希釈したｈＣＧ標準品（コントロール）４５０ｕｌを
加え、室温にて２分間混和した。次いで、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ｈＣＧ抗体（０，１％ウシ血清アルブミン、
０．９％食塩含有、０．０１モル／（ｌトリス緩衝液（
ｐＨ８，２）にて５０００倍に希釈したもの。）５００
μ２を加え、室温にて１分間混和した。

下層から濾過！（アトバンチツク社製ノンアスベスト濾
過板）、メンブレンフィルター（同上、ニトロセルロー
ス、孔径０．４５μｍ）及びメンブレンフィルター（同
上、ニトロセルロース、孔径３μｍ）の順序にて３層に
重ね、これをホルダーに取付け、前記反応溶液をスポイ
トにてフィルターの中心部に滴下した。

反応液が浸透した後、孔径３μｍのフィルターを取り除
き、トリス緩衝液（０，２％ウシ血清アルブミン、０．
９％食塩含有、ρ）１８．２）５００μｌにて洗浄した
。

次いで、酵素基質溶液（１ｍ　Ｍ　ｏ−フェニレンジア
ミン、０．０５％過酸化水素水含有、０．１モル／℃リ
ン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６，０）２００μｌを滴下
し、２分間静置して、その際に出現する色の有無を肉眼
にて判定した。

比較例１ （ａ）ｈＣＧの測定 実施例１にて調製した抗ｈＣＧ抗体結合ラテックス及び
ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体を用いて、ｈＣＧを
測定した。

濾材のｉ威を下層に濾過板、上層にメンブレンフィルタ
ー（孔径０．４５μｍ）に変更し、孔径３μｍのメンブ
レンフィルターを用いない以外は、実施例１と同様にし
て測定した。

比較例２ （ａ）　　ラテックスの調製 スチレン１００重量部、アクリル酸５．０重量部及びを
蒸留水４１０重量部を反応容器に仕込み、窒素ガスにて
十分に置換した後、７０″Ｃに昇温し、３００ｒｐｍに
て３０分間攪拌した。

次いで、過硫酸アンモニウム０．５重量部を蒸留水２０
重量部に溶解した重合開始剤水溶液を上記単量体混合物
に加え、撹拌下に７０゛Ｃで１２時間重合させた。

このようにして得られたラテックスを蒸留水を用いて、
３回、遠心分離による精製を行なった後、固形分濃度１
０重量％に調整した。このラテックスの平均粒径は、０
．３１μｍであった。

次に、上記で得た精製ラテックス１００重量部、スチレ
ン８５重量部、アクリル酸１重量部、ジビニルベンゼン
０．２重量部及びを蒸留水３２５重量部を反応容器に仕
込み、窒素ガスにて十分に置換した後、７０°Ｃに昇温
し、３０Ｑｒｐｍにて１時間攪拌した。

この後、過硫酸アンモニウム０．５重量部を蒸留水２０
重量部に溶解した重合開始剤水溶液を上記ラテックスと
単量体とを含む混合物に加え、攪拌下に７０°Ｃで１２
時間重合させた。

このようにして得られたカルボキシル化ポリスチレンラ
テックスをホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２，０，Ｏ１モル／
ｌ）を用いて、５回、遠心分離による精製を行なった後
、固形分濃度５重量％に調整した。

このラテックスの平均粒径は０．６８μｍ、粒子表面の
カルボキシル基量は５．３μモル／ｒＴｆであった。

（ｂ）　　抗体結合ラテックスの調製 実施例１と同様にして、抗ｈＣＧ抗体結合カルボキシル
化ラテックスを調製した。抗体結合量は、３９■／ｇで
あった。

（ｃ）ｈＣＧの測定 抗ｈＣＧ抗体結合カルボキシル化ラテックスを用いて、
実施例１と同様にして、ｈＣＧを測定した。

実施例２ （ａ）　　抗体結合う゛テックスの調製実施例１にて調
製したスルホン化カルボキシル化ポリスチレンラテック
スに実施例１と同様にして抗ヒトＣＲＰ抗体（ダコ社製
）を結合させた。

最終分散媒は、グリシン緩衝液（ｐＨ８，２，０，１モ
ル／乏）とした。抗体結合量は３８ｍｇ／ｇであった。

０）酵素標識抗体の調製 アルカリフフォスファターゼ（シグマ社製）０゜２■を
リン酸緩衝液（ｐＨ６，８，０，１モル／ｌ、）０゜５
ｍｌ中に溶解させ、更に、抗ヒ）ＣＲＰ抗体（ダコ社製
、上記緩衝液にて５■／　ｍ　＋に調整したもの。）０
．１ｍｌを混合した。混合液中に上記緩衝液にて０゜１
％に調整したグルタルアルデヒド０．１ｍｌを攪拌下に
ゆっくりと加え、室温で３時間静置した。次いで、セフ
ァクリルＳ−２００に展開して、アルカリフホスファタ
ーゼ標識抗ヒトＣＲＰ抗体を得た。

（ｃ）ＣＲＰの測定 抗ヒトＣＲＰ抗体結合スルホン化カルボキシル化ポリス
チレン系ラテックス溶液（５重量％）５０μ２に被検血
清１０μｌ及びグリシン緩衝液（ｐＨ８，２，０，２％
ウシ血清アルブミン、０．９％食塩含有）４００μｌを
加え、室温にて３分間混和した。

次いで、アルカリフホスファターゼ標識抗ヒトＣＲＰ抗
体（上記緩衝液にて１００倍に希釈したもの。）５００
μｌを加え、室温で２分間混和した。

酵素基質発色液として、２ｍＭ濃度の５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸ρ−トルイジン塩をジェ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ９，０，０、１モル／ｌ）
に溶解させた溶液を用いた以外は、実施例１と同様して
測定した。

比較例３ 比較例２にて調製したカルボキシル化ポリスチレンラテ
ックスに比較例２と同様にして抗ヒトＣＲＰ抗体を結合
させた。最終分散媒はグリシン緩衝液（ｐＨ８，２，０
，１モル／ｌ）とした。抗体結合量は、４０■／ｇであ
った。

（ｄ）ＣＲＰの測定 上記抗ヒトＣＲＰ抗体結合カルボキシルかポリスチレン
ラテックスを用いて、実施例２と同様にして、ＣＲＰを
測定した。

以上の結果を第１表及び第２表に示す。比較例１におい
ては、第１濾過工程がないために、非特異凝集が生じ、
比較例２及び３においては、ラテックス粒子がスルホン
酸基をもたないので、ラテックスの凝集によって、感度
が低下した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面にスルホン酸基及びカルボキシル基を有する
   粒子径０．５〜５００μｍの重合体粒子に上記カルボキ
   シル基を介して免疫活性物質を共有結合にて結合させて
   なる免疫活性物質固相化粒子の水性分散液に被検液を加
   えて、この被検液中の所定の被検物質を上記免疫活性物
   質に特異的に結合させる第１工程、及び上記被検物質に
   特異的に結合する標識化物質を上記被検物質に特異的に
   結合させる第２工程 を含み、 次いで、このようにして得た固相化粒子の分散液を上記
   固相化粒子の粒子径の２倍以上の平均保留粒子径を有す
   る第１の濾材にて濾過する第３工程、 得られた濾液を前記固相化粒子の粒子径以下で、且つ、
   ０．２μｍ以上の平均保留粒子径を有する第２の濾材に
   て濾過する第４工程、次いで、上記第２の濾材上に捕捉
   した固相化粒子に結合した標識を検出する第５工程から
   なることを特徴とする免疫学的測定法。
2. （２）重合体粒子が表面にカルボキシル基を０．３〜３
   ０μモル／ｍ＾２の範囲で有することを特徴とする請求
   項第１項記載の免疫学的測定法。