DE3784502T2 - Monoklonaler antikoerper, verfahren zu seiner herstellung und diagnostikum, das ihn enthaelt. - Google Patents
Monoklonaler antikoerper, verfahren zu seiner herstellung und diagnostikum, das ihn enthaelt.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper mit spezifischer Bindung an eine Zellmembrankomponente, die wenigstens ein Protein umfaßt, das durch humanes Chromosom Nr. 21 codiert wird, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein den Antikörper enthaltendes Diagnostikum für Down-Syndrom.
- In letzter Zeit haben erbliche und nichterbliche angeborene Chromosomen-Abberationen zugenommen und diese Tendenz ist ein weltweites Phänomen geworden. Medizinische Annäherungen an diese Abberations-Krankheiten hängen bis jetzt hauptsächlich von der Analyse eines außerhalb des Körpers gelegenen Krankheitsbildes ab und seine Analyse und Testverfahren für Erbfaktoren, insbesondere Chromosomen-Abberationen, sind außerordentlich beschränkt worden. Dies ist so, weil aufgrund der Tatsache, daß Chromosomen nicht in Ordinalzellen, sondern nur in Zellen in der mitotischen Phase beobachtet werden können, spezielle Techniken zu ihrem Fixierungsverfahren erforderlich sind. Frühdiagnose, insbesondere pränatale Diagnose von Chromosomen-Abberationen ist deshalb eine soziale Forderung, und die Errichtung leichter und hochzuverlässiger Diagnoseverfahren ist aus diesem Grund erwünscht.
- Obwohl viele befruchtete Eizellen mit irgendeiner Chromosomen-Abberation natürlicherweise während einer frühen Phase der Schwangerschaft ausselektiert werden, werden etwa 1% der geborenen Kinder in einem Zustand mit der Abberation geboren, und viele von ihnen haben so Mißbildungen und/oder schwere Störungen in der geistigen Entwicklung. Die Art der Chromosomen-Abberation wird in numerische Abberation und strukturelle Abberation klassifiziert. Eine Triploide, die durch Befruchtung einer Eizelle mit zwei Spermien entsteht, ist nicht lebensfähig, während, da ein Patient mit Trisomie, bei der das gleiche Chromosom im Übermaß im Kern vorhanden ist, lebensfähig ist, begleitet von mentalen und physischen Abberationen, der Kampf dagegen von der ganzen Gesellschaft erwünscht wird. Trisomie-21, bei der das Chromosom Nr. 21 einmal zuviel vorhanden ist, verursacht das Down-Syndrom (nachstehend mit "Down-Krankheit" bezeichnet). Die Geburtenziffer von Kindern mit der Down-Krankheit neigt dazu, übereinstimmend mit dem jüngsten Anstieg der Heirat in höherem Alter, zuzunehmen, und Methoden zur Frühdiagnose vor der Geburt werden folglich verlangt.
- Eine Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung neuartiger monoklonaler Antikörper, die sich zur Diagnose mit einfacher und hoher Zuverlässigkeit der durch Chromosom Nr. 21 mit numerischer Abberation verursachten Down- Krankheit eignen, in der Bereitstellung eines Verfahrens zu ihrer Herstellung und eines Diagnostikums, das diese monoklonalen Antikörper enthält.
- Vorliegend ist es gelungen, monoklonale Antikörper zu erhalten, die mit hoher Empfindlichkeit die numerische Abberation des humanen Chromosoms Nr. 21 durch Anwendung bekannter Zellfusionstechniken erkennen können. Außerdem wurde vorliegend ein Diagnostikum entwickelt, das für die Diagnose der Down-Krankheit durch Verwendung der monoklonalen Antikörper geeignet ist.
- Es wurde gefunden, daß wenigstens ein Membranprotein unter all den Proteinen, die von Genen auf dem humanen Chromosom Nr. 21 codiert werden, von normalen (diploiden) Zellen, wie Fibroblasten, in wesentlich geringeren Mengen gebildet wird, als von Zellen, die eine numerische Abberation des Chromosoms Nr. 21 enthalten, wie es bei Patienten mit der Down-Krankheit der Fall ist. Es wurde außerdem gefunden, daß monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung reproduzierbar erhalten werden können, die mit Chromosom-21 polysomale Zellen durch Bindung an eine Membrankomponente erkennen, die in nachweisbaren Mengen in solchen polysomalen Zellen vorhanden ist, jedoch nicht in normalen Zellen.
- Monoklonale Antikörper der Erfindung sind deshalb für die Diagnose der Down-Krankheit nützlich, die z.B. durch Trisomie-21 verursacht wird, d.h. sie binden spezifisch an eine Protein-enthaltende Membrankomponente, die nur in nachweisbaren Mengen vorhanden ist, wenn das humane Chromosom Nr. 21 polysomal ist. Diese monoklonalen Antikörper sind deshalb in der Lage, zwischen normalen Zellen und Zellen, die z.B. trisomal für Chromosom Nr. 21 sind, zu unterscheiden.
- Ein monoklonaler Antikörper der Erfindung kann z.B. durch ein Verfahren erhalten werden, das die folgenden Schritte umfaßt: Immunisierung eines Tieres mit einer Ovariumzelle eines chinesischen Hamsters, in die humanes Chromosom Nr. 21 eingeführt worden ist und die ein durch das humane Chromosom Nr. 21 codiertes Membranprotein hat; Fusion von aus dem Tier entnommenen Antikörper-produzierenden Zellen mit einer Myelomzelle zur Ausbildung von Hybridomen; Selektionierung, Screening und Klonierung der Hybridomen zum Erhalt eines Hybridoms, das zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers fähig ist, der eine Membrankomponente von Zellen spezifisch erkennt, in denen das humane Chromosom Nr. 21 numerisch abberant vorhanden ist, und Kultivierung des Hybridoms.
- Die Ovariumzelle des chinesischen Hamsters (CHO-Zelle), in die humanes Chromosom Nr. 21 eingeführt worden ist und die das durch das humane Chromosom Nr. 21 codierte Membranprotein hat, welches in dem vorstehend erwähnten Verfahren verwendet wird, kann durch bekannte Zellfusionstechniken erhalten werden. Ein Beispiel einer solchen CHO-Zelle schließt sogenannte 2Fur ein [vgl. D. Patterson et al, Som. Cell Genet., 1, (1975) 91-110].
- Beispiele von zu immunisierenden Tieren, wie sie in dem vorstehend erwähnten Verfahren verwendet werden, schließen Maus, Ratte und ähnliche ein, und Maus wird üblicherweise verwendet.
- Weg und Plan der Einbringung des Antigens in das Tier können verschiedenartig variiert werden. Gemäß einem bevorzugten Verabreichungsverfahren wird das Antigen z.B. zuerst mit Mitomycin behandelt und in mehreren Portionen dem Tier intraperitoneal verabreicht. Antikörper bilden sich in der Milz des Tiers durch Verabreichung des Antigens. Als Antikörper-produzierende Zellen werden Milzzellen gewöhnlicherweise verwendet. Als die Myelomzelle, die mit den so erhaltenen Antikörper-produzierenden Zellen gebraucht wird, wird z.B. eine von BALB/C-Maus MOPC 21 Myelom (mit NS-1 bezeichnet) induzierte Zelle verwendet. Diese NS-1 besitzt eine Resistenz gegen 8-Azaguanin und stirbt in einem Medium, das Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT-Medium) enthält, da ihr das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase fehlt. Die Verwendung von NS-1 ist daher geeignet zum Erhalt einer Selektivkultur von Hybridomen. Als ein Fusionsmittel zur Zellfusion wird Polyethylenglykol üblicherweise verwendet. Die vorstehend erwähnten Zellfusionstechniken, verwendbare Myelomzellen und ähnliches sind per se bekannt. [Myeloma cells; Kohler et al Fur. J. Immunol., 6, (1976), 292-295, und Fusion method; Kohler et al, bid., 6, (1976), 511-516].
- Die resultierenden Hybridome werden gescreent, um diejenigen zu selektieren, die Antikörper produzieren können, welche in der Lage sind, an die CHO-Zelle, die für die Immunisierung, wie vorstehend angegeben, verwendet wird, und an eine Zelle eines Menschen zu binden, nicht aber an eine normale CHO-Zelle binden können. Dieses Screening kann in einer konventionellen Weise ausgeführt werden. Die Art der für das Screening verwendeten menschlichen Zelle ist nicht beschränkt. Die auf diese Weise gescreenten Hybridome werden dann kloniert, wodurch man Nachkommenschaften der betreffenden Hybridome von betreffenden phyletischen Linien erhält. Monoklonale Antikörper, die ein Membranprotein, das für Zellen charakteristisch ist, in denen Chromosom Nr. 21 numerisch abberent vorhanden ist, erkennen können, können nacheinander synthetisiert und sezerniert werden, indem man diese Zelllinien nacheinander unbegrenzt wachsen läßt, z.B. Klone in einem Zellkulturmedium (in-vitro-Kultur) oder in vivo. Jeder der so produzierten monoklonalen Antikörper kann gemäß einem auf dem Fachgebiet in Fachkreisen bekannten Verfahren wiedergewonnen werden.
- Der so erhaltene monoklonale Antikörper bindet, wenn eine Fibroblastenzelle das Ziel ist, z.B. an eine Proteinkomponente der Zellmembran, die in nachweisbaren Mengen produziert wird, wenn Chromosom Nr. 21 eher trisomal als disomal ist.
- Die Erfindung liefert außerdem ein Diagnostikum für die durch Trisomie-21 verursachte Down-Krankheit, das den oben erwähnten monoklonalen Antikörper enthält. Numerische Abberation des Chromosoms Nr. 21 kann schnell durch Anwendung dieses Diagnostikums auf z.B. humane Fibroblasten oder ähnliches bestimmt werden. Die Diagnose der Down-Krankheit kann deshalb schnell durch Verwendung dieses Diagnostikums durchgeführt werden. Das Diagnostikum der Erfindung kann praktisch in jedem immunologischen Testverfahren, z.B. Immunfluoreszenz, einem Immunoadhäsionshämozyten-Agglutinationsverfahren, Radioimmunoassay oder ähnlichem verwendet werden. Bei der Anwendung von Immunfluoreszenz werden z.B. menschliche Zellen mit dem monoklonalen Antikörper der Erfindung behandelt, dann läßt man sie mit einem Anti-Maus- IgG, das mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, wie FITC markiert ist, reagieren und bringt sie in ein Fluoreszenzmikroskop, und der Lumineszensgrad wird kontrolliert, wodurch Anwesenheit oder Abwesenheit von chromosomaler Abberation schnell diagnostiziert werden kann.
- Monoklonale Antikörper und Diagnostikum der Erfindung werden nachstehend anhand nichtbeschränkender Beispiele weiter erläutert.
- CHO-Zellen (2Fur), in die humanes Chromosom Nr. 21 eingeführt worden ist und die das durch das Chromosom Nr. 21 codierte Membranprotein haben, wurden mit Mitomycin C behandelt und mit PBS (Phosphatpuffer) gewaschen. Eine 2Fur-Suspension aus 5 x 10&sup6; Zellen/0,5 cc in PBS wurde intraperitoneal in eine weibliche BALB/C-Maus (Immunisierung) injiziert. Zwei Wochen später wurde eine 2Fur-Suspension aus 1 x 10&sup7; Zellen/0,5 cc in PBS und weitere zwei Wochen später eine 2Fur-Suspension aus 1 x 10&sup7; Zellen/0,5 cc in PBS in gleicher Art und Weise wie oben injiziert. Drei Tage später wurde die Milz der Maus herausgenommen, in RPMI-1640-Hedium feinpulverisiert, dreimal einer Zentrifugation (1500 Upm) zum Waschen unterzogen, und in dem Medium resuspendiert.
- Proben der vorstehend verwendeten 2Fur-Kulturen können auf schriftliche Anfrage hin von Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., 6-1, Ohtemachi 2-chome, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan erhalten werden.
- 1,1 x 10&sup8; Zellen der durch das vorstehend erwähnte Verfahren erhaltenen Milzzelle und 1,0 x 10&sup7; Zellen einer BALB/C- Maus-Myelomzelle (NS-1), einmal im voraus mit RPMI-1640-Medium gewaschen, wurden gemischt und bei 1500 Upm 5 Minuten zentrifugiert, um ein Pellet herzustellen. Dann wurde 1 ml einer Lösung, die durch Lösen von Polyethylenglykol (1540) in RPMI-1640-Medium auf 50 Gew. -% erhalten wurde, dem Pellet unter Rühren zugegeben, RPMI-1640-Medium wurde auf ein Gesamtvolumen von 10 ml zugegeben, und die Mischung wurde 6 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde einer Zentrifugation bei 1000 Upm 5 Minuten ausgesetzt, um Polyethylenglykol zu entfernen, und die Feststoffe wurden in 40 ml RPMI-1640-Medium, das 20 Vol.-% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, resuspendiert.
- 0,2 ml (5 x 10&sup6; Zellen) der vorstehend erwähnten Suspension wurden in jedes von 192 Löchern einer 96-Loch-Platte für Gewebskultur gebracht, und die Hälfte des Kulturüberstands wurde jeden dritten bis vierten Tag mit HAT-Medium (136,1 mg/ml Hypoxanthin, 1,76 mg/ml Aminopterin und 38,75 mg/ml Thymidin) ausgewechselt. Die Kulturbedingungen bestanden in einer Temperatur von 37ºC, einem Feuchtigkeitsgehalt von 100% und einer CO&sub2;-Konzentration von 7%. 10 Tage nach dem Start der Kultur wurden Hybridome in 119 Löchern (Erscheinungsrate: 62%) beobachtet. Kulturüberstände in den 119 Löchern, die positive Ergebnisse zeigten, wurden einem Screening durch Kontrolle gemäß den Enzym-markierten Antikörper-Techniken (ELISA) unter Verwendung von 2Fur ausgesetzt, ob die Überstände Antikörper enthielten oder nicht, und die Ergebnisse zeigten, daß 20 Löcher positiv waren (10,6% der gesamten Löcher).
- Zellen in jedem der 20 Löcher wurden einer limitierten Verdünnung in HAT-Medium mit Supplementation von 1,0 x 10&sup7; Zellen/ml BALB/C-Maus-Thymozyte ausgesetzt, 0,2 ml-Portionen der resultierenden Zellsuspensionen wurden in jedes Loch einer 96-Lochplatte für Gewebskultur gegeben und die Kultivierung wurde durchgeführt. In diesem Zusammenhang betrug die Hybridomanzahl pro Loch und die Lochanzahl 48 Löcher mit 1 Zelle/Loch, 45 Löcher mit 5 Zellen/Loch und 3 Zellen mit 20 Zellen/Loch. Die Kulturbedingungen waren die gleichen wie vorstehend erwähnt. Die Kulturüberstände wurden der Reihe nach dem gleichen ELISA, wie vorstehend erwähnt, unterzogen, um diejenigen zu screenen, die negativ für die CHO-Zelle und positiv für humane Leukämiezelle (TALL) sind, und als Ergebnis wurden die gewünschten Klone aus 3 Löchern erhalten. Die Zellen in den 3 Löchern wurden der Reihe nach zweimal rekloniert gemäß dem Verfahren der begrenzten Verdünnung und die resultierenden Hybridome wurden OK-1, OK-2 bzw. OK-3 genannt.
- Durch eine Enzym-markierte Antikörpertechnik unter Verwendung eines Anti-Maus-Antikörpers wurde herausgefunden, daß von Hybridomen OK-1, OK-2 und OK-3 produzierte monoklonale Antikörper zu den Klassen IgM bzw. IgG und IgM gehören.
- Proteine, die die von OK-1 bzw. OK-2 und OK-3 produzierten monoklonalen Antikörper erkennen und binden sind folgende.
- - Monoklonaler Antikörper, produziert von OK-1
- Dieser Antikörper erkennt vier Banden des humanen Leukämiezellen(TALL)-Proteins im Western-Blot.
- - Monoklonaler Antikörper, produziert von OK-2
- Dieser Antikörper erkennt vier Banden von 40 und 90 Kilodalton des TALL-Proteins im Western-Blot.
- - Monoklonaler Antikörper, produziert von OK-3
- Dieser Antikörper erkennt vier Banden von 86.4, 74.2, 61.4 und 36.4 Kilodalton des TALL-Proteins im Western-Blot und erkennt drei Banden von 89, 82 und 45 Kilodalton des 2Fur- Proteins im Western-Blot.
- Fibroblasten eines normalen Menschen und eines Patienten mit Down-Krankheit wurden der Reihe nach zusammen mit einem Deckglas (12 x 12 mm) für ein Mikroskop in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und kultiviert. Als das Medium wurde eine Mischung verwendet, in der 10% nichtessentielle Aminosäure (NEAA), 10 mM Natriumpyruvat, 0,1% Lactoalbuminhydrolysat (LAH) und 10% FCS in MEM enthalten waren. Die Zellen wurden der Reihe nach 5 Tage bei Raumtemperatur kultiviert, in einer 3,7% Formaldehydlösung in PBS unmittelbar nach 2- bis 3maligem Waschen des Deckglases mit PBS fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen, und erneut in Aceton bei -20ºC fixiert.
- 15 ul des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers (Antikörper, der aus Hybridom OK-1, OK-2 oder OK-3 stammte) wurden über die fixierten Zellen gegeben, und man ließ die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Nach dreimaligem Waschen der Mischung mit PBS wurden 15 ul eines Anti-Maus-IgG-Antikörpers oder eines Anti-Maus-IgM-Antikörpers als zweiten Antikörper, die der Reihe nach mit FITC markiert waren, darübergegeben, und man ließ die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Die Mischung wurde dreimal mit PBS gewaschen, einmal mit destilliertem Wasser zur Entfernung von Salzen gewaschen, in einem Zustand auf einen Objektträger gegeben, bei dem die Zellen von unten fixiert werden, und mit Gelvatol versiegelt, um ein Testprobenstück zu erhalten.
- Die Testprobe wurde auf Vorhandensein von Lumineszens auf der Oberflächenschicht durch Verwendung eines Fluoreszensmikroskops getestet. Die resultierenden Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Fibroblasten des Patienten mit Down- Krankheit emittierten Fluoreszenz, während die des normalen Menschen nicht emittierten. Es zeigt sich also, daß das Vorhandensein einer chromosomalen Abberation erfindungsgemäß schnell mit hoher Sensitivität diagnostiziert werden kann, ohne daß eine spezielle Technik angewendet wird.
- Zur Bestätigung der Existenz des Proteins der Membran wurde außerdem ein Nachweis durch Membranimmunfluoreszenz parallel zu dem vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt, bei dem die Zellen nicht fixiert werden und mit einem Fluoreszenz-Farbstoff reagieren, und die resultierenden Ergebnisse waren die gleichen wie vorstehend erhalten. Tabelle 1 Vorhandensein oder Fehlen von Lumineszenz durch Immunfluoreszenz Fibroblast Monoklonaler Antikörper Normaler Mensch Patient mit Down-Krankheit Produziert von OK-1 Beachte +: Lumineszenz wurde beobachtet -: Lumineszenz wurde nicht beobachtet
- Die Hybridome OK-1, OK-2 und OK-3 wurden beim Fermentation Research Institute, Ibaraki-ken, Japan am 20. Oktober 1987 hinterlegt.
Claims (7)
1. Monoklonaler Antikörper mit spezifischer Bindung an eine
ein Protein umfassende Membrankomponente, wobei das
Protein durch humanes, in abweichender Zahl vorliegendes
Chromosom Nr. 21 codiert ist, produziert durch die
Hybridom-Zellinie FERM Bp-1802 oder FERM BP-1803 oder
durch einen Nachkommen oder eine Mutante davon.
2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, worin der
monoklonale Antikörper zwischen normalen, humanen Zellen
und polysomalen, humanen Zellen unterscheidet.
3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, worin der
monoklonale Antikörper zwischen normalen, humanen
Fibroblasten und Fibroblasten unterscheidet, die für
humanes Chromosom Nr. 21 trisomal sind.
4. Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers
nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:
- Immunisierung eines Tieres mit einer Ovariumzelle eines
Chinesischen Hamsters, in die humanes Chromosom Nr. 21
eingeführt worden ist und die mindestens ein durch das
humane Chromosom Nr. 21 codierte Membranprotein
exprimiert,
- Fusion von aus dem Tier entnommenen,
Antikörperproduzierenden Zellen mit einer Myelomzelle zur
Ausbildung von Hybridomen,
- Selektionierung, Screening und Klonierung der
Hybridomen zum Erhalt eines Hybridom, das zur
Produktion eines monoklonalen Antikörpers fähig ist,
der spezifisch an eine Membrankomponente bindet, die
ein durch humanes Chromosom Nr. 21 codiertes Protein
umfaßt, und
- Kultivierung des Hybridoms.
5. Diagnostisches Reagens für das Down-Syndrom, umfassend
einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1.
6. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 5, worin der
monoklonale Antikörper zwischen normalen Fibroblasten und
Fibroblasten unterscheidet, die für humanes Chromosom Nr.
21 trisomal sind.
7. Hybridom-Zellinie FERM BP-1802 oder FERN BP-1803 oder ein
Nachkomme oder eine Mutante davon, die einen Antikörper
mit der in Anspruch 1 angegebenen Spezifität exprimieren.
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