JPS63214196A - ヒト抗癌モノクローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、癌細胞、詳細には乳癌および結腸癌の抗原決
定基に対するモノクローン性抗体を産生ずるヒト−ヒト
ハイブリッドセルラインに関する。

以下余白 〔従来の技術〕 ここ数年間に、癌の治療に対する免疫治療学的方法を開
発するため著しい研究努力が行われてきた。これらの研
究のほとんど総てにおいて、腫瘍に関連する抗原が各種
悪性疾患に罹った患者を治療するのに用いられてきたが
、不運なことにはほとんど成功していない、成功を納め
られなかった主な理由が４つあり、その２つの理由の第
一のものは腫瘍に関連した抗原が同定困難であり、第二
は腫瘍に関連した抗原を認識する均質な抗体を調製する
ことが技術的に困難であり且つ労力がかかることである
。後者の困難は、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタ
イン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６
巻、４９５〜４９７頁、１９７５年）のハイブリドーマ
技術の開発によってモノクローン性抗体を無制限に産生
ずることができるようになったことによってかなり克服
されている。腫瘍に関連した抗原の同定については、現
在のところは癌細胞に限定される抗原を同定する確実な
方法はない。

癌の治療の免疫治療学的方法を考案するときに克服しな
ければならない第三の問題点は、免疫治療薬、すなわち
腫瘍に関連した抗原に対する抗体に対する免疫反応を防
止することである。この問題点はコズボール（Ｋｏｚｂ
ｏｒ）とローダ−（Ｒｏｄｅｒ）のｆｍｕｎｏｌ　　Ｔ
ｏｄａ　、　４巻、１９８３年、７２〜７９頁；グラシ
ー（Ｇｌａｓｓｙ）ら、モノクローン性抗体と癌（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃ
ａｎｃｅｒ）、ボス（Ｂｏｓｓ）ら監修、１９８３年、
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）　；およびグラシー（Ｇｌａｓｓｙ）ら、Ｐｒｏｃ　
　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０巻
、６３２７頁、１９８３年によって記載されている基本
的なコーラ−とミルスタインの方法の改変法によって生
成されるヒト抗体を用いることによって解決することが
できる。腫瘍を有する患者にヒトモノクローン性抗体を
注射すると、この抗体は腫瘍に関連した抗原に結合する
ことによって腫瘍を認識してこれに結合する。ヒト由来
の抗体は患者の免疫系によって異物とは「見なされ」な
いので、免疫学的には目に見えない状態にある。

第四の理由としては、これまでに製造されたヒトモノク
ローン性抗体のほとんどは１ｇＭクラスのモノクローン
性抗体である。このクラスの抗体は各種の試験管内での
研究には有用であるが、ＩｇＧクラスの抗体はどには臨
床的に有用でない。

他のものより優れているモノクローン性抗体のクラスの
生成はこれまではほとんど理解されておらず、したがっ
て再現性がない。

不運なことには、ヒトハイブリドーマの歴史は実質的な
且つしばしば腹立たしくなるような技術的問題点を有し
ており、「所望な」特異性を有するヒト免疫グロブリン
を分泌するハイブリッドの最初の報告は１９８０年まで
現れなかった。それからまもなく、ヒトリンパ球を融合
することは可能であるが融合の頻度、Ｉｇ合成の水準お
よびそれらの安定性が低いことは、ハイプリドーマ技術
によるヒト抗体の産生が日常的でも、実際的方法でもな
いことを意味することが明らかになった。しがしながら
、この２〜３年の間に、幾らかの進歩がなされた。比較
的効率的なり一リンパ球の融合のハートナーカ開発すれ
、エプスタイン−バール・ウィルス（ＥＢＶ）形質転換
の方法が改良された。

下記に、ヒトモノクローン性抗体の調製法およびその方
法において見られる問題点を説明する。

ヒトモノクローン性抗体は、種間ハイブリダイゼーシッ
ンによって調製することができる。適当なヒト融合パー
トナ−が欠如していることにより、ヒトリンパ球の非ヒ
ト融合パートナ−へのハイブリダイゼーシッンによりヒ
トモノクローン性抗体を産生させる試みが盛んに行われ
た。種間のバイプリドーマでは、破傷風毒素（コズボー
ル（にｏｚｂｏｒ）ら、ｈ紅ｕ匹Ｌｓ　１巻、１９８２
年、３２３〜３２８頁）、キーホール・リンペット（Ｋ
ｅｙｈｏｌｅｌｉｓｐｅｔ）　ヘモシアニン（レーン（
Ｌａｎｅ）ら、ムハム厘ム、１５５巻、１９８２年、３
３３〜３３７頁）および各種ヒト癌と反応するモノクロ
ーン性抗体を調製することが可能であった０種間ハイプ
リドーマでは、ネズミ染色体よりもヒト染色体が喪失し
くコート（Ｃｏ　ｔｅ）ら、Ｆｅｄｅｒ　　Ｐｒｏｃ工
、４３巻、１９８４年、２４５６〜２４５９頁；コズボ
ール（Ｋｏｚｂｏｒ）とローダー（Ｒｏｄｅｒ）、ｈ艶
匹ＩＴ何社、４巻、１９８３年、７２〜７９頁）、ヒト
染色体の喪失は稀ではない。染色体１４（重鎮）および
染色体２２（λ１１）の喪失の頻度は、染色体２（に鎖
）の喪失より少ない（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｏｎ）ら
、Ｎａｔｕｒｅｓ　２９４巻、１９８１年、１７３〜１
７５頁）。

極内ヒトハイブリドーマは、同様な種間ハイブリドーマ
よりもそれらの染色体組成が安定である（コズボール（
Ｋｏｚｂｏｒ）とローグー（Ｒｏｄｅｒ）、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌＪ組ｕ−、４巻、１９８３年、７２〜７９頁）、そ
れ故、ヒト／ヒトハイブリドーマの開発はヒトモノクロ
ーン性抗体の有望な入手源である。適当なヒト融合パー
トナ−が欠如していることが、この方法の主な障害とな
っていた。ヒト骨髄腫は試験管内で培養することが困難
であり、それらは低い頻度でしか融合せず、ＤＮＡ類似
体に耐性になることが困難である。はとんどの骨１１ｉ
腫由来のヒト融合パートナ−は、倍加時間が３６〜７０
時間であり、試験管内で増殖するには骨髄腫刺激因子を
必要とする。形態学内には、骨髄腫は粗面小胞体（ＲＥ
Ｒ）が豊富であり、遊離型ポリリボゾームが少なく、ミ
トコンドリアが豊富であり、ゴルジ体が良好に発達して
いることを特徴としている。免疫グロブリンの分泌水準
は高い〔コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、［ヒトハイブ
リドーマおよびモノクローン性抗体（Ｈｕｍａｎ　）ｌ
ｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　Ｊ　、エングルマン（Ｅｎｇｌ
ｅｍａｎ）ら監修、ブレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｓ　
Ｐｒｅｓｓ）、ニュー・ヨーク、１９８５年、２１〜３
６頁〕。

ヒトリンパ芽球様細胞ライン（ＬＣＬ）は試験管内で容
易に成長し、融合パートナ−代替物として用いられる。

ＬＣＬは骨髄腫セルラインよりも速やかに成長し、常に
エプスタイン−バールウィルスと関連している。形態学
的には、ＬＣＬはＲＥＲＥＲおよ・びゴルジ体の発達が
十分でなく、遊離型ポリリボゾームが多く、免疫グロブ
リンの分泌水準が低いことを特徴とする〔コズボール（
Ｋｏｚｂｏｒ）ら、上記文献〕。

一般的には、ヒト骨髄腫細胞およびＬＣＬは、ヒトハイ
ブリドーマを生成させる融合パートナ−としては最適で
はない、ヒトハイブリドーマを用いる研究は、最適なヒ
ト融合パートナ−が欠如しているために妨げられてきた
。ヒトリンパ芽球様セルラインは、ヒト骨髄腫よりも効
率的な融合パートナ−であると思われる。ＬＣＬで発生
させたヒトハイブリドーマは、融合パートナ−として骨
髄腫瘍を用いて発生させたヒトハイブリドーマよりも免
疫グロブリンを産生しにくい。過去数年間に、組換えＤ
ＮＡ技術および体細胞融合技術を用いることによって、
より良好なヒト融合パートナ−の調製が進歩してきた。

例えば、テング（Ｔｅｎｇ）ら（紅匹、ｈ且、に縁、と
紅」鎖、８０巻、１９８３年、７３０８〜７３２１頁）
は、マウス／ヒトへテロ骨髄腫融合パートナ−を構成し
た。

もう一つの例は、０Ｍ１５００　６７Ｇ−２リンパ芽球
様セルラインのウワバイン耐性変種（ＫＲ−４）とヒト
骨髄腫細胞（ＲＰ　Ｍ１８２２６）との融合によるＫＲ
−１２セルラインの構成である〔コズボール（Ｋｏｚｂ
ｏｒ）ら、Ｊ、　Ｉｓ＋ｗｕｎｏ１．．１３３巻、１９
８５年、３００１〜３００５頁〕。ＫＲ−１２セルライ
ンはＥＢＶ−ハイブリドーマ技術におけるＥＢＶ−形質
転換リンパ芽球様セルラインと融合するように設計され
た。これらの２例から引き出される結論は、融合パート
ナ−としての新規セルラインの工学技術がヒトモノクロ
ーン性抗体の調製における主な障害であった融合効率を
増加させるということである。

ヒトモノクローン性抗体の産生の第三の方法はＥＢＶ−
ハイブリドーマ技術である。ＥＢＶはリンパ性ヘルペス
ウィルスであり、正常なり一リンパ球を形質転換し、こ
れらの細胞を恒久的ラインとして培養することを可能に
する。目的の免疫グロブリンを産生ずるクローンを単離
した後、優性マーカーを有するヒト融合パートナ−と融
合して免疫グロブリンの産生を安定化させ増大させるこ
とができる。ＢＢＶ−ハイブリドーマ技術はある型の抗
原では極めて有効である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

現在のところ、乳癌、結腸癌、子宮癌、胃癌又はその他
の臓器の癌の治療または診断には、免疫療法は上記のよ
うな理由によりほとんど用いられていない。したがって
、腫瘍に関連した抗原に対するモノクローン性抗体を分
泌するヒト−ヒトハイブリッドセルラインを樹立するこ
とが非常に必要とされている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば、ヒトＩｇＭモノクローン性抗体を合成
して分泌するヒト−ヒトハイブリッドセルライン、すな
わちハイブリドーマは、乳癌患者由来の腋窩ドレインリ
ンパ節から単離されるリンパ球を薬剤耐性ヒトハイブリ
ッド細胞ラインに融合させることによって生成する。

本発明によれば、Ｂ細胞リンパ球は腫瘍を有する患者か
ら単離される。Ｂ細胞は、患者のリンパ節、詳細には腫
瘍塊近くの腋窩ドレインリンパ節から外科的技術によっ
て単離される。或いは、Ｂ細胞は、肺臓、扁桃腺、抹消
血のようなその他のリンパ性器官から単離することもで
きる。Ｂ細胞を得るのに用いられる器官が何であろうと
、後者のＢ細胞はハイブリドーマ形成に好適な形状に調
製される。一般的には、これは、シュロム（Ｓｃｈｌｏ
ｗ）ら　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　　ｓ　　ｏｆ　　ｔｈ
ｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ紅１μｌ！Ｌ録回三ｌ」１虹、
７７巻、６８４１頁、１９８０年）、シコラ（Ｓｉｋｏ
ｒａ）ら（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣａ
ｎｃｅｒｓ　４３巻、６９８頁、１９８１年）およびグ
ラシー（Ｇｌａｓｓｙ）ら、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　％　８０巻、６３２
７頁、１９８１年）によって報告されている方法に従う
ことから成る。これらの方法の詳細については、文献を
参照されたい、この方法は、患者からリンパ節を手術に
よって取り出してから数時間以内に入手し、そしてそれ
らをロスウェル・パーク・メモリアル・インスティチュ
ート（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　１６４０　（ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１
６４０）培地中で均質化してリンパ球を放出させること
から成る。

ヒトハイブリッドを得るには、Ｂリンパ球を、薬剤選択
性マーカーを示すヒトセルラインに融合させなければな
らず、一般的には、これらのセルラインにはリンパ芽球
様細胞由来であるかまたはリンパ芽球様細胞と骨髄種細
胞とのハイブリッド細胞である。或いは、ヒトセルライ
ンは、温度感受性の成長抑制を示すそれらの能力に基づ
いて選択することもできる。セルラインは、融合させる
まではＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０培養液中に保持される
。

ヒト−ヒトハイブリドーマセルラインを形成させるため
に、リンパ節のリンパ球をリンパ芽球様細胞またはハイ
ブリッド細胞と混合し、通常は等しいまたは１０倍数の
リンパ節リンパ球をセルラインと一緒にする。２種の細
胞型を遠沈管の底に沈澱させて、化学融合材、詳細には
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で適当な時間融合さ
せる。

或いは、融合は、電気細胞融合またはウィルス、詳細に
はセンダイウィルスおよびアベルソンウイルスによって
行うこともできる。次に、融合していない細胞を選択的
に殺す薬剤を含む培地中に、融合した細胞を移植する。

ハイブリッドセルラインを、通常は１０〜２０日以内の
間成長させ、多くの免疫同・定法の一つであって、詳細
については以下に説明する方法を用いて培地中に存在す
る抗体を同定することによってヒト抗体の産生をスクリ
ーニングする。

ハイブリドーマセルラインにおける抗体をコードする遺
伝子は、ＤＮＡ組換え技術によって他の細胞型に変換す
ることができ、且つ後者はモノクローン性抗体源として
作用することができることは、当業者には明らかであろ
う。

ハイブリドーマの培地中に存在するモノクローン性抗体
を、排除および親和性クロマトグラフィ法のような標準
的技法によって精製し、分析を行って、これらのモノク
ローン性抗体が属する免疫グロブリンのクラスおよびそ
れらの細胞型特異性を決定した。抗体のクラスの決定は
適当な抗血清を用いてＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって行った
ところ、下記のようなＩｇＭおよびＩｇＧＯクラスであ
ることを見出した。細胞型特異性を決定するために、正
常および癌組織を、アビジン−ビオチン系（エイ・ビー
・シー・キット（ＡＢＣＫｉｔ）、ベクトル・　　゛ラ
プス（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、）を用いて凍結部分お
よびホルマリン固定パラフィン埋没部について分析した
。

細胞ラインＭＡＣ４０／４３の安定なサブクローンは、
下記の日付で特許手続の目的のために、アプライド・マ
イクロバイオロジー・アンド・リサーチ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）のヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル
・セル・カルチャーズ（Ｂｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒ
ｅｓ）（Ｅ　ＣＡ　ＣＣ）　　Ｐ　ＨＬ　Ｓセンター、
ボートン・ダウン、サリスバリー、ウィルトシアー、Ｓ
Ｐ４、ＯＪＧ、英国に寄託されている。ＥＣＡＣＣはブ
タペスト条約で認定された国際受託機関であり、条約の
規則９によって寄託の恒久性を付与されている。

寄託日？　　　　　　１９８６年１１月１０日、寄託者
番号：　　ハイブリドーマ細胞ラインＭ　Ａ　Ｃ４０／
４３、 ＥＣＡＣＣ名：　　８６　１１　１０　０１゜本発明の
モノクローン性抗体は、非造血性ヒト癌、特に乳癌およ
び畢丸癌と選択的に反応し、皮膚癌、膀胱癌および結腸
癌とは余り反応しない。

モノクローン性抗体は上記腫瘍とのみ反応することが見
い出されたが、モノクローン性抗体によって認識される
抗原を発現するその他の腫瘍と反応することも期待され
ることに留意すべきである。

上記の様にして生成したモノクローン性抗体は試験管内
で腫瘍細胞の成長を抑制することが期待される。これは
、腫瘍細胞にモノクローン性抗体を５〜５０躍／−の範
囲で加え、数日間に亙ってそれらの成長速度を測定する
ことによって行われる。

本発明によって生成するモノクローン性抗体は広範囲の
種類のその他の腫瘍細胞型の成長を抑制し、且つ分子の
抗原結合部位が保持されているかぎり、抗体重鎮および
軽鎖のフラグメントまたは結合も腫瘍の成長を抑制する
ことが期待される。

下記の実施例によって、本発明を説明する。しかしなが
ら、発明の精神から離反せずに各種の変更および改質を
行うことができることを理解すべきである。

以下余白 〔実施例〕 豊思竺１里並 ヒト融合パートナ−およびヒトノ＼イブリドーマは、２
−Ｍグルタミン、ストレプトマイシン５０躍／ａＺ、ペ
ニシリン５０単位／−１２−メルカプトエタノール（シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）　、米国）　３．５　Ｘｌ０−’Ｍ
および１０−１５％の熱不活性化したウシ胎児血清（Ｆ
ｅ２）（いずれもギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、英国から入手
〕を補足したＲＰＭＩ−１６４０（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ
）、英国）（以下、完全ＲＰＭＩと命名する）中で成長
させた。）ＩＡＴ培地は、ヒポキサンチン１３．６ｎ／
−、アミノプテリン０．１８ｇ／ａＺおよびチミジン３
．９Ｊ２Ｉｒ／ａｊ（いずれもギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　
、英国〕を補足した完全ＲＰＭＩから成っていた。ＨＴ
培地は、ヒポキサンチン１３．６ｎ／−およびチミジン
３．９ｎ／−を補足した完全ＲＰＭＩから成っていた。

ヒト乳癌セルラインＭＣＦ−７は５％ウシ胎児血清を含
む完全ＲＰＭＩ中で成長させ、細胞をトリプシン−ＥＤ
ＴＡ　（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、英国）で分離した。

±Ｊヨ汗仁乙 ヒト融合パートナ−ＫＲ−１２（コズボール・ディ０（
ｏｚｂｏｒ、　Ｄ、）、トリプツチ・ピー（Ｔｒｉｐｐ
ｕｔｉ。

Ｐ、）ローグー・ジェイ・シー（Ｒｏｄｅｒ、　Ｊ、　
Ｃ，）およびクロース・シー・エム（Ｃｒｏｃｅ、　ｃ
、　Ｍ、）、ム１町現止り１１３３巻、３００１〜３０
０５頁、１９８４年）は、ヒト骨髄腫ＲＰＭ　Ｉ　−８
２２６（λ−鎖の生産細胞）と、ヒトＢ−リンパ芽球様
セルラインＧ　Ｍ−１５００のウアバイン耐性変異株で
あるヒトリンパ芽球様セルラインＫＲ−４（γ２および
に一鎖の生産細胞）とのハイブリッドである。ＫＲ−１
２セルラインは、表現型がヒト骨髄腫細胞と同じであり
、リンパ芽球様セルラインＫＲ−４と同様に増殖する。

ＫＲ−１２はＴ２、λおよびに一鎖を分泌する。

ＫＲ−１２はウィスター・インステイテユート（Ｗｉｓ
ｔｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、フィラデルフィア、
米国から入手した。

ハイ　１−マ 殺菌したヒト腋窩リンパ節のセグメントを、***切除を
行った乳癌患者から得た０節から脂肪を除去して・均質
化によって単細胞懸濁液を調製した。懸濁したリンパ節
細胞をＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０中で３回洗浄した。

ヒトリンパ節細胞と対数増殖期のヒト融合パートナ−を
１＝１または２：ｌに混合して、上記の・ようにケーラ
ー（にｏｅｌｅｒ）　とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）、１９７５年によって報告され、ゲッター（Ｇｅｆ
　ｔｅｒ）ら〔ゲッター・エム・エル（Ｇｅｆｔｅｒ、
　Ｍ。

し、）、マルキレス・ディ・エム（Ｍａｒｑｕｉｌｅｇ
＋　Ｄ。

？！、）およびシャー７・エム・ディ　（Ｓｃｈａｒｆ
ｆ、　Ｍ。

Ｄ、）　、５ｏｓａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　
、３巻、２３１〜２３６頁、１９７７年〕によって改変
された方法によってポリエチレングリコール４０００　
（ＰＥＧ）　　（５０重量％／ＲＰＭ１１６４０容積）
　〔メルク（Ｍｅｒｃｋ）　、西ドイツ〕を用いて融合
させた。３７℃に加熱したｌ−のＰＥＧを細胞ペレット
に１分間にわたって徐々に加え、細胞を１．５分間緩や
かに混合し、１０ｄのＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０を５分間
にわたって滴下して加えた。細胞を１０分間放置した後
、細胞をＲＰＭｌ−１６４０で３回洗浄し、再分散（５
ｘｌ□ｓ個／−）シ、細胞の総数によって３〜５枚のマ
イクロタイタープレート〔コスクール・プラスチックス
（Ｃｏｓｔａｒ　Ｐｌａａｔｉｃｓ）、米国）上のウェ
ルに播種した。細胞は２００ＩのＨＡＴ培地に直接播種
した。

ウェル当たり１００Ｉの培地を１週間に２回取り除き１
００Ｉ１１の新鮮な培地に取り替えた。ｔａ胞をＨＡＴ
培地中に３週間保持し、培地を徐々にＨＴ培地に変更し
た。ハイブリドーマが急激に増殖するとき、培地を完全
ＲＰＭＩに変えた。

ハイブリドーマは、通常は、融合の後３〜４週間目に現
われた０次にハイブリドーマ培養物の上澄液を試験して
、ヒト免疫グロブリンの存在を調べた。免疫グロブリン
を産生する（〉ｉｇ／ａｊ）ハイブリドーマ培養物を、
１．５−ウェル〔マルチディシュ２４プレート、エヌユ
ーエヌシ−（ＮＵＮＣ）、デンマーク〕に移した。免疫
グロブリンを含むハイブリドーマ培養物上澄液のヒト乳
癌セルラインＭＣＦ−７との反応性を細胞結合ＥＬＩＳ
Ａによって分析し、同温の乳癌組織との反応性を免疫組
織化学によって分析した。ＭＣＦ−７または同温の乳癌
のいずれか或いはその両方と反応する抗体を産生ずるハ
イブリドーマを５０−組織培養容器〔エヌユーエヌシー
（ＮＵＮＣ）　、デンマーク〕に移して、生育可能な小
分けしたサンプルを５０（容積／容積）％ＰＣ３，４０
（容積／容積）％および１０（容積／容積）％のジメチ
ルスルホキシド（シグマ（Ｓｉｇｓａ）　、米国）中で
凍結した。

ハイブリドーマを、ｌＯ細胞数／ウェルおよびｌ細胞数
／ウェルの密度での限界希釈によって標準的条件下でク
ローン化した。１匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスからの腹腔マ
クロファージを、フィーダー細胞としてそれぞれのマイ
クロタイタープレートに分配した。クローン化してから
８〜１０日後に、ウェルを単一クローンの増殖に就いて
顕微鏡で検討した。典型的にはクローン化から２〜４週
間後に、クローンか４０〜５０％のコンクルエンシーに
成長したとき、１種類のハイブリドーマコロニーを含む
ウェルからの上澄液を回収して、ヒト乳癌細胞と反応す
るヒト免疫グロブリンの存在に就いて分析した０選択さ
れたクローンを２４ウエルプレートに移して拡張した後
、クローニングを繰り返した。ハイブリドーマは、少な
くとも２回クローン化した。

これらの実験の結果を、下記の表−１に示す。

以下余白 表−１＝　乳癌患者由来の腋窩リンパ節からのり２　　
２　　４８　　５１３　　３　　１（２，０χ）ｘ１０
　　１０　　１９９　３２　７３　　４　　４０（２０
，１χ）Ｈｙｂ、　　Ｉｇ、　　：　　１層／１−上澄
液より多量のヒト１ｇＭまたは／およびＩｇＧを 産生ずるハイブリドーマ。

ＭＡｂ、　　：　　　　　モノクローン性抗体。

Ｘ　：　　　　　腫瘍に反応性を有する抗体の％。

表−１から明らかなように、１１人の患者からのリンパ
節細胞を用いて１１のヒト／ヒト融合が行われた。総数
で３４８個のヒトハイブリドーマが得られ、その内の１
８９個（５０，３％）がヒト免疫グロブリンを産生じた
。ヒトハイブリドーマの５０個は、最初にＭＣＦ−７細
胞、同温の腫瘍組織またはその両方と反応するヒト免疫
グロブリンを産生じた。これらのモノクローン性抗体は
１１人の患者中の３人から誘導された。いったん樹立さ
れたならば、ヒトハイブリドーマは速やかな増殖を示し
、倍加時間は２４〜３６時間であった。

ＥＬＩＳＡ　　に　　ヒ　　　グロブ１ンのハイブリド
ーマ培養物上澄液中のヒト免疫グロブリンをＥＬＩＳＡ
法によって測定した。用いたＥＬＩＳＡ法は、ドウラー
ド（Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ）とホフマン（Ｈｏｆｆｓａｎ
）　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　　、
ランボン・ジェイ・ジェイ（Ｌａｎｇｏｎｅ、　Ｊ、　
Ｊ、）およびブナキス・エイチ（Ｖｕｎａｋｉｓ、　Ｈ
，）監修、９２巻、１６８〜１７４頁、アカデミツク・
プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）。

ニュー・ヨークによって記載された方法の改変法であっ
た。ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＯＡＫＯ、デンマーク）
をＰＢＳで１：１００Ｇに希釈し、その５０Ｉを９６ウ
エルの平底イムノプレート（ＮＵＮＣ，デンマーク）に
分配し、プレートを２２℃で１時間インキエベーション
した。ＰＢＳ−Ｔで３回連続して洗浄した後、２００Ｉ
のＰＢＳ−ＢＳＡをそれぞれのウェルに加え、２２℃で
１時間インキエベーシッンした。ＰＢＳ−Ｔで３回連続
的に洗浄した後、５０Ｉ１１のハイブリドーマ上澄液を
それぞれのウェルに加え、２２℃で１時間インキエベー
ションした。ＰＢＳ−Ｔで３回連続して洗浄した後、５
０ｄのペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（
Ｄ八に０、デンマーク）をＰＢＳ−ＢＳＡで１：１００
０に希釈したちの５０４をそれぞれのウェルに加え、２
２℃で１時間インキユベーシッンした。ＰＢＳ−Ｔで３
回連続して洗浄した後、０．０１５％過酸化水素〔メル
クＣＭｅｒｃｋ）　、西ドイツ〕を含む５０−Ｍクエン
酸／リン酸緩衝液、ｐｏｓ、３のｌ−中にＯ−フェニレ
ンジアミン〔メルク（Ｍｅｒｃｋ）、西ドイツ〕０．５
■を含むもの１００ｍをそれぞれのウェルに加え、プレ
ートを３〜５分間放置した後、ウェル当たり１５０＃７
の２　ＮＨ１ＳＯ４を加えて酸素反応を停止した。ＥＬ
ＩＳＡリーダー〔コントロン（ｌｌｏｎｔｒｏｎ）　Ｓ
　Ｌ　７２１０　、Ｓ　Ｌ　Ｔ　・ラブインストルメン
ツ（ＳＬＴ　Ｌａｂｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　）で吸
収を測定した。免疫グロブリンの濃度を、ヒト血清対照
を用いて作成した標準曲線上での内挿法によって計算し
た。ＩｇＭ、におよびλ−鎖のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は、適
当な抗体（いずれもＤ＾に０、デンマーク）を用いて同
様の方法で行った。

ＥＬＩＳＡ ヒトモノクローン性抗体とゲルタールアルデヒド中で固
定されたＭＣＦ−７との反応性を細胞結合ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａによって計測した。ｔａ胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｐ
ＢＳ中に１．０Ｘ１０”個／−で懸濁し、０．００１％
ポリＬ−リジン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国）／ＰＢ
Ｓで予備処理した平底イムノプレート中に分配した（５
０ｍ／ウェル）、プレートを１１００Ｘで５分間遠心分
離し、０．５％ゲルタールアルデヒド〔シグマ（Ｓｉｇ
ｍａ）　、米国）／ＰＢＳ５０パをそれぞれのウェルに
加え、プレートを２２℃で１５分間放置した。遊離のゲ
ルタールアルデヒドをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄することに
よって除去した。０．１Ｍグリシンをそれぞれのウェル
に加え、プレートを２２℃で１時間インキエベーション
した。ハイブリドーマ上澄液５０Ｉをそれぞれのウェル
に加え、２２℃で１時間反応させた。

３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ヒト１ｇ
抗体〔タボ（Ｔａｌｏ）、米国〕をＰＢＳ−ＢＳＡで１
；３０００に希釈したちの５０１Ｊ１を２２℃で１時間
インキエベーシッンした。更に３回洗浄した後、ｌＯＯ
〆の酵素基質をそれぞれのウェルに加え、５〜１５分後
にＨ，５０４を加えて酸素反応を停止した。吸収が同濃
度におけるＫＲ−１２細胞ライン免疫グロブリンでの吸
収の３倍であったとき、反応は正であると考えた。

ハイブリドーマ培養上澄液を、融合の３〜５週間後、ヒ
トＩｇＧおよびＩｇＭの産生について試験した。ヒトハ
イプリドーマを含む３４８個のウェルの内、１８９個の
ウェルは１ｗＪ上澄液当たりＩＫのヒト免疫グロブリン
を産生ずるハイブリドーマを含んでいた。７４のウェル
はＩｇＭを産生ずるハイブリドーマを含み、１０１個の
ウェルはＩｇＧを産生ずるハイブリドーマを含み、１４
個のウェルはＩｇＭとＩｇＧの両方を産生ずるハイブリ
ドーマを含んでいた。

２０個の抗体産生ハイブリドーマでＭＣＦ−７または同
温の腫瘍組織と強力な反応性を有するものを選択して、
免疫グロブリン産生を安定化させた。これらのヒトハイ
ブリドーマの８個をクローン化して、１００％安定性に
した。

ヒトハイプリドーマは一旦安定化してしまうと、安定な
ままであり、通常の増殖条件（すなわち、フィーダー細
胞なしで、１週間に２回培地を交換し、１０％ＦＣ３を
含む完全ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０中）で、上澄液１−
当たり４．０〜１７．Ｏｕの範囲のヒト免疫グロブリン
を産生じ、低ハイブリドーマ密度は５Ｘ１０’個のパイ
プリド−マン−であり、高密度はＩ　Ｘ　１０’個のハ
イブリドーマ／ｄであつた。

クローン化して１００％安定にした８個のハイブリドー
マを更に特徴付けを行い、結果を表−２に示す。

以下余白 免疫■職学 反応性に就いての最初のスクリーニングは、低温槽上で
スライスした新たに凍結した同源の腫瘍の５ｎ切片を用
いて行った。この切片を、正常のヤギ血清と共に３０分
間予備インキエベーシツンし、ＴＢＳ中で洗浄し、抗体
産生ノ１イプリドーマからの未希釈上澄液と共に４℃で
一晩インキエベーシヨンした０次に、この切片をＴＢＳ
で洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭを（−次抗体
のサブクラスに依存して）　　１　：ａｏｏｏに希釈し
たものと共に４５分間インキュベージリンした。再度洗
浄した後、この切片をｌ：１００ペルオキシダーゼ接合
ブタ抗ヤギＩｇＧと共に３０分間インキュベージリンし
た０反応物をＡＢＣで発色せしめ、この切片をヘマトキ
シリンで対比染色して、アクアマウントに周定した。

正の反応の場合には、抗体をホルマリン固定してパラフ
ィン埋設した組織の切片に適用し、対応するエピトープ
が固定にも拘らず保存される場合に、かかる抗体のみを
別のスクリーニングに含めた。

背景染色を低減し、特異的反応を高めるため、上記３層
法の代わりにアビジン−ビオチン系を用いた。ビオチン
化した一次抗体を脱パラフイン化した切片に３０分間適
用し、ＰＢＳで洗浄し、アビジン−ビオチン系〔エイビ
ーシー（ＡＢＣ）キット、ベクトール・ラプス（Ｖｅｃ
ｔｏｒ　Ｌａｂｓ））を用いた。

ＡＢＣにより陽性反応が発色し、切片をヘマトキシリン
で対比染色し、アクアマウントに固定した。

既に述べたごとく、最初のスクリーニングは同源の乳癌
で行った。これに基づいて選択した抗体の特異性を、上
皮、開業およびリンパ球由来の広範囲の各種組織型に対
して試験した。胸部ｍｍの反応を１５０の一次乳癌、１
９の良性胸部Ｉｌｌ瘍および９個の正常な胸部組織で検
討した。

正の抗原−抗体反応は、細胞質内に生じる赤褐色の発色
として特徴的に見られた。環状構造においては、優先的
な尖端の染色の傾向は見られなかった。核は常に陰性で
あった。若干の抗体の反応の特異性を表−３に示す。

表−３から明らかなように、抗体のほとんどは開業腫瘍
と反応したが、正常な***組織とは反応しなかった。抗
体はリンパ組織またはリンパ球とは反応しなかった。

乳癌における反応は、顕著な不均一性を特徴とした。す
なわち、検出された抗原の幾つかは検討された場合の約
１１５にのみ存在するが、抗体ＭＡＣ１４／３９によっ
て検出された抗原は癌の８０％に存在した。

表−３から明らかなように、抗体Ｍ　Ａ　Ｃ４０／４３
は乳癌の５９％と反応し、検出された抗原は正常な胸部
組織では発現されなかった。

抗体Ｍ　Ａ　Ｃ４０／４３は、それ故更に特徴付けられ
、この抗体の反応パターンを表−４に示す。

以下余白 表−４：　ヒトモノクローン性抗体ＭＡ正常　　良性　
　悪性 皮膚　　　　　　　＋＋＋＋ 畢丸　　　　　　　＋＋＋＋＋ リンパ節　　　　　− 膣部十子宮膣部　　−＋ 中皮　　　　　　　　＋＋ 頭部十頭部　　　　−十 卵巣　　　　　　　　　　　　　　　十−前立腺　　　
　　　＋−＋ 甲状腺　　　　　　− Ｃ４０／４３の反応パターン 正常　　良性　　悪性 膀胱＋尿管　　＋＋＋＋ ＋　　　　肝臓　　　　　− 心室　　　　　− 腸　　　　　　十− 結腸＋直腸　　−＋＋（＋） 胸部　　　　　−−７／１９　　　＋　＋　＋＋（÷０
１／１９ ＋＋＋１／１９ 表−４から、良性腫瘍での反応は悪性腫瘍におけるより
も著しく弱く、良性腫瘍の５％（１９の内の１つ）だけ
が強い反応を示し、残りのものは抗原をわずかにしか発
現しないかまたはまうたく発現していないことが判る。

更に、上記の表は結腸／直腸における反応パターンは胸
部組織と同様であり、悪性腫瘍では不均質の反応であり
、良性および正常組織では反応があったとしても極めて
弱いものであることが示される。

五皿立拝敗仕鉄 ＭＣＦ−７細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１ｍＭフッ化
フェニルメチルスルホニルを含む２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ　　（ｐＨ８，０）中１５−Ｍデオキシコール酸中で
４℃にて３０分間可溶化した。懸濁液を５０．０００ｘ
　ｇで３０分間遠心分離し、５％β−メルカプトエタノ
ールを含むサンプル緩衝液でｌ：１に希釈し、５分間煮
沸し、そして３．５％、１２．６％の５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル系に適用した。

タンパクのニトロセルロース紙（０，２３１１Ｉサルト
リウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、西ドイツ）への電気泳
動法による移行を、ＪＣ半乾式電気ブロック−〔ジャン
コス（Ｊａｎｃｏｓ）デンマーク〕を用いて、製造業者
の指示にしたがって行った。プロットの後ニトロセルロ
ール紙上の追加のタンパク結合部位をトリス／ＮａＣｊ
！／ツイーン中２％ツイーン２０に暴露することによっ
て５分間飽和した。炭水化物を、ウッドワード（Ｗｏｏ
ｄｗａｒｄ）ら（Ｊ、　Ｉｓ＋５ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ
、、７８：＠、１９８５年、１４３〜１５３頁）の方法
によって、酸性ｐＨでの温和な過コウ素酸酸化によって
開裂した。要約すれば、ストリップを５０−Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐｔ１４．５）中１０−Ｍ過ヨウ素酸ナトリウ
ム中で２２℃で１時間インキエベーシッンし、アルデヒ
ド基をＰＢＳ中５０ｍ１’ｌ水素化ホウ素ナトリウムに
２２℃で３０分間暴露することによって還元した。対照
ストリップを、５０−４酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）
および５０５Ｍ水素化ホウ素ナトリウムと共にインキユ
ベーシヨンした。ストリップを、ＭＡＣ４０／４３上澄
液で２時間２２℃でインキユベーシヨンした。５分間の
間隔で４回洗浄した後、ストリップを、ペルオキシダー
ゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（タボ（Ｔａｇｏ）、米国〕を
、トリス／ＮａＣｊ！／ツイーン中で１：３０００に希
釈したものと共に２２℃で１時間インキエベーシッンし
た。Ｈ後に、ストリップを５０−Ｈ酢酸ナトリウムで４
回洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を基質としてＡＢＣを
用いて示した。

この処理の後、Ｍｒが約４７．０００を有するバンドが
可視化された。ＭＣＦ−７細胞酸分を１０＋＊Ｍ過ヨウ
素酸で処理した後に反応性が消失し、ＭＡＣ４０／４３
抗原が糖タンパクであることが示唆される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトリンパ節細胞と薬物が補充された培地中での増
   殖に感受性を有するヒト細胞ラインと融合することによ
   って産生されるハイブリドーマセルラインによって合成
   されるヒトの抗癌モノクローン性抗体。 ２、上記リンパ節細胞が局所腋窩リンパ節に由来する、
   特許請求の範囲第１項記載のヒトモノクローン性抗体。 ３、上記局所腋窩リンパ節が乳癌患者に由来する、特許
   請求の範囲第２項記載のヒトモノクローン性抗体。 ４、上記ヒトセルラインが骨髄腫−リンパ芽球様ハイブ
   リッドセルラインである、特許請求の範囲第１項記載の
   ヒトモノクローン性抗体。 ５、上記ハイブリッドセルラインがＫＲ− １２である、特許請求の範囲第４項記載のヒトモノクロ
   ーン性抗体。 ６、上記セルラインＫＲ−１２が薬剤ヒポキサンチン、
   アミノプテリンおよびチミジンを含む培地中における増
   殖に感受性を有する、特許請求の範囲第１項又は第５項
   記載のヒトモノクローン性抗体。 ７、モノクローン性抗体がＩｇＭまたは ＩｇＧのクラスの抗体である、特許請求の範囲第１功記
   載のヒトモノクローン性抗体。 ８、ハイブリドーマ、ＭＡＣ４０／４３から産生される
   ヒトモノクローン性抗体。 ９、放射免疫造影方に使用するのに好適な標識を行った
   特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項記載のヒ
   トモノクローン性抗体。 １０、特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項記
   載のヒトモノクローン性抗体の治療薬としての使用。 １１、ヒトリンパ節細胞と薬剤が充された培地での増殖
   に感受性を有するヒトセルラインとを融合することによ
   って形成されるヒトモノクローン性抗体を産生するハイ
   ブリドーマセルライン。 １２、上記リンパ節細胞が局所腋窩リンパ節に由来する
   、特許請求の範囲第１１項記載のハイブリドーマセルラ
   イン。 １３、上記局所腋窩リンパ節が乳癌の患者に由来する、
   特許請求の範囲第１２項記載のハイブリドーマセルライ
   ン。 １４、上記ヒトセルラインが骨髄腫−リンパ芽球様ハイ
   ブリッドセルラインである、特許請求の範囲第１１項記
   載のハイブリドーマセルライン。 １５、上記ハイブリッドセルラインがＫＲ−１２である
   、特許請求の肺第１４項記載のハイブリドーマセルライ
   ン。 １６、ハイブリッドセルラインＫＲ−１２がヒポキサン
   チン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地中にお
   ける増殖に感受性を有する、特許請求の範囲第１５項記
   載のハイブリドーマセルライン。 １７、抗体ＩｇＭまたはＩｇＧのカラスの抗体を分泌す
   る、特許請求の範囲第１１項記載のハイブリドーマ細胞
   ライン。 １８、ハイブリドーマ、ＭＡＣ４０／４３。 １９、癌細胞を正常細胞から識別する方法において、 乳癌患者のヒト局所リンパ節細胞と薬剤が補充された培
   地中での増殖に感受性を有するヒトセルラインとを融合
   させることによって、ヒトＩｇＭまたはＩｇＧモノクロ
   ーン性抗体を分泌するヒト−ヒトハイブリドーマを形成
   し、 上記ヒトモノクローン性抗体を単離し、 それらを上記癌細胞と結合させ、 上記癌細胞と関連したモノクローン性抗体を検出する階
   段を含んでなる方法。 ２０、上記癌細胞と結合したヒトモノクローン性抗体を
   、免疫化学的または放射免疫化学的方法によって検出す
   る、特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、ハイブリドーマセルラインＭＡＣ４０／４３（Ｉ
   ｇＭ）によって産生される抗体または免疫学的に同等の
   モノクローン性抗体によって認識されるエピトープを含
   む抗原。 ２２、前記エピトープが乳癌セルラインＭＣＦ−７によ
   って産生される特異的糖タンパク成分である、特許請求
   の範囲第２１項記載の抗原。 ２３、前記エピトープが抗イディオタイプ抗体成分また
   は免疫学的にこの成分と同等なものである、特許請求の
   範囲第２１項記載の抗原。 ２４、ハイブリドーマＭＡＣ４０／４３によって産生さ
   れる抗体に特異的に結合することができる実質的に精製
   された糖タンパク成分。 ２５、特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項記
   載のモノクローン性抗体を含んでなる、血清中、組織中
   または組織抽出物中においてヒト乳癌を検出する診断用
   キット。 ２６、ドット−プロット分析方、免疫サンドイッチ法ま
   たは競争法に適当な、特許請求の範囲第２５項記載の診
   断用キット。 ２７、ヒト乳癌細胞の免疫組織学的位置決定に適当な、
   特許請求の範囲第２５項記載の診断用キット。 ２８、２個以上の容器を密着捕捉して収容するための区
   分されたキャリヤーと、 ハイブリドーマＭＡＣ４０／４３によって産生される抗
   体によって認識されるエピトープを含む抗原を有する第
   一の容器と、 細胞ラインＭＣＦ−７によって産生されるヒト乳癌に特
   異的なエピトープ性糖タンパク成分を結合する検出可能
   な標識されたモノクローン性抗体を有する第二の容器と
   を含んでなる診断用キット。 ２９、上記第二の容器中の上記抗体がハイブリドーマ細
   胞ラインＭＡＣ４０／４３によって産生されたものであ
   る、特許請求の範囲第２８項記載のキット。