JP2640463B2 - ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 - Google Patents
ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、所望のヒト抗体の産生能を有するヒト−ヒ
トハイブリドーマの製造法に関する。
トハイブリドーマの製造法に関する。
モノクローナル抗体は免疫学領域のみならず、他の多
くの領域においてもその有用性が確認され、広く応用さ
れている。しかしながらこれらの抗体は、主にマウスで
作成されているものであり、ヒトの診断及び治療への応
用にはおのずとその限界がある。
くの領域においてもその有用性が確認され、広く応用さ
れている。しかしながらこれらの抗体は、主にマウスで
作成されているものであり、ヒトの診断及び治療への応
用にはおのずとその限界がある。
ヒトのモノクローナル抗体を製造するに際しては、所
望の抗原により感作された該抗原に特異的なヒトの抗体
産生細胞を得ることが必要であるが、ヒトでは、生体内
（in vivo）の抗原刺激が一部の抗原を除いては不可能
であることから、種々の抗原に対応するその様な手段
は、繁用技術として、未だ確立されたものはない。
望の抗原により感作された該抗原に特異的なヒトの抗体
産生細胞を得ることが必要であるが、ヒトでは、生体内
（in vivo）の抗原刺激が一部の抗原を除いては不可能
であることから、種々の抗原に対応するその様な手段
は、繁用技術として、未だ確立されたものはない。
また、抗体産生細胞の不死化（immortalization）手
段、例えば、ヒト骨髄腫細胞との融合、エプスタイン・
バー・ウイルス（Epstein-Barrvirus;EBV）での形質転
換（transform）等により、ヒトの永久株化細胞を得、
これからモノクローナル抗体を取得する試みがなされて
いるが、ヒトの系においては、マウスの系の様に、その
抗体産生能の安定したハイブリドーマもしくは形質転換
細胞は得られていないのが現状であつた。
段、例えば、ヒト骨髄腫細胞との融合、エプスタイン・
バー・ウイルス（Epstein-Barrvirus;EBV）での形質転
換（transform）等により、ヒトの永久株化細胞を得、
これからモノクローナル抗体を取得する試みがなされて
いるが、ヒトの系においては、マウスの系の様に、その
抗体産生能の安定したハイブリドーマもしくは形質転換
細胞は得られていないのが現状であつた。
したがつて、所望のヒトモノクローナル抗体を安定に
産生する永久株化細胞の提供が強く要望されていた。
産生する永久株化細胞の提供が強く要望されていた。
本発明者はヒト細胞についてのハイブリドーマを得べ
く種々研究をおこなつていたところ、ヒトの永久株化細
胞の特定の処理を施した後、これとヒト抗体産生細胞を
融合すれば、安定なヒトモノクローナル抗体を産生する
ヒト−ヒトハイブリドーマが得られることを見出し、本
発明を完成した。
く種々研究をおこなつていたところ、ヒトの永久株化細
胞の特定の処理を施した後、これとヒト抗体産生細胞を
融合すれば、安定なヒトモノクローナル抗体を産生する
ヒト−ヒトハイブリドーマが得られることを見出し、本
発明を完成した。
したがって、本発明は、エプスタイン−バーウイルス
感染により形質転換されたヒトＢ細胞にエメチン及びア
クチノマイシンＤを作用させて増殖抑制処理し、次いで
これとエプスタイン−バーウイルス感染により形質転換
されたヒトＢ細胞とを融合させることを特徴とする長期
間安定にモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイ
ブリドーマの製造法を提供するものである。
感染により形質転換されたヒトＢ細胞にエメチン及びア
クチノマイシンＤを作用させて増殖抑制処理し、次いで
これとエプスタイン−バーウイルス感染により形質転換
されたヒトＢ細胞とを融合させることを特徴とする長期
間安定にモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイ
ブリドーマの製造法を提供するものである。
本発明方法を実施するには、まず、エプスタイン−バ
ーウイルス感染により形質転換されたヒトＢ細胞の増殖
を抑制する。
ーウイルス感染により形質転換されたヒトＢ細胞の増殖
を抑制する。
親株としての形質転換されたヒトＢ細胞は、ヒトＢ細
胞にエプスタイン−バーウイルスを感染させる方法によ
り形質転換することによって得られる。この形質転換さ
れたヒトＢ細胞の増殖を抑制する方法は、エメチン及び
アクチノマイシンＤを組合せておこなう薬剤処理が好ま
しい。薬剤処理をおこなう場合の薬剤使用量について
は、融合に用いる細胞の種類によつて定める必要がある
が、一般には形質転換されたヒトＢ細胞が７〜10日で完
全に死滅する量を用いることが好ましい。このようにし
て得られた形質転換されたヒトＢ細胞は、ヘテロ接合性
であつてもホモ接合性であつても良いが、後のスクリー
ニング等を勘案するとホモ接合性のものであることが好
ましい。
胞にエプスタイン−バーウイルスを感染させる方法によ
り形質転換することによって得られる。この形質転換さ
れたヒトＢ細胞の増殖を抑制する方法は、エメチン及び
アクチノマイシンＤを組合せておこなう薬剤処理が好ま
しい。薬剤処理をおこなう場合の薬剤使用量について
は、融合に用いる細胞の種類によつて定める必要がある
が、一般には形質転換されたヒトＢ細胞が７〜10日で完
全に死滅する量を用いることが好ましい。このようにし
て得られた形質転換されたヒトＢ細胞は、ヘテロ接合性
であつてもホモ接合性であつても良いが、後のスクリー
ニング等を勘案するとホモ接合性のものであることが好
ましい。
次に、増殖抑制処理された形質転換されたヒトＢ細胞
は、抗体産生ヒト細胞と融合される。
は、抗体産生ヒト細胞と融合される。
抗体産生ヒト細胞としては、形質転換されたヒトＢ細
胞が好ましい。この抗体産生ヒト細胞は、ヒト組織又は
血液から分離したヒトＢ細胞をウイルス感染、特にエプ
スタイン−バーウイルス感染により形質転換せしめたも
のを用いるのが好ましい。この場合一般には融合操作の
のちに抗HLA抗体処理をおこない、非融合抗体産生ヒト
細胞を排除することが望ましい。また、細胞融合は、公
知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ウイルス
等を用いる方法又は電気細胞融合法等によりおこなわれ
る。細胞融合における増殖抑制されたヒト細胞と抗体産
生ヒト細胞の比は１〜30:1が好ましい。この細胞融合に
用いられる培地としては、例えばRPMI 1640培地、MEM培
地、ダルベツコ変法培地、及びそれらの血清加培地、並
びにそれらの無血清培地等が挙げられる。
胞が好ましい。この抗体産生ヒト細胞は、ヒト組織又は
血液から分離したヒトＢ細胞をウイルス感染、特にエプ
スタイン−バーウイルス感染により形質転換せしめたも
のを用いるのが好ましい。この場合一般には融合操作の
のちに抗HLA抗体処理をおこない、非融合抗体産生ヒト
細胞を排除することが望ましい。また、細胞融合は、公
知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ウイルス
等を用いる方法又は電気細胞融合法等によりおこなわれ
る。細胞融合における増殖抑制されたヒト細胞と抗体産
生ヒト細胞の比は１〜30:1が好ましい。この細胞融合に
用いられる培地としては、例えばRPMI 1640培地、MEM培
地、ダルベツコ変法培地、及びそれらの血清加培地、並
びにそれらの無血清培地等が挙げられる。
かくして得られたヒト−ヒトハイブリドーマは、更に
所望の抗体産生能の有無についての検索及びクローン化
に付される。
所望の抗体産生能の有無についての検索及びクローン化
に付される。
抗体産生能の有無は、ヒト−ヒトハイブリドーマの産
生する抗体の検定により確認される。この抗体検定は、
感作抗原に対する反応性を試験することにより実施さ
れ、その方法としては、例えば、ELISA法〔Meth.Enzymo
l.,70,419-439（1980）〕，プラーク法，スポツト法，
凝集反応法，オクテロニイ法，酵素免疫法（EIA），放
射免疫法（RIA）、細胞毒試験法等の一般の抗体検出に
利用される各種方法に従うことができる〔「ハイブリド
ーマ法とモノクローナル抗体」，（株）R ＆ D プラニ
ング発行、30〜53頁、昭和57年３月５日、等〕。また、
クローニングは、例えば公知の継代培養操作をくり返す
ことにより、また通常の限界希釈法に従うことにより容
易に達成される。
生する抗体の検定により確認される。この抗体検定は、
感作抗原に対する反応性を試験することにより実施さ
れ、その方法としては、例えば、ELISA法〔Meth.Enzymo
l.,70,419-439（1980）〕，プラーク法，スポツト法，
凝集反応法，オクテロニイ法，酵素免疫法（EIA），放
射免疫法（RIA）、細胞毒試験法等の一般の抗体検出に
利用される各種方法に従うことができる〔「ハイブリド
ーマ法とモノクローナル抗体」，（株）R ＆ D プラニ
ング発行、30〜53頁、昭和57年３月５日、等〕。また、
クローニングは、例えば公知の継代培養操作をくり返す
ことにより、また通常の限界希釈法に従うことにより容
易に達成される。
かくして製造されるヒト−ヒトハイブリドーマは、こ
れを常法に従い培養することにより、その培養上清中に
所望のヒトモノクローナル抗体を産生し、極めて有用で
ある。そして、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマは高
い融合率で得られ、クローン化された該ハイブリドーマ
は長期間安定にモノクローナル抗体を産生する。尚、上
記抗体は、常法に従い、更に精製・単離することがで
き、例えば高速液体クロマトグラフイー、抗原カラムを
用いるアフイニテイクロマト法等はことに好適な手段で
ある。
れを常法に従い培養することにより、その培養上清中に
所望のヒトモノクローナル抗体を産生し、極めて有用で
ある。そして、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマは高
い融合率で得られ、クローン化された該ハイブリドーマ
は長期間安定にモノクローナル抗体を産生する。尚、上
記抗体は、常法に従い、更に精製・単離することがで
き、例えば高速液体クロマトグラフイー、抗原カラムを
用いるアフイニテイクロマト法等はことに好適な手段で
ある。
更に、本発明方法で得られるヒト−ヒトハイブリドー
マから導かれるヒトモノクローナル抗体は、動物細胞を
用いたハイブリドーマから導かれたモノクローナル抗体
と比べ異種抗原性が低いので、治療用及び診断用の医薬
等として有用なものである。
マから導かれるヒトモノクローナル抗体は、動物細胞を
用いたハイブリドーマから導かれたモノクローナル抗体
と比べ異種抗原性が低いので、治療用及び診断用の医薬
等として有用なものである。
次に実施例を挙げ、本発明を説明する。
実施例 （ｉ）抗体産生Ｂ細胞の調製： 妊娠した供与者（SU:HLA-A2,−;Bw46,22;Cw7,−;DR4,
8）の末梢血を取り、これからリンパ球をフイコール−
コンレイ勾配により分離した。Ｔ細胞及びＢ細胞を、ノ
イラミダーゼで処理したSRBCを用いるロゼツト形成法に
より分離し、Ｂ細胞を得た。
8）の末梢血を取り、これからリンパ球をフイコール−
コンレイ勾配により分離した。Ｔ細胞及びＢ細胞を、ノ
イラミダーゼで処理したSRBCを用いるロゼツト形成法に
より分離し、Ｂ細胞を得た。
（ii）エプスタイン−バービールス（EBV）によるＢ細
胞の感作： EBV株を、10％牛胎児血清（FCS）加RPMI 1640培地中
で生育しているEBV−形質転換モーモセツト（mormose
t）細胞、B95-8株の培養物中で調製し、ビールスを含む
上清を得、２回過した。Ｂ細胞を５×104cell/100μ
ｌ含有する懸濁液100μｌ中に、ビールス株を加え、37
℃で１時間インキユベートした。次いで、10％FCS加RPM
I 1640培地800μｌを加えた。培地は３〜４日毎に加え
た。形質転換したＢ細胞は、感作後約２週間で見出され
た。このＢ細胞をEBV-SUと称する。
胞の感作： EBV株を、10％牛胎児血清（FCS）加RPMI 1640培地中
で生育しているEBV−形質転換モーモセツト（mormose
t）細胞、B95-8株の培養物中で調製し、ビールスを含む
上清を得、２回過した。Ｂ細胞を５×104cell/100μ
ｌ含有する懸濁液100μｌ中に、ビールス株を加え、37
℃で１時間インキユベートした。次いで、10％FCS加RPM
I 1640培地800μｌを加えた。培地は３〜４日毎に加え
た。形質転換したＢ細胞は、感作後約２週間で見出され
た。このＢ細胞をEBV-SUと称する。
（iii）親株、EBV−形質転換Ｂリンパ芽細胞（SA-1）エ
メチン及びアクチノマイシンＤ処理： ホモ接合性SA-1細胞（HLA-A24,B7,C−,DR1,Dw1）を10
％FCS加RPMI 1640培地中で培養した。この細胞をその増
殖期において採取し、RPMI 1640で３回（1000rpm,10分
間）洗浄し、１×106cell/mlの濃度に調整した。次いで
５×10-5Ｍエメチン塩酸塩及び0.1μg/mlアクチノマイ
シンＤを用い、37℃で２時間処理した。これらのエメチ
ン及びアクチノマイシンＤ濃度において、SA-1細胞の分
裂増殖は完全に抑制された。遊離のエメチン及びアクチ
ノマイシンＤを完全に除去するため、この細胞をRPMI 1
640で３回洗浄し、増殖抑制SA-1を得た。
メチン及びアクチノマイシンＤ処理： ホモ接合性SA-1細胞（HLA-A24,B7,C−,DR1,Dw1）を10
％FCS加RPMI 1640培地中で培養した。この細胞をその増
殖期において採取し、RPMI 1640で３回（1000rpm,10分
間）洗浄し、１×106cell/mlの濃度に調整した。次いで
５×10-5Ｍエメチン塩酸塩及び0.1μg/mlアクチノマイ
シンＤを用い、37℃で２時間処理した。これらのエメチ
ン及びアクチノマイシンＤ濃度において、SA-1細胞の分
裂増殖は完全に抑制された。遊離のエメチン及びアクチ
ノマイシンＤを完全に除去するため、この細胞をRPMI 1
640で３回洗浄し、増殖抑制SA-1を得た。
（iv）細胞融合技術及びハイブリツドの生育条件： EBV-SUを採取し、RPMI 1640で３回洗浄した。この細
胞をRPMI 1640に懸濁させ、増殖抑制SA-1と10:1の割合
で混合した。
胞をRPMI 1640に懸濁させ、増殖抑制SA-1と10:1の割合
で混合した。
15％DMSO-42.5％ポリエチレングリコール（PEG1000）
の0.25mlを継続的にスウイリング（swiling）させなが
ら１分間を要して加え、次いで予熱（37℃）したRPMI 1
640を1ml/分の割合で加えた。
の0.25mlを継続的にスウイリング（swiling）させなが
ら１分間を要して加え、次いで予熱（37℃）したRPMI 1
640を1ml/分の割合で加えた。
細胞を10分間1000rpmで回転して固型化し、増殖抑制S
A-1細胞が１ウエル当り５×104個となるように10％FCS
加RPMI 1640で懸濁させ、ミクロテツトプレートのウエ
ルに分配した。培地は２〜３日毎に加えた。
A-1細胞が１ウエル当り５×104個となるように10％FCS
加RPMI 1640で懸濁させ、ミクロテツトプレートのウエ
ルに分配した。培地は２〜３日毎に加えた。
（ｖ）HLA抗原の検出及び融合細胞の選択： ハイブリドーマの表面HLA-DR抗原を標準の微小リンパ
球障害試験（microlymphocytoloxicity test）により検
出し、1,4,8を有する融合細胞の選択をおこなつた。百
万のEBV-SU細胞から、HLA-DR1,4,8抗原を有するハイブ
リドーマ２個を得た。更に、限界希釈法により目的のハ
イブリドーマを得た。
球障害試験（microlymphocytoloxicity test）により検
出し、1,4,8を有する融合細胞の選択をおこなつた。百
万のEBV-SU細胞から、HLA-DR1,4,8抗原を有するハイブ
リドーマ２個を得た。更に、限界希釈法により目的のハ
イブリドーマを得た。
これに対し、親株として、エメチン及びアクチノマイ
シンＤ処理を行なわないSA-1細胞とEBV-SUを用いて上記
と同様にして融合操作を行ったところ、持続的にヒトIg
Mを産生するハイブリドーマを得られなかった。
シンＤ処理を行なわないSA-1細胞とEBV-SUを用いて上記
と同様にして融合操作を行ったところ、持続的にヒトIg
Mを産生するハイブリドーマを得られなかった。
（vi）イムノグロブリンの検定： ハイブリドーマ培養液の上清を微小リンパ球障害試験
と免疫螢光法により調べた。すなわち、ハイブリドーマ
培養上清をPBLと種々の培養細胞系統を標的細胞として
用いる標準微小リンパ球障害試験法によりスクリーニン
グした。細胞は、２×106cells/mlとなるよう調整され
た。この細胞１μｌを、テラサキタイピングトレーで37
℃、１時間培養された培養液上清とともに培養した。ウ
サギ血清（５μl,×２倍希釈）を補体源として加え、培
養は室温下で２時間おこなつた。細胞の生存能をエオシ
ン染料排除により調べた。反応は次の通り評価した。
と免疫螢光法により調べた。すなわち、ハイブリドーマ
培養上清をPBLと種々の培養細胞系統を標的細胞として
用いる標準微小リンパ球障害試験法によりスクリーニン
グした。細胞は、２×106cells/mlとなるよう調整され
た。この細胞１μｌを、テラサキタイピングトレーで37
℃、１時間培養された培養液上清とともに培養した。ウ
サギ血清（５μl,×２倍希釈）を補体源として加え、培
養は室温下で２時間おこなつた。細胞の生存能をエオシ
ン染料排除により調べた。反応は次の通り評価した。
評点 内容 １ 陰性（０〜10％死滅） ２ 弱陰性（11〜20％死滅） ４ 弱陽性（21〜40％死滅） ６ 陽性（41〜80％死滅） ８ 強陽性（81〜100％死滅） 細胞表面の分析は、ハイブリドーマ培養液上清と螢光物
質結合ヤギ抗ヒトIg又はウサギ抗ヒトIgを用いる間接免
疫螢光法によりおこなつた。
質結合ヤギ抗ヒトIg又はウサギ抗ヒトIgを用いる間接免
疫螢光法によりおこなつた。
（vii）Igクラスの決定因子： 抗体のクラス決定因子の分析には、セフアクリルS-30
0ゲル過フラクシヨンを用いる免疫螢光法を採用し
た。すなわち、ハイブリドーマ培養上清を10倍に濃縮
し、次いでセフアクリルS-300ゲル過により分画す
る。分画した試料は、第２の抗体としてウサギ抗ヒトIg
（IgM又はIgG）を、第３の抗体として螢光物質結合ヤギ
抗ウサギIg（IgM又はIgG）を用い、標的細胞の肺ガン細
胞系統（QG56）に対する間接免疫螢光法により調べた。
0ゲル過フラクシヨンを用いる免疫螢光法を採用し
た。すなわち、ハイブリドーマ培養上清を10倍に濃縮
し、次いでセフアクリルS-300ゲル過により分画す
る。分画した試料は、第２の抗体としてウサギ抗ヒトIg
（IgM又はIgG）を、第３の抗体として螢光物質結合ヤギ
抗ウサギIg（IgM又はIgG）を用い、標的細胞の肺ガン細
胞系統（QG56）に対する間接免疫螢光法により調べた。
（viii）抗体分泌細胞の検出： IgM又はIgG分泌細胞の検出には、プロテインＡ結合SR
BC及び単一特異的抗μ又は抗γ抗体を用いるリバースプ
ラーク検出法が採用された。
BC及び単一特異的抗μ又は抗γ抗体を用いるリバースプ
ラーク検出法が採用された。
（ix）SA-1細胞系統（親株）の特性： EBV−形質転換ヒトＢリンパ芽細胞系統（SA）がフイ
ーダー層としてBALB/Cネズミ胸腺細胞を用いるクローニ
ング（0.3cell/well）により選び出された。速やかに生
長するクローンを選び出し、これをSA-1と命名した。SA
-1細胞系統は、HLA-A24、B7、Ｃ−、DR1,Dw1を発現し、
下記第１表のIgGを分泌した。
ーダー層としてBALB/Cネズミ胸腺細胞を用いるクローニ
ング（0.3cell/well）により選び出された。速やかに生
長するクローンを選び出し、これをSA-1と命名した。SA
-1細胞系統は、HLA-A24、B7、Ｃ−、DR1,Dw1を発現し、
下記第１表のIgGを分泌した。
（ｘ）SU血清の抗HLA反応性のスクリーニング： 妊娠した供与者（SU）の血清について、そのHLA抗原
に対する反応性を標準微小リンパ球障害試験法によりス
クリーニングした。この抗体は、８名の健常供与者のリ
ンパ球及びEBV形質転換ホモ接合タイピング細胞に対し
障害性であつた。しかしながらこの抗体の特異性は、下
の第２表及び第３表に示す如く公知のHLA-A、Ｂ、Ｃ又
はDR遺伝子座抗原のいずれとも相関性がなかつた。
に対する反応性を標準微小リンパ球障害試験法によりス
クリーニングした。この抗体は、８名の健常供与者のリ
ンパ球及びEBV形質転換ホモ接合タイピング細胞に対し
障害性であつた。しかしながらこの抗体の特異性は、下
の第２表及び第３表に示す如く公知のHLA-A、Ｂ、Ｃ又
はDR遺伝子座抗原のいずれとも相関性がなかつた。
（xi）EBV-SU細胞系統の特性： EBV-SU細胞系統はHLA-A2,−;Bw46,22;Cw7,−DR4,8を
発現する。この細胞系統は下の第４表の通りIgM及びIgG
を分泌することが見出された。
発現する。この細胞系統は下の第４表の通りIgM及びIgG
を分泌することが見出された。
（xii）種々の細胞及び細胞系統についてのハイブリド
ーマ培養上清の検定： 増殖抑制SA-1及びEBV-SUから導かれたハイブリツド細
胞（223）はHLA-DR1,4,8抗原を発現する。このハイブリ
ツド細胞（223）はクローン化（10cells/well）され、
サブクローン（223・10・33）が得られた。このサブク
ローン（223・10・33）は補体依存性リンパ球障害抗体
を産生した。この抗体は、ヒトＢリンパ芽細胞系統及び
EBVで活性化されたＢ芽細胞と反応性を有していた。更
に、肺ガン細胞系統（QG56）及び胃ガン細胞系統（Kato
III）とも反応性を有していた。これに対し、この抗体
は、通常のリンパ組織、Ｔ芽細胞、白血病Ｔ細胞、腫腸
細胞（Myelomonocytes）、バーキツトリンパ球及び白血
病プレＢ細胞に対しては反応性がなかつた（第５表及び
第６表） （xiii）サブクローン（223・10・33）Igの分析： 抗体クラスの特異性を免疫螢光法により判定した（第
７表）。サブクローン（223・10・33）はそのセフアク
リルS-300ゲル過の分画からヒトIgMを産生することを
見出した（第１図）。
ーマ培養上清の検定： 増殖抑制SA-1及びEBV-SUから導かれたハイブリツド細
胞（223）はHLA-DR1,4,8抗原を発現する。このハイブリ
ツド細胞（223）はクローン化（10cells/well）され、
サブクローン（223・10・33）が得られた。このサブク
ローン（223・10・33）は補体依存性リンパ球障害抗体
を産生した。この抗体は、ヒトＢリンパ芽細胞系統及び
EBVで活性化されたＢ芽細胞と反応性を有していた。更
に、肺ガン細胞系統（QG56）及び胃ガン細胞系統（Kato
III）とも反応性を有していた。これに対し、この抗体
は、通常のリンパ組織、Ｔ芽細胞、白血病Ｔ細胞、腫腸
細胞（Myelomonocytes）、バーキツトリンパ球及び白血
病プレＢ細胞に対しては反応性がなかつた（第５表及び
第６表） （xiii）サブクローン（223・10・33）Igの分析： 抗体クラスの特異性を免疫螢光法により判定した（第
７表）。サブクローン（223・10・33）はそのセフアク
リルS-300ゲル過の分画からヒトIgMを産生することを
見出した（第１図）。
（xiv）サブクローン（223・10・33）の抗体産生能： サブクローン（223・10・33）を、10％FCS、0.6％ヘ
ペス、0.2％重炭酸ソーダ、100単位/mlのペニシリン、1
00μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培
地で37℃、３日間培養した。初発細胞濃度は１×105/m
l、最終細胞濃度は３〜４×105/mlとした。培地交換は
３日毎に行なつた。
ペス、0.2％重炭酸ソーダ、100単位/mlのペニシリン、1
00μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培
地で37℃、３日間培養した。初発細胞濃度は１×105/m
l、最終細胞濃度は３〜４×105/mlとした。培地交換は
３日毎に行なつた。
サブクローン（223・10・33）により産生される抗体
は、EBV−形質転換Ｂ細胞系列であるB85を標的細胞とす
る微小リンパ球細胞障害試験により定量した。抗体の力
価は、標的細胞の90％以上が死滅する抗体溶液の最大希
釈率で表わした。
は、EBV−形質転換Ｂ細胞系列であるB85を標的細胞とす
る微小リンパ球細胞障害試験により定量した。抗体の力
価は、標的細胞の90％以上が死滅する抗体溶液の最大希
釈率で表わした。
サブクローン（223・10・33）は、下の第８表に示す
ように長期間安定に抗体を産生した。
ように長期間安定に抗体を産生した。
第１図はサブクローン（223・10・33）のセフアクリルS
-300ゲル過分画の280nmの吸光度及びIgに対する陽性
率を示す図面である。
-300ゲル過分画の280nmの吸光度及びIgに対する陽性
率を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】エプスタイン−バーウイルス感染により形
質転換されたヒトＢ細胞にエメチン及びアクチノマイシ
ンＤを作用させて増殖抑制処理し、次いでこれとエプス
タイン−バーウイルス感染により形質転換されたヒトＢ
細胞とを融合させることを特徴とする長期間安定にモノ
クローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマの
製造法。 - 【請求項２】増殖抑制処理に用いるヒトＢ細胞の細胞表
面抗原であるHLAがホモ接合性のものである特許請求の
範囲第１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 - 【請求項３】増殖抑制処理に用いるヒトＢ細胞の細胞表
面抗原であるHLAがDR1である特許請求の範囲第２項記載
のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 - 【請求項４】増殖抑制処理を形質転換されたヒトＢ細胞
が７〜10日で完全に死滅する量のエメチン及びアクチノ
マイシンＤ処理によりおこなう特許請求の範囲第１項〜
３項のいずれか１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの
製造法。 - 【請求項５】ヒトＢ細胞が妊産婦由来のＢ細胞である特
許請求の範囲第１項〜４項のいずれか１項記載のヒト−
ヒトハイブリドーマの製造法。 - 【請求項６】細胞融合がポリエチレングリコールを添加
して行なわれる特許請求の範囲第１項記載のヒト−ヒト
ハイブリドーマの製造法。 - 【請求項７】細胞融合が、増殖抑制されたヒトＢ細胞と
ヒトＢ細胞を１〜30:1の割合で混合して行なわれる特許
請求の範囲第１項又は第６項記載のヒト−ヒトハイブリ
ドーマの製造法。 - 【請求項８】細胞融合がRPMI 1640培地を用いて行なわ
れる特許請求の範囲第１項〜７項のいずれか１項記載の
ヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 - 【請求項９】融合後、抗HLA抗体処理により融合細胞を
選択することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜８項
のいずれか１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造
法。 - 【請求項１０】モノクローナル抗体が、補体依存性リン
パ球障害性モノクローナル抗体である特許請求の範囲第
１〜10項のいずれか１項記載のヒト−ヒトハイブリドー
マの製造法。 - 【請求項１１】モノクローナル抗体が、形質転換Ｂ細胞
系、肺ガン細胞系および胃ガン細胞系に反応性があり、
正常リンパ組織、白血病Ｔ細胞及び白血病Ｂ細胞に反応
性がないモノクローナル抗体である特許請求の範囲第１
〜10項のいずれか１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマ
の製造法。
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| JP61-70199 | 1986-03-28 |
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|---|---|
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| US6197582B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-03-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Development of human monoclonal antibodies and uses thereof |
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| EP1188830B1 (en) | 1999-06-02 | 2010-01-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel hemopoietin receptor protein ,nr10 |
| WO2001018200A1 (fr) | 1999-09-06 | 2001-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene de type tsg |
| EP1486510B1 (en) | 1999-09-21 | 2009-05-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Use of transporter gene oatp-c to screen for test compounds |
| EP2019139A1 (en) | 2000-01-24 | 2009-01-28 | Sugiyama, Haruo | WT1 interacting protein WTIP |
| US7060802B1 (en) * | 2000-09-18 | 2006-06-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Tumor-associated marker |
| DE60336227D1 (de) | 2002-06-06 | 2011-04-14 | Oncotherapy Science Inc | Gene und proteine mit bezug zu menschlichem kolonkrebs |
| TW200418988A (en) | 2002-09-30 | 2004-10-01 | Oncotherapy Science Inc | Method for diagnosing prostate cancer |
| TW200413725A (en) | 2002-09-30 | 2004-08-01 | Oncotherapy Science Inc | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
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| AU2005264579B2 (en) | 2004-07-22 | 2010-06-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Lrp4/Corin dopaminergic neuron progenitor cell markers |
| JP5109131B2 (ja) | 2005-02-10 | 2012-12-26 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 膀胱癌を診断する方法 |
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| US8858949B2 (en) | 2009-08-06 | 2014-10-14 | Immunas Pharma, Inc. | Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof |
| TW201136604A (en) | 2009-12-14 | 2011-11-01 | Oncotherapy Science Inc | TMEM22 peptides and vaccines including the same |
| TWI538685B (zh) | 2010-04-02 | 2016-06-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Ｅｃｔ２胜肽及含此胜肽之疫苗 |
| EP2742133B1 (en) | 2011-08-12 | 2017-10-04 | Oncotherapy Science, Inc. | Mphosph1 peptides and vaccines including the same |
| BR122021015246B1 (pt) | 2011-10-28 | 2023-03-28 | Oncotherapy Science, Inc | Composição para indução de linfócito t citotóxico (ctl), uso no tratamento de câncer e indução de resposta imune contra câncer, bem como métodos in vitro para indução de ctl e célula apresentadora de antígeno |
| EP2872531A4 (en) | 2012-07-10 | 2016-04-06 | Oncotherapy Science Inc | LY6K EPITOPE PEPTIDES FOR TH1 CELLS AND VACCINES CONTAINING SAME |
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| DE3245665A1 (de) * | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| JPS5944325A (ja) * | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | 単クロ−ン性抗体およびそれらを産生するハイブリド−マ |
-
1987
- 1987-03-25 EP EP87104436A patent/EP0239102A3/en not_active Withdrawn
- 1987-03-26 JP JP62072767A patent/JP2640463B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-30 US US07/031,671 patent/US4916072A/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| US4916072A (en) | 1990-04-10 |
| EP0239102A2 (en) | 1987-09-30 |
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