SU1527260A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ - тимозину - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибридной технологии и может быть использовано при получении диагностикума. Цель изобретени  - создание нового штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) класса JGM. Депонирован под номером ВСКК(П) N 115Д. Штамм получен путем сли ни  клеток миеломы SP2/0 с клетками селезенки мыши BALB/с, иммунизированный конъюгатом бычий сывороточный альбумин-α₁-тимозин. При культивировании IN VITRO штамм образует круглые клетки, слабо прикрепл ющиес  к твердой подложке. Врем  удвоени  попул ции 30 ч. Клетки культивируют на среде RPM1-1640 с добавлением 10% летательной бычьей сыворотки, глютамина и меркаптоэтанола. Прививка клеток гибридомы сингенным мышам вызывает образование асцитной опухоли. Продуцируемые штаммом монАТ относ тс  к классу JGM и специфически св зываютс  с α₁-тимозином. Конъюгаци  монАТ с биотином не сопровождаетс  существенным снижением их активности, что дает основание дл  их использовани  в высокочувствительных вариантах иммунологического определени  α₁-тимозина.

Description

рый конъюгируют с пептидным матери- алом, содержащим 01,,-тимоэин. Дл  иммунизации животных конъюгат oi, - тимозин - БСА раствор ют в фосфатном буфере с рН 7,4 и смешивают в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Полученную суспензию ввод т внутрикожно мьш1ам в 6 точек тела из расчета по 100 мкг oi,-тимозина на одну мышь. Последующие 8 инъекций делают с недельным интервалом. Втора  инъекци  идентична первой, начина  с третьей животным ввод т имму- ноген без адъюванта Фрейнда. Спуст  4 и 8 недель после начала иммунизации у мьш1ей берут кровь из ретроор- битального синуса с целью определени  силы иммунного ответа иммунофер- ментным методом. Затем наиболее силь но отвечающую мьпиь забивают, стерильно готов т суспензию клеток селезен- ки. Полученные спленоциты сливают с клетками миеломы с помощью полиэти- ленгликол  4000.

Скрининг гибридом провод т с по- твердофазного иммунофермент- ного анализа. Высокоочиш.енный природный или синтетический oi. -тимозин раствор ют в карбоиатном буфере с рН 9,6 в концентрации 10 мкг/мл и нанос т по 100 мкл в  чейку 96-лу- ночной плоскодонной коммерческой пластины. Контрольным антигеном служит бычий сывороточный альбумин в той же концентрации. Пластины инкубируют 18 ч при . Затем  чейки той же концентрации.Пластины инкубиру . ют 13 ч при 4 С.Затем  чейки отмывают от несв завшегос  антигена фосфатным буфером с рН 7,4, с одержащим 0,05% Твин 20. Следуюш,ими сло ми иммунного сендвича служат супернатанты гибридов и кроличьи аффинные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгирован- ные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата пероксидазы используют перекись водорода, хромогеном служит ортофенилендиамин. Реакцию оценивают на мультискане при длине волны 450 н Полученный позитивный клон дважды клонирован методом лимитирующих разведений , в результате чего отобран штамм альфа-1/36/4, стабильно продуцирующий монАТ к (xi,-тимозину. Штамм клонирован в брюшной полости мьш1ей с целью наработки антител.

Штамм хранитс  в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) № 115 Д и характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура состоит из клеток округлой формы диаметром 29-30 мк ,большую часть клеток занимает  дро с 1-3 плотными  дрьшками; клетки располагаютс  раздельно при низкой плотности и образуют кластеры при увеличении их числа до 210 мл и выше.

Культуральные признаки.

Стандартные услови  культивировани  - ростова  среда ДМЕ или RPMI 1640 с добавлением 0,05 мм меркапто- зтанола, 14-, 7 мг/л глютамина, 10% эмбриональной тел чьей сьгеоротки. Культивирование провод т в пластиковой или стекл нной посуде при 37°С В пластиковый флакон емкостью 50 мл при 5% СО помещают IxlO клеток в 5-7 мл культуральной среды. Исходное количество клеток в том же объеме среды без поддержани  посто нства газового состава должно быть в 10 раз больше. При росте в указанных услови х штамм образует круглые клетки, слабо прикрепл ющиес  к твердой подложке и снимающиес  с нее ресуспен- дированием супернатантом. Врем  удвоени  попул ции . Кратность рассева 1:3 3-4 раза в неделю.

Культивирование в организме животных . Внутрибрюшинное введение клеток сингенным мьщ1ам, сенсибилизированным пристаном или вазелиновым маслом, вызывает образование асцит- ной опухоли. В сьшоротке крови и асците таких животных содержатс  антитела к oi, -тимозину. Способность к продукции монАТ сохран етс  при последовательных перевивках клеток от одного животного другому, а также при культивировании клеток асцити- ческой жидкости in vitro,

Продуктивность штамма.

ПРИ стандартных услови х культивировани  in vitro гибридома продуцирует 10-20 мкг/мл антител при плотности клеток 0,5г1,0-10 на 1 мл. При культивировании in vivo от одной мьш1и можно получить однократно 0,5-0,6 мл сыворотки и 1-3 мл асцита , в которых содержитс  20-40 мг антител.

Характеристика полученного продукта . МонАТ, продуцируемые гибри- домой, св зываютс  с высокоочидейным

природным ei, -тимозином из тимуса крупного рогатого скота и синтетическим об,-тимозином . Методом ДСН-эле- ктрофореза установлено, что штамм 115 Д продуцирет 1 цепь иммуноглобулинов . Принадлежность антител штамма к классу IgM подтверждено путем иммунофермен.тного анализа с использованием коммерческих антител к М цеп м иммуноглобулинов. Стабильность продуцировани  в культуре не менее 30 пассажей.

Криоконсервирование. Криоконсер- вацию провод т в ростовой среде с добавлением 10% диметипсульфоксида при концентрации клеток 1-1 на I мл. Жизнеспособность клеток после размораживани  70%.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, тест на мико плазму отрицателен.

6

Пример 1. По 3-10 клеток ввод т внутрибрюшинно мьшгам BALB/c. На 14-й день после введени  у каждой мыши берут по 1,5 мл асцитической жидкости и nd 1,0 МП крови. Вз тый материал пулируют и после свертыва

527260

с фиксированным о«, -тимозином. Специфичность антител вы вл ют, нанос  в качестве третьего сло  аффинные кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. В другом варианте опыта реакцию заканчивают нанесением аффинных кроличьих антител к иммуноглобулинам

Q мыши, пероксидазы хрена и моноклональ- ных антител к пероксидазе хрена, т.е. комплекса пероксидаза - анти- пероксидаза. В обоих вариантах опыта получено специфическое св зывание монАТ с о( -тимозином, но не с БСА.

Пример 2. Двум мьш1ам BALB/c, предварительно сенсибилизированным вазелиновым маслом, т рансплантируют внутрибрюшинно 1 клеток штамма

20 115 Д. На 6-е сутки от одной из

опытных мьппей получают 3,0 мл асцитической жидкости и 1,0 мл крови, от другой - по 1,0 мл асцита и крови. Клетки асцитической жнцкости осаж25 дают центрифугированием, ресуспен15

дируют в 0,1 Ми фосфатном буфере и ввод т повторно по двум сенсибилизированным вазелиновым маслом мьш1ам BALB/C. На 10-е сутки после

ни  крови и ретракции сгустка, центри- д переноса у вторичных реципиентов

фугируют при 4000 об/мин 30 мин. Иммуноглобулины супернатанта трижды осаждают 40%-кым сульфатом аммони , раствор   осадок в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4. После окончани  обработки получают 4,0 мл раствора, содержание белка в котором по данным спектрофотометрии при 280 нм составл ет 30 мг/мл. При электрофорезе в полиакриламидном геле с додешшсуль- фатом натри  (ДСН-электрофорез) в полученном материале установлено наличие несвойственной препаратам нормальной сыворотки мьш1ей полосы в зоне мол.м 70 кДа, величина которой составл ет не менее 50% величины всех белков данной дорожки и представл ет собой т желые цепи иммуноглобулинов , синтезируемые штаммом гибридом 115 Д. Таким образом, примерное содержание монАТ в полученном препарате cocтaвл et 60 мг, а количество антител, продуцируемое одной мышью, 30 мг. Учитьша  молекул рную массу т желой цепи монАТ, их следует отнести к иммуноглобулинам класса М. Полученные антитела испытывают в им- мунофернентном анализе, нанос  белок в количестве 5 мкг/мл на твердую фазу

35

40

45

50

55

берут по 1,5 мл асцита и по 1,0 м крови. После стандартной обработк сульфатом аммони  получено 150 мг белка, который перевод т в 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4 с помощь сефадекса G-25, а затем биотинили руют.

Полученные препараты провер ют на специфичность св зьшани  с «li- тимозином с помощью двух варианто иммуноферментного метода. В перво варианте на oL, -тимозин и БСА, фи на твердой фазе, нанос биотинилированные монАТ в концен рации 0,05 мкг/мл и авидин, конъю рованный с пероксидазой хрена. Во втором варианте на твердую фазу н нос т аффинные кроличьи антитела иммуноглобулинам G мьш1и, затем сы воротку мьш1и, спленоциты которой пользовали Дл  полу еЕШ  штамма. С дующие слои иммунного сендвича - специфический и контрольный антиг испытуемые биотинилированные анти тела и конъюгат авидин - пероксид за. В обоих вариантах опыта получ специфическое св зьтание биотинип рованных антител ел, -тимозином, не с ЕСА.

д переноса у вторичных реципиентов

5

0

5

0

5

берут по 1,5 мл асцита и по 1,0 мл крови. После стандартной обработки сульфатом аммони  получено 150 мг белка, который перевод т в 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4 с помощью сефадекса G-25, а затем биотинили- руют.

Полученные препараты провер ют на специфичность св зьшани  с «li- тимозином с помощью двух вариантов иммуноферментного метода. В первом варианте на oL, -тимозин и БСА, фик- на твердой фазе, нанос т биотинилированные монАТ в концентрации 0,05 мкг/мл и авидин, конъюги- рованный с пероксидазой хрена. Во втором варианте на твердую фазу нанос т аффинные кроличьи антитела к иммуноглобулинам G мьш1и, затем сыворотку мьш1и, спленоциты которой использовали Дл  полу еЕШ  штамма. Следующие слои иммунного сендвича - это специфический и контрольный антиген, испытуемые биотинилированные антитела и конъюгат авидин - пероксидаза . В обоих вариантах опыта получено специфическое св зьтание биотинипи- рованных антител ел, -тимозином,но не с ЕСА.

715272608

Claims (1)

1. Таким образом, штамм 115 Д даетФормула изобретени  возможность получать монАТ к о,-тимозину с последующим их использова- Штамм гибридных культивируемых

   нием с целью определени  о6,-тимозинаклеток животных Mus musculus BCKK(II)

   в различных вариантах иммунофермент-№ 115 Д, используемый дл  получени 

   него анализа.моноклональных антител к , -тимозину.