JPS63196521A - 腫瘍細胞障害性因子誘起剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 座！上η五■盆団 本発明は、腫瘍細胞障害性因子誘起剤に関するものであ
る。

従来の技術 中性プロテアーゼ、補体、アルギナーゼ、活性酵素群、
インターロイキンエ、腫瘍壊死因子・ＴＮＦなど、マク
ロ７アーシが産生するｌ！ｌ！瘍細胞障害性因子の中で
、ＴＮＦの作用はマクロファージの腫瘍細胞障害性のス
ペクトラムと非常によ（一致することが知られており、
マクロファージの抗腫瘍活性の最も重要なエフェクター
であると考えられている。

ＴＮＦとしては、マクロファージから放出されるＴＮＦ
−αのほかに、リンホサイトから放出されるＴＮＦ−β
が知られており、これらは担癌動物に投与すると癌を壊
死させ、ｉｎν１ｔｒｏではある種の癌細胞に対してそ
の増殖を抑制したり、死に至らしめたりする。しかしな
がら、ＴＮＦのよ’ｙ−’を腫瘍細胞障害性因子をマク
ロファージに作らせて放出させるためには、Ｃａｒｓｗ
ｅｌｌら（１９７５年）がしたように、マクロファージ
をまずＢＣＧ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌ論ｅｔｔｅ
　Ｇｕｅｒｉｎ）などの免疫賦活剤で処理し、その後、
エンドトキシンのような誘起剤を投与する必要がある。

腫瘍細胞障害性因子誘起物質としては、ほかにＬｉｐｉ
ｄ　Ａおよびその誘導体が知られている。

しかしながら、上記障害性因子誘起作用を有することが
分かっている物質は、毒性と副作用が強く、医薬として
の腫瘍細胞障害性因子誘起剤に使うことは困難であった
。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、エンドトキシンやＬｉｐｉｄ　Ａが示
すような毒性のない、安全性の高い物質からなる腫瘍細
胞障害性因子誘起剤を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、乳酸桿菌の処理物に関する広範な研究の
過程において、乳酸桿菌をＮ−７セチルムラミデースで
処理して得られる多糖−ペプチドグリカン複合体がすぐ
れた腫瘍細胞障害性因子誘起作用を示すことを知った。

本発明は上記新規な知見に基づくもので、乳酸桿菌の細
胞壁由来の多糖−ペプチドグリカン複合体を有効成分と
する腫癌細胞障害性因子誘起剤を提供するものである。

乳酸桿菌の細胞壁の表層部には主としてペプチドグリカ
ンからなる層があり、更にその外側には、タイコ酸や多
糖などが存在する。ペプチドグリカンは、４個または５
個の７ミノ酸からなるペプチド値で置換されたＮ−７セ
チルムラミン酸とＮ−７セチルグルフサミンとが結合し
た三糖単位を基本単位とし、これが、他のアミノ酸やペ
プチドによって架橋されなから巨大分子化したものであ
り、細胞壁中では、上記タイコ酸や多糖とリン酸を介し
て結合している。乳酸桿菌なＮ−７セチルムラミデース
で処理すると、Ｎ−７セチルムラミン酸とＮ−７セチル
グルコサミンとの間のβ−１，４結合が切断されて、ペ
プチドグリカンと多糖との結合を残したまま、上記基本
単位および該基本単位同士がペプチド鎖部分で結合した
ものが遊離する。その代表的なものを次に示す。

Ｒ−Ｌ−Ａ　１ａ−Ｄ−Ｇ　１ｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａ
　ｌａＲＬ−Ａｌａ　　Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−
Ａｌａ−Ａｓｐ Ｒ−Ｌ−Ａ　１ａ−Ｄ−Ｇ　１ｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａ
　ｌａ−Ａｓｐ Ｒ−Ｌ−Ａ　１ａ−Ｄ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−
Ａ　ｌ　ｍ但し、式中の略号はそれぞれ下記の単位を意
味する。

Ｒ：　　　　　　　　　　　多糖 ＨＯ−Ｐ＝０ ■ Ｈ−Ｃ−ＣＨ。

■ Ｃ＝０ Ｌ−Ａｌａ　：　Ｌ・アラニン Ｄ−Ｇｌｕ　：　Ｄ−グルタミン Ｌ−Ｌｙｓ　：　Ｌ−リジン Ｄ−Ａｓｐ　：　Ｄ−７スパラギン これら複雑な化合物の混合物が、本発明の腫瘍細胞障害
性因子誘起剤を構成する多糖−ペプチドグリカン複合体
である。

多糖−ペプチドグリカン複合体における糖組成およびア
ミノ酸配列は、原料乳酸桿菌の種類によって若干異なる
が、下記の乳酸桿菌から得られるものはすべて上記のア
ミノ酸配列のものであり、且つ本発明の腫瘍細胞障害性
因子誘起剤を構成する多糖−ペプチドグリカン複合体と
して好ましい。

Ｌ、カゼイ　（Ｌ、　ｃａｓｅｉ）、Ｌ、ブヒネリ　（
Ｌ、　ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ、ユーグルテ４　　（Ｌ
、ｊｕｇｕｒｔｉ）、Ｌ、サケ（Ｌ、　５ａｋｅ）、Ｌ
、ラクチス（Ｌ、１ａｃｔｉｓ）、Ｌ、コリネフォルミ
ス（Ｌ。

ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｉｓ）、Ｌ、７シドフイルス（Ｌ
、　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ、パストリ７ヌス（
Ｌ、ｐａｓｔｏｒｉｉｎｕｓ）、Ｌ、カルパタス（Ｌ、
　ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ、サリパリウス（Ｌ、　５ａ
ｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ。

キシロサス（Ｌ、ｘｙｌｏｓｕｓ）、Ｌ、デルプレッキ
イ（Ｌ、　ｄｅｌ−ｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ、ライヒマ
ンニ（Ｌ、　ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、Ｌ、プル〃リ
クＸ　（Ｌ、ｂｕｌｇａｌｉｃｕｓ）、Ｌ、ヘルベティ
カス（Ｌ。

ｈｅｌｖｅｔｉｅｕｓ）、Ｌ、プレビス（Ｌ、　ｂｒｅ
ｖｉｓ）、　（但し、Ｌ、はラクトバチルスＬａｃＬｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓの略、以下の文において同じ）。

本発明の腫瘍細胞障害性因子誘起剤の有効成分である多
糖・ペプチドグリカン複合体を乳酸桿菌から製造する方
法の詳細は、次のとおりである。

原料とする乳酸桿菌は、乳酸桿菌の培養に使用可能な適
当な培地を用いて常法により培養したものでよく、特殊
な培養法によるものである必要はない、培養後、常法に
より洗浄し、望ましくは加熱して死菌体としたものを水
に懸濁させて、Ｎ−アセチルムラミデースで処理する。

９Ｈ約５〜６、温度約３７〜５０℃で１２〜２４時間程
度処理すると、細胞壁が溶解する。反応混液な遠心分離
し、上清を再度酵素処理したのち、核酸分解酵素で核酸
を分解し、更にトリプシンを加えてタンパク質を分解す
る０次いで蒸留水にて透析し、透析内液を凍結乾燥すれ
ば、目的とする多糖−ペプチドグリカン複合体が得られ
る。

上述のようにして得られる多糖−ペプチドグリカン複合
体は、そのまま、あるいは必要に応じて更に精製して、
本発明の腫瘍細胞障害性因子誘起剤の構ｒ！を成分とす
ることができる。

多糖−ペプチドグリカン複合体は水溶性であり、また安
定性のよい物質である。すなわち、凍結乾燥粉末は室温
保存で一年以上も活性が低下せず、また生理的食塩水溶
液にしたものは、−２０℃で凍結保存した場合、６力月
以上活性が減弱しないし、凍結融解を３回くり返しても
活性が城弱しない、生理的食塩水溶液は、さらに１００
℃で１０分間加熱しても活性減弱を起こさない。

したがって、多糖−ペプチドグリカン複合体から腫瘍細
胞障害性因子誘起剤を製造する場合は任意の方法により
注射剤、錠剤、粉剤等の形に製剤し、静脈注射、経口投
与などの形で利用することができる。

本発明による腫瘍細胞障害性因子誘起剤の標準的な投与
量は、体重１に８当り、多糖−ペプチドグリカン複合体
として約０．８〜８０輸ｇである。

多糖−ペプチドグリカン複合体の毒性は、下記のＬＤ、
。値（７週令、体重的２５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雄マウスに
ウマウス値）から明らかなように、全く認められない。

経口投与の場合　　　２０００闘／ｋｇ以上静脈内投与
の場合　　　８００ｍｇ／ｋｇ以上腹腔内投与の場合　
　　８００ｍｇ／ｋｇ以上発明の効果 本発明の腫瘍細胞障害性因子誘起剤は、毒性や副作用が
なく、また、水溶性であるため注射剤その他任意の剤形
への製剤が容易である。＊た、乳酸桿菌画体から得られ
るので原料入手が容易であり、製造もまた容易である。

これらの特長を生かして、本発明の腫瘍細胞障害性因子
誘起剤はさまざまな投与経路により生体に使用可能であ
り、腫瘍細胞に対して効果的な障害活性を誘導しうる。

さらに、腫瘍細胞障害性因子の大量生産における誘起剤
としても使用可能であるなど、多くの用途に広く利用す
ることができる。

ヌ１男 以下、実施例を示して本発明を説明する。なお実施例に
おいては、次の方法によりａ癌細胞障害性因子誘起作用
を確認した。

試験法：８〜９週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ｃマウスにラ
クトバチルス・カゼイの死菌体０．５ａ＋ｇをＩＩ瞭内
投与し、その５日後に腹腔的浸出細胞を採集し、パーフ
ール（７フルマシ７社製）密度勾配法（Ｇｕｔｉｅｒｒ
ｅｙｅら：　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
、　　２９　、５７　。

１９７９）により純度９９％の腹腔マクロファージを得
る。

これを、１０％子牛脂児血清（シグマ社製）を添加した
ＲＰＭｌ−１６４０培地に２Ｘ１０’個／論１になるよ
うに懸濁させ、得られた懸濁液を３５−輪の培養用シャ
ーレに分注する。そこに検体（ＲＰＭＩ−１６４０培地
に溶解したもの）を加え、１８時間培養する。その後、
培養上清を１０分間遠心分離し、更にＲＰＭＩ−１６４
０培地に対して４８時間透析する。

別に、１０％子牛脂児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４
０培地にＬ９２９細胞を懸濁させ（ＩＸＩＯ＠／ａ＋Ｉ
）、得られた懸濁液を１００１１ずつ９６穴のマイクロ
プレートに分注し、５％炭酸ガス中、２時間培養する。

その後、前記透析した培養上清の透析内液を子牛胎児添
加ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈したものを各マイクロ
プレートに加え、５％炭酸ガス中、３７゛Ｃで７２時間
培養する。次いで培養上清を捨て、各ウエールにハンク
ス液を加えて洗浄する。ハンクス液を除去したのち２０
０μｍのエタノールを各ウェールに加え、室温で５分放
置後、エタノールを除去する６次いで、エタノールで固
定されたＬ９２９細胞を染色するため各ウェールに１０
％ギムザ液を加え、室温で１５分間放置し、水道水で洗
浄し、５０゛Ｃで乾燥する。その後、各ウェールに１０
０μｌの０．０５Ｎ−ＨＣＩを含む５０％エタノール液
を加え、細胞を染色していた色素を抽出し、６２０ｎ−
と４９ｏｎ−の吸光度を測定し、検体により誘起された
腫瘍細胞障害性因子のＬ９２９細胞に対する細胞障害性
を下式により算定する。

細胞障害性（％）＝ 体を加えたときの６２０ｎ論と４９０止の吸　度の屯検
体を加えないときの６２ｏｎ−と４９０ｎｍの吸光度の
差実施例　１ ラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０１８　（徽工研条
寄第６６５号）をロゴサの培地に接種し、３７℃で２４
時間培養した後、遠心分離操作により集菌し、蒸留水で
４回洗浄した。

洗浄済み菌体は、１００℃に２０分間加熱したのち凍結
乾燥した。

上記により得られた薗末１ｇを、２００ｍｌの５−Ｍト
リス−マレート緩衝液（ｐＨ５，８，２１ＭのＭｇＣｌ
□を含む）に懸濁させ、１０論ｇのＮ−７セチルムラミ
デースＳＧ（生化学工業製品）を加え、３７℃で１６時
間反応させた。その後、反応混合液を５０００ＸＱで２
０分間遠心分離して細胞質部分を含む沈殿を除き、上清
をさらに１８時間反応させた０次いで反応液に１０ｍｇ
のＤ　Ｎ　ａｓｅと１０輸ｇのＲＮａｓｅ　（イずれも
シグマ社製品）を加えて３７℃で１２時間反応させるこ
とにより混在する核酸を分解し、さらに１０−ｇのトリ
プシン（シグマ社製品）を加えて３７℃で１６時間反応
させることにより混在するタンパク質を分解した。得ら
れた反応混合液は、４℃で多量の蒸留水に対して透析し
、その後、透析内液を凍結乾燥して、約４００ｍｇの多
糖−ペプチドグリカン複合体を得た。

その赤外線吸収スペクトル図は第１図のとおりである。

上記多糖−ペプチドグリカン複合体について腫瘍細胞障
害性因子誘起作用を調べた結果、表１に示したように、
多糖−ペプチドグリカン複合体は１０１１ｇ／＋ｍ１以
上の濃度で腹腔マクロファージからの腫瘍細胞障害性因
子放出を誘発し、濃度５０３１ｇ／＋＊ｌで最も多くの
腫瘍細胞障害性因子を放出させた。

表１ −４．７±４．１ １００　　　　　８３．６±０．６ ５０　　　　　９３．１±０．３ １０　　　　　７０．６±０．９ 実施例　２ 実施例１と同様にして、種々の乳酸桿菌死菌体から多糖
−ペプチドグリカン複合体を製造し、それらについて、
腫瘍細胞障害性因子誘起作用を調べた。その結果を表２
に示す、なお、多糖ペプチドグリカン複合体を加えなか
った対照例の場合、細胞障害性は４．７±２．１であっ
た。

Ｌ、カゼイ　ＹＩＴ９０１８　　　　　　　６７．７±
１．ＩＬ、カゼイ　ＹＩＴＯ１２３７２，８±１．４Ｌ
、カゼイ　ＹＩＴＯ１０５７５，６±２．３Ｌ、ニーグ
ルティ　ＹＩＴＯＯ８５７３，４±２．ＯＬ、ヘルベテ
ィカスＹＩＴＯＯ８３８１，２±１．７Ｌ、サリバリウ
スＹＩＴＯ１０４７６，０±２．５

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１による多糖・ペプチドグリカン複合体
の赤外線スペクトル図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 乳酸桿菌細胞壁由来の多糖−ペプチドグリカン複合体を
   有効成分とする腫瘍細胞障害性因子誘起剤。