JPH0441596B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なNAD(P)Hオキシダーゼ及び
その用途に関する。さらに詳しくは、アルカリ側
に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシダー
ゼ、及びそれを用いて、被検液中の基質または酵
素活性を測定する方法に関する。
その用途に関する。さらに詳しくは、アルカリ側
に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシダー
ゼ、及びそれを用いて、被検液中の基質または酵
素活性を測定する方法に関する。
従来より、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド(以下NADHと略す)及び還元型ニ
コチンアミドデニンジヌクレオチドリン酸(以下
NADPHと略す)に作用して、過酸化水素を生
成するNAD(P)Hオキシダーゼについては、ア
コレプラズマ ライドラウイ(ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第120巻、
第329頁、1981年)及びバチルスメガテリウム
(ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第98
巻、第1433頁、1985年)などの微生物にその存在
が報告されている。しかし、これらの微生物から
得られた酵素はいずれも中性付近に至適PHを有し
ている。
クレオチド(以下NADHと略す)及び還元型ニ
コチンアミドデニンジヌクレオチドリン酸(以下
NADPHと略す)に作用して、過酸化水素を生
成するNAD(P)Hオキシダーゼについては、ア
コレプラズマ ライドラウイ(ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第120巻、
第329頁、1981年)及びバチルスメガテリウム
(ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、第98
巻、第1433頁、1985年)などの微生物にその存在
が報告されている。しかし、これらの微生物から
得られた酵素はいずれも中性付近に至適PHを有し
ている。
NAD及びNADPは種々の脱水素酵素の補酵素
であり、脱水素酵素の作用により生じる還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下
NADHと略す)及び還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸(以下NADPHと略
す)を定量することにより、被検液中の基質量ま
たは脱水素酵素活性を測定することが可能であ
り、その測定方法は臨床分析、食品分析などにお
いて広く用いられている。
であり、脱水素酵素の作用により生じる還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下
NADHと略す)及び還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸(以下NADPHと略
す)を定量することにより、被検液中の基質量ま
たは脱水素酵素活性を測定することが可能であ
り、その測定方法は臨床分析、食品分析などにお
いて広く用いられている。
これらのNADHまたはNADPHを定量する方
法としては、一般にNADH及びNADPHに特異
的な340nmの吸光度より測定する方法、あるい
はNADHまたはNADPHをテトラゾリウム塩と
反応させて生じたホルマザン色素を比色定量する
方法がある。しかし、340nmの吸光度より測定
する方法は、NADH及びNADPHの分子吸光係
数がさほど大きくないことから感度の点で問題が
あり、また、ホルマザン色素の生成に導く方法に
おいてはホルマザン色素が難溶性のため、色素が
沈殿したり、セルやチユーブに付着するなどの欠
点がある。
法としては、一般にNADH及びNADPHに特異
的な340nmの吸光度より測定する方法、あるい
はNADHまたはNADPHをテトラゾリウム塩と
反応させて生じたホルマザン色素を比色定量する
方法がある。しかし、340nmの吸光度より測定
する方法は、NADH及びNADPHの分子吸光係
数がさほど大きくないことから感度の点で問題が
あり、また、ホルマザン色素の生成に導く方法に
おいてはホルマザン色素が難溶性のため、色素が
沈殿したり、セルやチユーブに付着するなどの欠
点がある。
〔発明が解決しようとする問題点〕
そこで、NADH及びNADPHを酸化して過酸
化水素を生成するNAD(P)Hオキシダーゼを用
い、酸素の消費量あるいは過酸化水素の生成量を
測定することによつて、前記の二つの方法におけ
る欠点を解消した高感度な測定が可能となる。し
かしながら、脱水素酵素反応は一般に可逆反応で
あり、中性付近では平衡はNAD(P)H→NAD
(P)の方向に大きく片寄つており、このような
場合には、NAD(P)Hオキシダーゼと共役させ
て、基質または酵素活性を測定することは困難で
ある。ところが、アルカリ側では脱水素酵素反応
の平衡はNAD(P)→NAD(P)Hの方向に移
り、NAD(P)Hオキシダーゼとの共役反応が容
易になつてNAD(P)Hオキシダーゼの作用によ
る酸素の消費量あるいは過酸化水素の生成量を測
定することより高感度化も可能となる。それ故、
中性付近に至適PHを有する従来のNAD(P)Hオ
キシダーゼとは異なり、アルカリ側に至適PHを有
するNAD(P)Hオキシダーゼの開発、及び該酵
素を用いる基質または酵素活性の優れた測定方法
が強く望まれている。
化水素を生成するNAD(P)Hオキシダーゼを用
い、酸素の消費量あるいは過酸化水素の生成量を
測定することによつて、前記の二つの方法におけ
る欠点を解消した高感度な測定が可能となる。し
かしながら、脱水素酵素反応は一般に可逆反応で
あり、中性付近では平衡はNAD(P)H→NAD
(P)の方向に大きく片寄つており、このような
場合には、NAD(P)Hオキシダーゼと共役させ
て、基質または酵素活性を測定することは困難で
ある。ところが、アルカリ側では脱水素酵素反応
の平衡はNAD(P)→NAD(P)Hの方向に移
り、NAD(P)Hオキシダーゼとの共役反応が容
易になつてNAD(P)Hオキシダーゼの作用によ
る酸素の消費量あるいは過酸化水素の生成量を測
定することより高感度化も可能となる。それ故、
中性付近に至適PHを有する従来のNAD(P)Hオ
キシダーゼとは異なり、アルカリ側に至適PHを有
するNAD(P)Hオキシダーゼの開発、及び該酵
素を用いる基質または酵素活性の優れた測定方法
が強く望まれている。
従つて本発明の目的は、上記現状に鑑み、アル
カリ側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼ及び該酵素を用いた被検液中の基質または
酵素活性の高感度で簡便かつ安価な測定方法を提
供することにある。
カリ側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼ及び該酵素を用いた被検液中の基質または
酵素活性の高感度で簡便かつ安価な測定方法を提
供することにある。
本発明の第1の発明は新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼに関するものであつて、詳しくはアルカリ
側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシダー
ゼに関する。
ダーゼに関するものであつて、詳しくはアルカリ
側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシダー
ゼに関する。
また、本発明の第2の発明は新規NAD(P)H
オキシダーゼを用いた被検液中の基質または酵素
活性の測定方法に関するものであつて、詳しくは
被検液中の基質または酵素活性をNADHまたは
NADPHを生成する反応系を利用して測定する
方法において、アルカリ側に至適PHを有する新規
MAD(P)Hオキシダーゼを用いて、酵素の消
費量あるいは過酸化水素の生成量から、被検波中
の基質または酵素活性を測定する方法に関するも
のである。
オキシダーゼを用いた被検液中の基質または酵素
活性の測定方法に関するものであつて、詳しくは
被検液中の基質または酵素活性をNADHまたは
NADPHを生成する反応系を利用して測定する
方法において、アルカリ側に至適PHを有する新規
MAD(P)Hオキシダーゼを用いて、酵素の消
費量あるいは過酸化水素の生成量から、被検波中
の基質または酵素活性を測定する方法に関するも
のである。
本発明者らは、先に微生物の生産するNAD
(P)Hオキシダーゼについてスクリーニングし
た結果、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス
(Brevibacterium ammoniagenes)などの微生
物がその菌体中にアルカリ側に至適PHを有し、か
つ安定なNAD(P)Hオキシダーゼを生産するこ
とを見出し、本酵素の酵素化学的性質を検討した
(特願昭61−188824号参照)。その結果、本酵素は
アルカリ側に至適PHを有することから既に報告さ
れているNAD(P)Hオキシダーゼとは異なる
NAD(P)Hオキシダーゼ〔本明細書中新規
MAD(P)Hオキシダーゼと称する〕であると
いうことが出来る。
(P)Hオキシダーゼについてスクリーニングし
た結果、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス
(Brevibacterium ammoniagenes)などの微生
物がその菌体中にアルカリ側に至適PHを有し、か
つ安定なNAD(P)Hオキシダーゼを生産するこ
とを見出し、本酵素の酵素化学的性質を検討した
(特願昭61−188824号参照)。その結果、本酵素は
アルカリ側に至適PHを有することから既に報告さ
れているNAD(P)Hオキシダーゼとは異なる
NAD(P)Hオキシダーゼ〔本明細書中新規
MAD(P)Hオキシダーゼと称する〕であると
いうことが出来る。
本発明による新規NAD(P)Hオキシダーゼ生
産には、新規NAD(P)Hオキシダーゼ生産能を
有する菌株であれば、すべて使用することができ
るが、生産に好適な菌株の例としては、ブレビバ
クテリウム アンモニアゲネス(Brevibactrium
ammoniagenes)IAM1645、コリネバクテリウ
ム フラカムフアシエンス(Corynebacterium
flaccumfaciens)AHU1622、アースロバクター
アトロシアネウス(Arthrobacter
atrocyaneus)IAM12339、ミクロコツカス フ
ラバス(Micrococcus flavus)IFO3242、シユ
ードモナス アエルギノサ(Pseudomonas
aeruginosa)IAM1156、アクロモバクター パ
ルブラス(Achromobacter parvulus)
IFO13182、アグロバクテリウム ラジオバクタ
ー(Agrobacterium radiobacter)IFO12664、
フラボバクテリウム エステロアロマテイカム
(Flavobacterium esteroaromaticum)
IFO3751、ストレプトミセス アウレウス
(Streptmyces aureus)IAM0092が挙げられる。
産には、新規NAD(P)Hオキシダーゼ生産能を
有する菌株であれば、すべて使用することができ
るが、生産に好適な菌株の例としては、ブレビバ
クテリウム アンモニアゲネス(Brevibactrium
ammoniagenes)IAM1645、コリネバクテリウ
ム フラカムフアシエンス(Corynebacterium
flaccumfaciens)AHU1622、アースロバクター
アトロシアネウス(Arthrobacter
atrocyaneus)IAM12339、ミクロコツカス フ
ラバス(Micrococcus flavus)IFO3242、シユ
ードモナス アエルギノサ(Pseudomonas
aeruginosa)IAM1156、アクロモバクター パ
ルブラス(Achromobacter parvulus)
IFO13182、アグロバクテリウム ラジオバクタ
ー(Agrobacterium radiobacter)IFO12664、
フラボバクテリウム エステロアロマテイカム
(Flavobacterium esteroaromaticum)
IFO3751、ストレプトミセス アウレウス
(Streptmyces aureus)IAM0092が挙げられる。
上記菌株を培養するに当つて使用する培地は、
使用菌株が新規NAD(P)Hオキシダーゼを生産
するものであれば良く、窒素源としては例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイー
プリカー、硫安、塩化アンモニウムなどが挙げら
れ、炭素源としては、例えばグルコース、糖蜜、
グリセロール、シユクロース、ソルビトールなど
が使用できる。その他にリン酸塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩などの無機塩および金属塩を
加えても良く、更にはビタミン類、生長促進因子
などを加えても良い。
使用菌株が新規NAD(P)Hオキシダーゼを生産
するものであれば良く、窒素源としては例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイー
プリカー、硫安、塩化アンモニウムなどが挙げら
れ、炭素源としては、例えばグルコース、糖蜜、
グリセロール、シユクロース、ソルビトールなど
が使用できる。その他にリン酸塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩などの無機塩および金属塩を
加えても良く、更にはビタミン類、生長促進因子
などを加えても良い。
新規NAD(P)Hオキシダーゼ生産菌を培養す
るにあたり、培養温度は通常20℃〜40℃の範囲
で、好適には30℃付近で行われる。初発PHは、通
常PH6〜8の範囲で、好適にはPH7付近で行わ
れ、通常10〜30時間の通気撹拌培養によりNAD
(P)Hオキシダーゼの生産は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培養組成などに応じ、
NAD(P)Hオキシダーゼの生産量が最大になる
よう設定するのは当然である。
るにあたり、培養温度は通常20℃〜40℃の範囲
で、好適には30℃付近で行われる。初発PHは、通
常PH6〜8の範囲で、好適にはPH7付近で行わ
れ、通常10〜30時間の通気撹拌培養によりNAD
(P)Hオキシダーゼの生産は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培養組成などに応じ、
NAD(P)Hオキシダーゼの生産量が最大になる
よう設定するのは当然である。
かくして生産さた新規NAD(P)オキシダーゼ
は大部分菌体内に存在するので、培養物を固液分
離し、得られた菌体を通常用いられる超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ処理等により破壊
し、無細胞抽出液を得る。次いで、この抽出液か
ら通常用いられる精製手段により、精製酵素標品
を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、イオン交換カラムクロマトグラフイー、吸着
剤によるカラムクロマトグラフイー、ゲル過、
凍結乾燥等により精製を行い、ポリアクリルアミ
ドゲルデイスク電気泳動的に単一な新規NAD
(P)Hオキシダーゼの標品を得ることができる。
は大部分菌体内に存在するので、培養物を固液分
離し、得られた菌体を通常用いられる超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ処理等により破壊
し、無細胞抽出液を得る。次いで、この抽出液か
ら通常用いられる精製手段により、精製酵素標品
を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、イオン交換カラムクロマトグラフイー、吸着
剤によるカラムクロマトグラフイー、ゲル過、
凍結乾燥等により精製を行い、ポリアクリルアミ
ドゲルデイスク電気泳動的に単一な新規NAD
(P)Hオキシダーゼの標品を得ることができる。
本発明の新規NAD(P)Hオキシダーゼの酵素
化学的性質は次のとおりである。
化学的性質は次のとおりである。
(1) 作用:
本発明の酵素は、酵素の存在下、NADH及
びNADPHを酸化し、NADまたはNADPと過
酸化水素を生成する。本酵素は下記反応式の如
く、NADHまたはNADPH1モルと酵素1モル
からNADまたはNADP1モルと過酸化水素1
モルを生成する。
びNADPHを酸化し、NADまたはNADPと過
酸化水素を生成する。本酵素は下記反応式の如
く、NADHまたはNADPH1モルと酵素1モル
からNADまたはNADP1モルと過酸化水素1
モルを生成する。
NAD(P)H+H++O2→NAD(P)++H2O2
(2) 基質特異性:
NADH及びNADPHに作用する。
(3) 至適PH及びPH安定性:
本酵素の至適PHをプリント−ロビンソン緩衝
液を用いて測定したところ、本酵素はPH9〜10
付近に至適PHを有している(第1図)。また、
同緩衝液を用い、本酵素を各PHにおいて37℃で
60分間処理後、その残存活性を測定したとこ
ろ、PH6〜10.5の間で安定である(第3図)。
液を用いて測定したところ、本酵素はPH9〜10
付近に至適PHを有している(第1図)。また、
同緩衝液を用い、本酵素を各PHにおいて37℃で
60分間処理後、その残存活性を測定したとこ
ろ、PH6〜10.5の間で安定である(第3図)。
(4) 至適温度及び熱安定性:
本酵素の至適温度をリン酸カリウム緩衝液
(PH7.0)を用いて測定したところ、40〜50℃付
近に至適温度を有している(第2図)。また、
同緩衝液を用い、本酵素を各温度で10分間処理
後、その残存活性を測定したところ、55℃まで
安定である(第4図)。
(PH7.0)を用いて測定したところ、40〜50℃付
近に至適温度を有している(第2図)。また、
同緩衝液を用い、本酵素を各温度で10分間処理
後、その残存活性を測定したところ、55℃まで
安定である(第4図)。
(5) 分子量:
Sephadex G−200(フアルマシア製)を用い
たゲル過法で約480000であつた。
たゲル過法で約480000であつた。
なお、本酵素の活性測定は次の如く行う。
0.3Mリン酸カリウム緩衝液(PH7.0)1.0ml、6
mM NADH溶液0.1ml及び蒸留水1.9mlよりなる
反応液を予め37℃で保持後、酵素液0.1mlを加え、
37℃で反応を行い、340nmにおける吸光度の減
少を測定する。酵素活性の表示は、1分間に
1μmoleのNADHを酸化する酵素量を1単位とす
る。
mM NADH溶液0.1ml及び蒸留水1.9mlよりなる
反応液を予め37℃で保持後、酵素液0.1mlを加え、
37℃で反応を行い、340nmにおける吸光度の減
少を測定する。酵素活性の表示は、1分間に
1μmoleのNADHを酸化する酵素量を1単位とす
る。
本発明は、アルカリ側に至適PHを有する新規
NAD(P)Hオキシターゼを用いることから、脱
水素酵素反応と共役させることが用意で高感度測
定が可能である。例えば、被検液中の乳酸デヒド
ロゲナーゼ(以下LDHとも略す)活性を新規
NAD(P)Hオキシダーゼと共役させて、過酸化
水素の生成量から測定する場合、次の反応系が進
行する。
NAD(P)Hオキシターゼを用いることから、脱
水素酵素反応と共役させることが用意で高感度測
定が可能である。例えば、被検液中の乳酸デヒド
ロゲナーゼ(以下LDHとも略す)活性を新規
NAD(P)Hオキシダーゼと共役させて、過酸化
水素の生成量から測定する場合、次の反応系が進
行する。
この場合、LDH反応の平衡は中性付近では
NADH減少方向(NADH→NAD+)に片寄つて
いるので、NAD(P)Hオキシダーゼによる過酸
化水素の生産量から、LDH活性を測定すること
は困難である。ところが、アルカリ側ではLDH
反応の平衡はNADH増加方向(NAD+→
NADH)に移るので、新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼの反応が進行して、LDH活性を過酸化水
素の生成量から測定可能である。また、被検液中
の乳酸をLDH、新規NAD(P)Hオキシダーゼ
系を用いて定量する場合も、同様にアルカリ側で
は乳酸を過酸化水素の生成量としてとらえること
ができる。それ故、アルカリ側で安定でかつ反応
性に優れた新規NAD(P)Hオキシダーゼを用い
ることが高感度分析に適している。該酵素反応に
より生成した過酸化水素量は高感度比色法、蛍光
法あるいは化学発光法を用いる公知の方法で定量
が可能である。
NADH減少方向(NADH→NAD+)に片寄つて
いるので、NAD(P)Hオキシダーゼによる過酸
化水素の生産量から、LDH活性を測定すること
は困難である。ところが、アルカリ側ではLDH
反応の平衡はNADH増加方向(NAD+→
NADH)に移るので、新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼの反応が進行して、LDH活性を過酸化水
素の生成量から測定可能である。また、被検液中
の乳酸をLDH、新規NAD(P)Hオキシダーゼ
系を用いて定量する場合も、同様にアルカリ側で
は乳酸を過酸化水素の生成量としてとらえること
ができる。それ故、アルカリ側で安定でかつ反応
性に優れた新規NAD(P)Hオキシダーゼを用い
ることが高感度分析に適している。該酵素反応に
より生成した過酸化水素量は高感度比色法、蛍光
法あるいは化学発光法を用いる公知の方法で定量
が可能である。
このアルカリ側に至適PHを有する新規NAD
(P)Hオキシダーゼは溶液状態で用いことがで
きるが、ガラスビーズや多層フイルムその他種々
の担体に固定化しても使用可能である。膜に固定
化して、これを酵素電極上に装着すれば、酸素の
消費量からも被検液中の基質まは酵素活性を定量
するとができる。即ち、本発明は高感度測定法が
可能であること、アルカリ側に至適PHを有する新
規NAD(P)Hオキシダーゼが微生物より安価に
かつ大量に調製可能であること、とくにブレビバ
クテリウム属などから得られた新規NAD(P)H
オキシダーゼは酵素生産性が高く、かつ非常に安
定である、などの特長を有しており、臨床検査分
野に新規な基質または酵素活性の測定方法を提供
するものである。
(P)Hオキシダーゼは溶液状態で用いことがで
きるが、ガラスビーズや多層フイルムその他種々
の担体に固定化しても使用可能である。膜に固定
化して、これを酵素電極上に装着すれば、酸素の
消費量からも被検液中の基質まは酵素活性を定量
するとができる。即ち、本発明は高感度測定法が
可能であること、アルカリ側に至適PHを有する新
規NAD(P)Hオキシダーゼが微生物より安価に
かつ大量に調製可能であること、とくにブレビバ
クテリウム属などから得られた新規NAD(P)H
オキシダーゼは酵素生産性が高く、かつ非常に安
定である、などの特長を有しており、臨床検査分
野に新規な基質または酵素活性の測定方法を提供
するものである。
本発明に供される被検液としては、NADHま
たはNADPHを含むものであればよく、NADH
またはNADPHを予め含む被検液や酵素反応に
より生成されたNADHまたはNADPHを予め含
む被検波や酵素反応により生成されたNADHま
たはNADPHを含む被検液がある。酵素反応に
よりNADHまたはNADPHを生成する反応には、
以下に例示するものがあるが、それらの酵素活性
測定、基質または生成物の定量を行うことが可能
である。
たはNADPHを含むものであればよく、NADH
またはNADPHを予め含む被検液や酵素反応に
より生成されたNADHまたはNADPHを予め含
む被検波や酵素反応により生成されたNADHま
たはNADPHを含む被検液がある。酵素反応に
よりNADHまたはNADPHを生成する反応には、
以下に例示するものがあるが、それらの酵素活性
測定、基質または生成物の定量を行うことが可能
である。
1 アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、1) アルコール+NAD+ アルデヒド+NADH+H+ 2 アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、2) アルコール+NADP+ アルデヒド+NADPH+H+ 3 グリセロールデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、6) グリセロール+NAD+ジヒドロキシ
アセトン+NADH+H+ 4 乳酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、27) L−乳酸+NAD+ ピルビン酸+NADH+H+ 5 3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、30) D−3−ヒドロキシ酪酸+NAD+アセト
酢酸+NADH+H+ 6 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、
37) L−リンゴ酸+NAD+オキザロ酢酸+NADH
+H+ 7 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、
40) L−リンゴ酸+NADP+ピルビン酸+C
O2+NADPH+H+ 8 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、41) イソクエン酸+NAD+2−オキソグルタ
ル酸+CO2+NADH+H+ 9 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、42) イソクエン酸+NADP+2−オキソグル
タル酸+CO2+NADPH+H+ 10 グルコースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、47) β−D−グルコピラノース+NAD(P)+→D−グ
ルコノ−δ−ラクトン+NAD(P)H+H+ 11 ガラクトースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、48) D−ガラクトフラノース+NAD+D−ガラクトノ
−γ−ラクトン+NADH+H+ 12 グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、49) D−グルコース6−リン酸+NADP+ D−グルコノ−δ−ラクトン
6−リン酸+NADPH+H+ 13 3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼ(EC1、1、1、50) 3α−ヒドロキシステロイド+NAD(P)+3−
オキソステロイド+NAD(P)H+H+ 14 テストステロン17β−デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、63) テストステロン+NAD+4−アンドロステン−3
,17−ジオン+NADH+H+ 15 テストステロン17β−デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、64) テストステロン+NADP+4−アンドロステン−
3,17−ジオン+NADPH+H+ 16 ガラストースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、120) D−ガラクトフラノース+NADP+→D−ガラクト
ノ−γ−ラクトン+NADPH+H+ 17 L−フコースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、122) L−フコピラノース+NAD+→L−フコノ−1,5
−ラクトン+NADH+H+ 18 ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1、
2、1、1) ホルムアルデヒド+環元型グルタチオン+
NAD+ S−ホルミルグルタチオン+
NADH+H+ 19 ギ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、2、1、2) ギ酸+NAD+→CO2+NADH+H+ 20 アラニンデヒドロゲナーゼ(EC1、4、1、
1) L−アラニン+H2O+NADピルビン酸+
NH4 ++NADH+H+ 21 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、4、
1、2) L−グルタミン酸+H2O+NAD+2−オキソダク
タル酸+NH4 ++NADH+H+ 22 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、4、
1、3) L−グルタミン酸+H2O+NAD(P)+2−オキソク
ルタル酸+NH4 ++NAD(P)H+H+ 以上、これらは例示であり、何ら本発明の対象
を限定するものではない。
1、1) アルコール+NAD+ アルデヒド+NADH+H+ 2 アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、2) アルコール+NADP+ アルデヒド+NADPH+H+ 3 グリセロールデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、6) グリセロール+NAD+ジヒドロキシ
アセトン+NADH+H+ 4 乳酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、27) L−乳酸+NAD+ ピルビン酸+NADH+H+ 5 3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、30) D−3−ヒドロキシ酪酸+NAD+アセト
酢酸+NADH+H+ 6 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、
37) L−リンゴ酸+NAD+オキザロ酢酸+NADH
+H+ 7 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、1、
40) L−リンゴ酸+NADP+ピルビン酸+C
O2+NADPH+H+ 8 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、41) イソクエン酸+NAD+2−オキソグルタ
ル酸+CO2+NADH+H+ 9 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、42) イソクエン酸+NADP+2−オキソグル
タル酸+CO2+NADPH+H+ 10 グルコースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、47) β−D−グルコピラノース+NAD(P)+→D−グ
ルコノ−δ−ラクトン+NAD(P)H+H+ 11 ガラクトースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、48) D−ガラクトフラノース+NAD+D−ガラクトノ
−γ−ラクトン+NADH+H+ 12 グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、49) D−グルコース6−リン酸+NADP+ D−グルコノ−δ−ラクトン
6−リン酸+NADPH+H+ 13 3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼ(EC1、1、1、50) 3α−ヒドロキシステロイド+NAD(P)+3−
オキソステロイド+NAD(P)H+H+ 14 テストステロン17β−デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、63) テストステロン+NAD+4−アンドロステン−3
,17−ジオン+NADH+H+ 15 テストステロン17β−デヒドロゲナーゼ
(EC1、1、1、64) テストステロン+NADP+4−アンドロステン−
3,17−ジオン+NADPH+H+ 16 ガラストースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、120) D−ガラクトフラノース+NADP+→D−ガラクト
ノ−γ−ラクトン+NADPH+H+ 17 L−フコースデヒドロゲナーゼ(EC1、1、
1、122) L−フコピラノース+NAD+→L−フコノ−1,5
−ラクトン+NADH+H+ 18 ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1、
2、1、1) ホルムアルデヒド+環元型グルタチオン+
NAD+ S−ホルミルグルタチオン+
NADH+H+ 19 ギ酸デヒドロゲナーゼ(EC1、2、1、2) ギ酸+NAD+→CO2+NADH+H+ 20 アラニンデヒドロゲナーゼ(EC1、4、1、
1) L−アラニン+H2O+NADピルビン酸+
NH4 ++NADH+H+ 21 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、4、
1、2) L−グルタミン酸+H2O+NAD+2−オキソダク
タル酸+NH4 ++NADH+H+ 22 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1、4、
1、3) L−グルタミン酸+H2O+NAD(P)+2−オキソク
ルタル酸+NH4 ++NAD(P)H+H+ 以上、これらは例示であり、何ら本発明の対象
を限定するものではない。
本発明者らは、被検液中の基質または酵素活性
の測定方法について鋭意検討を重ねた結果、アル
カリ側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼを用いることにより、高感度で簡便かつ安
価な基質または酵素活性の測定方法を見出した。
まず、被検液中の基質を定量する場合、被検液に
その基質を酸化する脱水素酵素、NADまたは
NADP、及び新規NAD(P)Hオキシダーゼを
作用させると、反応の第1ステツプとして基質酸
化物とNADHまたはNADPHが生成される。次
に反応の第2ステツプとして、生成された
NADHまたはNADPHが酵素の存在下、新規
NAD(P)Hオキシダーゼの作用により、NAD
またはNADPと過酸化水素に変換される。一方、
被検液中の酵素活性を測定する場合も被検液にそ
の酵素反応の基質、NADまたはNADP、及び新
規NAD(P)Hオキシダーゼを作用させると上記
と同様に反応の最終生成物としてNADまたは
NADPと過酸化水素が生成される。生成した過
酸化水素の定量には公知の方法である比色法、蛍
光法、化学発光法、あるいは電極法が利用でき、
また、消費された酵素の定量には酵素電極を用い
ることができる。
の測定方法について鋭意検討を重ねた結果、アル
カリ側に至適PHを有する新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼを用いることにより、高感度で簡便かつ安
価な基質または酵素活性の測定方法を見出した。
まず、被検液中の基質を定量する場合、被検液に
その基質を酸化する脱水素酵素、NADまたは
NADP、及び新規NAD(P)Hオキシダーゼを
作用させると、反応の第1ステツプとして基質酸
化物とNADHまたはNADPHが生成される。次
に反応の第2ステツプとして、生成された
NADHまたはNADPHが酵素の存在下、新規
NAD(P)Hオキシダーゼの作用により、NAD
またはNADPと過酸化水素に変換される。一方、
被検液中の酵素活性を測定する場合も被検液にそ
の酵素反応の基質、NADまたはNADP、及び新
規NAD(P)Hオキシダーゼを作用させると上記
と同様に反応の最終生成物としてNADまたは
NADPと過酸化水素が生成される。生成した過
酸化水素の定量には公知の方法である比色法、蛍
光法、化学発光法、あるいは電極法が利用でき、
また、消費された酵素の定量には酵素電極を用い
ることができる。
過酸化水素の比色法による定量方法としては、
例えばペルオキシダーゼ系による呈色反応が挙げ
られる。この定量方法では4−アミノアンチピリ
ンとフエノールの組み合わせが一般的であるが、
さらに感度を上げるために、例えばフエノールの
代りに2,4−ジクロロフエノール、2,4−ジ
ブロムフエノール、2,6−ジクロロフエノール
などのフエノール誘導体、ジメチルアニリン、ジ
エチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシエチル)−m−トルイジン、N−エチル−N
−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−
トルイジン(以下TOOSと略す)などのアニリン
誘導体を用いることができる。一方、4−アミノ
アンチピリンの代りとしては、4−アミノフエナ
ゾンや3−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン
(MBTH)が用いられる。
例えばペルオキシダーゼ系による呈色反応が挙げ
られる。この定量方法では4−アミノアンチピリ
ンとフエノールの組み合わせが一般的であるが、
さらに感度を上げるために、例えばフエノールの
代りに2,4−ジクロロフエノール、2,4−ジ
ブロムフエノール、2,6−ジクロロフエノール
などのフエノール誘導体、ジメチルアニリン、ジ
エチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシエチル)−m−トルイジン、N−エチル−N
−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−
トルイジン(以下TOOSと略す)などのアニリン
誘導体を用いることができる。一方、4−アミノ
アンチピリンの代りとしては、4−アミノフエナ
ゾンや3−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン
(MBTH)が用いられる。
過酸化水素の蛍光法による定量方法としては、
ホモバニリン酸やp−ヒドロキシフエニル酢酸な
どを過酸化水素とペルオキシダーゼによりそれぞ
れの蛍光物質に変換して測定する方法が知られて
いる。
ホモバニリン酸やp−ヒドロキシフエニル酢酸な
どを過酸化水素とペルオキシダーゼによりそれぞ
れの蛍光物質に変換して測定する方法が知られて
いる。
さらに、過酸化水素の化学発光による定量方法
としては、ルミノール及びフエリシアン化カリウ
ムと反応させ、生じる発光を測定する方法などが
知られている。
としては、ルミノール及びフエリシアン化カリウ
ムと反応させ、生じる発光を測定する方法などが
知られている。
反応に用いられる緩衝液は特に限定されない
が、反応液中のNADまたはNADPの酸化及び共
役させるアルカリ側に至適PHを有する新規NAD
(P)Hオキシダーゼの作用が進行しやすいよう
に、アルカリ領域の緩衝液が望ましい。
が、反応液中のNADまたはNADPの酸化及び共
役させるアルカリ側に至適PHを有する新規NAD
(P)Hオキシダーゼの作用が進行しやすいよう
に、アルカリ領域の緩衝液が望ましい。
新規NAD(P)Hオキシダーゼは通常0.05〜10
単位、好ましくは0.1〜1単位用いらる。被検液
中の基質を定量する場合は、その基質を酸化する
脱水素酵素反応が律速にならないように、脱水素
酵素を充分量また、NADまたはNADPを少なく
とも被検液中の基質のモル量以上用いればよい。
一方、被検液中の酵素活性を測定する場合は、そ
の酵素反応の基質とNADまたはNADPをその酵
素反応が律速にならない量以上用いる必要があ
る。また、通常、反応温度は20〜40℃、反応時間
は1〜30分間で行われる。
単位、好ましくは0.1〜1単位用いらる。被検液
中の基質を定量する場合は、その基質を酸化する
脱水素酵素反応が律速にならないように、脱水素
酵素を充分量また、NADまたはNADPを少なく
とも被検液中の基質のモル量以上用いればよい。
一方、被検液中の酵素活性を測定する場合は、そ
の酵素反応の基質とNADまたはNADPをその酵
素反応が律速にならない量以上用いる必要があ
る。また、通常、反応温度は20〜40℃、反応時間
は1〜30分間で行われる。
以下に本発明を、実施例をもつて説明するが、
本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるも
のではない。
本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるも
のではない。
実施例 1
新規NAD(P)Hオキシダーゼの製造
グルコース1.0%、肉エキス1.0%、ペプトン1.0
%、KH2PO40.1%、MgSO4・7H2O0.05%、PH
7.0からなる培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間殺菌後、ブレビバクテリ
ウム アンモニアゲネスIAM1645に接種し、30
℃で24時間振とう培養したものを種培養液とし
た。
%、KH2PO40.1%、MgSO4・7H2O0.05%、PH
7.0からなる培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間殺菌後、ブレビバクテリ
ウム アンモニアゲネスIAM1645に接種し、30
℃で24時間振とう培養したものを種培養液とし
た。
同組成培地500mlを2容三角フラスコに分注
し、120℃で15分間殺菌後、前記種培養液を20ml
接種し、30℃で15時間振とう培養した。培養終了
後、遠心分離により固液分離を行い培養液5よ
り湿菌体68gを得た。この菌体を30mMリン酸カ
リウム緩衝液(PH7.0)150mlに懸濁後、超音波処
理により菌体を破壊し、遠心分離して得られた上
澄を粗酵素液とした。この粗酵素を10mMグリシ
ン−NaOH緩衝液(PH9.0)で透析後、予め同緩
衝液で緩衝化したDEAE−セフアロース(CL−
6B)(フアルマシア製)のカラムに通したとこ
ろ、活性は通過液に認められた。次にこの通過液
のPHをNaOHにより10.0に調整後、予め10mMグ
リシン−NaOH緩衝液(PH10.0)で緩衝化したL
−セフアロース(FF)(フアルマシア製)のカラ
ムに通したところ新規NAD(P)Hオキシダーゼ
は吸着した。そこで10mM〜1.0MのNaClの直線
濃度勾配により溶出を行い、活性画分を集め、コ
ロジオンバツグで濃縮後、100mMリン酸カリウ
ム緩衝液(PH7.0)で平衡化したセフアクリルS
−300(フアルマシア製)のカラムでゲル過を行
い、活性画分を回収し、新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼ50mgを得た。この比活性は2.1単位/mgで
あり、粗酵素液からの収率42%であつた。
し、120℃で15分間殺菌後、前記種培養液を20ml
接種し、30℃で15時間振とう培養した。培養終了
後、遠心分離により固液分離を行い培養液5よ
り湿菌体68gを得た。この菌体を30mMリン酸カ
リウム緩衝液(PH7.0)150mlに懸濁後、超音波処
理により菌体を破壊し、遠心分離して得られた上
澄を粗酵素液とした。この粗酵素を10mMグリシ
ン−NaOH緩衝液(PH9.0)で透析後、予め同緩
衝液で緩衝化したDEAE−セフアロース(CL−
6B)(フアルマシア製)のカラムに通したとこ
ろ、活性は通過液に認められた。次にこの通過液
のPHをNaOHにより10.0に調整後、予め10mMグ
リシン−NaOH緩衝液(PH10.0)で緩衝化したL
−セフアロース(FF)(フアルマシア製)のカラ
ムに通したところ新規NAD(P)Hオキシダーゼ
は吸着した。そこで10mM〜1.0MのNaClの直線
濃度勾配により溶出を行い、活性画分を集め、コ
ロジオンバツグで濃縮後、100mMリン酸カリウ
ム緩衝液(PH7.0)で平衡化したセフアクリルS
−300(フアルマシア製)のカラムでゲル過を行
い、活性画分を回収し、新規NAD(P)Hオキシ
ダーゼ50mgを得た。この比活性は2.1単位/mgで
あり、粗酵素液からの収率42%であつた。
実施例 2
NADHの定量
試薬組成
P−1液
トリス−塩酸緩衝液(PH9.0) 50mM
新規NADHオキシダーゼ 0.25単位/ml
R−2液
リン酸緩衝液(PH6.0) 500mM
4−アミノアンチピリン 2.4mM
TOOS 2.4mM
ペルオキシダーゼ(西洋ワサビ由来、シグマ社
製) 24U/ml 5、10、15及び20mMのNADH溶液10μをR
−1液2mlにそれぞれ添加後、37℃で5分間反応
した。次いでR−2液1mlを加え、550nmの吸
光度を測定した。その結果、第5図に示すよう
に、添加したNADH量と550nmの吸光度の増加
量には良好な直線関係が得られた。
製) 24U/ml 5、10、15及び20mMのNADH溶液10μをR
−1液2mlにそれぞれ添加後、37℃で5分間反応
した。次いでR−2液1mlを加え、550nmの吸
光度を測定した。その結果、第5図に示すよう
に、添加したNADH量と550nmの吸光度の増加
量には良好な直線関係が得られた。
実施例 3
コール酸ナトリウムの定量
試薬組成
R−1液
トリス−塩酸緩衝液(PH9.0) 50mM
NAD 1mM
3α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ(シ
ユードモナス テストステロニ由来、宝酒造社
製) 0.4単位/ml 新規NAD(P)Hオキシダーゼ 0.8単位/ml P−2液 リン酸緩衝液(PH6.0) 500mM 4−アミノアンチピリン 2.4mM TOOS 2.4mM ペルオキシダーゼ(西洋ワサビ由来、シグマ社
製) 24U/ml 2、4、6、8及び10mMのコール酸ナトリウ
ム溶液10μをR−1液2mlにそれぞれ添加後、
37℃で5分間反応した。次いでR−2液1mlを加
え、550nmの吸光度を測定した。その結果、第
6図に示すように添加したコール酸ナトリウム量
と550nmの吸光度の増加量には良好な直線関係
が得られた。
ユードモナス テストステロニ由来、宝酒造社
製) 0.4単位/ml 新規NAD(P)Hオキシダーゼ 0.8単位/ml P−2液 リン酸緩衝液(PH6.0) 500mM 4−アミノアンチピリン 2.4mM TOOS 2.4mM ペルオキシダーゼ(西洋ワサビ由来、シグマ社
製) 24U/ml 2、4、6、8及び10mMのコール酸ナトリウ
ム溶液10μをR−1液2mlにそれぞれ添加後、
37℃で5分間反応した。次いでR−2液1mlを加
え、550nmの吸光度を測定した。その結果、第
6図に示すように添加したコール酸ナトリウム量
と550nmの吸光度の増加量には良好な直線関係
が得られた。
実施例 4
コール酸ナトリムウの定量
試薬組成
R−1液
トリス−塩酸緩衝液(PH9.0) 50mM
NAD 1mM
3α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ(シ
ユードモナス テストステロニ由来、宝酒造社
製) 0.4単位/ml 新規NAD(P)Hオキシダーゼ 0.8単位/ml クラーク型酸素電極を装着した密閉セルにR−
1液1.4mlを入れ、37℃で5分間予備加温して電
極を安定させた。次いで2、4、6、8及び10m
Mのコール酸ナトリウム溶液10μを添加し、酸
素消費量を測定した。その結果、添加したコール
酸ナトリウム量と酵素消費量には良好な直線関係
が得られた。
ユードモナス テストステロニ由来、宝酒造社
製) 0.4単位/ml 新規NAD(P)Hオキシダーゼ 0.8単位/ml クラーク型酸素電極を装着した密閉セルにR−
1液1.4mlを入れ、37℃で5分間予備加温して電
極を安定させた。次いで2、4、6、8及び10m
Mのコール酸ナトリウム溶液10μを添加し、酸
素消費量を測定した。その結果、添加したコール
酸ナトリウム量と酵素消費量には良好な直線関係
が得られた。
また、アセチルセルロース膜に新規NAD(P)
Hオキシダーゼを固定化し、上記酸素電極に装着
した酵素電極を用いて同様の実験を行つたとこ
ろ、同じく良好な結果を得た。
Hオキシダーゼを固定化し、上記酸素電極に装着
した酵素電極を用いて同様の実験を行つたとこ
ろ、同じく良好な結果を得た。
実施例 5
乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定
試薬組成
R−1液
グリシン−NaOH緩衝液(PH9.5) 50mM
L−乳酸ナトリウム 30mM
NAD 1mM
新規NAD(P)Hオキシダーゼ 0.8単位/ml
R−2液
リン酸緩衝液(PH6.0) 500mM
4−アミノアンチピリン 2.4mM
TOOS 2.4mM
ペルオキシダーゼ(西洋ワサビ由来、シグマ社
製) 24U/ml 0.5、1.0、1.5、2.0及び2.5単位/mlの乳酸デヒ
ドロゲナーゼ溶液10μをR−1液2mlにそれぞ
れ添加後、37℃で5分間反応した。次いで反応停
止後、R2液1mlを加え、550nmの吸光度を測定
した。その結果、乳酸デヒドロゲナーゼ量と
550nmの吸光度の増加量には良好な直接関係が
得られた。
製) 24U/ml 0.5、1.0、1.5、2.0及び2.5単位/mlの乳酸デヒ
ドロゲナーゼ溶液10μをR−1液2mlにそれぞ
れ添加後、37℃で5分間反応した。次いで反応停
止後、R2液1mlを加え、550nmの吸光度を測定
した。その結果、乳酸デヒドロゲナーゼ量と
550nmの吸光度の増加量には良好な直接関係が
得られた。
以上、詳細に説明したように、本発明の定量方
法によれば被検液中の基質または酵素活性を高感
度かつ特異的に定量することができる。また、本
発明の新規NAD(P)Hオキシダーゼは微生物よ
り安価に調製することが可能であり、臨床検査試
薬として優れた効果を有する。
法によれば被検液中の基質または酵素活性を高感
度かつ特異的に定量することができる。また、本
発明の新規NAD(P)Hオキシダーゼは微生物よ
り安価に調製することが可能であり、臨床検査試
薬として優れた効果を有する。
第1図は、本発明の新規NAD(P)Hオキシダ
ーゼの活性とPHの関係を示すグラフ、第2図は本
酵素の活性と温度の関係を示すグラフ、第3図は
本酵素のPH安定領域を示すグラフ、第4図は本酵
素の熱安定性を示すグラフである。また、第5図
は本発明の定量方法の実施例2における検量線を
NADH量と550nmの吸光度との関係で示したグ
ラフ、第6図は本発明の定量方法の実施例3にお
ける検量線をコール酸ナトリウム量と550nmの
吸光度との関係で示したグラフである。
ーゼの活性とPHの関係を示すグラフ、第2図は本
酵素の活性と温度の関係を示すグラフ、第3図は
本酵素のPH安定領域を示すグラフ、第4図は本酵
素の熱安定性を示すグラフである。また、第5図
は本発明の定量方法の実施例2における検量線を
NADH量と550nmの吸光度との関係で示したグ
ラフ、第6図は本発明の定量方法の実施例3にお
ける検量線をコール酸ナトリウム量と550nmの
吸光度との関係で示したグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 次の酵素化学的性質を有する新規NAD(P)
Hオキシダーゼ、 (1) 作用:酸素の存在下、NADH及びNADPH
を酸化して、NADまたはNADPと過酸化水素
を生成する。 NAD(P)H+H++O2 →NAD(P)++H2O2 (2) 基質特異性:NADH及びNADPHに作用す
る。 (3) 至適PH及びPH安定性:至適PHが9〜10付近で
あり、37℃、60分間処理ではPH6〜10.5の間で
安定である。 (4) 至適温度及び熱安定性:至適温度が40〜50℃
付近であり、PH7.0、10分間処理では55℃まで
安定である。 (5) 分子量:約480000(Sephadex G−200を用い
たゲル濾過法)。 2 被検液中の基質または酵素活性をNADHま
たはNADPHを生成する反応系を利用して測定
する方法において、下記酵素化学的性質を有する
新規NAD(P)Hオキシダーゼを用いて、酸素の
消費量あるいは過酸化水素の生成量から、被検液
中の基質または酵素活性を測定することを特徴と
する基質または酵素活性の測定方法。 (1) 作用:酸素の存在下、NADH及びNADPH
を酸化して、NADまたはNADPと過酸化水素
を生成する。 NAD(P)H+H++O2→NAD(P)++H2O2 (2) 基質特異性:NADH及びNADPHに作用す
る。 (3) 至適PH及びPH安定性:至適PHが9〜10付近で
あり、37℃、60分間処理ではPH6〜10.5の間で
安定である。 (4) 至適温度及び熱安定性:至適温度が40〜50℃
付近であり、PH7.0、10分間処理では55℃まで
安定である。 (5) 分子量:約480000(Sephadex G−200を用い
たゲル濾過法)。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61283240A JPS63137675A (ja) | 1986-11-28 | 1986-11-28 | 新規nad(p)hオキシダ−ゼ及びその用途 |
DE3725851A DE3725851A1 (de) | 1986-08-12 | 1987-08-04 | Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung |
US07/083,921 US4954445A (en) | 1986-08-12 | 1987-08-11 | Novel NAD(P)H oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61283240A JPS63137675A (ja) | 1986-11-28 | 1986-11-28 | 新規nad(p)hオキシダ−ゼ及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63137675A JPS63137675A (ja) | 1988-06-09 |
JPH0441596B2 true JPH0441596B2 (ja) | 1992-07-08 |
Family
ID=17662905
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61283240A Granted JPS63137675A (ja) | 1986-08-12 | 1986-11-28 | 新規nad(p)hオキシダ−ゼ及びその用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63137675A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4963209B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-06-27 | 学校法人慶應義塾 | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ |
-
1986
- 1986-11-28 JP JP61283240A patent/JPS63137675A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS63137675A (ja) | 1988-06-09 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |