DE3750421T2

DE3750421T2 - Lebensfähige Zelle-Markierung.

Info

Publication number: DE3750421T2
Application number: DE3750421T
Authority: DE
Inventors: Paul Karl Horan; Bruce David Jensen; Sue Ellen Slezak
Original assignee: Zynaxis Inc
Current assignee: ZYNAXIS Inc MALVERN PA US
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1987-10-29
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2007-10-30
Also published as: JPH0737978B2; JPS63122954A; DK175074B1; CA1311685C; CN1014547B; US4783401A; PT86028A; CN87107216A; PH23564A; AU8040387A; DK570387D0; KR970000783B1; AU606894B2; DK570387A; IE872872L; IL84278A0; IL84278A; DE3750421D1; PT86028B; EP0266194A2

Description

Die Erfindung betrifft neue Verfahren, welche die Markierung von lebensfähigen Zellen gestatten, ohne gleichzeitig die Zellmorphologie oder -funktionen negativ zu beeinflussen.
Überall in der Immunologie und der Zellbiologie werden Fluoreszenznachweisverfahren als analytische Hilfsmittel eingesetzt, um spezifische Eigenschaften von vielen Zellen zu bestimmen. Der Vorteil der Fluoreszenzmessungen liegt darin, daß ein einzelnes Farbmolekül mehrere tausendmal pro Sekunde angeregt werden und in den Grundzustand zurückkehren kann, wobei genauso viele Photonen als Licht emittiert werden. Wird daher ein einzelnes Antikörpermolekül mit zwei oder drei Farbstoffmolekülen markiert, können mehrere Tausend Lichtphotonen pro Bindungsstelle von Antigen und Antikörper erhalten werden. Dieses stellt ein Verfahren mit einer enormen Signalverstärkung dar.
Der Einsatz von Dioxacarbocyaninfarbstoffen erlaubte die Bestimmung von Unterschieden bei weißen Blutkörperchen (Gunter Valet, Max Planck Ges. Wissensch.: EP- A-0 106 339; Simultaneous Quantitative Determination of Blood Cells by Selective Staining and Measuring Volume and Fluoreszenz). Die in diesen Studien eingesetzten Farbstoffe sind jedoch kurzkettige Carbocyaninfarbstoffe (weniger als 10) und reagieren auf Veränderungen von Membranpotentialen. Darüber hinaus dringen diese Farbstoffe in die Mitochondrien der Zelle ein, und sind cytotoxisch; außerdem laufen die Farbstoffe beim Waschen der Zellen leicht aus diesen aus, unabhängig davon, ob sich das Membranpotential verändert oder nicht. Die erfindungsgemäßen, langkettigen Farbstoffe sind nicht auf Zellmembranen beschränkt und werden durch das Membranpotential nur äußerst geringfügig beeinflußt. Sie laufen nicht aus der Zelle aus.
Andere zum Erhalt von Unterschieden bei weißen Blutkörperchen verwendete Farbstofftypen sind keine Cyanine und verteilen sich nicht in Lipiden. Pyrylium- sowie Thiapyryliumverbindungen sind zur Unterscheidung von Klassen weißer Blutkörperchen verwendet worden (David S., Frank R.T., Belly, US-A-4 555 396 und 4 840 784; Distinguishing Cells in Biological Samples by Staining with Pyrylium or Thiapyrylium Compounds). Diese Färbemittel binden jedoch an cytoplasmatische Elemente sowie an solche des Zellkerns; sie binden nicht spezifisch an die Zellmembranen. Andere kationische Farbstoffe sind zur Ermittlung von Unterschieden bei weißen Blutkörperchen verwendet worden (L.Kass US-A-4 581 223, Determination of Different Leucocyte Categories by Staining with Meta:Chromatic Cationic Dyes, L.Kass, US-A-4 400 370, 23.August 1983, Metachromic Dye Sorption Means for Differential Determination of Leucocytes, L.Kass US-A-4 500 509, Analysis of Human Blood Cells by Staining Uni fixed Cells with Specific Basic Dyes); diese Farbstoffe verteilen sich jedoch nicht in signifikantem Maße in den Membranlipiden, farben aber verschiedene Organellen in der Zelle. Ein anderer zur Bestimmung von Unterschieden bei weißen Blutkörperchen verwendeter metachromer Farbstoff ist Acridinorange (P.J.Natale, US-A-4 336 029, 22 Juni 1982, Method and Reagents For Quantitative Determination of Reticulocytes and Platelets in Whole Blood, R.J.Gershman US-A-4 325 706, 20 April 1982, Automated Detection of Platelets and Reticulocytes in Whole Blood). Acridinorange färbt die RNA und die DNA einer Zelle und verteilt sich nicht signifikant in Membranlipiden.
Gemäß einer weiteren Anmeldung wird Merocyanin 540 eingesetzt, um normale von malignen Zellen zu unterscheiden. Dieser Farbstoff besitzt einen langen Kohlenwasserstoffschwanz von bis zu 15 Kohlenstoffatomen, weist jedoch gleichzeitig eine hydrophile Gruppe am Ende des Kohlenwasserstoffschwanzes auf; bei Exposition der Zelle an Licht ist er cytotoxisch (Valinsky J.E., Reich E. und Easton T.G., US-A-4 424 201, 3 Januar 1984, Employment of a Merocyanin Dye for the Detection of Malignant Leucocytic Cells). Merocyanin wird auf charakteristische Weise in die Membranen von normalen und malignen Zellen eingebaut.
Cyaninfarbstoffe mit kurzen aliphatischen Ketten werden in einer Reihe biologischer Tests verwendet. Diese Moleküle mit kurzen aliphatischen Ketten reagieren jedoch auf Membranpotentiale, gehen durch die Zellmembran hindurch und dringen in die Mitochondrien der Zelle ein (H.M.Shapiro, US-A-4 343 782, 10 August 1982). Die kurzkettigen Cyaninfarbstoffe sind außerdem toxisch für die Zellen und können nicht zum Verfolgen von Zellen verwendet werden, da sie schnell aus der Zelle auslaufen.
Tricarbocyaninfarbstoffe (Fox I.J. et al, Proc. Mayo Clinic 32, S. 478-484, 1957) und der Farbstoff Evans-blue (Schad H. et al., Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol. 370 (2), S. 139-144, 1977) sind in vivo verwendet worden, um über ein Verdünnungsverfahren die Herzleistung abzuschätzen. Dow (Dow P., Physiol.Rev. 36, S. 77-102, 1956) beschreibt ein Verfahren, bei dem eine bekannte Menge eines bestimmten Indikators auf der venösen Lungenseite injiziert und anschließend der zeitliche Verlauf der arteriellen Indikatorkonzentration gemessen wird, um das Volumen zwischen den Punkten der Injektion und der Probeentnahme zu bestimmen. Diese Farbstoffe werden nicht zum Färben von Zellen verwendet.
Derivate von Fluorescein und Rhodamin mit langen aliphatischen Ketten sind zur Beobachtung der Zellfusion verwendet worden (Wanda P.E., Smith J.D., J.Histochem.Cytochem. 30, S. 1297-1300, 1982). Diese Farbstoffe enthalten jedoch lediglich eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette und sind in der Membran über einen längeren Zeitraum nicht stabil. Außerdem beruht das Nachweisverfahren der Heterokaryonbildung auf der Resonanzenergieübertragung zwischen zwei Farbstoffmolekülen. Weiterhin wurde die Färbung in einer Kochsalzlösung ausgeführt, wobei keine Erklärungen bezüglich der Löslichkeit abgegeben wurden.
Biophysiker haben dialiphatische Cyaninfarbstoffe mit langen Ketten gemäß ihrer hauptsächlichen Anwendung dazu eingesetzt, die Fluidität der Zellmembran zu untersuchen (D.Axelrod, Biophysical.J. 26, S. 557-574, 1979). Bei diesen Untersuchungen wird der Farbstoff aus einer ethanolischen Stammlösung auf Zellen in einer auf kurze Dauer angelegten Zellkultur angewandt. Zahlreiche Forscher haben berichtet, daß die Variationsbreite der Anfärbung sehr groß sei. Für biophysikalische Messungen reicht es jedoch aus, nur einige, wenige Zellen zu beobachten, wobei jede untersuchte Zelle mehrmals vermessen wird. Weiterhin sind langkettige Cyaninfarbstoffe, die in die Plasmamembran inkorporiert werden, dazu verwendet worden, die ursprüngliche Identität von Neuronen in Zellkulturen zu bestimmen (Honig M.G., Hume R.I., J.Cell Biology 103, S. 171-187, 1986). In den obigen Literaturzitaten findet sich jedoch kein einheitliches Verfahren zum Färben von lebensfähigen Zellen, ohne gleichzeitig die Zellmorphologie oder -funktion zu beeinträchtigen.
In Chemical Abstracts, Bd. 104, Nr. 5, 1986, Abstract Nr. 30657c (A.Juarrez et al., "A micellar model for the disaggregating effect of detergents on phthalocyanine dyes") ist offenbart, daß Detergenzien die Disaggregation von Phthalocyaninfarbstoffen fördern, wodurch sie die Färbwirkung dieser Farbstoffe in vitro verbessern. In Chemical Abstracts, Bd. 101, Nr.21, 1984, Abstrakt Nr.187282n, K.M.Kirpichnikova et al., "Spectrophotometric study of intact and trypsin-treated erythrocyte membranes stained with a phthalocyanine dye") wird die Verwendung eines Phthalocyaninpigments als ein bildverstärkender Farbstoff bei einem Versuch, in vitro den Zustand der Oberflächenmembran von Erythrozyten zu untersuchen, offenbart, wobei ein isotoner Phosphatpuffer verwendet wird, um eine ungleichmäßige Sorption des Farbstoffes auf einer Zelloberfläche zu erreichen. US-A-4 232 121 (Gilman et al., 4. November 1980) offenbart ein Verfahren zur Selektion von Methinfarbstoffen, welche spezifisch zur Inhibition des Zellwachstums verwendet werden, wobei ein Kompromiß in bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen geschlossen wird.
Gegenstand der Erfindung sind neue Verfahren, welche die gleichmäßige und reproduzierbare Markierung von lebensfähigen Zellen ermöglichen, ohne die Zellmorphologie und -funktion wesentlich zu beeinträchtigen. Erfindungsgemäß werden die Zellen mit einem Cyaninfarbstoff markiert, welcher ausreichend lipidlöslich ist und einen ausreichend hohen Zellmembran-Verteilungskoeffizienten aufweist, um die Abwanderung der Farbstoffmoleküle von der Zellmembran zu minimieren oder zu verhindern. Die gleichmäßige und reproduzierbare Markierung wird erreicht, indem man den Farbstoff zu in einem Medium suspendierten Zellen hinzufügt, wobei das Medium einen Osmolaritätsregulator enthält, der die Lebensfähigkeit der Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt, und der Farbstoff im Medium löslich ist. Solche Osmolaritätsregulatoren umfassen Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren sowie bestimmte Puffer für Wasserstoffionen ("Good-Puffer").
Die Erfindung schließt demnach ein Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 15 und eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 ein.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Markierung verschiedener Zellen, ohne die Zellmorphologie oder -funktion nachteilig zu beeinflussen, werden Cyaninfarbstoffe verwendet. In der Beschreibung werden Verbindung mit der folgenden Struktur als Cyaninfarbstoffe bezeichnet:
in der
Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder ein alkylsubstituiertes Methylen darstellt und
m eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 und
n eine ganze Zahl zwischen 12 und 22 bedeuten.
Dabei sind mit alkylsubstituiertem Methylen mono- oder disubstituiertes Methylen mit jeder beliebigen Kombination von Methyl-, Ethyl- oder Propylsubstituenten gemeint.
Eine unter die obige Formel fallende Gruppe von Verbindungen besteht aus solchen, in denen Y Schwefel darstellt und m 2 und n 14 bedeuten oder in denen Y Sauerstoff ist und m 1 und n 14 bedeuten.
Verbindungen der obigen Struktur werden auch mit der folgenden allgemein bekannten Kurzformel:
DiYCn(2m + 1)
bezeichnet (Sims P. et al., Biochem. 13, S. 3315, 1974). So wird zum Beispiel die Verbindung, in der Y Schwefel darstellt und die eine Brücke aus drei Kohlenstoffatomen zwischen den Ringen sowie zwei aliphatische Kohlenstoffketten mit 14 C- Atomen aufweist, als DiSC&sub1;&sub4;(3) bezeichnet. Gleichermaßen bezeichnet DiIC&sub1;&sub4;(5) eine Verbindung, in der Y Isopropyl bedeutet und die fünf Kohlenstoffatome als Brücke zwischen den Ringen sowie zwei aliphatische C&sub1;&sub4;-Ketten aufweist.
Eingeschlossen in die hier als Cyaninfarbstoffe bezeichneten Verbindungen sind Verbindungen der obigen Formel mit einem oder mehreren Substituenten mit der Maßgabe, daß die substituierten Verbindungen zumindest solange, wie zum Markieren erforderlich, in dem Zellmarkierungsmedium löslich sind und daß sie einen ausreichend hohen Zellmembran-Verteilungskoeffizienten aufweisen, um mit der markierten Membran assoziiert zu bleiben. Diese Verbindungen dürfen darüber hinaus in den zur Markierung benötigten Konzentrationen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht wesentlich beeinträchtigen. Die Löslichkeit im Zellmarkierungsmedium wird, wie nachstehend beschrieben, bestimmt, indem man den Cyaninfarbstoff im Markierungsmedium dispergiert und über spektrofluorometrische Standardverfahren die zelluläre Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit mißt. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigt dabei ein Ausfallen des Farbstoffes sowie dessen Anhaften an die Gefäßwandungen an. Ob der Farbstoff mit der Zellmembran assoziiert verbleibt, wird beispielsweise unter Verwendung bekannter durchflußcytometrischer Verfahren zur Beobachtung der Fluoreszenzintensität von roten Blutkörperchen, welche nach der Markierung wieder in das Spendertier injiziert werden, bestimmt. Eine im wesentlichen konstante Fluoreszenzintensität der markierten Zellen nach der Reinjektion beweist die Stabilität des Farbstoffes in den Zellmembranen.
Ebenfalls in die hier als Cyaninfarbstoffen bezeichneten Verbindungen sind Verbindungen der obigen Struktur eingeschlossen, welche ein mittels des Kernresonanz-Imaging nachweisbares Atom enthalten. Solche Verbindungen werden beispielsweise durch Einbringen eines Fluoratoms in eine der Methylgruppen der aliphatischen Ketten hergestellt. Verbindungen der obigen Struktur, die mit einem γ-Strahler wie ¹²&sup5;I markiert sind, fallen ebenfalls unter die hier genannten Cyaninfarbstoffe.
Die erfindungsgemäß verwendeten Cyaninfarbstoffe können aus verschiedenen Quellen bezogen werden, wie z. B. Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, und können aus verschiedenen zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterialien mittel an sich bekannter Syntheseverfahren hergestellt werden (Hamer F.M., The Cyanine Dyes and Related Compounds, Interscience Publishers, 1964).
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann jede lebensfähige Zelle mit Cyaninfarbstoffen markiert werden. Der Ausdruck Zelle, wie er hier benutzt wird, umfaßt prokaryontische Zellen wie Bakterien, kernhaltige, eukaryontische Zellen wie weiße Blutkörperchen, verschiedene Tumorzellen, Säugerzellen in Zellkultur, z. B. Ovarienzellen vom chinesischen Hamster (CHO-Zellen), Hefen sowie kernlose Zellen wie rote Blutkörperchen und Blutplättchen. Eine kernhaltige Zelle ist lebensfähig, wenn sie in der Lage ist, zu wachsen oder im wesentlichen so zu funktionieren, wie es von diesem Zelltyp erwartet wird. Eine kernlose Zelle ist lebensfähig, wenn sie ihre zu erwartenden Funktionen erfüllen kann, beispielsweise kann ein lebensfähiges rotes Blutkörperchen Sauerstoff und Kohlendoxid transportieren und lebensfähige Plättchen können sich z. B. in Tests zur Aggregation oder Freisetzung erwartungsgemäß verhalten.
Die Zellmarkierung wird in einem für die Zellen nichtletalen Medium durchgeführt, welches die reproduzierbare Markierung von Zellen gestattet. Um dem Medium die erforderlichen Eigenschaften zu verleihen, werden Osmolaritätsregulatoren verwendet, in welchen die Cyaninfarbstoffe stabile Lösungen über mindestens die zur Markierung benötigte Zeit bilden. Geeignete Osmolaritätsregulatoren umfassen Mittel oder Kombinationen von Mitteln wie Zucker, z. B. Monosaccharide wie Glucose, Fructose, Sorbose, Xylose, Ribose und Disaccharide wie Saccharose, Zuckeralkohole wie Mannit, Glycerin, Inosit, Xylit und Ribit, Aminosäure wie Glycin und Arginin sowie bestimmte Good's-Puffer wie N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-3-aminopropansulfonsäure und die in der untenstehenden Tabelle II genannten Puffer (Good N.E. et al., Biochem. 15, S. 467-477, (1966); Good N.E. und S.Izawa, Methods Enzymol. 24, Teil B 53 (1968); Feguson W.J. et al., Anal.Biochem. 104, S. 301-310, 1980). Einige Zellinien können jedoch gegenüber einem oder mehreren der Osmolaritätsregulatoren, insbesondere gegenüber den Zuckeralkoholen, empfindlich sein. Deswegen werden vor dem Markieren Standardtests durchgeführt, um sicherzugehen, daß die Zellen in dem beabsichtigten Osmolaritätsregulator lebensfähig sind. Zusätzlich können dem Markierungsmedium zum Einstellen der Wasserstoffionenkonzentration kleinere Mengen an Puffersubstanzen zugesetzt werden.
Die Wirkung der Exposition an eine Reihe von Osmolariotätsregulatoren auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die Messung der Verdopplungszeit von Yac- Zellen bestimmt, nachdem diese Zellen 30 Minuten lang einer Reihe von Osmolaritätsregulatoren ausgesetzt worden waren. Yac-Zellen sind Zellen einer Zellkulturlinie aus Mäuse-Lymphomgewebe, welche von der Amerikanischen Zellkultursammlung frei zu beziehen und von Kiessling R. beschrieben in European J.Immunology 5, S. 112-117, 1975 ist. Wie die Daten aus Tabelle I belegen, führte das Aussetzen an Saccharose und Glucose sowie die Good's-Puffer TAPS, CAPS, EPPS, HEPPSO und DIPSO im Vergleich mit phosphatgepufferten Kochsalzlösungen nur zu vernachlässigbar geringen Auswirkungen auf die Verdopplungszeit der Zellen, was das Fehlen einer auf die Exposition zurückzuführenden zellulären Toxizität belegt.

Tabelle 1

Osmolaritätsregulator Verdopplungszeit (Stunden)
phosphatgepufferte Kochsalzlösung 31,0
Saccharose 41,0
Glucose 34,5
TAPS 32,7
CAPS 45,8
EPPS 32,2
HEPPSO 23,4
DIPSO 36,7
3-Amino-1-propansulfonsäure 99,6
Natrium-3-(N-morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) A
2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol B
2-Amino-2-methyl-1-propanol B
N-Tris-(hydroxymethyl)-methylaminoethansulfonsäure (TES) B
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES) A
3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1- propansulfonsäure (CAPSO) A
Triethanolamin B
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIZMA) B
Bis-tris-propan B
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES) B
3-[Dimethyl-(hydroxymethyl)-methylamino]- 2-hydroxypropansulfonsäure (AMPSO) A
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-glycin (BICINE) 57,7
3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]- 1-propansulfonsäure (CHAPS) B
3-[N-Tris-(hydroxymethyl)-methylamino]- 2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO) 63,6
Osmolaritätsregulator Verdopplungszeit (Stunden)
3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure (MOPSO) 178,4
2-[(2-Amino-2-oxoethyl)-amino]-ethansulfonsäure (ACES) 1038,4
Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris- (hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS) A
2-(N-Cyclohexylamino)-ethansulfonsäure (CHES) 51,5
N-Tris-(hydroxymethyl)-methylglycin (TRICINE) A
Glucosamin 288,4
Imidazol B
Glycylglycin 66,9
A kein Wachstum oder teilweise cytotoxisch
B Akut cytotoxisch
Tabelle II zeigt verschiedene Osmolaritätsregulatoren, die auf die Löslichkeit von Cyaninfarbstoffen hin getestet wurden. Alle Konzentrationsmessungen wurden nach der Entfernung von Niederschlägen mittels Zentrifugation und durch Auflösen eines kleinen Aliquots des den Cyaninfarbstoff enthaltenden Osmolaritätsregulators in Ethanol zur spektrofluorimetrischen Analyse durchgeführt. Die verwendeten Farbstoffe waren DiSC&sub1;&sub4;(5) und DiOC&sub1;&sub4;(3); die Osmolaritätsregulatoren wurden in isoosmotischen Konzentrationen eingesetzt. Verringerungen der Fluoreszenzintensität im Vergleich mit der Ethanolstandardlösung korrelieren direkt mit der Verringerung der Löslichkeit des Cyaninfarbstoffes. Tabelle II Relative Fluoreszenzintensität (Konzentration) Osmolaritätsregulator Ethanol Glucose Fructose Sorbose Saccharose Xylose Ribose Lyxose Glycin Arginin Glycerin Inosit Xylit Mannit Ribit Tris(hydroxymethyl)-methylaminopropansulfonsäure (TAPS) 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS) N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N-3-propansulfonsäure (EPPS) N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure (HEPPSO) 3-[N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-amino]-2-hydroxypropansulfonsäure (DIPSO) NaCl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Na&sub2;SO&sub4; NaI Cholinchlorid Cholinjodid
* Niederschlag in Ethanol, keine Daten erhältlich
** Artefakt aufgrund großer, nicht sedimentierender Kristalle
*** Niederschlag in Ethanol (Daten in Frage zu stellen)
N.b. Nicht bestimmt
Wie aus Tabelle II zu entnehmen ist, sind Cyaninfarbstoffe in Anwesenheit der klassischen Salze wesentlich weniger löslich als in Anwesenheit von Zuckern, ausgenommen Lyxose, sowie in Anwesenheit von Zuckeralkoholen, Aminosäuren und den Good- Puffern TAPS, HEPPSO, DIPSO; CAPS und EPPS. Außerdem wurde die Stabilität von DiSC&sub1;&sub4;(5) in Lösung mit Zuckern wie Glucose, Fructose, Ribose, Sorbose, Saccharose und Xylose, Zuckeralkoholen wie Glycerin, Inosit, Xylit und Ribit sowie Aminosäuren wie Glycin und Arginin bestimmt. Der Cyaninfarbstoff war in den getesteten Lösungen über mindestens zwanzig Minuten stabil, was für eine reproduzierbare Markierung ausreichend ist; bei vielen Zusatzstoffen hatte die in Lösung befindliche Menge an Cyaninfarbstoff auch nach 60 Minuten noch nicht wesentlich abgenommen.
Darüber hinaus wurde die Löslichkeit von Cyaninfarbstoffen in einem Medium, welches die klassischen Salze sowie Osmolaritätsregulatoren enthält, in denen die Farbstoffe löslich sind, ermittelt. Die Löslichkeit von DiSC&sub1;&sub4;(5) in einer isoosmolaren Glucoselösung wurde durch Verdünnung mit destilliertem Wasser nicht wesentlich beeinflußt. Die Löslichkeit von DiSC&sub1;&sub4;(5) in einer isoosmolaren Glucoselösung wurde jedoch durch Verdünnung mit einer nur etwa 20%igen isoosmotischen Natriumchlorid-Lösung deutlich verringert. Somit kann die reproduzierbare Zellmarkierung mit Cyaninfarbstoffen in Medien durchgeführt werden, die nicht mehr als nur geringe Menge an klassischen Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumsulfat, Natriumjodid, Cholinchlorid oder Cholinjodid enthalten; sie wird vorzugsweise in einem Medium durchgeführt, in welchem keine klassischen Salze zum Einstellen der Osmolarität verwendet werden.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Cyanin markierte Zellen wurden untersucht, um die Auswirkungen der Markierung auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. V79-Zellen, die von der amerikanischen Zellkultursammlung, Rockville, Maryland, bezogen werden können, und beschrieben sind in Prescott D.M., Ann.New York Acad.Sci, 397, S. 101-109, (1982) wurden mit DiOC&sub1;&sub4;(3) in Konzentrationen von 10&supmin;&sup5; oder 4 · 10&supmin;&sup5; enthaltenden Lösung markiert und das Wachstum der markierten Zellen mit demjenigen unmarkierter Zellen sowie einer Mischung aus markierten und nichtmarkierten Zellen verglichen. Die Verdopplungszeit der Zellen wurde durch die Markierung mit Cyaninfarbstoffen nicht beeinflußt. Somit hatte die Markierung keinerlei Auswirkung auf das Zellwachstum. Darüber hinaus bestätigten andere Standardtests der Lebensfähigkeit der Zellen wie der Ausschluß von Trypanblue und Propidiumjodid, daß keine Auswirkung der Markierung mit Cyaninfarbstoffen nach den beschriebenen Verfahren auf die Lebensfähigkeit der Zellen vorhanden war.
Die Auswirkung der Cyaninmarkierung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch durch Messen der Fragilität von roten Blutkörperchen bestimmt. Markierte und nichtmarkierte Zellen wurden in Medien unterschiedlicher osmotischer Stärke (Variieren der Salzkonzentration) suspendiert. Die Volumenverteilung der Zellen wurde unter Verwendung eines Coulter Counters® mit Kanalisieransatz gemessen. Es wurde jeweils das Durchschnittsvolumen wurden ermittelt und für die jeweilige Salzkonzentration aufgetragen; dabei stiegen die Volumina mit abfallender Salzkonzentration bis zu einer Konzentration von etwa 0,5 g/100 ml an, bei der das Volumen einen schlagartigen Abfall zeigt. An diesem Punkt lysieren die Zellen. Außerdem waren die Volumenänderungen, unabhängig davon, ob die Zellen markiert waren oder nicht, gleich.
In gleicher Weise wurde in parallelen Proben die Hämolyse als Funktion der Natriumchloridkonzentration beobachtet. 2-3 Minuten, nachdem die roten Blutkörperchen in Natriumchlorid eingebracht worden waren, wurden die Lösungen zum Sedimentieren von nichtlysierten Zellen zentrifugiert. Die Überstände wurden anschließend zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration einer spektrophotometrischen Analyse unterzogen. Die prozentuale Lysis wird durch Vergleich jeder Probe mit einer vollständig lysierten Kontrolle ermittelt. Die Konzentration an freiem Hämoglobin war bis herab zu Konzentrationen von 0,5 g Natriumchlorid pro 100 ml relativ gering; anschließend wird das Hämoglobin sofort freigesetzt. Durch Vergleich mit den Ergebnissen zur Fragilität der roten Blutkörperchen wurden die Volumenänderungen direkt mit der Hämoglobinfreisetzung korreliert. Außerdem war die Hämoglobinfreisetzung bei markierten und nichtmarkierten Zellen gleich.
Um die in vivo Stabilität von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Cyaninfarbstoffen markierten Zellen zu testen, wurden rote Blutkörperchen aus Kaninchen gewonnen, mit DiSC&sub1;&sub4;(5) markiert und reinjiziert. Anschließend wurden periodisch Blutproben entnommen und auf den prozentualen Gehalt an markierten Zellen sowie die Fluoreszenzintensität der markierten Zellen hin untersucht. Die Anzahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen nahm linear mit der Zeit ab und die gemessene Lebensdauer von 52 Tagen korrelierte gut mit der berichteten mittleren Lebensdauer von 40 bis 60 Tagen für rote Blutkörperchen von Kaninchen. Damit beeinflußte die Markierung mit Cyaninfarbstoff die Geschwindigkeit der Clearance von roten Blutkörperchen nicht.
In allen fünf untersuchten Kaninchen blieb, bei einer Ausnahme, die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen über 60 Tage nach der Markierung und Reinjektion im wesentlichen unverändert. Beim 5. Tier waren nach 60 Tagen nicht mehr als 20% des Cyaninfarbstoffes aus den gefärbten Zellen im Kreislauf ausgewandert. In Kombination mit den Daten aus Zellkulturen belegen diese Daten, die keinen Farbstofftransfer von markierten zu unmarkierten Zellen zeigen, daß die Zellen stabil mit den Farbstoffen markiert werden.
Erfindungsgemäß mit Cyaninfarbstoffen markierte, lebensfähige Zellen werden in zahlreichen Anwendungen eingesetzt, welche es erfordern, mehrere Subpopulationen einer Zellpopulation unterscheiden zu können. Beispielsweise wird, um zu bestimmen, ob die Hämatokritverringerung nach der Transfusion von roten Blutkörperchen auf Blutungen oder auf immunologischen Reaktionen gegen die transfundierten Zellen beruht, ein Anteil der Zellen vor der Transfusion erfindungsgemäß markiert und sofort nach der Transfusion der Anteil der markierten roten Blutkörperchen im Kreislauf bestimmt. Anschließend wird beim Befund eines erniedrigten Hämatokrits der Anteil der markierten roten Blutkörperchen mit demjenigen unmittelbar nach der Transfusion verglichen und die relativen Verringerungsraten von markierten und unmarkierten Zellen ermittelt. Eine äquivalente Verringerung von markierten und nicht markierten Zellen zeigt einen Blutverlust aufgrund von Blutungen an, wogegen eine stärkere Verringerung der markierten Zellen eine immunologische Reaktion auf die transfundierten Zellen anzeigt. Unter Einsatz entsprechender Verfahren können Verringerungen der Plättchenzahlen nach der Plättchentransfusion aufgrund von Blutungen von immunologischen Reaktionen auf die transfundierten Plättchen unterschieden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auch zur Bestimmung von Wachstumsraten von Säugerzellen in Zellkultur verwendet. Jedesmal, wenn sich die markierten Kulturzellen teilen, wird der Cyaninfarbstoff gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Dementsprechend kann unter Verwendung von durchflußcytometrischen Verfahren zum Vergleich der Fluoreszenzintensität der Zellen nach einer gewissen Wachstumsdauer mit der Fluoreszenzintensität sofort die Anzahl der Zellteilungen nach der Markierung und somit die Wachstumrate bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.

BEISPIEL I

Verfahren zur Färbung von Gewebskulturzellen

1. Herstellung der Zellen

Zum Erhalt der besten Ergebnisse werden in der logarithmischen Phase befindliche Gewebskulturzellen verwendet. Suspensionskulturen werden aus dem Kulturgefäß entnommen und in Polypropylenzentrifugenröhrchen gebracht.
Bei der Verwendung von einschichtigen Kulturen müssen die Überstände entfernt und die anhaftenden Zellen mit Calcium und Magnesium freier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen werden, um Serumproteine aus der Flasche zu entfernen. Eine Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco Laboratories, Grand Island, New York, #610-5300) wird zum Bedecken des Flaschenbodens hinzugefügt und bei Raumtemperatur inkubieren gelassen, bis die Schicht der Zellen gelöst und auseinander gerissen ist. Die erhaltene Zellsuspension wird in Polypropylenzentrifugenröhrchen überführt und ein gleiches Volumen eines 10% fetales Rinderserum (FBS, Hazelton) enthaltenden Kulturmediums zum Stoppen der Enzymaktivität des Trypsins zugegeben. Die Zellen werden bei Raumtemperatur mit 400·g 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände werden abgesaugt und durch ein gleiches Volumen einer isoosmotischen Mannitlösung ersetzt, um das Sediment aus Zellen zu resuspendieren. Dieses Waschen mit Mannit dient dazu, die Plasmaproteine aus der Zellsuspension zu entfernen und die Zellen für die Färbung vorzubereiten. Die Zellen werden nochmals bei Raumtemperatur mit 400·g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden abgesaugt und das erhaltene Sediment zum Färben in einer Mannitlösung in einer Konzentration von 2 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Einige Zellinien reagieren jedoch empfindlich auf Zuckeralkohole (Mannit); in diesem Fall kann eine isoosmotische Glucoselösung verwendet werden (MG 180,16; 54,05 g/l).

2. Herstellung der Farbstoffstammlösungen

2 · 10&supmin;³ molare Stammlösungen werden wie folgt in absolutem Ethanol hergestellt:
DiOC&sub1;&sub4;(3); MG 800 (1,600 mg/ml)
DiSC&sub1;&sub4;(5); MG 814 (1,628 mg/ml)
DiOC&sub1;&sub8;(3); MG 936 mg/ml (1,872 mg/ml)
DiIC&sub1;&sub4;(5); MG 850 mg/ml (1,700 mg/ml)
Alle Farbstoffe wurden von Molecular Probes, Eugene, Oregon, bezogen.
Um die vollständige Lösung sicherzustellen sowie um die Haftung an die Röhrchen zu minimieren, werden die Stammlösungen mit Ultraschall behandelt. Damit die Lösung der Farbstoffe beobachtete werden kann, werden Polystyrolröhrchen verwendet. Zum Färben der Zellen werden jedoch Polypropylenröhrchen verwendet, da die Cyaninfarbstoffe im Vergleich zu Polystyrol im wäßrigen Milieu wesentlich geringer an Polypropylen anhaften.

3. Zellfarbung

Die Zellen werden auf eine Konzentration von 2 · 10&sup6; Zellen/ml in einer isoosmotischem Mannitlösung eingestellt. Zum Färben der Zellen wird wird die 2 · 10&supmin;³ M Farbstoffstammlösung den Färbelösungen in einem Verhältnis von 5 ul Farbstoff auf 1 ml Zellsuspension zugefügt. Die zu färbende Probe wird pipettiert oder verwirbelt, um die Probe gut zu mischen. Die Zellen werden 10 Minuten mit dem Farbstoff inkubiert, wonach eine kleine aliquote -Menge zur Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop entnommen wird, um sicherzugehen, daß eine intensive und gleichmäßige Färbung erzielt worden ist. Für die Farbstoffe der DiO-Reihe werden für eine Anregungswellenlänge von 488 nm selektive Mikroskopfilter verwendet, während die Farbstoffe der DiS und DiI-Reihe zur Beobachtung von Fluoreszenz bei 575 nm angeregt werden müssen.
Nach der Inkubation wird ein gleiches Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) der Zellfärbelösung hinzugefügt. Die Zellen werden bei 20ºC 10 Minuten mit 400·g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesogen und das Sediment in PBS resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt und der dann erhaltene Überstand auf das Vorhandensein von Farbstoff hin untersucht. Ist noch Farbstoff im Überstand zu sehen, wird der Waschvorgang solange wiederholt, bis der Überstand gemäß den spektrofluorimetrischen Messungen frei von freiem Farbstoff ist. Nach der letzten Waschung wird der Überstand entfernt und das Sediment in der gewünschten Konzentration in einem geeigneten Kulturmedium resuspendiert. Alle Verfahrensschritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

BEISPIEL 2

Färbung von roten Blutkörperchen

1. Herstellung der Reagenzien

A.Citrat als Antikoagulans

1,66 g Na-Citrat
0,206 g Zitronensäure
0,140 g NaH&sub2;PO&sub4;
1,61 g Glucose
Die aufgezählten Verbindungen werden in 63 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung auf einen pH von 5,6 eingestellt. Zur Sterilisation wird die fertige Lösung durch ein 0,22 um-Filter gepreßt.
B. isoosmotische Glucoselösung
Glucose (54,05 g) wird in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Osmolarität wird mit Hilfe eines Fiske-Osmometers überprüft und gegebenenfalls auf 320 mOsm eingestellt.

2. Herstellung der Farbstoffstammlösung

Durch Auflösen von 1,628 mg/ml Farbstoff in absolutem Ethanol wird eine 2 · 10&supmin;³ M Stammlösung von DiC&sub1;&sub4;(5) hergestellt. Um den Farbstoff vollständig zu lösen, kann die Beschallung mit Ultraschall erforderlich sein.

3. Färbeverfahren

Unter Verwendung eines Natriumcitrat enthaltenden Vakuumbehälters oder einer vorbereitetes Antikoagulans aus Citrat enthaltenden Spritze wird aseptisch Vollblut in einer Menge gewonnen, die einem Zehntel des Gesamtvolumens der Spritze entspricht. Ein kleiner Anteil wird für die Durchflußcytometrie oder andere Funktionalitätstests zurückbehalten. Das Blut wird zum Sedimentieren der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur 10 Minuten mit 100·g zentrifugiert. Das die Plättchen enthaltenden Plasma wird entfernt und aufbewahrt; die roten Blutkörperchen werden durch Zugabe einer isoosmotischen Glucoselösung in einer Menge, die dem 5fachen Volumen des Sediments aus dichtgepackten roten Blutkörperchen entspricht, gewaschen. Die Zellen sollten dann nochmals für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 100·g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt werden. Dieser Waschvorgang, durch den die Plasmaproteine entfernt werden und der eine intensivere und gleichmäßigere Färbung gestattet, wird nochmals wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation und dem Absaugen des Überstands werden die Zelle in isoosmotischer Glucose in einer Konzentration von 4 · 10&sup8; Zellen/ml resuspendiert.
Vor der Farbstoffzugabe wird die Probe pipettiert oder verwirbelt, um sicherzustellen, daß keine Sedimentation eingetreten ist. 15 ul der DiC&sub1;&sub4;(5)-Stammlösung (2 mM in EtOH) werden je Milliliter der Erythrozytensuspension zugegeben. Die Probe wird sofort gemischt, um eine schnelle und gleichmäßige Verteilung des Farbstoffes in der Lösung sicherzustellen. Nach ungefähr 5 Minuten wird ein kleiner Anteil zur mikroskopischen Kontrolle entnommen. Unter Verwendung eines Wachsstiftes wird ein Kreis auf einem Glasobjektträger gezogen und eine kleine Probe der Zellen in der Färbelösung in dem Kreis plaziert. Ein Deckglas wird auf dem Objektträger angebracht und die Probe betrachtet. Der Einsatz eines Wachskreises vermindert das Ausmaß der Umwandlung von Normozyten (Discocyten) in Echinozyten aufgrund des Objektträgers und des Deckgläschens. Verwendung von Objektträgern und Deckgläschen aus Kunststoff beugen dieser Umwandlung ebenfalls vor. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, daß die Konstitution der roten Blutkörperchen während des Färbevorganges bei gleichzeitiger Sicherstellung des Auftretens von intensiver und gleichmäßiger Färbung beibehalten wird. Die Zellen sollten nach 5 Minuten gleichmäßig gefärbt sein und Expositionszeiten von über 10 Minuten sollten nicht erforderlich sein.
Nach Beobachtung einer gleichmäßigen Färbung der Zellen wird zu der Färbelösung ein gleiches Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 400·g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Üblicherweise werden in diesem Überstand sichtlich Spuren freien Farbstoffes vorhanden sein, sodaß der Waschvorgang unter Verwendung der Calcium und Magnesium enthaltenden, phosphatgepufferten Kochsalzlösung wiederholt werden muß, bis der Überstand gemäß spektrofluorimetrischer Messung frei von freiem Farbstoff ist.
In diesem Stadium können die Zellen entweder in einem für experimentelle Zwecke geeigneten Medium oder in plättchenarmen Plasma zur Reinjektion in ein Empfängertier suspendiert werden. Die allgemeine Vorgehensweise bei der Reinjektion besteht in der Reinjektion der gefärbten Zellen in dem Plasmavolumen, welches aus der ersten Zentrifugation des entnommenen Vollblutes gewonnen und anschließend mit 4000·g zur Entfernung der Plättchen zentrifugiert wurde. Alle Verfahrensschritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

BEISPIEL 3

Färbung von Plättchen

1. Gewinnung der Zellen

Unter Verwendung eines Natriumcitrat enthaltenden Vakuumbehälters oder einer vorbereitetes Antikoagulans aus Citrat enthaltenden Spritze wird aseptisch Vollblut in einer Menge gewonnen, die einem Zehntel des Gesamtvolumens der Spritze entspricht. Zum Erhalt eines mit Plättchen angereicherten Plasmas werden die Zellen bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 400·g zentrifugiert. Um die Aktivierung zu verhindern, werden für alle die Plättchen involvierenden Verfahrensschritte Kunststoffpipetten und Polypropylenzentrifugenröhrchen verwendet.
Das mit Plättchen angereicherte Plasma wird abgesaugt und in ein anderes Zentrifugenröhrchen überführt. Die Plättchen werden anschließend aus dem Plasma durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 20ºC mit 1000·g sedimentiert. Das Plasma wird danach gesammelt und entweder für Funktionalitätstests oder zur Verwendung als Resuspensionsmedium zur Reinjektion aufbewahrt. Dieses Plasma sollte für 10 Minuten mit 4000·g zentrifugiert werden, um sicher zu stellen, daß alle restlichen Plättchen vor dessen Verwendung als Resuspensionsmedium entfernt werden; es wird dann als plättchenarmes Plasma bezeichnet.
Die durch die Zentrifugation mit 100·g (1000·g) erhaltenen Plättchen sollten in einem kleinen Volumen an Antikoagulans aus Citrat vorsichtig resuspendiert werden, um eine homogene, konzentrierte Suspension zu erhalten. Wenn dieses erreicht ist, kann isoosmotische Glucoselösung als Verdünner in einer Menge zugesetzt werden, die der ursprünglich vorhandenen Plasmamenge entspricht. Anschließend werden die Plättchen 5 Minuten mit 300·g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieses Waschen mit Glucose entfernt verbliebene Plasmaproteine und ermöglicht eine gleichmäßige und intensivere Färbung. Das Sediment aus Plättchen wird in der Glucoselösung resuspendiert und ist nun für die Färbung bereit.
Die Plättchenkonzentration wird auf 4 · 10&sup8; Zellen/ml eingestellt; es werden 15 ul der DiOC&sub1;&sub4;(3)-Stammlösung (2mM in absol. EtOH) pro ml der Plättchensuspension zugefügt. Die Suspension wird sofort vorsichtig doch gründlich gemischt, um die gleichmäßige Verteilung des Farbstoffes sicherzustellen. Die Plättchen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um sicherzustellen, daß die Färbung erfolgt ist. In diesem Falle sind die Plättchen für die Abtrennung von freiem Farbstoff in der Suspension bereit.

2. Verwendung einer Sephadex G-100-Säule zur Abtrennung der markierten Plättchen

Traditionsgemäß wird Sepharose 2B verwendet, um Plättchen aus einem mit Plättchen angereicherten Plasma zu isolieren. Es wurde nun gefunden, daß Sephadex G-100 ebenfalls gut für die Isolierung von Plättchen geeignet ist. Dieses Verfahren wird zusammen mit dem Färbeverfahren angewandt und funktioniert folgendermaßen: Eine Suspension aus Farbstoff und Plättchen wird auf eine Säule geladen. Die kleinen Farbstoffmoleküle werden in den Teilchen eingeschlossen, während die großen Plättchen direkt durch die Säule hindurchlaufen. So kann Sephadex G-100 zur Trennung von fluoreszenzmarklerten Plättchen und freiem Farbstoff verwendet werden.

A. Herstellung der Säule

Sephadex G-100 (Pharmacia Laboratories, Piscataway, New Jersey) wird gemäß den Angaben des Herstellers hydratisiert und zur Vorbereitung ihrer Verwendung als Trennungsmedium von Plättchen in Aceton (100%) gewaschen. Ein Waschvorgang wird mittels 10minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur mit 300·g, Entfernung des Überstandes und Resuspension in Hanks balancierter Salzlösung durchgeführt. Die Sephadex-Säulenfüllung sollte mehrfach mit Hanks balancierter Salzlösung gewaschen werden und zwar solange, bis der Geruch nach Aceton verschwunden ist. Die erhaltene Lösung wird im Vakuum unter Eintauchen in ein kochendes Wasserbad entgast.
Die Sephadex-Aufschlämmung wird anschließend zum Packen einer Säule verwendet. Eine 10 ml-Spritze ohne Kolben wird als Säulenschaft verwendet. Ein Silikonschlauch wird an den Auslaß der Spritze angefügt; eine kleine Schlauchklemme wird zum Regulieren des Flüssigkeitsdurchflusses durch die Säule verwendet. Ein 47 um-Nylonnetz wird am unteren Ende der Spritze als Träger benutzt, um die Sephadex-Perlen zurückzuhalten. Handelsübliche Glassäulen mit Glasfilterfritten als Träger sollten umgangen werden, da diese zur Aktivierung der Plättchen beitragen könnten. Die Säule wird mit Hanks Medium gefüllt und kleine Mengen an Sephadex-Aufschlämmung hinzugefügt. Die Schlauchklemme wird so weit geöffnet, daß sie einen langsamen, jedoch stetigen Durchfluß ermöglicht. Mittels dieser Vorgehensweise wird das Sephadex gleichmäßig und homogen gepackt, wobei die Bildung von Kanälen und Luftblasen verhindert wird. Die Schritte des Zufügens von HBSS und Sephadex-Aufschlämmung werden solange wiederholt, bis die gewünschte Höhe der gepackten Säule erreicht ist. Die Säule sollte vor der Verwendung vollständig mit HBSS gespült werden (2 freie Volumina).

B. Abtrennung der Plättchen

Die Suspension aus Plättchen und Farbstoff wird vorsichtig auf die Sephadexfüllung aufgeschichtet. Dabei sollte die Klemme am unteren Ende der Säule geöffnet und der Flüssigkeitspegel soweit in der Säule abfallen gelassen werden, bis dieser den oberen Rand des Sephadex erreicht. Der Fluß wird in Gang gesetzt, um die Suspension in das Sephadex eindringen zu lassen. Der Durchfluß wird dann wieder abgestoppt, wenn der Flüssigkeitspegel das obere Sephadexende erreicht. Dann wird genug HBBS oben auf die Säule aufgegeben, um einem Puffer zu schaffen, sodaß weiteres HBBS leicht zugegeben werden kann, ohne das Sephadex aufzuwirbeln. Wiederum wird der Fluß durch die Säule in Gang gesetzt. Diese Vorgehensweise läßt die Plättchensuspension eine dichte Bande im Gel bilden und diese mit halbwegs gleichmäßiger Geschwindigkeit über die Länge der Säule wandern. Auf diese Weise wird ein konzentrierteres Plättcheneluat erhalten. Der Durchfluß durch die Säule wird fortgesetzt, wobei 0,5 bis 1 ml- Fraktionen gesammelt werden. Die plättchenhaltigen Fraktionen sind aufgrund ihrer Opalenszenz zu erkennen und können vereinigt werden. Die vereinigten Fraktionen werden anschließend 10 Minuten lang bei 300·g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen; das Sediment kann in für Experimente oder zur Analyse geeigneten Medien oder auch in plättchenarmem Plasma für Funktionalitätsbestimmungen bzw. zur Reinjektion resuspendiert werden.
Durch obige Darstellung werden die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert; die Erfindung ist jedoch nicht auf die dort gegebenen Anweisungen beschränkt.

Claims

1. Verfahren zum Markieren lebensfähiger Zellen mit einem Cyaninfarbstoff der Formel

worin Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder ein- oder zweifach durch C&sub1;-C&sub3; substituiertes Methylen, m eine ganze Zahl von O bis 3 und n eine ganze Zahl von 12 bis 22 bedeuten, und worin das Molekül gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert ist, vorausgesetzt, daß die substituierte Verbindung solange wie zum Markieren erforderlich in Zellmarkierungsmedien löslich ist, daß ihr Zellmembran-Verteilungskoeffizient hoch genug ist, um mit den markierten Zellmembranen assoziiert zu bleiben, und daß sie in den zum Markieren verwendeten Konzentrationen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt und/oder worin das Molekül ein mittels Kernresonanz-Imaging nachweisbares Atom enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit dem Cyaninfarbstoff in einem Medium in Kontakt gebracht wird, das einen Osmolaritätsregulator enthält, die Lebensfähigkeit der Zelle nicht wesentlich beeinträchtigt und für eine reproduzierbare Markierung der Zellmembran sorgt, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um ein oder mehrere aus der Gruppe der Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren und Good-Puffer ausgewähltes bzw. ausgewählte Mittel handelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Medium um ein Isoosmotikum handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Zelle um ein rotes Blutkörperchen handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Zelle um ein weißes Blutkörperchen handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Zelle um ein Plättchen handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Zelle um eine Gewebekulturzelle handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um einen Zucker handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dein Zucker um Glukose handelt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um einen Zuckeralkohol handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Zuckeralkohol um Mannit handelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um eine Aminosäure handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Aminosäure um Glycin handelt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um einen Good- Puffer handelt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Good-Puffer aus der Gruppe N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure, N-(2-Eydroxyethyl)piperazin-N'-3- propansulfonsäure, tris(Hydroxymethyl)methylaminopropansulfonsäure, 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure und 3-[N,N-bis(2-Hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure ausgewählt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei beim Cyaninfarbstoff entweder Y Schwefel, m 2 und n 14 oder Y Sauerstoff, m 1 und n 14 bedeuten.

16. Zusammensetzung mit einem Cyaninfarbstoff der Formel

worin Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder ein- oder zweifach durch C&sub1;-C&sub3; substituiertes Methylen, in eine ganze Zahl von 0 bis 3 und n eine ganze Zahl von 12 bis 22 bedeuten, und worin das Molekül gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert ist, vorausgesetzt, daß die substituierte Verbindung solange wie zum Markieren erforderlich in Zellmarkierungsmedien löslich ist, daß ihr Zellmembran-Verteilungskoeffizient hoch genug ist, um mit den markierten Zellmembranen assoziiert zu bleiben, und daß sie in den zum Markieren verwendeten Konzentrationen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt und/oder worin des Molekül ein mittels Kernresonanz-Imaging nachweisbares Atom enthält, wobei der Cyaninfarbstoff in einem Osmolaritätsregulator gelöst wird, der die Lebensfähigkeit der Zelle nicht wes beeinträchtigt, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um ein oder mehrere aus der Gruppe der Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren und Good-Puffer ausgewähltes bzw. ausgewählte Mittel handelt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um Glukose handelt.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um Mannit handelt.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um Glycin handelt.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Osmolaritätsregulator um einen Good-Puffer handelt, der aus der Gruppe N-(2-Hydroxyethyl)piperazin- N'-2-hydroxypropansulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-3-propansulfonsäure, tris(Hydroxymethyl)methyl-aminopropansulfonsäure, 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure und 3-[N,N-bis(2-Eydroxyethyl)amino[-2-hydroxypropansulfonsäure ausgewählt ist.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei beim Cyaninfarbstoff entweder Y Schwefel, m 2 und n 14 oder Y Sauerstoff, m 1 und n 14 bedeuten.