JPS62502540A - 精製されたインターフェロンを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「インターフェロンの精製法およびそれによって製造される物質の組成物」介厳 糟屡 本発明は、一般に組換え皮付によって産生されるインターフェロンの精製法およ び精製による生成物、特に、ヒト免疫インターフェロンの精製法および精製した ヒト免疫インターフェロン４Ａに関する。

疫反応抑制タンパク質の一群を形成する。確認されている３オ覆頌のインターフ ェロンは。

αインターフェロン（白血球）、βインターフェロン（＆’！Ｊｆｆｉおよびγ インターフェロンＧびりと呼ばれる。

がおこなわれている。その結果１発熱やアレルギー反応といった昌ＩＨ乍用をも たらす可能性がある不純物を除去するために、インターフェロンを高度に精製す ることが重要であるこな方法は未だ１つも見出されていない。

インターフェロンを精製する皮付として′ｃ上　アフィニティークロマトグラフ ィー（コンアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの 併用ｒＹｉｐ等、　Ｐｒｏｃヒト免疫インターフェロン（ＩＦ）ｉ−Ｔ　）の合 成遺伝子ならびにｃＩｌ！；Ａ遺伝子コーディングをプラスミドベクターに挿入 し３次に原核化工および真核重工に導入して１組換えヒト免疫インターフェロン （ｒｌＦＮ−γ）のｒｔａ体Ｍａｔｕｒｅ”および類似体を産生するのに用いら れていお距よ、ヒト免疫インターフェロンのコードを決める遺伝子のＷ＆ｌ［’ １１．ｌＦの決定に恭づくと、　Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓで始まる。［；ｏｅｄ ｄｅｌ等、欧州特許出１！ＬＦｆ０７７６７０号、　Ａｌｔｏｎ等のＰＣＴ特許 出１ｉＥ謝０８３１０４０５３号公報には、成熟ｒｌＦＮ−ｒの種々の類似体が 記載されている。これらの記載されている類似体の中には９アミノ末″１３Ｃｙ ｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ残基の無い類似体、聞ぢ（ｄｅｓ−Ｃｙｓ’−Ｔｙｒ２−Ｃ ｙｓｌ）　ＩＦＮ−７類イ以体がある。Ｄｅ　Ｍａｅｙｅｒ等Ｅ、Ｔｈｅ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒ■■秩B ｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１９８３”、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌ ｉｓｈｅｒｓ　（１９ａ３）に収録された。　（ｄｅｓ−Ｃ凾刀f−Ｔｙｒ ｎ等の論文、　１１９−１２８ページをも参照されたい。大腸菌に昔通に直接に 発現されるｒｌＦＮ−γは、Ｎ末端メチオニン残基を有する点とグリコジル基を 持たない点において、リンパ球によって産生される天然ＩＦＮ−γと異なってい る。したがって、成熟ｒｌＦＮ−γは直接に〔１ｉｅｔ　−’）　ＩＦＮ−７と して表し１組換えによって産生される類似体（ｄｅｓ−Ｃｙｓ’−Ｔｙｒ２−Ｃ ｙｓ３）　ＩＦＮ−γ（以後　ｒＢ換えヒト免疫インターフェロン４ＡＪまたは ｒｌＦＮ−γ４ＡＪと呼ぶ）は、　〔Ｍｅｔ　−’、ｄｅｓ−Ｃｙｓ’−Ｔｙｒ ”−Ｃｙｓ’　）　ＩＦＮ−ｒと表す。

ＩＦＮ−ｒの天然の形態は、　４０，０００から６０，０００の分子量のオリゴ マーであると報告されており、これまでに報告されている２０，０００および２ ５，０００の分子量を持つ２つのＭ量体の二量体であると考えられる。単量体の 炭水化物成分をグリコシダーゼ処理によって除去すると。

各々１６，０００と１８．５００の分子量の、！１１量体が生じる。ｔａ等、　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３２：　１３００−１３０４（１９８４）、ｒＩ ＦＮ−７の単量体形態は１７．　ｉ４０の分子量を持つと計算されている。ＩＦ Ｎ−７の天然形態と組換え形態の分子量の相違は、少なくとも部分的には、天然 のＩＦＮ−γはＣ末端アミノ酸残基を除去するプロセスを受けており、−一方、 ｒＴＦＮ−ｒはこれらの追加的な残基を含んでいるという事実によって説明する ことが可能であろう。

ＩＦＮ−γを分離するための処理を行う際には、　ＩＦＮ−γ力や倣舅浬に対し て潜在的に不安定性であることを考慮にいれねばならない０例えば＋Ｙｉ痔、ｒ ｓｕｐｒａ　ｊは、天然のＩＦＮＴをｐＨ２Ｑ溶液に対して透析し、その後に中 性リン酸塩緩衝液で処理した場合、抗ウィルス作用が約１７１０に低下すること を観察した。これは、　ＩＦＮ−γカ螢の中で変性して元の天然の構造にフォウ ルド（ｆｏｌｄ）　Ｌないことを示唆している。

ｒｌＦＮ−γの精製をさらに難しクシ、ている間Ｊは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ＋＞ からのｒｌＦＮ−丁の抽出に関連ｒる。天然のＩＦＮ−γは、培養リンパ球の周 囲の培地から採取することが可能であるが、大腸菌ｒｌＦＮ−γは、細菌細胞を 破壊して採取するので、産生されたインターフェロンを劣化させる可能性がある タンパク質分解酵素が細胞から放出されることになる。

尿素および塩酸グアニジンといった変性剤は、抽出時にインターフェロンの活性 を不可逆的に損うことなく酵素の作用を抑制する。　Ｒｕｎｇ、合衆ｆ！ｍｌ、 ４７６．０４９号。

しかしながら、一旦変性すると（アンフォウルド（ｕｎｆｏｌｄ）すると）、イ ンターフェロンをもとにフォウルドするために適切な条件を容易に決定すること ができない。その結果、免疫グロブリンあるいはメチオニン−プロキモシンとい った可溶性ＪＪ汐ンバク質の復元の一一法として、尿素あるいＬオ鑵峻グアジニ ンのアルカリ溶液中における変性および希釈、そして、タンパク質の変性に有効 なｐＨ値よりもｐＨを低下させることによる１鎖元（例としてＬＯＷｅ等、刀覇 竿許出南口砧Ｂ２１３８００４Ａを参照されたい）という技法があるが、このよ うな技法をインターフェロンにそのまま適用することはできない。

それゆえ１インターフエロン、特にｒＩＦ）Ｉ’　ｒを゛活性の高い状態でもた らす精製法がめられている。

発則のｙ約 本発明によってもたらされる物質の組成物は、中性」Ｈの水性溶液中において、 約２５９　ｎｍ、　２６６　ｎｍ、　２８０　ｎｍ　および２８７　ｎｍ　に正 帯、ｖ″Ｊ２７０ｎｍおよび２９２　ｒ＋ｍに肩がある近紫外円二色性（ＣＤ） スペクトル（ｎｅａｒ−ＵＶ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｃ　ｓｐｅｃ ｔｒｕｍ）を有する活性の高いＭｉ換えヒト免疫インターフェロン分離体から好 ましくは木質的に成る０本発明の最も望ましい組成物は、０．１モルの酢酸アン モニウム中において上述したような特性を示すＩＦＮ−ｒ　４Ａ組成吻である。

、・本発明による分離−ｑ頭をおこなうと、クロマトグラフィーによるインター フェロンの主軍存分画が２つ得られるが、一つは上述したスペクトルを特徴とす るものであり、いま一つはスペクトルの近紫外部域に強い二色性（ＣＤ）がない ことを特徴とするものである。後者の分画は、前者と選択的に組み合わせて（例 えば、　９５：５．９０＋１０．８０：２０．７０：３０および６０：４０の重 量比で）生物学的活性を有する組成物を提供することも可能であり、あるいは更 に処理をして前者のスペクトノー制生を備えた物質を得ることも可能である。

本発明の別の態様によると、セファデックス”　Ｇ−７５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　 ”　Ｇ−７５）カラムから取り出した分子間の共存結合のない凝集した状態のイ ンターフェロンを精製する段階と、分画を変性剤を含んだ溶液中でアンフォウル ドする段階とから成る組換えヒト免疫インターフェロンの精製法が提供される。

この方法はさらに、ｌＩｎ１当たりＹ鱒、１８ｍｇ未満のインターフェロンの７ □７；ＪＸとするためにこのン容嵌を希釈するｆｆ１ｌと、ダイアフイルトレイ シ５ン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって希釈溶液を濃縮する段階とから 成る。

図面Ｑ量率な説明 第１図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−γ４Ａの遠紫外部域円二色性スペクト ル（ｆａｒ−Ｕｖｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｃ　５ｐｅｃｔｒａ）を示 す。

第２図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−ｒ４Ａの近紫外部域円二色性スペクト ルを示す。

第３図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−ｒ　４Ａのゲルろ過分析のグラフであ る。

第４図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−γ４Ａの近紫外部域円二色性スペクト ルを示す。

第５図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−ｒ　４Ａの二次微分スペクトルを示す 。

第６図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−１４Ａの紫外吸収スペクトルを示す。

第７図は、異なる条件下におけるＩＦＮ−ｒ　４Ａの二次微分スペクトルを示す 。

坪袷を説明 本発明に従い５組換えヒト免疫インターフェロン、特にＩＦＮ−γ４Ａを、精製 手頃の最後の段階として、ＩＭの尿素および０．１Ｍの酢酸アンモニウム中でセ フ１デソクス”　Ｇ−７５ゲルろ過園付を用いて精製する。アミノ８誦θＩ］お よびそれから誘導された合成遺伝子の塩基配を表１に示す。

表土 ４　＋１　１０ Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ@Ａｓｎ　Ａｌａ　 Ｇｌｙ ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＣＧ　ＴＡＣＧＴＴ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　Ｇ ＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＡＡＣfＣＡ　ＧＧＣ ＴＡＣＧＴＣＣＴＡ　ＧＧＣＡＴＧ　ＣＡＡ　ＴｒＣＣＴＴ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　 ＴＴＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　bＧＴ　ＣＣＧ Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ@Ａｓｎ　Ｔｒｐ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ ＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧ　ＴＴ ＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＧＧ　`ＡＡ　ＧＡＧ ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　 ＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＧＡＣＴＴｒ　ＴＴf　ＡＣＣＴＴＴ　 ＣＴＣ Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　 Ｇｉｎ　Ｊｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ@Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｐｈｅ　Ｉ、ｙｓ ＧＡＡＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴＡ ＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＧＧＣＡ ＴＴＣＴＡＧＴＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧ ＴＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　 Ｓｅｒ　Ｉｃｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｌｙｓ@Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ ＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧへＣＧＡＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＴＡ ＧＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧ ＣＴＡＧＴＴＡＧＧＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＣ ＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＶａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｓ@Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＣＴＴＴ　ＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　 ＣＧＣＧＡＴ　ＧＡＣＴＴＣＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＣs　ＡＡＣＴＡＣ ＣＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＡ ＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＴＧＡＴＧＳｅｒ〜’ａｌ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｒ（ＨＬｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　 Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｕｅ　ｌｉｅ@Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　Ａ ＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＣＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡ`　ＧＴＴ　ＡＴＧ 　ＧＣＴ 八ＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＧＴＣＧＣＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＧＡＣＴＡＧＧＴＴＣＡＡＴＡＣＣＧＡＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ@Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇａｙ ＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＡＡＧ ＣＧＴＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴ　ＧＡＣＡＧＡ　Ｇ ＧＡ　ＣＧＣＣＧＴ　ＴＴＣＴＧＡ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＴＴＣＧＣＡ　 ＴＣＧ　ＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡ`　ＧＣＡ　ＣＣＡ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　０ｐＣＧＣＣＧＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ 　ＣＡＧ　ＴＧＡ　ＴＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＡＣｆｌ、ＡＡＧＡＧＴＣＡＣ ＴＡＴＣＡＧＣＴＧこの′：４４Ｉ胆こおいては、　ＩＦＮ−γ４Ａが２つのピ ー久すなわち、会合状態を表すピークと単量体状態を表すピークとして溶離する ことが分かった。会合状態においては、尿素および酢酸アンモニア中のタンパ久 容液は、普通には限外ろ過によって生成物の沈澱を生ずることなく約１■／ｍｌ よりも高く濃縮されることはなく、またＩＦＮ−ｒ　４Ａの活性は０．５Ｘ　１ ０’から２Ｘ１０’の程度であることが分かった。

本発明による方法を用いることによって、　ＩＦＮ−γ４Ａを各々の状態で分離 し、推定上の単量体タンパクを、６Ｘ１０’から１０刈０’　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ もの高い活性を示す５■／Ｌ１１１より高い態に濃縮することが可能となる。会 合タンパク質の分離された分画、あるいは会合分画のみは、Ｔ？Ｉ尿素処理とそ れに続くゲルろ過によって実際上完全に＃４量体の状態に変換することが可能で ある。変換されたタンパク質は１分離された単量体タンパク質と同等の可溶性お よび活性を有するものと思われる。変換が必要なのは、会合状態の活性が単量体 状態の活性の１／４から１７８の大きさにすぎないからである。

会合状班閃１ら単量体状態似後各々「ピークＩ」および「ピーク■」と呼ぶ）へ の変換の手頃では、７Ｍ尿素の存在下においてタンパク質を完全にアンフオウル ドし、続いて酢酸アンモニウム水溶液中で希釈し、その後にＩＭの尿素中でＧ− ７５のカラムを用いてクロマトグラフィーを行う。

以下に示す例は１本発明によるＩＦＮ−γ４ＡのピークＩおよびピーク■の調製 およびそれらの特性づけを例示するものである。第１例においては、大腸菌から のＩＦＮ−ｒ４Ａの分離、およびそれによって得られるピーク！ならびにピーク ■のＷについて説明する。第２例においては１円二色性スペクトルを用いたピー ク！ならびにピークＨの特性づけを示す。第３例においては、　ＩＦＮ−ｒ４＾ のゲルろ過分析について説明する。第４例では、リフオウルディング（ｒｅｆｏ ｌｄｉｎｇ）の結果がタンパク質の濃度に依存することについて検討する。第５ 例では、使用する溶媒がリフォウルデイングにおよぼす影響について検討する。

第６例では、ピーク！およびピークＨの溶解度に対する種々の溶媒の影響を調べ る。第７例では、ピークＩおよびピーク■の沈降速度の定量を開示する。第８例 では、ピークＩおよびピーク１の比活性の定量について説明する。第９例では、 ピーク夏物質からピーク■吻賞への変第上例 下記の狙１胆よ、ｒｌＦＮ−γの分離および精製に多大な利点をもたらす非常に 望ましい方法である。

ＩＦＮ−ｒ　４Ａを含んだペレット状の大腸菌細胞を１例えばポリトロンＴＭミ キサー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ”　ｍ１ｘｅｒ）のような適切なミキサーを用いて、 室温で約５分間分散した。その結果性した細胞の＝ａ液を、ホモジナイザーに７ ．０００ρｓｉで４回通した。各パスごとに約１１’Ｃに冷却した。ホモジネー トを４℃で約６分間にわたって４２００　ｒｐｍで遠尼扮離を行い、バレント１ 個を得た。

ペレットを、出発細胞ペースト（２００ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、７Ｍ尿素、ｐＨ ９，０）１ｋｇにつき２゜６　ｐの可？？Ａ’０１１衝液中に５°ＣＴ：Ｑ濁さ せ、ミキサーを用いて均質な懸濁が得られるまで５分間にわたって昶谷内で分散 した。懸コ仮の容積の０．００１倍の量の１０χポリエチレンイミン（ＰＥＩ） を加え、溶液を５℃で１９述ａ牢した。次に、懸湯液を５℃において４（５）油 にわたり毎分４２００回転で遠Ｉ０分離した。

上滑を静かに別の容器に移し、２Ｎ塩酸を用いて上滑のｐＨを５℃で８．１に３ 財整した。この溶液を、イジ隼率力ｑｏＯμＳ／Ｌ：ｍ以下になるまで８門尿素 で希釈した。

緩衝液（４０＋ｎＭ　トリス−臨　６Ｍ　尿素、　ｐＨ８，１）で平衡させたワ ットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）　５Ｅ−５甜封脂を、出発細胞ペースト１ｋｇに 対してＨの割合で加え、５℃で約１時間にわたってゆるやかに攪拌した。適切な 大きさの漏斗に、予め５Ｅ−５３ｔｆｉ衝液で平衡させた５Ｅ−５３樹脂５００ ｍ６（出発ペース目ｋｇ当たり）を加えた。真空ポンプおよび吸引フィルターを 用い、　５Ｅ−５３緩衝液２００〜４００　ｍｌを漏斗に注ぎ込み、湿ったケー キ（固形物）が残るまでスラリーをろ過することにより、湿った樹脂ベッドを用 意した。洗浄した樹脂に、２〜３１の５℃の５Ｅ−５３１Ｎ衝液を加え、樹脂を 攪拌して均一なゲル状スラリーを得た。ゲノ囁濁液をカラムに注ぎ、流量を６〜 １２ｍｊ！／分に調節した。分画を０．２カラム容量のインクリメント（ｉｎｃ ｒｅｍｅｎｔ）で集めた。

１衝液Ａ　（４０ｉＭ　トリス−塩ｉＪ、６ｈ尿素、　ｐＨ８，１）内の０１’ ！−０，４ＭのＮａＣｌの線形勾配溶離いて、　ＩＦＮ−γ４Ａを溶離した。

緩衝液（４０ｍ牡リスす塩ａｔ　６　Ｍ尿素、ｐｉ（９）で平衡させた５Ｅ−５ ３樹脂を詰めたカラムを用意し、前段階から得た７０χより多くのＩＦＮ−１４ Ａを含んでいる分画をカラムに入れた。

カラムを６００ｍＡの緩衝液Ｃ（４０ｍ！Ｉ　トリス−塩ｆｉ、６？Ｉ尿素、　 ３０　ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ９，０）で洗浄し、３０ｍＭ　から３３０　ｍＭ のＮａＣｌの線形勾配溶離を行った。流量は６〜１２１／分に訊炬貨した。

８５〜９０！よりも高いＩＦＮ−ｒ　４Ａを含んでいる分画を集め、２　Ｎ　Ｈ ＣＬを用いてｐＨ７，５に滴定した。この溶液を０．５　Ｍ　ＮａＣ１の濃度に して、シリカゲルカラムに入れた。カラムをゲル溶離緩衝液（９χエタノール、 　４０　ｍＭ　）リス−塩酸＋　６　Ｍ　尿素、　０．５　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ ７，５）を用いて、０〜９χのエタノールの線形勾配で溶離した。エタノールを 用いずにン容庸した分画、および高分子量の不純物を含まないエタノール溶離分 画を集めた。

前段階によって集めた物質を、　Ｇ−７５４夏衝液（０，１Ｍ　酢酸アンモニウ ム、１１１尿素）で平衡させた分子量１０，０００−力ントオフメンフ゛ラン（ ｃｕｔ−ｏｆｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を有するベリコンＴ９カセント（Ｐｅｌｌ ｉｅｏｎ　ＴＭｃａｓｓｅｔｔｅ）を用いて、約２ｗ／ｍｌｌにｔＭｍした０次 に、集めたものをセファデフクス”　Ｇ−７５カラムに入れて、１０〜１６　ｒ ａｉｌ／分の流量でＧ−７５緩衝液を用いて溶離した。各々力ＱＯＯｒＩＩｆｔ の分画を４５（［？尋た。

上記の：ｆＪ唄で得たＩＦＮ−ｒ　４Ａは、　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動分析（クマシープルおよびシルバー東口に基づくと、純度が９５χより高 かった。

上記の手頃で得たＩＦＮ−γ４Ａの約１　ｍｇ／ｍ　１２の溶液に、０．１ｍア ンモニウムから、タンパクを完全にアンフォウルドする濃度である７門の最終濃 度まで、固体尿素を加えることにより、　ＩＦＮ−γ４Ａの適切なフォウルデイ ングを試みた。

透析を行った結果、２つの異なる構造形臆すなわち、ピーク■およびピーク■を 得た。

ピーク■は長時間にわたって安定しており、ピークＩの形態に変換することはな かった。

一方、０．１Ｍ酢酸アンモニウム内で、ピークＩからピーク■への極めて緩慢な 変換が見られた。この変換は、１と尿素の存在下、あるいはもっと低いイオン強 度において、加速される可能性がある。

第１倒 日本の東京に所在するＪａｓｃｏから入手したＪａｓｃｏ　Ｊ−５００Ｃスペク ト口ボラリメター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて、室温で 円二色性スペクトルを測定した。スベクトノＩ４副よｌｎｍに設定し、１９０− ２６０　ｎｍおよび２４０−３４０　ｎｏ＋に対する光路長がそれぞれ０．１ｃ ｍおよび１ｃｍのキュベツト（ｃｕｖｅｔｔｅｓ）を用いた。各試料について、 溶媒スペクトルを得て、クンバク質スペクトルから差し引いた。平均残基楕円率 （θ）は、　ＩＦＮ−ｒ４Ａの平均残基重量（１１７）から算出した。

第１図に、　０．１　Ｍ酢酸アンモニウム、におけるピーク■の遠紫外域円二色 性スペクトルを線１０として示す。このスペクトルは、　２０９　ｎｍおよび２ ２０　ｎｍ！、ｌ：８（Ｊる２つの最／Ｊ４直？、こよって１看改づけられてお り、秩序のある構造の存在を示している。０．１Ｍ１ｌｊ！アンモニウム中の１ 　ｍｇ／ｍ　ｉのピーク■をｐＨ２の緩衝液に対して透析した。その円二色性ス ペクトルを第１図に曲線１１として示す。このスペクトルは、　２０９　ｎｍに おいて最）ｊＨ直を、また２１６周辺で肩を示しており９曲線１０の値に比して 、検討した波長域において楕円率がかなり減少していることを示している。

円二色性スペクトルにおけるこれらの変化は、　ＩＦＮ−１４ＡがｐＨ２の酸の なかでアンフォウルドされたことを示唆している。一方９曲線１２によって示す 灯尿素におけるピークＨのスペクトルは、秩序のある構造がほとんど無いことを 示している。したがって、α−へリンクス（α−ｈｅｌｉｘ）およびβ−シート （β−５ｈｅｅｔ）のような秩序ある構造が、特にα−ヘリックスがもとの状態 に比べてかなり酸中で失われてはいるが、これらの構造が酸のなかでまだ存在し ていると結論してもよいであろう。従って、酸中のＩＦＮ−ｒ　４＾のアンフォ ウルディングは、７ＦＩの尿素中で生じるアンフォウルデイングと比較すると部 分的である。

酸によってアンフォウルドした試料を、　０．１１１酢酸アンモニウムに対して 透析し、タンパク質の復元をおこなった。生成物の遠紫外域円二色性スペクトル を第１図に曲線１３として示す。曲線１３は、酸処理の前後で楕円率の大きさお よびビーク位置に小さな差異があるものの、酸中で部分的にアンフォウルドされ たＩＦＮ−γ晶力（元のビーク■物質に似た構造にリフォウルドされることを示 している。

近紫外域円二色性スペクトルを第２図に各々２０．２１．２２．および詔の曲線 で示す。０．１ｉ′ｒ＃ｊＬアンモニウム中の元のピーク■は１曲線孔のいくつ かの正のピークならびに肩を特徴と薫る。このことは、芳香族残基がビーク■の 堅固な３次構造の中に組み込ま札　この構造がこれら残基に非対称性の環境をも たらし、芳香族の円二色性シグナルを生じることを示唆する。酸中のＩＦＮ−ｒ 　４Ａのスペクトルは９曲紹２１に示すように９元のスペクトルと完全に異なり 、近紫外域において認識しうる円二色性シグナルを殆ど示さず２曲線２２に示し た７１尿素においてアンフオウルドしたＩＦＮ−γ４Ａのスペクトルに類似して いる。したがって、ピーク■を酸に対して透析すると、２次構造は部分的にアン フオウルドしているだけのように見えるが、その堅固な３次構造を失うように１ 曹われる。

曲線おとして示す酸処理後の０．１Ｍ酢酸アンモニウムにおりるピーク■の近紫 外域円二色性スペクトルは１元のビーク■構造（曲′ｆ！ｖ！Ｏ）と酸によって アンフオウルドした構造（曲紡唸１）の中間である。この結果は、同し試料の遠 紫外円二色性スペクトルの結果が、元のスペクトルへのほぼ完全な復元を示して いるのと対照的である。したがって１酸によってアンフォウルドされたＩＦＮ− ｒ　４Ａは、ピーク■と似た２次構造にリフオウルドする可能性はあるが、３次 構造は部分的にし力徊復されないものと眉、ねれる。あるいは、リフオウルデイ ングによってピークＩおよびピーク■の双方が形成さ名７観察される近紫外域円 二色性スペクトルは２つの形態の平均である可能性もある。この後者の仮説を支 持する兆候が第２図の曲線Ｕに示されている。この曲線はビーク１カ男１さい負 の円二色性シグナルを生しることを示している。

第１例 ４°Ｃ’？’ｐＨ７のｌｌ’ｌ尿素を含む１．１？ｌ酢酸アンモニウム内で、セ ファデックスＴＭＧ−７５カラム（Ｉ　Ｘ　１２０　ｃｍ）の分析ゲルろ過を行 った。

第３図に示すように、酸処理したピークＨのリフォヴルデイング後の、２つのピ ーク（ピークＩおよびピーク■）の形成を分析ゲルろ過によって確認した。元の ピーク■は、単一のピークを有する曲線３０のウシ血清アルブミン（分子量６８ ，０００）とミオグロビン（分子量１７，０００）の間乃容碓した。ピークＨの 試料を酸処理すると１曲線３１の２つのピーク、すなわち、１つＬ刺符う容量に あり、いま１つは元のピーク■と同し溶離点にあるピークを示した。これらの条 件下では１生成されたピーク■のパーセンテージは７５χであり、これはリフオ ウルドされた試料の近紫外域部において観察された楕円率の中間値と定性的に合 致する。上記の結果は、ピーク■形態のＩＦＮ−ｒ　４Ａを７門尿素中でアンフ オウルドし、またこれより低い′／相変の尿素によってリフォウルドした場合に 観察した結果と似通っている。

ピークＩの活性はピーク■の１／４から１／８であることを、終始一貫して観察 した。したがって、ピーク■からピークＩを生成すると、ＩＦＮ−γ４Ａの比活 性が低下する。

第４例 クンバク’ｔｌＲ度に対するリフォウルデイングの依存性を検討した。０．１Ｍ の酢酸アンモニウム中の０．５■／ｍｌから４■／ｌ１１１のピーク■溶液を上 記の方法で処理し、近紫外域円二色性スペクトルならびに二次微分スペクトル、 およびゲルろ過によって分析した。タンパク賢′晟度は、２８０　ｎｍで０．６ ５　ｍ７！／（ｍｇ、　ｃｍ）の吸光係数を用いて、３Ｍのグアニジン塩酸塩中 で分光光度定量した。

タンパク質濃度に対する依存性の研究については１円二色性スペクトルを第４図 に示し。

結果を表■に要約する。

表呈 ２８０　ｎｍにおける（ｅ） タンパク勲農度　生成した　−鷹に１ ■／ｍ１　外視−ピーク■（χ）　デシモル　−０．５ｂ　透明　１００　１２ ５ ０．５　透明　８０６６ １　透明　５６２４ ２　透明　２８　−３６ ４　沈澱０　−　− 酸処理後の溶液の外観 ゝ処理していないピーク■ ０遠心分離後、上清にはタンパク質は観察されなかった。

４■／ｍｌｌの試料は、０．１Ｍの酢酸アンモニウムに対して透析を行った後に 多量の沈澱を生じたが、ｐＨ２における溶液は透明であった。このことは、タン パク質をｍ・らリフオウルドした時に、沈澱を生したａｌきたことを示している 。この試料を遠ｌ已−’ｒ＋１し、上清のタンパクＴｏ裂斐を定量したところ、 タンパク質が全て嘱していることを示した。

０．５■／ｍｊ！、１■／ｍｌおよび２　ｑ／ｍ　Ｒの試料について、第４図に それぞａ４０．４１および４２の曲線で示す、これらの円二色性スペクトルは、 第４Ｍの曲線４３に示す元のピークＨのスペクトルとは異なり、タンパク質濃度 に依存している。　２ｎｖ／＋ｎ４の試料は、典型的なピークＩの８叫誹吻に観 察されたものに似たスペトクルを示した。タンパク質の濃度の変化に伴う楕円率 の緩慢な変化を、　２８０　ｎｍにおける〔θ〕の変化として表Ｈに示す。

これらの試料の紫外吸収の二次微分スペクトルを、タンパク賢和文をｈｏ、５　 ａｇ／ｍｌに調節した後に測定した。その結果を第５図にそれぞわ、５０．５１ ．５２および詔の曲線で示す、二次微分スペクトルはタンパク質構造の変化に対 して感受性が強いことが指摘されている。

Ｉｓｈｉｋａｗａ等、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　５ ８０：　１２０−１２８　（１９７９）。

曲線５３に示す元のピーク■のスペクトルは、　２７０　ｎｍから３００　ｎｍ の範囲において、２９２　ｎｍに正のピーク、　２８２　ｎｍならびに２８７． ５　ｎｍにおける負のピークがあることが特徴である。

２　ｗ／ｍ　１の試料の酸処理後のスペクトルは１元のスペクトルとは大幅に異 なり、　２９０　ｎｍに正のピーク、　２８５　ｎｍに負のピーク、そして２７ ５　ｎｆｆ＋（寸近に負の肩があった。これらの特徴はピークＩに特有のもので ある。０．５■／ｍＡおよび１■７ｍｌの酸処理した試料は１元のピーク■と２ ■／ｍｊ！の試料との中間のパターンを示した。これらの円二色性および紫外吸 収の結果は、ピーク■の酸処理によってピークＩが形成されること、またピーク ｌの形成の程変がタンパク質濃度に依存することを示唆している。

表２に、酸処理したピークＨの試料および元のピーク■の試料の分析ゲルろ過の 結果を要約する。元のピークＨの結果は、ピーク■の溶離点における検出範囲内 でタンパク質がが６在することを示している。タンパク’ｔｌＲ度が高いほど、 ピークＩの形成が促進された。

ピーク■の形成はタンパク質の会合によるため、４■７ｍｌにおいて律した完全 すン“５：Ａはビ、−り■を形成する会合力堪だしく促進し、沈澱するほどの大 きさにまで達したためとも考えられる。これらの結果は、タンパ久質濃度が高い 状態でビーク■力場数ｙ里を受けるとピークＩの形成が高まるという１円二色性 および紫外吸収が示した結果を確認するものである。１■／ｍ１２の結果（表１ ）は、前例におけるピークＩの形成が２５χであったのに対して、４４χの形成 を示しており、こ孔はピーク■の形成がアンフォウルデイングおよびリフォウル テ゛イングの実際の手１石に幾分か依存することを示唆している。

第】例 グフオウルデイングに対する溶媒の影響ＩＦＮ−１４Ａを５　ｍＭゾリン塩（ｐ Ｈ７）および０．０１　＄陵アンモニウムならびにＯ，］、Ｍ酢酸アンモニウム 中でリフォウルデイングした。ゲルろ過分析および円二色性分析の結果を表形成 された　２８０　ｎｍにおける〔θ〕タンパク質　リフォウルデイング　ピーク ■′″　は二臼しンＲｆＫ　■／！！Ｌ　Ｍ傭媒　％＠ニー　χ　−テ′シモル ０．５　５−リン酸塩（ｐＨ７）　Ｗｉ明　１００　１２６２　５　ｍＭ　’） ７ｍ塩（ｐＨ７）　沈澱ｂ１ｏＯｃＯ，５０，０１１酢酸アンモニウム　透明　 １００　１．２４２　０．０１Ｍ　酢酸７ンモニウム　透明　９０　１０９０． ５　０．１Ｍ酢酸アンモニウム　透明　８５９２２　０．１Ｍ禮アンモニウム　 透明　４７７１　全ン容離タンパク質田１のピークＨのパーセンテージ。

５　ｍＭゾリン塩（ｐＨ７＞における２■／ｌ１１１の試料を除いて、実験した 溶液はいずれも酸処理後に沈澱を生じなかった。２■／ｍｌの試料は、全タンパ ク質の２７χ力６し９分析ゲルろ過によって定量したところ９上清に残っている タンパク質はピーク■であった。　４０　ｍＭのリン酸塩（ｐ）１７）をリフォ ウルデイングに用いた場合は、０．５■／ＩＩＩＡの試料はタンパク質の約加χ 力Ｗし、可ン絡生分画はピーク■であった（データは示していない）。これらの 結果は５　ｍＭゾリン塩の場合と同様であるが、リン酸塩濃度が高いほどタンパ ク質の沈澱を生ずる効果が高まるようである。

タンパク質濃度が５■７ｍａｌの試料は、５＋ｎＭリン酸塩および０．０１　Ｆ 　酢酸アンモニウムの双方についてピーク■を１００χ形成した。分析ゲルろ過 および円二色性スペクトルが示すところでは、０．１Ｍ酢酸アンモニウムではピ ーク■の形成は１００　％を下回った。この傾向は２■７ｍｌのタンパクＷにお いても観察されたが、５ｍＭリン酸塩は上述したように沈澱を生じた。これらの 結果は、低いイオン強度■ち、０．１Ｍ酢酸アンモニウムと比べて５　ｍＭゾリ ン塩および０．０１　圧醒浚アンモニウム）は、ピーク■の形成に有利であるこ とを明確に示している。

タンパク質濃度が２■／ｍ７！の試料を５　ｍＭゾリン塩と０．０１　噸渭浚ア ンモニウムでそれぞれ処理した結果の比較は、前者の？ｇ某もまた観察したよう な沈澱の形でピーク■の形成をきたすということを示唆している。これが正しけ れば、２■／ｌａｎにおけるＩＦＮ−ｒ　４Ａを用いた場合は、５ｍＭリン酸塩 中でのピーク■の形成は７３χであり、この値は０．０１Ｍ酵アンモニウムで観 察したイ直よりほんの僅力ＶＪＸさいものである。これは５ｍｍゾリン酸塩よび ０．０１　Ｍ＠ａアンモニウムがピーク■を形成する能力が共に４１っているこ とを示唆している。０．１１１酢酸アンモニウム中の２　ｗ／ｍ　ｉｔの試料の 結果（４７χのピーク■の形■は、同じ条件下での先例の結果（！ｉＥｎ、２８ χのピーク■の形■と僅かに異なり１この差異も。

条件によって幾分か変化する可能情勢（あることを示唆している。

第旦例 ピークＩおよびピーク■の可ｉ９＋４：に対する溶媒の影響。

上記の結果は、酸処理後のＩＦＮ−１４Ａのりフォケルデイングカ朝楽系に依存 し、またリン酸塩緩衝液力社澱を生じさせることを示唆した。したがって、　２ ０χのピーク■を含む０．１と酢酸アンモニウム中のピークＩの調製液を種々の 溶媒に対して遇折することにより、ピーク■の沈澱の可能性を調べた。表■ｖに 示す結果は、検査したリン酸塩緩衝液の全てについて８０χ近くのタンパク力Ｗ したが、水性酢酸アンモニウムでは沈澱が起きなかったことを示している。リン 酸塩緩衝液試料のゲルろ過分析および二次微分スペクトルは、上清の中のタンパ ク質が全タンパク質のおよそ２０χであり、ピーク■であることを示した。この パーセンテージは、出発Ｍ中に存在する量に等しく、リン酸塩緩衝液は試料中の ピークｌおよびピーク■の率に影響することはない力（ピークＩを完全に沈澱さ せることを示唆している。

さらに１表ＩＶに示す結果は、　０．１　Ｍ酢酸アンモニウムに対して透析した 場合に、ＩＦＮ−ｒ４Ａの８０χはピークＩの４だ歩に止まったことを示してい る。これは、０．１Ｍ酉隨アンモニウム中でのピークＩからのピークＩ＋の形成 力俳常にゆるやかに起こるカ吠きくないという前記の観察と合致する６表Ｉｖの 最後の欄は、これらの溶媒中で観察したピークＨのパーセンテージを示している 。０．ＯＩＭ酩アンモニウムの場合を除いて、これらのパーセンテージはおよそ ２０χで一定しており、したがって出発物質中にあったピークＨの量に等しい。

結果は、これらの溶媒がピーク■対ビーク■の比率を変化させないという点で一 致するが、リン酸塩ＩＨ種ｒ液がピーク■の沈澱を生しる一方、　０．１　？Ｉ 酢酸アンモニウムはそのような影響力を持たないという点で異なることを示唆し ている。

飢 上滑中の　上清中の　全タンパク質 タンパク質　ピーク■の　における −一桜媒−−−−−−　外観　χ　Ｐ　ピーク■のχ５　ｍＭ　’Ｊ　７耐υ話 （ＰＨ７）　？昆ｉｆ５　２０　１００　２０４０　ｍＭ　’Ｊ　７９塩（ｐＨ ７）　沈ｅａ　２０　１００　２０ＰＢＳ　’　沈澱　１５　１００　１５０． ０１　Ｍ　酢酸７ンモニウム　透明　ｔｏｏ　５５　５５０．１Ｍ酢酸７７　モ ニウム　３３明　１００　２０　２０１分析ゲルろ過によって定量した。

ｂｏ、１５　Ｍ　塩化ナトリウムを含んだ５　ｍＭゾリン塩（ｐＨ７）。

０．０１　ｉｌｌアンモニウムを用い加護は、その他の溶媒を用いた場合とは異 なるものであった。分析ゲルろ過によって定量したところ、透析の間に、サンプ ル中のピーク■の量が２０％（出発物質）がら５５％に増した。この結果は、低 いイオン強度がピークＩの解離を促進すること従って、ピーク■が形成されると いう前記の観察に一致するものである。

一方、０．５〜２ｍｇ／ｍｆｆのピーク■を同じ方法で処理したが、いがなる溶 媒系に対しても沈澱は見られなかった俵示していない）、ピーク■は１分析ゲル ろ過ならびに二次微力・スペクトル分析優示していない）による定量によると、 その大きさと構造を保持した。

ピークＩの溶解度は嘗舅某中に存在するイオン種の種類によって異なるものと思 われ５ｍＭのＣａＣ１ｔを含有する０、１Ｍの酢酸アンモニウム、　ＨＣＩで滴 定した５＋＋＋Ｍの炭酸塩（ｐＨ７，５）、および５１のＮａｔＳＯａを含有す る０、０１　？Ｉの酢酸アンモニウム等を用いて試験を行った＊５＋ｉＭのＮａ ｚＳＯ−（ｐＨ７，０）を含有する０、０１肋酢酸アンモニウムを除いて。

これらの溶媒のいずれも沈澱を起こさなかった。

用いたｐ）ｌにおいては、ホウ酸塩および炭酸塩は主にｍ個イオンとして存在し 、一般的に一価陰イオンはピークＩの沈澱を生じないことを示唆している。また 、ニイ旨場イオンＣａ１−もこのような作用が無い。ＮａｚＳＯａ含有溶媒は、 約５％の沈澱を引き起こしたが、これは出発物質中に存在するピークＩの量に等 しい。

リン酸塩緩衝液を用いた場合にも同様な語法め碍られる。この溶媒およびリン酸 緩衝液ば二価陰イオンを含有し１またＩＦＮ−γ４Ａの等電点は非常に高いので 、この結果は。

二価陰イオンが、正に電荷したＴＦＮ−γ４Ａのクロスリンカ−（ｃｒｏｓｓ− ］　１ｎｋｅｒ）として作用し、さらにすでに凝集しているビークＩ分子間がさ らＣ’４給するのを促進することを示唆している。５百１のリン酸塩、または５ １のＮａｔＳＯａを含有する０、０１Ｍ酢酸アンモニウムのイオン強度は低いた めに、これらのＷはピーク■の生成を高めることが予測されるが、こｔｔＪ＄Ｊ に反する。二価陰イオンの架橋結合の影響は、低イオン強度による角を禿の影響 を圧倒することが考えられる。

第１例 シュリーレン光学系（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ　ｏｐｔｉｃｓ）および温度制御装置 を備えた限外遠尼＠５ｐｉｎｃ。

Ｍｏｄｅｌ　Ｅを用いて、沈降速度実験を実施した。水晶窓を備えたアルミニウ ム充填ｅｐｏｎダブルセクターセンターピース（ａ１ｍｉｎｕｍ４ｉ１１ｅｄ　 ｅｐｏｎ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｅｃｔｏｒ　ｃｅｎｔｅｒｐｉｅｃｅ）を用いた。

実験は全て２５″″Ｃで敲した。

沈降の早いピークは、おそらくピークＩに対応するものであり、２〜５　ｍｇ／ 　ｎ７！の０．１門酢酸アンモニウム中での沈降定数は％Ｏｓであった。沈降の 遅いピークは、おそらくピーク■であり、ゼロタンパク質濃度に外挿した場合の 沈降定数！ｇ、８ｓであった。

サンプル中の２つの沈降ビークの比は、タンパクｍ′−変とは関係がないように 眉、われ。

２つの形態ハき激に可逆可能な自己会合を起こしていないことを示している。

第旦例 ＩＦＮ−Ｔ　４ＡｔＭ製剤の抗ウィルス作用を、標準細胞笈旧佼が財丸キ（ｓｔ ａｎｄａｒｄ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ　ａｓｓａｙ）を用いて調べ た。ＨｅＬ禰胞を、上記の精製を行ったＩＦＮ−γ４Ａ調製斉］、あるいＩ＝斜 ｊ馬路を用いて処理し、その後にＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｓウィル スで試した。この標準品は、天然ＩＦＮ−ｒＡＪｊｌ製剤であり、　Ｉｎｔｅｒ ｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、から入手可能であり。

Ｎ１）１　ｉ準（Ｇｇ−２３−９０２−５３０）に対して検定されている。比較 のために、ピークＩとピーク■の物質は常に同じ時間に検定を行った。精製した ＩＦＮ−ｒ　４Ａ１１製剤は、　ｐＨ６，９，温度４″Ｃの０．１？ｌ酢酸アン モニウム中に保存した。

同じ希釈度では、ピーク■はピークＩよりも２〜３倍の高い滴定濃度を示した。

これは５タンパク１ｍ度を考慮した場合、ピーク■のほうが４〜８倍活性が高い ことを示している。ピークＩとピーク■との差異のこの大きさは、別のｉ屏製斉 １についても一貫して観察された。

ピーク■について観察された抗ウイルス性比活性の範囲ＩＬ　０．５　Ｘｌ０７ 〜２ｘｌＯ’　１１／ｍｇであった。ピークＨについては、観察された抗ウイル ス性比活性の範囲は＋　６　ＸＩＯ’ビーク■のアンフォウルデイングおよびリ フォウルデイング。

上記の結果から、ピーク■物質は、ビーク■力゛９夛によってアンフォウルドさ れ、さらにｐ！（を中性まで高めることによってリフォウルドされる時に形成さ れることが明らかになった。ピーク■のほうが活性力潤いので、ピークＩを出発 物質として用いた場合にピーク■の生成が促進されるかどうかを調べることが望 まれる。

０．１Ｍ腔アンモニウム（０，３ｍｇ／　ｍ６）中のビークｌ８１ｆｆｌ剤の紫 外吸収スペクトルには、第６図の曲線印が示すように、大きな光の散乱が見られ ることから、試料が相当にｉしていることを実証している０曲翁巧０の二次微分 は、第７図の曲線７０が示すように、ピーク■とピーク■の混合物のスペクトル に似通ったスペクトルを示す。実際のところ、ゲルろ過分析によって、このビー ク１３１１製斉］には、　４０％のピーク■が存在していることがわかった。こ のピーク■の試料を酸に対して透析し、その後０．０１　Ｍ酢酸アンモニウムに 対して退所を行った。ピーク■からのピークＨの生成は、　０．１　Ｍ　酪アン モニウムよりも０．０１　Ｍ酢酸アンモニウムにおいてずっと早く生じるので、 　０．０１　道耐俊ア酸処理後の０．０１　Ｍ酢酸アンモニウム中のピークＩの 紫外吸収スペクトルには、第６図の曲線団に示すように、出発物質に見られた種 類の光の散乱が見られる。二次微分スペクトルは、もとのピークＩスペクトルに 実験誤差内で一致するものであった。これらの結果は、ゲルろ過分析によっても 確認されるように、ビークＩ試料の酸処理前後の３次構造および凝集状態には変 化がないことを示している。これは、酸処理がピーク■およびピーク■の比率に は影響を及ぼさず、さらに酸処理後にこの緩衝液に対する透析を行った際に０． ０１１’ｌ酢酸アンモニウムによってピーク■からピーク■が大量に生成されな いことを示している。

出発ＭとしてピークＩまたはピーク■を用いるかどうかにはかかわらず、この処 理が同じアンフォウルデイング状態をつくることができるのならば、前述の低タ ンパク譬濃度（０，３ｍｇ／　ｍ７りにおいて、リフォウルデイング溶媒として ０．０１　Ｍ　１ｍアンモニウムを用いて１００％のピーク■を生成することが できるであろう。したがって、ｐＨ２におけるピークＩおよびピーク］の構造を 、紫外吸収スペクトルおよび二次微分スペクトルによって比較した。二次微分ス ペクトルＧＨ即は９曲線７１で示すピーク■と１曲線７２で示すピーク］につい て非常にイ防勇っており、勘りピーク■とピーク■の３次構造を同じようにアン フォウルドすることが分かる。しかし、第６図の曲Ｗ３２に示すピークＩの紫外 吸収スペクトルと、第６図の曲線団に示すピーク■のそれとは非常に異なってい る。ピーク■は、酸中において光の散乱が見られないが、ピークＩはまだ大きな 光の４Ｌを呈している。これは１酸力（ピークＩをピーク■と同し程度にアンフ ォウルドする承トはできるが、ピークＩをｊＥｔＩ’ｉ−ることができないこと を示唆している。このように。

：：′− 一発試料中に存在するビークＩ形態は、酸中でその凝集状態を維持し、動く取り 除かれると同し構造を再形成し、さらに出発試料（Ｘ”ｉ　０．１２　ｍｇ／　 ｍｆｆ１）中のビーク■形態は。

酸中でアンフォウルドされ、ピーク■にリフタウルドされる。このように、酸処 理によっては、ピーク■に対するピークＨの比率の変化は起きない。

クロマトグラフィー精製を行ったピークＩまたはピーク■、あるいはその混合物 を。

０．１門酢酸アンモニウム、７？Ｉ尿素中でアンフォウルドし１それから種々の 条件のもとでリフオウルドした。７−尿素は、タンパク質がピークＩまたはピー ク■形態のいずれであってもアンフォウルドするので、その結果はいずれの試料 を使用するかには関係がない。したがって、出発物質としてピーク■を用いた場 合の結果だけを示すやその結果を表■に示す。

表ｙ タンパク質　生成した′　スペクトル 大部　匝操痛煤　置換方法　１慮：！しぐ！Ｌ　ピーク■　（％）　特性１　０ ．１門　退所　２　０（厨　ピーク■２　０．１門　透析　１　５０％　混合３ ０．１門　希釈（５倍）　１　８０％　混合４　０．１！’ｌ　希釈（６（）ｆ 合）　１　９５％（概釦　ピーク■５　０．０１門　希釈（５倍）　１　９８％ 　ピーク■６　０．０１？ｌ　希釈（Ｗ倍）　１　１００％　ビーク■１ピーク Ｉは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、７門尿素中で生成され、それか頓霜陵アンモ ニウム水で透析または希釈を行った。溶媒置換に使用される緩衝液は１表示した 濃度の酢酸アンモニウムであった。

０．１１酢酸アンモニウムおよびｌＦＩ尿素中の表■に示したＹ相変のピーク１ タンパク質に．固形尿素を加えて尿素を７Ｍとし．これを２時間放置し，それか らｓ斤または希釈を行って尿素の濃度を低下させた。実験１および２を比較した 場合．タンパク質濃度の低い方がビーク■が生成しやすいことは明白である．こ の特性は２タンパク質濃度も希釈によって低下した実験３および４においても明 白である、しかし．実験４に見られるように，２５％を上回るビーク■を生成す るには，希釈冫猾勘１．Ｉ　Ｍ　禮アンモニウムの場合には，タンパクｍ８隻を 約０．０１５　ｍｇ／　ｍｆｆまで低下させる必要がある。一方．実験５　（ｎ 　０．１８　ｍｇ／　ｍｅに相応するインターフェロンの希いおよび実験６は， １０　ｎ＋Ｍの禮アンモニウムを使用する場合には，５〜ｌＯ倍の希釈において ，ほとんど１００　％のビーク■が形成されたことを示しており，これらの希釈 係数はＯ．］．Ｍ酢酸アンモニウムの場合に用いた希釈イｍよりもずっと小さい 。したがって．置換溶媒のイオン強度をイ帳威すればピーク■が生成しやすくな るといが割釧こなる。

本発明の望ましい実施態様を示して本発明を説明したが，本発明の前述の実例を 検討すれば，当業ａ’ｉｌｉＪＦＰ｛ｔ替えを思いつくことは可能であろう。

例えば，天然ＩＦＮ−γの酸に対する不安定の機構は．組換えＩＦＮ−　ｒ　４ Ａについて得られた結果から推測することが可能であろう。天然タンパク質力領 摸えタンパク質と同し挙動を示すと想定した場合には，たとえ出発試料にビーク ■形態だけが含有されていた場合でも，天然タンパク質の酸処理後にはビーク■ とピーク■の双方の形態が生じると思われる。高分子量の不純物が存在すると， 例えば，タンパク質の凝集を促進する除外容量の影響が生し，ビーク■状形態の 形成が促進されるものと思われる。Ｍｉｎｔｏｎ，　町卯斜カｅｒｓ，　２０： ２０９３−２１２０　（１９８１）　ｉ　ＬｅＬ４，　町迦Ｉヌ．　１８：５５ １８−５５２６　（１９７９）　．ピーク■は，？−ＥＰＥ検定においては，終 止一貫してビーク■よりも４倍から８倍活性が高いことが観察された。したがっ て．ビーク１の形成は抗ウィルス作用の４ｆｍを招くはずである。リン鏝夏衝液 をリフォウノケイング冫舅某としてイ吏用する場合には．舌生の低下はさらに大 きなものとなろう。なぜなら，１ル′酸塩緩衝液がビーク■を沈澱させる；とが 示されており，さらにこのような杖潟イクビークＩの生物学的活性の完全喪失を ひ１６〜匹理等の要因のために，組換えタンパク質とは異なる挙動をすることが 無いと＝言えない。

さらに，分子間の二硫化物結合か生じる可能性があるインターフェロンの形態（ たとえば，ｒ成７ｊｆｊ」ｒｌＦＮ−Ｔ等）においては，ジチオスレイ１−−ル （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ　ｔｏｌ）等の還元剤をアンフォウルデイングまたは 希釈段階で添加することによって１このような結合を防ぐことが出来るゆ 先にも述べたように，ピーク■吻質をビーク■構造にｒ変換ｊすることは，本発 明の創図するところである。また，重量比が例えば，　９５：５，　９０：］． ０，　８０：２０，　７０：３０あるいは６０　：　４０のピーク■およびビー ク■の分画の混合または共存によって非常に有用な組成物を得ることも木発明の 意図するところである。

したがって，本発明は，請求の範囲に述べる発明の範囲に含まれるすべての同等 な変更を含むことを意図するものである。

波長（ｎ　ｍ） 第１図 ２５０　２６０　２７０　２ａＯ　２Ｘ）　３００　３１０波長（　ｎ　ｍ　） 第２図 波長（ｎｍ） 波長（ｎｍ） 第５図 吸収度 ２次微分 国際調査報告 １ｍｅ＋仙ａｎｉｌ＾ＤＤｌ１ｃｍｌｉａｎＮａ、　ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７ ２３

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．組換えヒト免疫インターフェロンから成る物質の組成物で，中性ｐＨの水性 溶液中において，約２５９ｎｍ，２６６ｎｍ，２８０ｎｍおよび２８７ｎｍに正 帯，約２７０ｎｍおよび２９２ｎｍに肩がある近紫外円二色性スペクトルを有す るもの。
2. ２．請求の範囲第１項記載の物質の組成物で，組換えヒト免疫インターフェロン ４Ａから成るもの。
3. ３．請求の範囲第２項記載の物質の組成物で，約３０，０００から約４０，００ ０の範囲の分子量を有するもの。
4. ４．請求の範囲第３項記載の物質の組成物で，前述のヒト免疫インターフェロン ４Ａが約２．８Ｓの沈降定数を有するもの。
5. ５．請求の範囲第４項記載の物質の組成物で，前述のヒト免疫インターフェロン ４Ａが，２８２ｎｍおよび２８８ｎｍに負のピークがある二次微分スペクトルを 有するもの。
6. ６．請求の範囲第５項記載の物質の組成物で，前述のヒト免疫インターフェロン ４Ａが，約２０９ｎｍおよび約２２０ｎｍに最小値がある遠紫外円二色性スペク トルを有するもの。
7. ７．インターフェロンを精製する方法で，セファデックスＧ−７５カラムから取 り出した分子間の共有結合のない凝集した状態のインターフェロンを精製する段 階と，分画を変性剤を含んだ溶液中でアンフォウルドする段階と，インターフェ ロン濃度を１ｍｌ当たり約０．１８ｍｇ未満とするために，この溶夜を希釈する 段階，および ダイアフィルトレイションによって希釈溶液を濃縮する段階とから成るもの。
8. ８．請求の範囲第７項記載の方法で，さらに変性剤を含有する溶液のイオン強度 を低減する段階から成るもの。