PT90321B - Processo para a preparacao de polipeptideos de veneno de vibora - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE POLIPEPTIDEOS DE VENENO DE VI BORA polipeptideos são descritos e expressos como proteína de fu são usando o vector de expressão pJC264 em E. coli.

Os polipeptideos atrás referidos são preparados quer por métodos de purificação a partir de vene no de víbora quer utilizando métodos sintéticos de obtenção de polipeptideos através de meios de produção recombinantes adequados.

invento está relacionado com polipeptídeos para a inibição da agregação de plaquetas.

Campo do invento

Fundamento do invento

Este invento de um modo geral relaciona-se com a modulação da adesão de células e com a inibição de ligação do fibrinogénio e outras proteínas a plaquetas sanguíneas e inibição da agregação de plaquetas sanguíneas. 0 fibrinogénio é uma ficoproteína, presente no plasma sanguíneo, que participa na agregação de plaquetas e na formação de fibrina. As plaquetas são fragmentos anucleados tipo células, encontrados no sangue de todos os mamíferos e que participam na coagulação do sangue. Sabe-se que a interação do fibrinogénio com um receptor, o complexo de g1icoproteínas I Ib/IIIa da membrana de plaquetas, é essêncial ao funcionamento normal das plaquetas .

Quando um vaso sanguíneo é danificado, as plaquetas aderem à superfície sub-endotelia 1 atingida.

> Subsequentemente as plaquetas aderentes 1ibertam constituintes biológicamente activos e agregam. A agregação é iniciada pela ligação de agonistas, tais como trombina, epinefrina ou ADP a receptores da membrana das plaquetas. A estimulação por agonistas resulta na exposição de receptores do fibrinogénio latentes na superfície das plaquetas e ligação do fibrinogénio ao complexo de glicoproteínas Ilb/IIIa.

Têm sido feitas tentativas para usar produtos naturais e peptídeos sintéticos no estudo do mecanismo de agregação e adesão de plaquetas. Proteínas inibidoras da agregação de plaquetas foram isoladas a partir de uma variedade de venenos de víbora. No entanto, estudos do mecanismo da inibição da agregação de plaquetas por estas proteínas tem sido entravado pela ausência de informação estrutural .

Recentemente, um peptideo de veneno chamado trigramina foi caracterizado com algum detalhe (ver Huang et a 1., J. of Bio 1 . Chem. 1987, 262, pág. 16157-16163 e U.S. N⁹ de Série 121.972, entregue em 18 de Novembro de 1987). 0 peptideo foi descrito como inibindo competitivamente a ligação do fibrogénio ao complexo de g1icoproteínas Ilb/IIIa na membrana de plaquetas. 0 peptideo contem uma sequência Arg-Gli-Asp que se pensa estar perto do resíduo COOH-termi na 1 .

Rouslahti e Pierschbacher, Science, 1987 238, pág. 491 -497, descrevem proteínas adesivas tais como fibronectina, vitronectina, osteopontina, colagénios, trombospondina, fibrinogénio e o factor de von Willbrand presentes em matrizes extrace1u1 ares e no sangue. As proteínas contêm o tripeptídeo arginina-g1icina-ácido aspártico como o seu sítio de reconhecimento celular. Os tripeptídeos são reconhecidos por pelo menos um membro de uma família de receptores estruturalmente relacionados, integrinas, as quais são proteínas heterodiméricas com duas subunidades que atravessam a membrana. Os autores sustentam que a conformação da sequência tripeptídica nas proteínas individuais pode ser crítica para a especificidade do reconhecimento.

Cheresh, Proc. Nat'1 . Acad. Sei. uSA, 1987, 84, pág. 6471-6475, descreve um receptor de adesão dirigido Arg-Gli-Asp expresso por células endoteliais humanas que é estruturalmente semelhante ao complexo Ilb/IIIa das plaquetas mas antigénica e funcionalmente distintos. 0 receptor está directamente envolvido na ligação do fibrinogénio, factor de von Willebrand e vitronectina às células endoteliais.

Pierschbacher e Ronslahti, J.of Biol .

Chem., 1989, 262, 36, pág. 17294-17298 descrevem a influência da esterioquímica da sequência Arg-Gli-Asp-Xaa na especificidade da ligação de peptídeos contendo a sequência tripeptídica Arg-Gli-Asp. Nos Proc. Nat¹!. Acad. Sei Usa, 1984 81 , págs. 5985-5988, os mesmos autores descrevem variantes do sítio de recomhecimento celular da fibronectina que retem a actividade promotora da ligação. 0 tetrapeptídeo Arg-G1i-Asp-Ser- está descrito como a estrutura mínima reconhecida pelas células na grande gl icoproteína adesiva que é a fibronectina. Peptídeos tendo fracções Arg-Gli-Asp-Serestão descritas nas Patentes U.S. Nos. 4.589.881 e 4.614.517. Peptídeos tendo fracções-Arg-Gli-Asp-R em que R é seleccionado entre Tre ou Cis ou outro aminoácido tendo a mesma actividade de lgiação a células como a fibronectina, estão descritos na Patente U.S. N^e 4.578.079.

Ruggeri et^ a 1 . , Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 1986, 83, pág. 5708-5712, descrevem uma série de peptídeos sintéticos, projectados com comprimentos de 16 resíduos que contém a sequência Arg-Gli-Asp-Va1, a qual inibe a ligação do fibrinogénio às plaquetas.

Gold et a 1. , Circulation, 77, 3, março de 1988, pág. 670-677 descreve os eleitos de injecções tipo bolus de activador do plasminogénio tipo tecido, de cadeia simples e recombinante e fragmentos F(ab')₂ de um anti-corpo monoclonal de ratinho (7E3) contra o receptor GPIIb/IIIa de plaquetas humanas sobre trombólise e reoclusão de artérias coronárias. Gold et al., encontraram que a injecção de fragmentos F(ab¹)₂ do anticorpo monoclonal 7E3, dirigido contra o receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, acelera a trombólise com activador do plasminogénio tipo tecido, de cadeia simples e recombinante e evita a reoclusão.

Se bem que seja conhecido que a sequência tripeptidica Arg-Gli-Asp está presente em certos polipeptídeos que podem duplicar ou inibir os efeitos de potenciação

-6da ligação celular de fibronectina e vitronectina, pouco se compreende da Influência de outros aminoácidos do polipeptídeos sobre a especificidade da ligação. Os requerentes desta patente identificaram e purificaram polipeptídeos que constem a sequência tripeptídica Arg-Gli-Asp, os quais são inibidores da agregação de plaquetas e possuem resíduos císteina especificamente posicionados relativamente à posição do tripeptídeo. A localização específica dos aminoácidos císteina para influênciar significativamente a capacidade destes polipeptídeos para inibir a agregação de plaquetas.

aparecimento de métodos reprodutíveis e equipamento para a síntese química de longos oligodesoxinucleotídeos tornou a síntese de genes uma alternativa possível para o isolamento e expressão de genes naturais (Caruthers, Sc i ence, 230 ( 1985 ) págs. 281-285; Ferretti et a 1 . , Proc, Nat' I . Acad. Sei USA, 83 (1986), pág 599-603; Wosmick et a 1., Gene, 60 ( 1987) pág. 115-127; Nassal, Gene, 66^ ( 1988 ) pág. 279-294; Bell et aj_. Gene 63 ( 1988 ) pág. 155 -161). A técnica é especialmente útil para a expressão e alteração de pequenas proteínas naturais. No entanto, muitas proteínas eucarióticas num hospedeiro bacteriano não são estáveis (Taniguchi et a 1., Proc. Nat¹1 Acad.SCi. USA, 77 ( 1980), pág. 5230-5233 ; Davis et a 1., Proc. Nat¹1 . Acad . Sei USA 78 ( 1981 ) pág. 5376-5380; Shen, Proc. Nat¹ 1 Acad. Sei. USA, 81 (1984) pág. 4627-4631; e Lennick et a 1 . , Gene, 61 (1987) pág. 103-112). Uma estratégia frequentemente usada para ultrapassar a instabilidade é fundir o gene com interes se com uma sequência nucleótidica codificadora de uma proteí na bacteriana para produzir uma proteína de fusão, protegendo assim a proteína eucariótica. Foram descritos muitos rea gentes químicos a proteases que clivam uma variedade de sítios de aminoácidos em proteínas de fusão. 0 brometo de cianogénio eficaz e selectivamente cliva em metionina (Savige et a 1. , Methods in Enzymoiogy, Hirs e Timashelff eds. Acadmie Press, New York, 47 ( 1977 ) pág. 459-469; Nagai et a 1 Nature, 309 (1 984) pág. 610-812; Szoka et a 1 ., DNA, 5_ (1986) pãg. 11-20; e Haffey et a_l . , DNA, 6 ( 1987) pág. 565-57 1 ).

Sumário do Invento presente invento compreende polipeptídeos antagonistas de receptores do fibrinogénio caracterizados por inibirem a ligação do fibrinogénio a plaquetas e por terem a fórmula geral I:

X-Cis-R-R-R-Arg-G1i-Asp-R-R-R-R-R-Cis-Y (I ) onde X é H ou pelo menos um aminoácido; Y é OH ou pelo menos um aminoácido; e cada R, iguais ou diferentes é qualquer aminoácido.

Os polipeptídeos dentro da fórmula I incluem os da fórmula Ia:

H₂N-(Ch)-Cis-R-R-R-Arg-G1i-Asp-R-R-R-R-R-Cis-(Cx)-H (Ia) onde Ch representa pelo menos um aminoácido; Cx representa pelo menos um aminoácido, e cada R-, iguais ou diferentes, representa um aminoaóido.

Os pol ipeptldeos do in/ento foram purificados a partir de veneno de várias víboras, e.g. Trimeresurus gramineus, Echis carinatus, Agkistrodon piscivorus, Bitis arietaus e Eristocophis macmahonii. Estes polipeptídeos são úteis na inibição da lgiação do fibrinogénio a plaquetas humanas e na inibição da agregação de plaquetas humanas induzida pelo fibrinogénio.

Estes polipeptídeos foram purificados a partir de veneno de víbora de acordo com o processo de purificação descrito abaixo. Eles são ricos em cisteina e con têm a sequência comum-Cis-R-R-R-Arg-G1i-Asp-R-R-R-R-R-Cis-,

-8onde cada R, iguais ou diferentes, representa qualquer aminoácido .

Se bem que os requerentes não pretendam estar ligados a qualquer teoria particular relativa ao mecanismo de ligação, pensa-se que a localização de aminoácidos císteina desempenhe um papel importante na determinação da conformação tridimensional, grau de rigidez e especificidade de ligação dos polipeptideos.

presente invento também compreende um gene ou equivalente degenerado codificador de um inibidor da agregação de plaquetas da fórmula geral:

X-C i s-R-R_R_Arg-61i-Ash-R-R_R_R-R-C is-Y onde X é H ou pelo menos um aminoácido; Y é OH ou pelo menos um aminoaóido; e cada R, iguais ou diferentes, é qualquer aminoácido.

Um gene preferido do presente invento codifica equistatina modificada. A equistatina ê definida como:

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr

A metionina na posição 28 da proteína nativa foi substituida por leucina na equistatina recombinante. 0 gene sintético foi expresso em ji. co 1 i (MB-5385, ATCC Ν^θ de Acesso 67873, depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklavin Drive, Rockville, MD20852 U.S.A.) usando um vector de expressão pJC264, que foi constituído da inserção de fracções do complexo de genes cheB e cheY de jí. col i no plasmídeo pUC13 (U.S. N^? de Série 145.800, entregue em 5 de Novembro de 1988). Microorganismos da estirpe foram depositados sob o tratamento de Budapeste e quaisquer restrições acerca da disponibilidade da patente ao público do microorganismo depositado serão irrevogSvelmente removidas quando do pagamento da patente. Conseguiu-se um nível de expressão elevado do gene da r-leu 28-equistatina. Ieu28-equistatina recombinante foi libertada da proteína de fusão por clivagem com brometo de cianogénio na metionina genéticamente inserida entre a proteína Chey e a equistatina e purificada até à homogeneidade pro HPLC de fase reversa e reenrolada. A r-leu 28-equistatina reenrolada não se distingue da equistatina nativa na inibição da agregação de plaquetas, sugerindo que a metionina na posição 28 não é esêncial para a actividade biológica deste inibidor da agregação de plaquetas.

invento também inclui composições para a inibição da agregação de plaquetas usando proteínas do invento e vectores de expressão úteis para a produção de proteínas recombinantes do invento.

invento também inclui polipeptídeos sintéticos da fórmula I e métodos de síntese.

-10Fig, 1 - Sequências de nucleotideos e de aminoácidos da

Leu28-Equistativa recombinante

Breve descrição das Figuras

Os oligodesoxinucleotídeos sintéticos individuais foram marcados com linhas a cheio e numerados entre parêntesis. 0 primeiro aminoãcido, metionina, na sequeficia N-terminal da proteína foi projectado para clivagem com brometo de cianogénio. 0 codão de paragem no extremo C da proteína está indicado por um asterisco. Em ambos os extremos 5' e 3' estão sítios EcoRI para inserção no vector de expressão.

Fig. 2 - Estrutura do vector de expressão pJC264

A construção do vector de expressão pJC264 e inserção do gene r-leu28-equistatina no vector estão discutidas na Descrição Detalhada do Invento. A. A estrutura de pJC264. Asequência derivada de pUC13 está indicada por setas . 0 promotor-operador 1ac de E .coli em pUC13 precede o gene cheB e a direcção da transcrição está indicada por uma seta. 0 gene cheB (450 pb) e o gene cheY ( 263pb) estão apresentados com linhas duplas e uma caixa sombreada, respectivamente. 0 sítio EcoRI no qual foi inserido o gene r-leu28-quistatina estã apresentado. Β. A sequência de DNA entre o sítio PstI de cheY e o sítio de clonagem EcoRI, mostrando os aminoácidos codificados.

Fig. 3 - Análise por SDS-PAGE da produção bacteriana de proteínas de fusão de Ieu-28-equistatina recombinante

E .coli JM109 contendo o vector de expressão da equistatina pJC264 foi cultivada em meio LB contendo 200 ^g/ml de ampicilina. Quando a densidade celular atingiu uma leitura de Οϋθθθ de 0,2 iniciou-se a indução da expressão adicionando IPTG ao meio para uma concentração fi-11 -

nal de 1 mM. Retiraram-se amostras das culturas que se centrifugaram numa centrífuga Eppendorf a diferentes tempos após indução. Os sedimentos foram suspensos em tampão de amostra para SDS-PAGE contendo 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,2% SDS, 75 mM ditiotreito 1, 10% glicerol e 0,05% de azul de bromofenol. As amostras foram aquecidas a 100°C durante 15 min. e depois centrifugados numa centrífuga Eppendorf antes da aplicação num gel de gradiente de po1iacri1amida e SDS.

Os lisados equivalentes a 100 ul de cultura saturada (ODgoo ^{= 1}>8) foram analisados no gel. As proteínas foram detectadas por coloração com azul Coomassie. Faixas F-J: lisados de culturas induzidas durante 0,2h, 4h, 6h e 16h respectivamente; Faixa E: sedimento sonicado de aproximadamente 150 ul de cultura após 16h de indução; Faixa D: Lisado de 100 ul de cultura saturada derivada de células transformadas com o vector de expressão testemunha pJC264 não possuindo o gene r-leu 28-quistatina ; Faixa B: 8 jug de equistatina nativa; Faixa C: 8 pg de leu-28-equistatina recombinante purificada; Faixa A: Marcadores de baixo peso molecular da Pharmacia (os pesos moleculares foram indicados na figura); Faixa K; padrões de baixo peso molecular da Bio-Rad, os pesos moleculares de cima para baixo correspondem a 92,5, 66,2, 45,0, 31,0, 21,0 e 14,4 KDa respectivamente.

Fig. 4 - Perfis de HPLC na purificação de 1eu28-equistatina recombinante e comparação com equistatina nativa

A purificação e condições de HPLC estão descritas na Descrição Detalhada do Invento. A: mistura de clivagem com brometo de cianogénio; B: Equistatina nativa que foi reduzida nas mesmas condições usadaspara a mistura de clivagem com brometo de cianogénio; C: mistura de renaturação da leu-28-equistatina recombinante purificada de rivada de A; D; Equistatina nativa: As setas nos painéis A B indicam 1eu28-equistatina recombinante e equistatina reduzidas, respectivamente. A posição da leu-28-equistatina recombinante reenrolada e de equistatina nativa estão apresen-12-

tadas por setas nos painéis C e D respectivamente.

Fig. 5 - Inibição da agregação de plaquetas por equistatina recombinante (r-Ieu 28-equistatina) e nativa (n-equistatina )

As condições do ensaio para a agregação de plaquetas estão descritas na Descrição Detalhada do Invento. A: A agregação foi controlada na ausência e na presença de leu28-equistatina recombinante ou equistatina nativa 1,5uM. Note-se que o decréscimo inicial na transmitância da luz, indicador da alteração da forma das plaquetas não foi afectado. B: velocidade inicial de agregação foi medida após adição de ADP na presença de equistatina recombinante purificada (leu28) (quadrados) e equistatina nativa (c í rculos).

Descrição detalhada do invento

As proteínas nativas como aqui usadas refere-se a proteínas de tamanho completo produzidas pelos genes correspondentes. Proteínas recombinantes refere-se ao isolamento de um gene ou cDNA de uma proteína pretendida e a utilização daquele gene ou cDNA purificado para construir uma célula que produz em abundância a proteína pretendida. Forma micro-heterogéneas tal como aqui são usadas refere-se ao produto de um único gene, que é uma proteína produzida a partir de uma única unidade genética de DNA, que é estruturalmente modificada após tradução. No entanto estas modificações estruturais não resultam em quaisquer alterações significativamente da actividade da proteína. As modificações podem ter lugar iη vivo ou durante o processo de isolamento e purificação. A modificação iη vivo pode resultar em acetilação do extremo N, proteólise, glicosilação ou fosforilação ou outras. A proteólise pode incluir exoproteó1ise em que um ou mais aminoãcidos terminais são clivados sequência 1 mente por enzimas para produzir formas micro-heterogéneas que

têm menos aminoácidos do que o produto original. A proteólise pode também incluir modificação endoproteo1ítica que resulta da acção do endoproteases que clivam o peptideo em sítios específicos dentro da sequência de aminoácidos. Modificações semelhantes, podem ocorrer durante o processo de purificação que pode resultar na produção de formas microheterogéneas. A modificação mais comum durante a purificação é a proteôlise.

A economia de DNA recombinante é aqui definida como a tecnologia que permite que segmentos de informação genética, DNA, de diferentes células, geralmente de diferentes organismos, seja ligado extremo a extremo fora dos organismos a partir dos quais o DNA é obtido e incorporado este DNA híbrido numa célula que permite a produção da proteína codificada pelo DNA original. A informação genética,

DNA ou mRNA, é isolada a incorporada num vector de clonagem apropriado e usado para a transdução de uma célula hospedeira adequada .

Vector de clonagem tal como aqui é usado é definido como uma sequência deDNA que permite a incorporação de DNA estranho especifico experimental, sedo o DNA combinado introduzido numa célula hospedeira que pode existir de modo estável e expressar a proteína ditada pelo DNA experimental. 0 DNA estranho combinado com o DNA vector constitui uma molécula de DNA recombinante que deriva de tecnologia de DNA recombinante. Os vectores de clonagem podem incluir plasmídeos, bacteriófagos, vírus e cosmídeos. Os vectores de expressão são aqui definidos como sequências de DNA necessárias à transcrição de cópias clonadas de genes e à tradução dos seus mRNAs num hospedeiro adequado. Tais vectores podem ser usados para expressar genes procarióticos ou eucarióticos numa varie&de de células tais como bactérias, leveduras, células de insectos e células de mamíferos. As proteínas podem também ser expressas numa série de sistemas de vírus. Um vector de expressão adequadamente constituído

deverá conter uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras, marcas selectivas, um número de cópias elevado e promotores fortes. Um promotor é definido como uma sequência de DNA que dirige a ligação da RNA-polimerase ao DNA para iniciar a síntese do RNA. Um promotor forte é um que faz com que os mRNAs sejam iniciados com uma frequência elevada. Os vectores de expansão podem incluir, mas não estão limitados a vectores de clonagem, vectores de clonagem modificados, pasmídeos ou vírus especialmente projectados .

As proteínas do presente invento podem existir, mas não estão limitados a proteínas completas especificadas pelos genes definidos da proteína nativa ou como um seu fragmento ou subunidade, ou como híbridos da proteína completa ou seus fragmentos ou subunidades, desde que mantenham a actividade de inibição da agregação de plaquetas. As proteínas completas, tal como aqui são usadas, refere-se aos polipeptídeos de tamanho completo produzidos pelos genes adequados. As proteínas completas podem ser obtidas por purificação a partir do veneno de víbora adequado ou por expresar um vector de expressão adequado do correç>ondente produto genético derivado recombinante. Fragmentos ou subunidades proteicas refere-se a qualquer porção da proteína que contenha menos aminoácido do que a proteína completa e retenha a capacidade para inibir a agregação de plaquetas nas mesmas condições da proteína nativa. As proteínas híbridas incluem, mas não estão limitadas a proteínas de fusão ou proteínas resultantes da expressão de genes múltiplos dentro do vector de expressão. Uma proteína de fusão é definida como aquela em que um número limitado de aminoácidos codificados pelo factor de expressão são expressos e a expressão resulta na sua ligação no polipeptídeo específico inibidor da agregação de plaquetas. As proteínas resultantes de genes múltiplos podem incluir o polipeptídeo específico ligado a um segundo polipeptídeo ou peptideo por ligações peptídicas que aumentam a inibição da agregação de plaquetas.

-15Os polipeptídeos dentro do âmbito do presente invento foram isolados a partir de veneno de víbora de Trimeresurus grami neos , Echis carinatus e Agk i strodon pi sci vorus, Bi t i s arietans e Eri stocoplus macmahoni s. Todos estes po1ipeptídeos são fortes inibidores da agregação de plaquetas.

A sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de Ech i s cari natus é:

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCy_S_Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr

Este inibidor é daqui em diante referido aamo Equistatina

A sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de Agkistrodon piscivorus é:

Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-ThrCys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly^Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-Gly???-Ile-Cys-???-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn...

Nesta altura não são conhecidos as identidades de certos aminoácidos nem a identidade da sequência após o 46^e aminoácido.

Pensa-se no entanto que o inibidor caia dentro do âmbito do presente invento e é daqui em diante identificado como Agkistrostat i n.

Uma sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de Bitis arietans é:

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-GluGly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-CysGln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-LeuThr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-CysAsp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-CysArg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-CysThr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His inibidor é daqui em diante identificado como Bitistatinas 1

Uma outra sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de B i t i s arietans é:

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-GlnGly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-CysGln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-LeuThr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-CysAsp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-CysArg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-CysThr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.

inibidor é daqui em diante identificado como Bitistatinas 2.

Uma outras sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de B i t i s arietans é:

Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-GluGln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-AsnCys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-LysLeu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-CysCys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-ValCys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-TyrCys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.

inibidor é daqui em diante identificado como Bitistatina 3

A sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de Eri stocoph i s macrnahon i i ê:

Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-ArgArg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-ArgVal-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-ThrGly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-AsnHis .

inibidor é daqui em diante identificado como Eristostatina

Uma outra sequência para um inibidor isolado a partir de veneno de Bitis arietans é:

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Ile-Leu-Glu-GlnGly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-...

A identidade da equència a seguir ao 20⁵ aminoácido não foi determinada. Devido à semelhança estrutural entre esta sequência, daqui em diante referida como Bitistatina 4, e os outros polipeptídeos isolados a partir de veneno de Biti s arietans, pensa-se que Bitistatina 4 cai dentro do âmbito da fórmula I.

As sequências identifiçadas atrás são exemplos específicos de polipeptideo que caem dentro da sequência definicb na fórmula I e não deverão ser interpretadas cc mo limitantes do âmbito do presente invento. Elas foram definidas por meio de sequênciação de aminoácidos. Será compreendida a existência de variações alélicas naturais. Estas variações podem ser demonstradas pro uma ou mais diferenças de aminoácidos na sequência global ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de um ou mais aminoácidos na referida sequência.

EXEMPLO 1

MÉTODOS

Materi a i s - 0 veneno de Ech i s ca ri catus foi adquirido a Miami Serpentarium Laboratories, Salt Lake City, U.T.. Os padrões peptídicos de baixo peso molecular, as colónias de Sephadex G-50 e Mono S FPLC foram da, Pharmacia, Inc.. Os géis de isoelectrofocagem Servalyt Precote foram adquiridos à Serva Fine Biochemicals, Inc., e as proteínas marcadoras de isoelectrofocagem foram da BDH Chemicals, Ltd.. As colunas de HPLC C18 foram produtos da Vydac.

Preparação de Plaquetas

Colheu-se sangue completo de coelhos brancos New Zealand. Centrifugou-se o sangue a 200xg durante 10 min. 0 sobrenadante plasma enriquecido em plaquetas foi centrifugado durante 15 min. a 800xg na presença de apirave (20 ug/ml) e PGE₁ (5 mg/ml). 0 sedimento foi ressuspenso em 10 ml de tampão fresco (138 mM NaCl, 2,9 mM KC1 , 0,31mM NagHPO^, 1 mM MgClg, 5 mM Hepes, pH 6,5, 5 mM glucose, 0,1% NaHCOg, 1 mM EGTA e 0,38% albumina do soro bovina). Adicionou-se apirase para uma concentração final de 20 pg/ml . 0 sedimento ressuspenso foi centrifugado a 800xg durante 15 min., depois lavada uma segunda vez no mesmo tampão. As plaquetas lavadas foram então ressuspensas em tampão de lavagem, pH 7,4,

Q sem EGTA, numa concentrçaão de 2-5X10 células/ml.

Ensaio da agregação de plaquetas

A agregação de plaquetas foi medida a 37°C num agregómetro. A mistura de reacção continha plaquetas lavadas (2-5x10® células/ml) fíbrinogénio (100 pig/ml), Ca®⁺ (1 mM), ADP (10 ρM), epinefrina (2 pg/ml) e a fracção inibidor da agregação de plaquetas a ser testada. A agregação foi iniciada pela adição de ADP e epinafrina 1 após os outros componentes terem sido adicionados. Deixou-se decorrer a reacção durante pelo menos 2 min. 0 grau de inibição da agregação das plaquetas foi expresso como percentagem da agregação observada na ausência de inibidor.

Purificação de Equistatina

Os ensaios de agregação de plaquetas de coelho foram usados para controlar a actividade durante a purificação. Veneno liofilizado de Ech i s cari natus _g ) foi dissolvido em 12 ml de bicarbonato de amónio 10 mM, pH 7,7 contendo 20 mM DTT. Após 15 min. à temperatura ambiente a so-20-

lução foi centrifugada a 45000xg durante 45 min. 0 sedimento foi rejeitado?e o sobrenadante aplicado numa coluna de 2,5x125 cm de Sephadex G-50 equilibrada e eluida a 4°C com 10 mM MES, pH 5,3. As fracções contendo actividade inibidora da agregação de plaquetas foram reunidas e concentradas sob vácuo. Após remoção do sal numa coluna de Sephadec G-15, 10-13 mg de proteína foram aplicadas numa coluna de FPLC Mono S que foi préviamente equilibrada com 10 mM MeS, pH 5,3.A proteína ligada foi fraccionada a 4°C com um gradiente linear de 0 a 0,3M NaCl em 10 mM MES, pH 5,3. 0 caudal foi de

0,6 ml/min. A actividade inibidora elui como um pico único a cerca de 0,17M NaCl. A actividade reunida foi aplicada directamente numa coluna de HPLC de fase reversa C18 que tin^Q ha sido préviamente equilibrada com 0,1% (v/v) de ácido trif1uoroacético em água. A coluna foi desenvolvida à temperatura ambiente com um gradiente polifásico de acetonitrilo em TFA aquoso a 0,1%, num caudal de 0,7 ml/min. A actividade inibidora elui como um pico único numa concentração de acetonitrilo de 17%. 0 material volátil foi removido por centrifugação sob vácuo seguido de 1iofi1ização. A proteína resultante estava homogénea conforme avaliado por electroforese em gel de SDS e poliacrilamida, focagem isoelectrica, recromatografia em PHLC de fase reversa e determinação da sequência N-terminal. A produção de proteína purificada, que designámos pro Equistatina foi de 2,2 mg a partir de 1 g de material de partida.

Electrofose em gel de SDS-poliacrilamida

Usámos uma modificação do sistema de Lae mmli (Nature, 1970, 227, pág. 680-685, aqui induzido como referência). Os géis de concentração e separação (1,5 mm) continham respectivamente 8% e 20% de poliacrilamida . Adicionou-se ureia (8 M) ao gel de separação. Os géis correram a 85 volts durante 1,5 hr e depois a 90 volts durante 17 hr. A proteína foi detectada por coloração com azul Coomassie R-250.

Focagem isoeléctrica

Usou-se um gel de isoelectrofocagem Servalyt Precote. As amostras migraram a uma proteína constante de 1N um sistema Ultraphore LKB. Os géis foram corados com Serva Blue W.

Equistatina reduzida e carboximetilada

Equistatina (0,75mg de proteína) foi reduzida durante 1 hr, à temperatura ambiente com 20 mM DTT na presença de 0,28 M Tris e 6,7 M hidrocloreto de guanidina, num volume de 0,6 ml. Adicionou-se então ácido iodoácetico (0,06 ml) para dar uma concentração final de 0 ,136M e deixou-se a alquilação decorrer durante 20 min. à temperatura ambiente. A Equistatina reduzida e carboximeti1 a da foi isolada a partir dos reagentes por HPLC de fase reversa C18.

Clivagem quimotriptica de Equistatina

Equistatina foi digerida com quimotripsina numa proporção de substrato para protease de 40:1 (p/p). A reacção proteolítica foi efectuada durante 4 hr a 37°C em bicarbonato de amónio 0,2 M, pH 7,8. A mistura de reacção foi então liofilizada e os peptídeos quimotrípticos foram isolados por HPLC de fase reversa.

Determinação da sequência de aminoácidos

Fragmentos, quimotrípticos Equistatina purificados e seleccionados foram sujeitos a análise de sequências de proteína automatizada num Sequenciador Applied Biosystems 470A usando o programa do sequenciador e os reagentes fornecidos pelo fabricante. Os derivados de aminoácidos libertados foram identificados com a ajuda do sistema deHPLC montado em série.

Determinação da proteína

A proteína foi determinada pelo método de Lowry et a 1., (J. of Biol. Chem. , 1951, 193, pág. 265-279, aqui incluído como referência) usando como padrão a albumina do soro bovina.

RESULTADOS

Purificação

Equistatina foi purificada até à homogeneidade a partir da fraeção solúvel do veneno liofilizado de Echis carinatus em três passos cromatográficos . Devido à presença de actividade estimuladora da agregação de plaquetas no veneno bruto, o inibidor não pode ser detectado de modo reprodutível nesta fraeção. Após filtração em gel numa coluna de Sephadex-G-50 observou-se um único pico de actividade inibidora. Esta actividade foi ainda purificada por FPLC de permuta catiónica em Mono S_ e finalmente por HPLC de fase reversa em C18.

Uma grama de veneno liofilizado em 2,2 mg de Equistatina purificada. Este material apresentou uma única banda por electroforese em gel de SDS e poliacrilamida de ureia 8M e em isoe 1ectrofocagem. Recromatografia em HPLC de fase reversa resultou um único pico de abservância simétrico que corresponde exactamente à actividade inibidora da agregação de plaquetas. Posterior confirmação da homogeneidade da preparação de Equistatina foi conse-23-

guida durante a sequênciação de aminoácidos da proteína nativa ou da proteína reduzida e carboximetilada. 0 único resíduo de aminoãcido observado durante o primeiro ciclo da sequênciação foi o ácido glutâmico.

Peso molecular e ponto isoeléctrico peso molecular aparente da Equistatina reduzida durante a electroforese em géis de 20% de SDS-poliacrilamida na presença de ureia 8 M foi de 5800 daltons. Isto é semelhante ao valor calculado a partir da sequência de aminoácidos (ver abaixo). Em condições não redutoras, a proteína migrou mais lentamente, correspondendo a um peso molecular aparente de 7000 daltons. Surpreendentemente quando a Equistatina nativa foi tratada com dissulfureto de hidroxietilo, o peso molecular foi de apenas cerca de 4000 daltons. Na Equistatina tratada com dissulfureto de hidroxietilo observou-se uma banda pouco abundante provávelmente resultante da derivatização incompleta.

Tanto a Equistatina nativa com a tratada com dissulfureto apresentaram PI de 8,3. Quando do tratamento com dltiotreitol, detectou-se uma banda fraca com um pi de 7,5 além da banda predominante a pi de 8,3.

Composição em aminoácidos

A composição em aminoácidos de Equistatina obtida após 20 hr de hidrólise da proteína reduzida e carboximeti1ada, está apresentada na Tabela I. A composição obtida por esta análise foi comparada com a prevista a partir da sequência (ver abaixo). A maior parte dos valores obtidos por estes dois métodos estão de acordo. 0 têor em resíduos cistenilo encontrado na composição de aminoácidos (6,7) foi inferior ao previsto pela sequência (8). Isto po-24-

derá ser devido â carboximeti1 ação incompleta da Equistatina¹¹.

TABELA I

Comparação da composição em aminoácidos da Equistatina entre o valor determinado após hidrólise e o calculado a partir da sequência:

Aminoácido	Resíduos por molécula	Sequênc i a
Hidrólise	ácida
Cisteína	6,5		8
Acido aspártico 1	8,4		8
Treonina	2,8		3
Seri na	1 ,2		1
acido glutâmico 2	3,3		3
Prolina	4,2		4
Glicina	5,3		5
Alan i na	1,8		2
Met i on i na	0,6		1
Isoleucina	1 ,o		1
1euci na	1,1		1
Tirosina	1 ,o		1
Fen i1 a 1an i na	1 ,o		1
Histidina	1 ,2		1
Lisina	5,2		5
Arg i n i na	4,1		4
Total	48,7		49

0 valor inclui asparagina valor inclui glutamina

Efeito da '‘Equistatina na agregação de plaquetas in vitro

Os estudos da agregação de plaquetas indicam que a Equistatina é mais potente que a trigramina na inibição da agregação de plaquetas humanas filtradas em gel induzida pelo ADP na presença de 0,1 mg/ml de fibrinogénio (IC^Q = 30 mM vs 150 nM).

A Equistatina inibe a agregação de plaquetas humanas induzida por ADP-colagénio, factor de activação de plaquetas ou epinefrina em doses de 30-300 nM. Plasma enriquecido em plaquetas humanas.

Retirou-se sangue da veia de voluntários humanos normais para 0,1 ml de citrato de sódio a 3,8%. Preparou-se plasma enriquecido com plaquetas (PRP) por centrifugação a 400xg durante 12 min. As agregações foram efectuadas pela adição de ADP-colagénio factor de activação de plaquetas ou epinefrina a PRP e medidas num agregómetro S i enco.

Plaquetas humanas filtradas em gel

Retirou-se sangue da veia de voluntários humanos rrrmais para 0,1 volume de ácido-citrato-dextrose (citrato de sódio 85 mM, ácido cítrico 64 mM, dextrose 110 mM). 0 plasma enriquecido em plaquetas foi preparado por centrifugação a 400 xg durante 12 min.. Adicionou-se PGE₁ (5 ug/ml) e as plaquetas foram colhidas por centrifugação a 800 xg durante 12 min. 0 sedimento de plaquetas foi ressuspenso em tampão para plaquetas humanas (140 mM NaCl, 7,9 mM KC1, 3,2 mM Ν3₂ΗΡ0^, 6 mM HEPES, 2% de albumina do soro bovina, 0,1% de dextrose, pH 7,2) e filtrado através de Sepharose 2B que foi préviamente equilibrada em tampão para plaquetas humanas. As plaquetas forarn contadas e ajusQ tadas a 2x10 /ml com tampão para plaquetas humanas.

Sequência de aminoácido

A sequência de aminoácidos de Equistatina foi obtida por degradação automática de Edmanda proteína reduzida e carboximetilada. A proteína tem 49 aminoácidos, um resíduo de ácido glutâmico N-terminal e uma teonina C-terminal e está apresentada acima. A císteina constitui 8 resíduos ou mais de 16% dos aminoácidos totais da Equistatina. A sequência foi repetida duas vezes com o mesmo resultado. Quando a Equistatina nativa foi sequênciada não se observaram picos de aminoácidos-PTH durante os ciclos de sequênciador onde se esperavam resíduos cisteinilo, confirmando assim a designação destes resíduos. 0 carácter dissulfureto destes resíduos cisteinilo não ê conhecido.

Posterior confirmação da sequência foi obtida por análise dos peptídeos quinotripticos isolados a partir da proteína reduzida carboximeti1ada (Tabela II).

-27TABELA II

Composição em aminoácidos dos peptídeos quinotriptivos da Equistatina.

Os valores entre parêntesis são os números de resíduos de aminoácidos determinados pela sequên ci ação.

	Cl	C2	C3	C4	C3 +C4
Cys (CM)	2.6(4)	0.7(1)	1.3(3)		1.5(3)
Asx	1-3(1)		2.7(3)		2.9(3)
Thr		1.0(1)	1.0(1)	1.0(1)	1.4(2)
Ser	1-1(1)
Glu	2.0(2)	1.1(1)
Gly	1-2(1)	1.4(1)	1.9(1)	1.2(1)	2.2(2)
Ala				1.0(1)	0.8(1)
Ile		0.6(1)
Leu		0.9(1)
His			1.2(1)		1.3(1)
Phe	0.9(1)
Lys	1-1(1)	1.9(2)	1.7(1)	1.0(1)	2.2(2)
Arg	1.2(1)	0.7(1)	1.1(1)		l.KD
Pro	1.3(1)		1.4(2)	1.0(1)	2.5(3)

A Equistatina contem a sequência Arg-Gli-Asp que é comum a certas proteínas que se ligam ao complexo de g1icoprotefnas Ilb/IIIa na superfície das plaquetas, nos resíduos 24-26. Esta sequência faz parte de um sítio de lgiação putativo a plaquetas na molécula de fibrinogén i o.

A Equistatina apresentou um compostamento invulgar durante a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida na presença de ureia 8M. A proteína nativa migrou com um peso molecular aparente de 7000 daltons, comparado com o valor de 5400 daltons obtido a partir da análise de sequênciação. Em condições não redutoras as proteínas com ligações dissulfureto dentro de uma cadeia ligam geralmente menos quantidade de SDS do que o esperado, ao mesmo tempo que a redução prévia aumenta a ligação de SDS para níveis observadas com proteínas sem ligações dissulfureto entre as cadeias (Pitt-Rivers et a 1 . , Biochem. J. 1968, 109 pág. 825-83(): Assim o aumento da mobilidade da Equistatina reduzida durante a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida sugere que esta proteína contenha uma ou mais ligações dissulfureto dentro de uma cadeia na sua conformação nativa.

tratamento de Equistatina com ditiotreitol 80 mM à temperatura ambiente durante 20 minutos destruiu completamente a sua actividade inibidora da agregação de plaquetas. Em condições semelhantes, o tratamento com dissulfureto de hidroxietilo 80 mM levou à perda de 50% da actividade inibidora. Estes resultados tal como os dos estudos da electroforese em gel de SDS, implicam que uma ou mais ligações dissulfureto dentro de uma cadeia desempenham um papel importante na manutenção da conformação da Echistatin necessária à sua actividade inibidora.

EXEMPLO 2

Os métodos de purificação e determinação de proteína usados no Exemplo 1 foram empregues para isolar e identificar um inibidor da agregação de plaquetas presente em veneno de Agk i strodon pisei vorus. A proteína cuja sequência de aminoácidos está identificada acima, apresenta carac terísticas de um inibidor da agregação de plaquetas.

EXEMPLO 3

Os métodos de purificação e determinação de proteína usados no Exemplo 1 foram empregues para isolar e identificar um inibidor da agregação de plaquetas presente em veneno de Bi 1 is arietans. A proteína cuja sequência de aminoácidos foi identificada atrás, apresentou características de um inibidor da agregação de plaquetas.

EXEMPLO 4

Os métodos de purificação e determinação de proteína usados no Exemplo 1 foram usados para isolar e identificar um segundo inibidor da agregação de plaquetas presente em veneno de Bitis-arietans. A proteína cuja sequência de aminoácidos foi identificada atrás, apresenta características de um inibidor da agregação de plaquetas.

EXEMPLO 5

Os métodos de purificação e determinação de proteína usados no Exemplo 1 foram empregues para isolar e identificar um terceiro inibidor da agregação de plaquetas presente no veneno de Bitis ar i etans. A proteína, cuja sequência de aminoácidos foi identificada atrás, apresen-30-

tou características de um inibidor da agregação de plaquetas .

EXEMPLO 6

Os métodos de purificação e determinação de proteína usados no Exemplo 1 foram empregues para isolar e identificar um inibidor de agregação de plaquetas, presente em veneno de Eristocophis macmahoni i. A proteína cuja sequência de aminoácidos foi identificada atrás, apresenta características de um inibidor da agregação de plaquetas.

A purificação de vários polipeptídeos dentro da fórmula I até homogenenidade de acordo com o presente invento permitiu a sequênciação de aminoácidos das moléculas. Com base na sequência de aminoácidos apresentada na fórmula I, pode-se com vantagem preparar um gene sintético correspondendo a uma sequência de aminoácidos divulgada e introduzir aquele gene num hospedeiro adequado através de vec tores de clonagem adequados. Como alternativa pode-se considerar que o polipeptideo puro pode ser preparado através da obtenção do gene natural a partir de células produtoras do veneno, seguido de recombinação e clonagem. Deverá ser entendido que o âmbito do invento não está meramente limitado a polipeptídeos isolados seguindo os passos cromatográficos aqui divulgados ou a polipeptídeos dentro da fórmula I, mas também inclui estes polipeptídeos preparados por técnicas de engenharia genética.

EXEMPLO 7

Construção de DNA e plasmideo e expressão de proteínas para Ieu28-Equistatina recombinante

Todas as enzimas e marcadores de peso molecular foram da New England Biolabs. Os Kits de sequênciação didesoxi de DNA foram adquiridos à United States Biochemical Corporation Inc.. Células competentes £. coli JM 109 foram adquiridas à Stratagene. Todos os outros reagentes de graus de pureza analíticos ou para e1ectroforese. Todos os oligodesoxinucleotídeos foram sintetizados num sintetizador de DNA Applied Biosystems 380B usando metilfosforamideto. Após desprotecção com amónia concentrada, removeu-se o sal aos ol igodesoxinucleotídeos numa coluna de filtração em gel Pharmacia NAP-10.

Todos os oligodesoxinucleotídeos foram fosforilados por ATP e pol inucleotídeo-cinase de T4 execeptuando os dois oligodesoxinucleotídeos protuberantes nos extremos 5' de ambas as cadeias. Os oligodesoxinucleotídeos complementares fosforilados foram aquecidos a 99°C e depois emparelhados arrefecendo lentamente até à temperatura ambiente . A ligação dos 3 duplexes foi efectuada a 14°C durante 15 horas, numa mistura de reacção contendo 0,5 mmoles de cada um dos duplexes, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgC^, 20 mM ditiotreitol , 1 mM ATP, 50 jjg/ml de albumina do soro bovina e 4000 unidades de DNA-ligase de T4 num volume total de 130 ul A mistura de ligação foi fracõonada por electroforese em gel nativo de 10% de poliacri1amida. 0 gene montado da leu 28-Equistatina foi retirado do gel de poliacri1amida e electroeluido. 0 gene eluido da 1 eu-28-Equistatina foi fosforilado, extraído com fenol/clorofórmio e precipitado por etanol antes de ser inserido no vector de expressão.

Construção do vector de expressão pJC264

Um fragmento HindIII-PstI de 714 pb de pLC1-28 (adquirido à B. Bachmann, £. col i Genetic Stock Center) contendo os 436 pb 3' do gene che B e os 26,3 pb 5' do gene chey (Matsumura et a 1., J. Bact. 160 (1984) pág. 36-41) foi clonado nos sítios HindIII e PatI de pUC13. Para movimentar o único sítio EcoRI na sequência da poliadaptadora de pUC13 adjacente ao gene chey, retiraram-se as sequências do poliadaptor entre os sítios PstI e EcoRI. 0 vector de expressão resultante pJC264 contêm um único sítio EcoRI que premite que genes com interesse se fundam com o gene chey (Fig. 2). Para outros fins, o sítio HindIII ligando pUC13 e o gene cheB foi convertido num sítio Bam HI por procedimento com o fragmento Klemon da DNA polimerase I de £. co1i e ligação com um adaptador sintético BamHI.

gene sintético de I eu-28-equistatina recombinante foi (Fig. 1) inserido no sítio EcoRI do pJC264 por ligação de um terço do gene sintético leu 28equistatina preparado atrás a 0,1 ^ug de pJC264 cortado com EcoRI nas seguintes condições: 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10mM MgC^, 20mM d i t i otre i to 1 , 1mM ATP, 50 yug/ml de albumina do soro bovina e 800 unidades de DNA-ligase de T4 num volume total de 20 ul. A ligação foi efectuada durante 15 horas a 14°C.

Transformação das bactérias recipientes e identificação dos clones positivos

Um terço do vector de expressão pJC 264 contendo o gene r-leu 28-equistatina inserido (7 pl) foi usado para transformar 50 ml de células competentes JM109 em condições convencionais. Os clones contendo o gene r-leu 28-echistatin foram se 1eccionados por mapeamento de restrição. A preseça da sequência codificadora da Equistatina foi verificada por análise da sequência didesoxi.

Cultura de células e preparação de sedimentos de proteína de fusão

As culturas foram incubadas com uma cultura para sementeira crescida durante a noite (1% v/v) e cultivadas em meio LB contendo 100 jjg de ampici 1 ina/ml. Quando a densidade celular atingiu uma leitura de θθθθθ de 0,2 a 0,3, adicionou-se I PTG para dar uma concentração final de 1 mM. As células foram colhidas por centrifugação após mais 10h de crescimento. 0 sedimento de células de uma cultura de 3000 ml foi ressuspenso em água para um volume final de 50 ml e sonicado a 4°C durante 10 min. usando um Fischer Sonic Dismembrator, Modelo 300, com a ponta larga na potência máxima. A mistura sonicada foi centrifugada a 20 000 g durante 15 min. 0 sedimento foi ressuspenso em 8 ml de água e aplicado sobre sacarose a 50% em 15 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 0,15 M NaCl. Após centrifugação a 13 000 rpm durante 30 min. num rotor Beckman SW28 a 6°C, o sedimento contendo a protéina de fusão insolúvel chey-1 eu 28-equistatina foi ressuspenso em 6 ml de ãgua.

Clivagem da proteína de fusão sedimento contendo a proteína de fusão de uma cultura de 1000 ml foi clivado com brometo de cianogénio 60mM em ácido fórmico a 70% num volume total de 13 ml. A reacção prosseguiu durante 15 horas à temperatura ambiente. Os reagentes foram removidos por dialise extensiva e biofi1ização.

Purificação e reenro1amento da 1eu28-equistatina recombinante meiro desnaturada e depois reduzida biente durante 10

A proteína de fusão clivada foi pricom 8M guanidina-HCl a 60°C durante 5 min., com 0,15M ditiotreitol à temperatura ammin. na presença da base tris 0,35M e 6M

guanidina-HC 1 . A leu 28-eq 1 istatina reduzida foi purificada por HPLC de fase reversa em CIB com um guadiente de 0-65% de acetonitrilo na presença de 0,1% de ácido trifluoroacético. A leu 28-equistatina purificada por HPLC foi reenrolada em condições oxidativas em acetato de amónio 0,1M numa concentração de protéina de 0,2 mg/ml. 0 reacção de reenrolamento prosseguiu durante 72 horas à temperatura ambiente misturando com vortex uma vez de 12 em 12 horas.

Ensaio de agregação de plaquetas

A agregação de plaquetas foi medida através do aumento na transmissão de luz. Resumidamente, r-leu- 28-equistatina foi adicionado à mistura de reacção contendo plaquetas humanas filtradas em gel (2x10 cêlulas/ml) fibrinogênio (100 ug/ml) e Ca⁺⁺ (1mM). A agregação de plaquetas foi iniciada pela adição de ADP (concentração final de 10jjM ) 1 min. após os outras componentes terem sido adicionados. A velocidade ou grau de agregação foi expressa como a percentagem da transmição máxima de luz obtida na ausência de Equistatina.

Fluxograma para a produção de leu 28-equistatina recombinante

£. col i (portadora do plasmídeo pJC264-equistatina)

Induzir com IPTG Colheita de células Lise das células Centrifugação

Sedimento de proteína de fusão

Brometo de cianogénio

Sedimento da proteína de fusão clivada com CnBr

Desnaturar (guan id ina-HC 1) Reduzir (ditiotreitol)

Sedimento da proteína de fusão clivada e totalmente reduz ida r-leu 28-equistati na

HPLC de fase reversa em C18 totalmente reduzida

Reoxidação/rrenrolamento HPLC de fase reversa em C18 r-leu 28-equistatina purificada e oxidada

Planeamento e construção do gene sintético

A equistatina nativa é um polipeptídeo de cadeia simples de 49 resíduos de aminoácidos com um pi de 8,3. Projectou-se um gene sintético de r-leu 28-equistatina e fundiu-se com o gene cheY de E^. coli. As estruturas primárias dos inibidores da agregação de plaquetas isolados a partir de outras fontes do veneno-de víboras revelaram que a metionina 28 não é um aminoácido conservado nesta família de inibidores (Huang et a I., (1987) J.B iol. Chem. 262, pág. 16157-16163). Portanto a metionina 28 da equistatina foi substituída por uma leucina e uma metionina foi inserida entre a proteína chey e uma leu 28-equistatina recombinante para gerar um sítio de clivagem com brometo de cianogénio (Fig. 1). Dois extremos coesivos EcoRI foram colocados nos extremos delimitantes para permitir uma junção ao vector de expressão. Inseriu-se um codão de paragem precedendo imediatamente o sítio EcoRI delinitante 3'. 0 gene sintético r-leu 28-equistatina foi montado a partir de três fragmentos de cadeia dupla que continham sítios de restrição Kpml e Aval nos sítios de união. No gene estrutural usaram-se os codões preferidos de £. coI i exceptiendo onde foram criados propositadamente sítios de restrição. 0 gene constrúido foi verificado por mapeamento de restrição e análise da sequência de DNA.

Construção do vector de expressão

Para expressar r-leu 28-equistatina em £. coli visou-se o vector de expressão pJC264. 0 vector (Fig. 2) contêm o gene codificador dos 88 aminoácidos do extremo amino de proteína chey de £. coli, que previamente se mostrou ser abuntante e estâvelmente expressa em E^. co 1 i (Matsumura et a 1., (1984), J. Bact 160, pág. 36-41). A expressão do gene chey neste vector ê controlada pelo promotor-operador lac de E. coli do pUC13 (Messing, Methods in Enzy-37-

mo1ogy, Wu, et a 1., eds, Academic Press, New York, 101 ( 1 983 ) pág. 20-78) e a replicação eficaz deverá contribuir para os elevados níveis de expressão observados. As proteínas de fusão chey são muitas vezes encontradas como corpos de inclusão insolúveis. Esta insolubilidade pode ser explorada na purificação da proteína de fusão. A insolubilidade da proteína pode também evitar a sua degradação por proteases intracelulares. Devido ao pequeno tamanho da fracção Chey, a proporção de massas da proteína com interesse ê mais alta do que seria conseguido por fusão com a B-galactosidase, proteína maior e normalmente usada. Finalmente, a ausência de resíduos cisteira na proteína Chey evita os potenciais problemas da formação incorrecta de ligações dissulfureto na proteína de fusão.

Expressão de 1eu-28-equistatina recombinante

A expressão de leu 28-equistatína recombinante em £. coIi JM109 foi induzida por IPTG conforme prêviamente descrito. 0 produto de expressão a diferentes tempos após indução foi analisado por electroforese em gel de SDS e 14% de po 1 iacri1amida. Após 2 horas de indução, um polipeptideo com o molecular esperado da proteína de fusão chey-equistatina (14,5 KDa) foi detectado no lisado celular total (Fig. 3). As 6 horas de indução, esta proteína acumulou num nível máximo correspondendo a pelo menos 20% da proteína celular total. A proteína expressa era insolúvel após somicação das células sugerindo que os corpos de inclusão se formaram durante a expressão. 0 sedimento sonicado foi sujeito a clivagem com brometo de cianogénio para isolamento de leu 28-equistatina recombinante.

Purificação e rematuração de leu 28-equistatina recombinante

As proteínas clivadas com brometo de cianogénio foram reduzidas por um excesso de ditíotreitol na presença de 6M guemidina-HCl antes de purificação.

fraccionamento das proteínas reduzidas por HP1C de fase reversa revelou um pico que tinha um tempo de retenção semelhante ao da eclistatin nativa reduzida (Fig. 4A e Β). A análise da sequência de aminoácidos da proteína deste pico mostrou que ele contêm leu 28-equistatina recombinante com uma pureza de mais de 90%. Uma vez que a equistatina reduzida estava em ãcido trifluoroacético (à volta de pH 2) durante HPLC, as reacções de troca tiol-dimulfureto dentro da leu 28-equistatina recombinante deverão ser muito lentas Portanto, a ecristatin liofilizada foi directamente reenrolada na presença de acetato de amónio 0,1M sem qualquer desnaturação e redução. Foi proposto que a rematuração de uma proteína inactiva é facilitada pela adição de uma mistura tio 1/dissu1foreto â solução de rematuração (Tam et a 1. Nature, 309 (1984) pág. 376-378). Rematuramos leu 28-equis tatina recombinante com 0,5mM ditiotreitol e ditiotreitol oxidado 1mM na presoça de 6M guanidina-HC 1. No entanto, o rendimento de equistatina reenrolada não aumentou em tais condições. Eclistatin correctamente enrolada foi isolada a partir de espécies desenroladas por HPLC de fase reversa. 0 perfil de HPLC apresentado na Fig, 4C indicou que mais de 30% da equistatina reduzida estava correctamente enrolada nas condições dadas. A quantidade de equistatina pura correctamente enrolada obtida pelo processo de purificação foi calculada em cerca de 1,5 mg por litro de cultura celular. A leu 28-equistatina recombinante foi eluida da coluna C18 numa concentração de acetonitrilo ligeiramente superior à da equistatina nativa (Fig. 4C e 4D). Isto pode ser o resultado da substituição da metionina 28 na equistatina nativa por leucina na leu 28-equistatina recombinante. A sequência de aminoácidos N-terminal da leu 28-equistatina recombinante foi determinada por degradação automática de Edman. A sequência até ao resíduo 32 do extremo N verificou-se ser idêntica à nativa exceptuando a substituição de metionina por leucina no resíduo 28.

-39Actividade biológica da leu 28-equ i stati na recombinante

Na Figura 5 está apresentada uma comparação da actividade biológica de leu 28-equistatina recombinante e equistatina nativa. A inibição da agregação de plaquetas pela equ i stat i na foi medida na presença de fibrinogénio humano e CaCl₂ após adição de ADP. Tal como a equistatina nativa, a proteína recombinante não afectou o decréscimo inicial da transmitância de luz após a adição de ADP (Fig. 5A), sugerindo que os inibidores não influenciaram a activação de plaquetas. Leu 28-equistatina recombinante e equistatina nativa inibiram a agregação de plaquetas, medido como a velocidade ou grau de agregação, com a mesma IC^q (Fig. 5B). Portanto, a leu 28-equistatina recombinante parece ser idêntica â equistatina nativa na sua capacidade para afectar a agregação de plaquetas. Os resultados sugerem que a presença de metlonina na posição 28 na equistatina nativa não é essencial para o enrolamento correcto e actividade biológica deste inibidor de agregação de plaquetas.

Existe o potencial, na utilização da tecnologia de DNA recombinante, para a preparação de polipeptideos derivados modificados de modo vãrio por substituições, deleções, adições de um ou mais aminoácidos, por exemplo por meio de mutegénese dirigida específica de sítio de DNA sobjacente. Todas estas variações alílicas e modificações resultando em polipeptideos derivados estão incluídas dentro do âmbito deste invento desde que a actividade essencial caracteristica de inibição de agregação de plaquetas se martenha sem ser afectada. Os polipeptídeos são preparados (1) tendo metlonina como o seu primeiro aminoácido (presente devido à inserção de um codão de sinal de iniciação ATG antes do gene estrutural) ou (2) quando a metionina, for clivada intra ou extracelularmente, tendo o seu primeiro aminoácido habitual ou (3) juntamente com o seu

peptideo sinal ou uma proteína conjugada que não seja o polipeptideo sinal convencional, o polipiptideo sinal ou conjugado sendo especificamente clivãvel num ambiente intra ou extracelular (ver Pedido de Patente Britânica Publicação N^Q 2007 676A) ou (4) por expressão directa na forma madura sem a necessidade de clivar qualquer polipeptideo estranho supérfulo. 0 último ê particularmente importante sempre que um dado hospedeiro não possa remover um peptídeo sinal, ou não o faça eficazmente, sempre quando o veículo de expressão se destina a expressar a proteína juntamente com o seu peptídeo sinal. Em qualquer dos casos, o inibidor da agregação de plaquetas assim produzidas nas suas várias formas, ê recuperado e purificado num nível adequado à sua utilização no tratamento de várias condições ou doenças vasculares.

Polipeptídeos sintéticos da fórmula I

Os polipeptideos do invento podem ser preparados usando síntese em fase sólida, tal como descrito por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85, 2149 (1964), se bem que também possam ser usados outras sínteses químicas equivalentes conhecidas, como seja a síntese de Houghten Proc. Natl. Aca 1. Sei., 82, 5132 (1985). A síntese em fase sólida é começada a partir do extremo C do peptídeo atravéz do acoplamento de um aminoácido protegido a uma resina adequada, conforme estabelecido na Pat. US N^Q 4 244 946 publicada em 21 de Jan., 1982 de Rivier et a 1., a divulgação da qual é a que incluída como referência. Exemplos de sínteses deste tipo geral estão descritas na Pat. U.S. N? 4 305 872 e 4 316 891. A discussão da síntese em fase sólida de um polipeptideo de 41 resíduos está descrita na Science, 213, 1394-1397 (Setembro 1981) num artigo de Vale et a 1 . , que se refere a uma discussão mais detalhada da síntese, a qual aparece num artigo de Marke et al. no J. Am. Chem. Soc.,

103, 3178 (1981).

Ao sintetizarem-se os polipeptideos, o aminoácido do extremo carboxilo, tendo o seu grupo amino alfa adequadamente protegido, é acoplado a uma resina de polistireno c1orometi1ado ou similar. Após remoção do grupo protector de amino alfa, como seja através da utilização de ácido trif1uoroacêtico em cloreto ou metileno, o passo seguinte na síntese pode prosseguir. Podem ser usados outros reagentes e condições de clivagem convencionais para a remoção de grupos protectores amino específicos, como descrito na literatura.

Os restantes aminoácidos protegidos no grupo amino alfa e nas cadeias laterais são então acoplados passo por passo na ordem pretendida para se obter um composto intermediãrio ligado à resina. Como alternativa à adição de cada um dos aminoácidos separadamente na síntese, alguns deles podem ser acoplados uns nos outros antes da adição à cadeia em crescimento na fase sólida, A selecção dos reagentes de acoplamento adequados está dentro do âmbito da matéria.

Comum à síntese química de peptídeos é a protecção de grupos de cadeias laterais das vãrias fracções de aminoácidos com grupos protectores adequados naquele sítio até o grupo ser finalmente removido após a cadeia ter sido totalmente montada. Também comum ê a protecção do grupo amino alfa num aminoácido ou num fragmento ao mesmo tempo que a entidade reage no seu grupo carboxilo seguido da remoção selectiva do grupo protector de amino alfa para permitir que subsequente reacção tenha lugar nesse sítio. Assim, é vulgar ter num passo da síntese um composto intermediário produzido que inclui cada um dos resíduas de aminoácidos situados na sequência pretendida na cadeia peptidica com vários destes resíduos tendo grupos protectores de cadeias laterais. Normalmente estes grupos protectores são então removidos substancialmente todos ao mesmo tempo

de modo a produzir o produto resultante pretendido após purificação.

Após completada a sequência de aminoãcidos pretendida, o peptideo intermediário é removido do suporte de resina por tratamento com um reagente, como seja HF líquido, que não só cliva o peptideo da resina como também cliva todos os restantes grupos protectores de cadeias laterais. 0 polipeptideo pode então ser purificado por filtrção el gel seguido de HPLC semipreparativa como descrito em Rivier et al., Peptideo: Structural and Biological Function (1979) pág. 125-128. Uma pureza de pelo menos 93% ou mais (baseado em todos os peptideos presentes) é razoá1velmente obtida e é prefeida para os testes clínicos e/ou utilização clínica. Pureza de 98% é conseguida; no entanto, para certas aplicações in vitro pode ser aceitável uma pureza inferior. Assim, o polipeptideo ê considerado útil quando estã na forma substancialmente pura que, para fins deste pedido de patente, significa pelo menos cerca de 50 peso por cento, com base nos peptideos presentes.

Exemplos de vários po 1 ipeptideos do presente invento e métodos de síntese estão apresentados abai xo.

Exemplo 8

A resina Boc-O-benziltrionina-PAM, aminoácidos protegidos com Boc e todos os outros reagentes necessários para a síntese no sintetizador de peptideos Applied Biosystems 430 A (ABI) foram obtidos do fabricante Asp, Glu e Hís protegidas nas cadeias laterais foram fornecidos por Bachem, Inc. Os solventes dimetilformamida (DMF) e cloreto de metileno (CH₂C1₂) foram adquiridos a Burdick e Jackson. Ditiotreitol (DTT) foi adquirido à Bethesda Res. Labs. Ditioeritritol (DTT) foi obtido a Chemical Dynamics, p-tiocresol foram adquiridos à Aldrich Chemi-43-

cal Co.

Síntese da echistatin

Partindo de 0,50 mM (0,69 g) de Boc-Tre-(Bzl)0-Pam-resina (substituição a 0,72 mM de Tre/g de resina) a síntese foi efectuada passo a passo usando o sintetizador de peptideos automático ABI. Kent e Clark-Lewis (1985) Synthetic Peptides in Biology and Medicina, Proc. Labsystems Res. Symp., Eds., Alitalo et a I ., Elsevier, Netherlands pãg. 29-57. Os aminoácidos foram introduzidos usando as cassetes pré-empacotadas do fabricante (2mM cada).

A protecção das cadeias laterais foi Arg (Tos), Asp (OcHx), Cis (Meb), Glu (OcHx), His (Bom), Lis /Z (Cl)J , Ser (Bzl), Tre (Bzl), Tir /Z (Br) 7. /Tos, Tosilo; cHx, cic1o-hexi1 o ; Meb, 4-meti1benzilo; Z (Cl), 2-c1orobenzi1oxicarboni1 o ; Bom, benzi1oximetilo; Bgl 1, Benzilo; Z (Br)2, bromobenzi1oxicarbonilo 7. 0 acoplamento duplo com anidridos simétricos (efectuado em CH2CL2 seguido de troca de solvente com DMF) foi usado para todos os aminoácidos protegidos com Boc exceptuando Arg (Tos), Asn e His (Bom), onde foram usados ésteres de hidroxibenzotriazol em DMF num protocolo de duplo acoplamento. Para proteger contra oxidações indesejavéis catalisadas por ácidos de Cis e Met (Draper et al. (1973)

J. Med. Chem. Vol 16 , pág. 1326-1329 ) durante desbloqueamento com ácido trifluoroacético (TFA), adicionou-se 0,1% (p/v) de DTE como captador. Apôs 0 acoplamento do grupo Glu N-terminal, 0 grupo Boc foi removido usando TFA e a resina-peptidao: foi seca. 0 peso final da resina-peptideo desbloqueado no extremo N foi de 4,15 g.

Clivagem com HF e oxidação peptídeo-resina montado (2,0 g) foi ressuspenso numa mistura de 3 ml de 1:1 (v:v) de p-tiocresol/p-cresol num sistema de HF (Peninusula Labs. Inc.,

Tipo 1B). 0 sistema foi evaquado com uma bomba de vácuo macânica e condensado HF (30 ml) usando arrefecimento com azoto líquido. Após agitação a 0-5°C durante 1 1/2 hr a mistura de reacção foi evaporada in vacuo usando uma ratoeira de azoto líquido (20-30 min). 0 resíduo foi triturado com éter, filtrado e lavado três vezes com mais êter. 0 resíduo filtrado foi imediatamente transferido para 4 litros de uma solução em agitação de ácido acético diluido (0,4%/ /H₂0). Após agitação durante vários minutos o pH da mistura foi ajustado a 8,0 com hidróxido de amónio. Após filtração para remover a resina, o produto de oxidação bruto foi mantido sem agitação a 5°C (18 h) e subsquentemente à temperatura ambiente (19-20°C) durante 3 dias. Usou-se HPLC analítica para controlar o progresso da oxidação. Antes de se proceder à purificação usou-se um teste qualitativo de Ellman (Habeeb, Methods in Enzymology (1972), Eds. Hirs e Timasheff, Academia Press New York pág. 457-464) para controlar o desaparecimento de grupos sulfidrilo livres. Este teste foi efectuado numa amostra de 1 ml que foi liofilizada para remover o p-tiocresol residual.

Purificação de equistatina oxidada bruta

A solução oxidada bruta (4 1) foi acidificada pela adição de ácido acético (10 ml) e bombeada directamente para uma cassete de C18-silica (5x30 cm, 15m, 300 A) (Waters Associates). 0 produto foi purificado usando HPLC preparativa (Separations Technology, Inc.) Um gradiente por passos (aumentos de 100 ml) que foi gerado a partir de 1 litro de cada uma das concentrações crescentes da fase móvel. Usou-se um caudal de 70 ml/min para eluir o produto. Fracções homogéneas (^>95%) conforme determinado

por RP-HPLC (Vydac C_1Q, 218TP5415) foram reunidas e liofilizadas para dar 72 mg de produto. 0 produto semi-puro foi estava comtaminado com um componente menos polar como um patamar relativamente ao pico do produto. 0 produto foi ainda purificado por nova pesagem em HPLC como descrito atrás para dar echistatin (54 mg). Com base em 0,25 mM da resina de partida este peso representa um rendimento global de 4 por cento. A homogeneidade foi demonstrada por HPLC analítica. A coinjecção do produto sintético com material nativo deu um único pico. 0 produto foi ainda caracterizado pela análise de aminoácidos após hidrólise com 6N HC1 (tabela 3) e por degradação automática de Edman (Sequenciador de Protéinas ABI 470A) .

TABELA 3

Análise de aminoácidos³ da equistatina sintética (número teórico entre parêntesis)

Lys	5.00 (5)	Gly	5.03 (5)
His	1.00 (1)	Ala	2.10 (2)
Arg	3.87 (4)	Cysd	7.67 (8)
Asp	8.13 (8)	Metc	0.84 (1)
Thrb	2.99 (3)	Leu	0.98 (1)
Serb	1.04 (1)	Phe	0.95 (1)
Glu	3.07 (3)	Tyr	1.00 (1)
Pro	4.08 (4)	Ile + allo-Ile	0.99 (1)

^a Após hidrólise com 6N HC1 a 1OO°C durante 70 hrs.

^b Corrigido relativamente à decomposição durante a hidrólise ^c Não corrigido.

^d Determinado como ácido cisteico após oxidação com ãcido perfórm ico.

Observou-se um máximo de 1,9 por cento. 0 elevado rendimento de aminoácidos PTH do primeiro passo também demonstrou que a ciclização do Glu C-terminal com piro-Glu não ocorreu.

Redução e reenrolamento de equistatina sintética

A equistatina sintética (0,50 mg) foi dissolvida em 1 ml de 0,07M acetato de amónio pH8,0 (10mM DTT) e o curso da redução foi seguido por HPLC analítica. Após 1 hr o material de partida foi convertido quantitativamente num único produto reduzido. A diálise (24 hr) do produto reduzido usando manga de celulose de 12 mm de diâmetro e 1000 MW de exclusão (Spectrum Medicai Ind.) contra (4 1) de um tampão acetato de amónio 0,07M (pH 8,0) produziu apenas echistatin. Para demonstrar que a equistatin estava na sua forma totalmente reduzida antes da reoxidação, a redução com DTT da equistatina sintética foi repetida como descrito mas na presença de hidrocloreto de guanidina 6M. HPLC analítica confirmou que os produtos reduzidos têm tempos idênticos. 0 isolamento da equistatina reduzida por HPLC semipreparativa seguido de análise quantitativa de Ellman (Habeeb, ibid) mostrou que o produto estava na forma octa-hidro.

Ensaio da agregação de plaquetas

A agregação de plaquetas foi medida a 37°C num agregómetro cromológico. A mistura de reacção p

continha plaquetas lavadas (2x10 /ml), fibrinogénio (100mg/ml)

Ca^{z +} (1 mM) e a fracção do inibidor da agregação de plaquetas a ser testado. A agregação foi iniciada pela adição de 10 mM ADP 1 min após os outros componentes terem sido adicionados. A reacção foi deixada decorrer durante pelo menos 2 min. 0 grau de inibição da agregação foi expresso como percentagem da taxa de agregação observada na ausência do inibidor. A equistatina sintética possui propriedades químicas e biológicas indistintas das da echistatin natural (Tabela 4)

TABELA 4

EFEITO DA EQUISTATINA NATIVA E DA EQUISTATINA SINTÉTICA NA INIBIÇÃO DA AGREGAÇAO DE PLAQUETAS

HUMANAS;

IC 5 0)

PEPTIDEO LIMITES DE CONFIANÇA 95%)

Equistatina nativa 0,032 (0,026-0,039)

Equistatina sintética 0,033 (0,026-0,041)

A concentração do peptideo necessária para inibir em 50% a velocidade da agregação de plaquetas humanas (IC^q) foi determinada usando plaquetas de 2-4 dadores. As determinações foram feitas em duplicado para cada dador.

EXEMPLOS 9-20

Seguindo os processos gerais de síntese para a preparação de echistatin descritos no Exemplo 8 foram preparados muitos polipeptideos tendo sequências semelhantes às da equistatina e caindo dentro da fórmula geral I.

Tabela 5

Análogos da equistatina preparados por meios sintéticos e sem efeito na agregação de plaquetas humanas

Exemplo fjp, Sequência

ΙΟ^θζμΜ) (957» (Limites de Confiança)

9	fen 27- equistatina	.013	(.010-	. 016)
10	phe 27 , leu 28-equistatina	.016	( .011-	. 022)
11	trp 27- equistatina	. 017	(.014-	. 019)
12	pro 23, fen 27, leu 28- équistatina	.026	(.021-	. 033)
13	leu 28- equistatina	.034	(.026-	. 043)
14	phe 28- equistatina	.038	(.026-	.058)
15	asn 22, phe 27, leu 28- équistatina	.038	(.031-	.047)
16	(1-41) amida de equistatina	.066	(.048-	.084)
17<	(1-43) amida de equistatina	.081	(.066-	.099)
18	met SO 28-equistatina	.088	(.033-	.154)
19	(1-39)-amida de equistatina	.327	(.214-	.414)
20	(1-39 )-equistatina	.800	(.580-	1.1)

As abreviaturas atrás definem os vários pol ipeptídeos sintetizados. Nos exemplos 9-15 e 18 o(s) número(s) de posição(ões) de sequência que estâ(estão) substituido(s) e o(s) resíduo(s) que substitui(em) o(s) resíduo(s) natural(ais) está(estão) indicado(s) (e.g. no Exemplo 9, Asp, o residuo na posição 27 que ocorre na equistatina natural foi substituído por Fer). Os resíduo 1-26 e 28-49 são idênticos aos da equistatina natural. Os exemplos 16, 17, 19 e 20 são seqências que possuem resíduos omitidos no extremo carboxilo (e.g. no Exemplo 20, os resíduos 42-49 foram omitidos), met 50 no Exemplo 18 representa sulfóxido de metionina.

Utilidade Terapêutica

Os polipeptideos do invento podem ser administrados em qualquer situação em que se pretenda inibição da agregação ou adesão de plaquetas humanas ou de mamífero.

Os polipeptideos do invento são eliminados da circulação rápidamente e são particularmente úteis na inibição da agregação de plaquetas em situações onde seja necessário uma eficácia antitrombótica forte de curta duração. Assim, eles podem ter utilidade em cirurgia de artérias periféricas (enxertos de artérias, endarterectomia das carótidas) e na cirúrgia cardiovascular onde a manipulação de artérias e orgãos e/ou a interacção de plaquetas com superfícies artificiais conduz à agregação e consumo de plaquetas. As plaquetas agregadas podem formar trombos e tromboembolia. Os polipeptídeos do invento podem ser administrados a estes pacientes cirúrgicos para evitar a formação de trombos e tromboembo1ia.

A circulação extracorpora1 é rotineiramente usada na cirúrgia cardiovascular para originar o sangue. As plaquetas aderem às superfícies do circuito extracorpora1. A adesão está dependente da interacção entre GPIIb/IIIa nas membranas das plaquetas e o fibrinogénio adsorvido à superfície do circuito. (Gluszko, et a 1., Amer. J. Physiol., 1987, 252: Η, pág. 615-621). As plaquetas libertadas das superfícies artificiais apresentam uma função hemostática diminuída. Os pol ipeptídeos do invento podem ser administrados para evitar adesão.

Outras aplicações destes polipeptídeos incluem prevenção da trombose por plaquetas, tromboembolismo e reoclusão durante e após terapia trombolítica e prevenção da trombose por plaquetas, tromboembolismo e reoclusão após angioplastia das coronárias e de outras artérias e após processos de bypass das artérias coronárias. Em muitos centros clínicos os pacientes sujeitos a estes processos estão já a receber drogas antiplaquetas que são inibidores mais fracos da agregação de plaquetas comparados com os po1ipeptídeos do presente invento. Os polipeptideos do invento podem também ser usados para evitar enfarte do miocárdio.

Estes po1ipeptídeos podem ser administrados por quaisquer meios adequados que resultarão na sua libertação para o sangue em quantidade substancial.

Eles podem ser combinados com agentes trombolíticos tais como activadores do plasminogénio ou estreptoquinase de modo a inibir a agregação de plaquetas. Eles podem também ser combinados com anticoagu1 antes tais como heparina, aspirina ou warfarin. A administração intravenosa é presentemente considerada como a via de administração preferida. Eles são solúveis em água e podem portanto ser eficazmente administrados em solução.

Num exemplo de aplicação, uma quantidade adequada de Echistatin é administrada intravenosamente a uma vítima de ataque cardíaco sujeita a angioplastia. A administração ocorre durante os vários minutos antes da angioplastia e é dada numa quantidade suficiente para inibir a agregação de plaquetas, e.g. uma quantidade que atinge uma conçentração estacionária no plasma entre cerca de 0,05-2jjM. Caso o paciente necessite de ser submetido a cirúrgia de bypass, a administração de equistatina deverá ser parada imediatamente e não causará complicações durante a cirúrgia as quais surgiriam devido a outros materiais tais como aspirina ou anticorpos monoclonais (e.g. 7E3, ver Gold et al.) os efeitos dos quais duram várias outras após a cessação da administração.

presente invento também inclui uma composição compreendendo activador do ρ1 asminogénio recom-51 -

binante tipo tecido de cadeia simples ou estreptoquinase e um polipeptideo tendo uma seqência H^N-(Ch )-Cis-R-R-R-Arg-G1i-Asp-R-R-R-R-R-Cis-(Cx)-Η, onde cada R, iguais ou diferentes, representa qualquer aminoácido. 0 invento também inclui um método para a formação de trombolíse e prevenção da reoclusão num paciente que se caracteriza pela administração ao paciente de uma quantidade de activador do plasminogénio recombinante tipo tecido de cadeia simples e uma quantidade de um peptídeo tendo uma seqência H^N-(Ch )-Cis-R-R-R-Arg-G1i-Asp-R-R-R-R-R-Cis-(Cx)-Η , onde cada R, iguais ou diferentes, representa qualquer aminoácido.

presente invento pode ser realizado noutras formas específicas sem se afastar dos seu âmbito ou atributos essenciais. Assim, os exemplos específicos descritos atrás não deverão ser interpretados como limitantes do âmbito do presente invento.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1-.- Processo para a preparação de um poli peptideo tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

   X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y onde X é H ou pelo menos um aminoácido; Y ê OH ou pelo menos um aminoácido; e cada R, iguais ou diferentes, é qualquer aminoácido, caracterizado por:

   a) se purificar o referido polipeptideo a partir de veneno de víbora; ou

   b) se produzir o referido polipeptideo utilizando meios de produção recombinantes adequados.
2. 2*.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, para a preparação de um polipeptideo rico em císteina contendo a seguinte sequência de aminoácidos:

   H₂N-(Ch>-Cy_S-R-R-R-Arg-Gly-_Asp-_R__R__R__R__R_

   Cys-(Cx)-H onde Ch representa pelo menos um aminoácido; Cx representa pelo menos um aminoácido; e cada R, iguais ou diferentes, representa um aminoácido, caracterizado por:

   a) se ligar o primeiro aminoácido C-terminal da sequência a uma resina sólida de poliestireno inter-ligado para formar um polímero aminoaci1ado, se remover o grupo bloqueador do primeiro aminoácido C-terminal do polímero aminoaci1ado, se acoplar o segundo aminoácido da sequência ao residuo de aminoácido C-terminal, se acoplarem os aminoácidos subse-53- quentes passo por passo para formar a sequência polipeptidica e se remover o grupo Boc N-terminal protector do aminoác i do N-terminal;

   b) se tratar a sequência polipeptidica com HF e um ou mais captadores contendo grupos tio.

   c) se lavar e transferir a sequência tratada da coluna para um volume grande de ácido acético diluido para minimizar ligações cruzadas indesejáveis; e

   d) se ajustar a solução resultante do passo c) a um pH de aproximadamente 8,0 com agitação.
3. 3^?.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um po1ipeptideo, substancia 1 mente puro, tendo a seguinte sequência de aminoácidos :

   Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-,Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
4. 4^?.- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se preparar um polipeptideo, substancialmente puro, tendo a seguinte sequência de aminoácidos :

   Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-ThrCys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-GlyLeu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-GlyR-Ile-Cys-R-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Y onde Y e R têm o mesmo significado da Reivindicação 1.
5. 5^?.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo, substancia 1 mente puro, tendo a seguinte sequência;

   Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-GlnGly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-CysGln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-LeuThr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-CysAsp-Gln-Asp-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-CysArg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-CysThr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
6. 6⁵.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo, substancia 1 mente puro, tendo a seguinte sequência:

   Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-GluGly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-CysGln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-LeuThr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-CysAsp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-CysArg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-CysThr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His ya _ processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um pol ipeptideo, substancialmente puro, tendo a seguinte sequência.

   Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-GluGln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-AsnCys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-LysLeu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-CysCys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-ValCys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-TyrCys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
7. 8^?.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo, substancialmente puro, tendo a seguinte sequência de aminoácidos :

   Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-ArgArg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-ArgVal-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-ThrGly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-AsnHis
8. 9⁵.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um po1ipeptideo, tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

   Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glo-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Phe-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr

   -57103.- processo.de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um po 1 ipeptideo , tendo a seguinte sequência de aminoácidos :

   Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
9. 11³.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo, tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

   Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Sly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
10. 12⁵.- Processo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um po1ipeptideo, tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Trp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
11. 13-.- Processo, de acordo com a reivindicação 1; caracterizado por se preparar um polipeptideo tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Hi s-Lys-Gly-Pro-AlaThr
12. 14³.- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
13. 15³.- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipeptideo, tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Pro-ArgGly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr
14. 16^â.- Processo, de acordo com a reivindicação 1, para a purificação de um polipeptideo da seguinte sequência:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr caracterizado por compreender:

    (a) a dissolução do veneno de Echis carinatus liofilizado numa solução ligeiramente básica;

    (b) a centrifugação da solução para se recuperar o sobrenadante;

    (c) a aplicação do sobrenadante numa coluna; e (d) a determinação das fracções contendo actividade inibidora da agregação de plaquetas e a concentração sob vácuo.
15. 17⁵.- Método para inibição da ligação do fibrinogéneo a plaquetas de mamífero ou da agregação das plaquetas de mamíferos induzida pelo fíbrinogénio caracterizado por compreender a incubação das plaquetas de mamíferos

    X com um polipeptideo de acordo com a Reivindicação 1, sendo a gama de dosagem tal que se obtenha uma concentração no plasma, no estado estacionário, de desde 0,05 a 2 pM.
16. 18^â.- Método para inibição da agregação de plaquetas num mamifero, caracterizado por compreender a administração ao referido mamifero, de um polipeptideo de acordo com a Reivindicação 1, para inibir a ocorrência da agregação de plaquetas na corrente sanguinea, sendo a gama de dosagem tal que se obtenha uma concentração no plasma, no estado estacionário, de desde 0,05 a 2 jjM.
17. 19^?.- Gene caracterizado por compreender uma molécula de DNA recombinante codificadora de um polipeptideo tendo a seguinte sequência de aminoácidos:

    H₂-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-K-^cy^s (Cx)-H onde Ch representa pelo menos um aminoácido; Cx representa, pelo menos um aminoácido; e cada R, iguais ou diferentes, representa um aminoácido em que o referido polipeptideo inibe a agregação de plaquetas.
18. 20^?.- Gene, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequência de aminoácidos ser a seguinte:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-ArgGly-Asp-Asp-Phe-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr

    -6221³.- Vector de expressão microbiano replicãvel, caracterizado por compreender uma sequência promotor-operador capaz de expressar proteínas heterólogas num microorganismo seguido de DNA codificador de um inibidor da agregação de plaquetas tendo uma sequência de aminoácidos:

    H₂N-(Ch)-Cys-R-R-R__Arg__Gly (Cx)-H

    -Asp-R-R-R_R__R__Cys_ onde Ch representa pelo menos um aminoácido; Cx representa pelo menos um aminoácido; e cada R, iguais ou diferentes, representa um aminoácido, em que a transcrição do referido DNA num microorganismo transformante está sob o controlo do referido promotor-operador.
19. 22³.- Vector de expressão, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter a seguinte sequência de aminoácidos:

    Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-LysPhe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Asn-Ala-ArgGly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrCys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-AlaThr

    -6323^§.- Cultura de células viáveis caracterizado por compreender células transformadas com o vector de expressão da Reivindicação 22.