JPS62502378A - 型特異的乳頭腫ウイルスdna配列およびペプチド - Google Patents
型特異的乳頭腫ウイルスdna配列およびペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
型特異的乳頭腫ウィルスDNA配列およびペプチド[技術分野]
本発明は、乳頭腫ウィルス(PV)のポリヌクレオチド配列中に、PVの型およ
び種の区別ならびに識別に有用なヌクレオチド配列のセグメントが存在するとい
う発見に関するるものである。ゲノム中のこの領域(可変領域)は特定のPV型
に特異的であって、与えられた特定のPVに特異的なりNAプローブ、抗体(標
識化および非標識化)、ポリペプチドセグメント、標識化ポリペプチドセグメン
ト、およびワクチンの製造の基礎を形成する。
本発明の別の局面によれば、さらに全てのPVのポリヌクレオヂド配列は、全P
Vに特有であり且つPV属特異的、即ち任意のPVを認識および区別し、非PV
ウィルスおよびウィルス生産物を識別するポリペプチドセグメント(標識化およ
び非標識化)および抗体(標識化および非標識化)の製造の基礎を形成する高度
保存化領域を含んでいることが発見された。この後者のDNA配列は、「風待異
的」と呼ばれる。
[背景技術]
人の癌の誘起に関係するウィルスの探査は挫折の多いものであった。数多くのウ
ィルスが、ヒトの癌ウィルスとしての可能性があるものとして新たな興味をひい
てきた。こうしたウィルスの1つがヒト乳頭腫ウィルス(HPV)である。HP
Vは電子顕微鏡によって見ることができた最初のウィルスの1つであるが、この
ウィルスの生物学についての情報は、最近まで殆んど得られなかった。初期の研
究は、HPVか悪性腫瘍と結び付いているという直接の示唆を提供することがで
きなかった(これらの研究は、ローソーン等によりバクテリオロジカル・レビx
−(Bacteriol、 Rev、)31巻llO〜131頁(1967)に
論評されている)。しかしながら、早くも1930年代に、ワタオウサギの乳頭
腫ウィルス(CRPV)がその宿主の種に対し発癌性であるということが実験的
証拠によって示されていた[ルース等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル
・メディスン(J 、 Exp、 Med)65巻523〜548頁(1935
)]。さらに、他の動物の乳頭腫ウィルスが実験動物に腫瘍を発生させ、幾つか
のものは培養細胞に形態学上の形質転換を起こすことができるということがわか
った[オルメン等、アーカイブス・オブ・エンバイアランメンタル・ヘルス(A
rch、 Environ、 Health)19巻827〜837頁(196
9)i。しかし、実験動物へのHPVの実験的移入も、また、ウィルス複製また
は生物学的活性の発現を許容する組織培養系のいずれもが成功しなかった。した
がって、HPVの研究は大部分が乳頭腫から得られるウィルス粒子(ピリオン)
の物理的および化学的性格決定に限定されてきた。
培養物中でHPVウィルスの複製を許容する系を確立することの不可能性は、詳
細な分子解析を可能にするウィルスDNA配列の分子クローニングによりある程
度克服できた。さらに、解剖学的な部位嗜好性を有する、最小限の関連性を有す
る数多くのウィルス型が発見され、まrコ、悪性の可能性がある病変中にHPV
抗原およびDNAが見出された。以前には、これらの病変の原因は、他の伝染性
物体または何か他の未知の病因に帰せられていた。これらの発展により、HPV
の研究がウィルス発癌の立場から魅力あるものとなった。 乳頭腫ウィルス属の
成員は、小さく(直径50〜55nm)、二十面の対称性を有するエンベロープ
の無いウィルスであることが知られている。このゲノムは、約8000塩基対(
8kb)を含む円形の二本鎖D N A分子より成る。ピリオンは、ウィルス陽
性の乳頭腫から、電子顕微鏡により、また、表皮を機械的に破壊し、次いで一連
の分別遠心分離工程および塩化セシウム中でのバンド化を行なうことによって容
易に単離できる。殆んどの試料において2本のバンドが現われ、この一方は1.
339/iσ、他方は1.299/+Qに現われる。前者はDNAの入った「全
体の」ピリオンを表わし、後者は「空の」ウィルス酸から成っていると信じられ
ている。このDNAは、ピリオンをイオン性界面活性剤で破壊し、有機抽出によ
り蛋白質を除くことによって単離できる。得られたDNA試料は通常、2つの形
のDNA、即ち高次コイル分画(FoI)およびニック円形(nicked−c
ircular)型(FoI[)を含んでいる。
P■)が同定されている。これらのウィルスは、DNA配列の相同性、抗原とし
ての関連性、組織特異性(皮膚または粘膜表面)の程度が異なり、違った型の病
変(線維乳頭腫または乳頭腫)を誘発する。
ヒト乳頭腫ウィルスは、さらに大きな多様性を示す。現在18の異なるHPV型
が文献に記載されており、さらに別の型力く発見されるであろうことが予測され
ている。ウィルスの新規な型として分類するためには、標準的なハイブリダイゼ
ーション条件下において数分類ウィルスと50%以上のDNA配列の相同性があ
ってはならない。与えられたウィルス型に対し50%より大きな配列相同性をも
ってハイブリダイズするDNAは、サブタイプとみなされる[コーギン等、キャ
ンサー・リサーチ(Cancer Res、)39巻545〜546頁(197
9)]。標準的ハハイブリダイゼーシヨは、DNAの融解温度より25℃低い温
度(Tm−25℃)で実施し、この温度では約17%の塩基が誤対合をおこす[
レアー等、ネーチャー(Nature)224巻149〜154頁(1969)
]。
現在HPVは、配列相同性と感染部位の点で、以下の表■に示すように分類でき
るようである。
表 1
ヒト乳頭腫ウィルス(HPV)
部位 病変 一群内の相同性(%)
皮膚性
HPV−1足底床贅 く1%
)rPV−2尋常性床贅
HPV−4足底床贅
HPV−7ブッチャーの尋常性床贅
HPV−3扁平床賢 く35%
HP V −10扁平洸贅
*
HPV−5EV 5−39%
HPV−8EV
HPV−12EV
HPV−14EV
HPV−9EV −5−19%
HPV−15EV
HPV−17EV
粘膜皮膚性/粘膜性
HPV−6性器床贅 3〜25%
HPV−11喉頭乳頭腫
HPV−13限局性表皮過形成
HPV−16頚部の癌腫 〈1%
HPV−18頚部の癌腫
*床状表皮異形成の批糠疹様病変
皮膚表面に感染するウィルスは、粘膜表面に感染するものよりも、他の皮膚感染
性HPVに対しある程度相同性が高いようである。さらに、ある特定のウィルス
型は専らその病変部位と結び付くが、時には他の病変部位に見出され得る。ジエ
ンセン等の報告[ラボラトリ−・インベスティゲーション(Lab、I nve
st、)47巻491〜497頁(1982)]によると、HPV−1は足底床
贅の約85%に存在するが、HPV−2もまた低率の足底床贅に検出されており
、逆の事も言える。特に興味深いのはヒト乳頭腫ウィルスの3.5.8〜1O1
12〜15および17型の群である。これらのウィルスは、全身性化した批糠疹
様病変を特徴とする稀な退行性病変である症状表皮異形成(EV)または扁平洸
贅をもつヒトに付随して見出される[ジャブロンスカ等、キャンサー・リサーチ
(Cancer Res、)32巻583〜589頁(1972)l。3および
IO型を除き、この群のHPVは健康人の圧贅からは検出されておらず、免疫抑
制された腎の同種移植片受容者の病変からに限り確認されている[ルツナー等、
ジャーナル・オブ・インベステイゲイテイブ・ダーマトロジー(J、 I nv
est、 Dermatol、)75巻353〜356頁(1980)]。さら
に、HPV−5およびHPV−8を含む病変は、日光に暴露される領域に存在す
る場合、しばしば悪性のものに変化することが報告されている。原発生および転
移性の癌の)zイブリダイゼーション分析により、これらの腫瘍の中にHPV−
5およびHPV−8のDNA配列が存在することがわかった[オース等、セルプ
ロリフアレージョン(Cell Prolif、)7巻259〜282頁(19
8Q)];オスドロー等、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、 Natl、 Aead、 Sci、)
79巻1634〜1638頁(1982)およびブフイスター等、レビューズ・
オブ・フィジオロジー・バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー(Re
v、 Physiol、 Biochem、 Pharmacol、)99巻1
11−181頁(1983)]。
厳密でないハイブリダイゼーション条件を用いた最近の研究によれば、HPVと
他の動物の乳頭腫ウィルスの間でそうであるように、各HPVゲノムのゲノム間
で同一のDNA配列が維持されていることが実証された[バイルマン、C,A、
、ジャーナル・オブ・ウイロロジー(J 、V 1ro1.)32巻199〜2
07頁(1979)]。したがって、現在では、PV特異的DNAプローブを用
いてPV誘発性と思われる病変から取り出したDNAを調べ、非厳密ハイブリダ
イゼーション条件を使用することにより関連する配列を探すことが可能である。
この試みは、未知の型のHPVのHPVDNA配列ならびに肛門性器洸贅から調
製されたDNA[クルツィツエク、R,A、等、ジャーナル・オブ・ウイロロジ
−(J 、V 1ro1.)36巻236〜244頁(1980)’lおよび若
年性喉頭乳頭腫からのDNA[ランカスター、W、D、、インターウイロaジー
(I ntervirology) 15巻204〜212頁(t981)]に
ついて成功することが立証された。
PVゲノムの分析のための適当な組織培養系が無いにもかかわらず、分子クロー
ニング技術により生産された大量のDNAの配列解析の結果、このウィルスゲノ
ムの考え得る機能についてのかなりの洞察が進められた。牛乳頭腫l型(BPV
−1)l、チェノ等、ホーチャー(Nature) 299巻529−534頁
(1982)]、HPV−1a[ダノス等、エンボ・ジャーナル(Embo、
J 、) 1巻231〜236頁(1982)]および]HPV−6bシュバル
ツ等、エンボ・ジャーナル(E mbo、 J 、) 2巻2341〜2348
頁(1983)コのヌクレオチド配列が現在知られている。同様に既知なのは、
)(PV−11、HPV−16、および兜の乳頭腫(DPV)のD N A配列
である。
乳頭腫ウィルスは抗原性の点で同族であるということも立証されている。特異的
HPVの無傷なウィルス粒子に対して生成された抗血清は型特異的であり、他の
型のHP Vに感染した組織中では反応しないが、熱および界面活性剤で破壊し
たPVピリオンに対して生成された抗血清は、全てのHPVおよび他の動物種の
PVのキャプシド抗原と交差反応する[ジエンセン、A、B、等、ジャーナル・
ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテユート(J NCI )64巻、4
95〜500頁(1980)]。この知見により、乳頭腫ウィルスの主要キャプ
シド蛋白質中には、この風待異的抗原交差反応性の原因となる共通のアミノ酸配
列があり、この共通のアミノ酸配列はピリオン粒子表面に露出していないという
考察が導かれた[ホーレイ、P、M、、アーカイブズ・オブ・パソロジー・アン
ド・ラボラトリ−・メディスン(Arch、 Pathol、 Lab、 Me
d、 ) 106巻429〜432頁(1882)]。
したがって、通常のP、M、−抗原に対して生成された抗血清の使用は、既知ま
たは未知の任意のHPVに増殖的感染した細胞の同定に有用である。この交差反
応性抗血清により、病理学者および臨床研究者は、若年性喉頭乳頭腫[コスタ、
J9等、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジ−(Am、 J
、Cl1n、 Pathol。
)75巻194〜197頁(1981);およびラック、El等、インターウイ
ロoジー(I ntervirology) I 4巻148〜156頁(19
81)]および頚部扁平圧贅[カーマン、R,J、等、アメリカン・ジャーナル
・オブ・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー(A m。
J 、 0bstet、 Gynecol、 ) 140巻931〜935頁(
1981):およびモリン、C2等、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャ
ンサー・インスティテユート(JNCI)66巻831−835頁(1981)
]の病変物質としてHPVを同定することができた。しかしながら、この抗血清
は、特異的HPVの同定には有用でなく、または適当でない。さらに、この抗血
清は初期段階の感染または蛋白質の発現が起こっていない感染を拾い上げるには
役立1こないため、ウィルス感染が蛋白質の発現が起こっている時点まで進行し
ていることが必須である。
今日までHPVゲノムの機能的局面については殆んど知られていない。動物の乳
頭腫ウィルス系に関しては、より多くの情報が得られている。ゲノムの体制は乳
頭腫ウィルス間で高度に共通しているため、動物とヒトの乳頭腫ウィルスの間に
ゲノム構造および機能に関して同゛様な関係を想定するのは理にかなっている。
動物の乳頭腫ウィルスの幾つかは高い発癌性があるため、この機能の全てまたは
一部の幾つかのHPVの性質でもあり得るということが考えられる。
尋常性床贅、足底床贅、および扁平痣贅といった多くのHPV誘発性病変は全く
良性であり、臨床上癌腫への進行1こ結び付くことはない。しかしながら、幾つ
のHPVは、時に扁平上皮癌への二次的展開を伴い、HPV−5は、床状表皮異
形成の患者において皮膚癌と結び付く。若年性喉頭乳頭腫は乳頭腫ウィルスHP
V−1tによって惹起される。照射をせずに喉頭の湿潤性側頭鱗癌に自然移行し
た稀な症例が、ランケル、Dl等によりアメリカン・ジャーナル・オブ・サージ
カル・パソロジー(Am、 J、 Surg、 Pathol、)4巻293〜
296頁(1980)に記載されている。照射療法の後には、より頻繁に若年性
喉頭乳頭腫症の経過が扁平上皮癌に進行する。肛門性器床贅(condolom
a acuminata)は数多くの異なったHPVによって引き起こされる。
文献には、この病変の若干例が局所性湿潤性扁平上皮癌に進行したとの報告があ
る[ツア・ハウゼン、Ho、カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジー
・アンド・イミュノ977)]。さらに、HPV特異性抗原が、異形成と解釈さ
れる頚部病変の50%に検出された。頚部異形成と同部位における癌腫および湿
潤性頚部癌腫との明白な疫学上の結び付きは、少なくともこの進行におけるHP
Vの役割を強く示唆するものである。
数多くのpvが存在し、成るPV誘発性病変に1以上のPVが存在するという事
、乳頭腫と様々な癌腫との厳密な結び付き、そして、ウィルス誘発性乳頭腫から
導かれる。癌に関連しない医学上の問題から、高度の確実性をもって、乳頭腫の
特異的病因を同定する方法論に対する、進行中の且つ絶えず増大する必要性が生
じた。したがって、存在が知られている多数のPV型の識別手段、ならびに尚未
知のPV型をさらに同定する手段の必要性が存在し続けている。
薗時に、全PVに共通する高度共通性ヌクレオチド配列およびこの高度共通性ヌ
クレオチド配列がコードしている「共通抗原」の決定は大きな価値があり、かつ
その必要性が存在し続けている。この配列の決定は、全PVと交差反応性の抗体
の生産において大きな価値があるであろう。
表皮細胞の増殖的乳頭腫ウィルス感染は、有蒜層の細胞の過形成(親細胞症)に
つながることが現在知られている。細胞は大きさを増し、橋小体と張原線維の数
を増す。他の表皮細胞は、張原線維の消失、橋小体の剥離、核のしわ、細胞質の
空胞化を伴う変性的変化を示す。表皮の上層においては、これらの変化がより著
名である。顆粒層の細胞は、核の変性、辺縁趨向、およびクロマチンの凝縮を示
す。ピリオンは電子顕微鏡によるとケラチン層の変性細胞の核中およびしばしば
結晶間列に現われる。
乳頭腫ウィルス感染に対する宿主免疫反応は良くわかっていないが、感染は通例
若年者に起こり、その後圧贅の持続が様々な期間に及ぶ。緩解後、宿主は同ウィ
ルスによる再感染に対し免疫が残る。
人間の場合、)(PV感染に対する抗体反応は、緩解の開始に先立つIgMの出
現を特徴とする。緩解直後にIgM及びIgG抗体が出現し、緩解のずっと後に
IgGのみが検出できる[フォノ・クルー、G。
Jo、ダーマトロジ−(Dermatol、)18巻195〜204頁(197
9)コ。IgMからIgGへのこの転換は、実験的にBPVな感染させた牛にお
いて同様に観察された[リー、K、P、等、キャンサー・リサーチ(Cance
r Res、)29巻1393−’1397(1969)]。
乳頭腫の拒絶は細胞性免疫と密接に結び付いていると思われる。
実験的に乳頭腫ウィルスに感染させた牛においては、緩解に先立って単核白血球
、主にリンパ球の浸潤がおこる。これは通例血管1辺領域に起こるが、乳頭腫全
体の洲漫性散乱としても起こる[リー、K、P、等、ジャーナル・オプ・インベ
スティゲイティブ・ダーマトロジー(J 、 I nvest、Dermato
l、)52巻〜454〜464頁(1969)]。
人間の場合、緩解しつつある扁平圧贅は、上部真皮における単核白血球の血管周
辺への浸潤、そして乳頭腫に限局された表皮への侵入を伴う。類似の組織学的外
観を呈す[タガミ、Hl等、ジャーナル・オブ・ダーマトロジー(J 、 De
rmatol、) 90巻147〜154頁(1974)]。離れた部位におけ
るこの複数の床贅の同時緩解は、細胞性免疫が乳頭腫の拒絶に主たる役割を演じ
ていることを示唆している。しかしながら、扁平床贅の緩解は同一人物の足底ま
たは手掌床贅に影響せず、これは緩解がHPVの型特異的であることを示すもの
である[バーマン、A1等、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ダーマトロジ
ー(Br、 J 、Dermatol、)99巻179〜182頁(1978)
]。複数の型のRPVに感染させた牛においても同様の別々、な床贅緩解が観察
された[バートルド、S、W、等、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ベタリ
ナリー・メディカル・アソシエーション(J 、Am、Vet、Med、As5
oc、) 165巻276〜280頁(1974)]。
[発明の開示コ
特異的PVを同定するアッセイを開発するため、特異的PVに対する抗血清を作
り、ここから競合的かつ/または免疫測定的アッセイを開発するのが望ましい。
足底洸贅には大量のウィルス物質が存在し、また厳密条件下ではHPV−IDN
Aと交差ハイブリダイズするHPVDNAが同定されていないため、HPV−1
のような成る乳頭腫ウィルスについて型特異的抗原または抗体を調製することが
できる。しかしながら、粘膜表皮に感染するウィルスについては、免疫原物質と
して使用する充分量のウィルス粒子を得ることが極めて困難である。キャプシド
蛋白質上に存在(恐らく内部に)するとわかっている共通の抗原決定基の故に、
ポリクローナル抗体が他のPVとの交差反応性を最も産み出し易いと思われる。
存在が知られている種々のPVを区別するアッセイに対する必要性が募るにあた
り、本発明者等は初めに、キャプシド蛋白質中の型特異的抗原決定領域が、各P
Vの主要キャプシド蛋白質をコードしているDNA配列をコンピューター解析す
ることから推定し得ると考えた。分子クローニング技術に、より、配列決定を行
なうに充分量のDNAが得られた。
この概念が、本発明、即ち与えられた型の主要なPVキャプシド蛋白質(Ll)
をコードしている開放読み取り枠のDNA配列が、実際には他のいかなるPV型
の対応セグメントとも実質上同一性を示さない少なくとも1個のDNAセグメン
トを含んでいるという発見、そして、この非同−DNA配列がPV型型具異的D
NAプローブ型ド、標識化オリゴペプチド、標識化抗体、実質上純粋な抗体、診
断方法、アッセイキット、およびワクチンの製造に利用できるという発見に導い
た。
同様の解析により、本発明の他の局面、即ち主要キャプシド蛋白質Llをコー゛
ドしている配列内における共通PV抗原をコードする高度に共通したDNA配列
の発見が導かれた。この抗原(ポリペプチド)は、任意の且つ全てのPVと交差
反応性の抗体の生成を導き出す。この高度に共通したヌクレオチド配列の発見は
ζPV属特異的抗体、固持異的免疫原的および免疫学的特性を与えるオリゴペプ
チド、風待異的標識化抗体、診断方法、アッセイキット等の製造を可能にする。
[図面の説明]
第1図は、BPV−1,HPV−1aおよびHPV−6bのL1開アミノ酸配列
を示す。
第3図は、BPV−1、DPVおよびBPV−2の一部ニツイテのEl読み取り
枠のアミノ酸配列を示す。
第4図は、BPV−1、DPVlHPV−1a、HPV−6b、CRPVおよび
BPV−2の一部についてのEl読み取り枠のアミノ酸配列を並べたものを示す
。相同マーク領域A、B、C,DおよびElならびに好ましい、そしてより好ま
しい型特異的(TS)領域を示しである。
第5図は、BPV−1ゲノムとBPV−2ゲノムの6040および6754ヌク
レオチド間のDNA配列の相同性の比較である。
第6図は、型特異的デカペプチドに対する抗血清にょるBPV−1の形質転換活
性が中和される動力学を示す。
[発明を実施する最良の方法]
本発明は任意のPvに適用できる。当分野において常套であり周知の配列決定技
術、即ちマクサムおよびギルバート(1977)の方法(引用としてここに記載
する)を用いて、主要キャプシド蛋白質のEl読み取り枠のヌクレオチド配列を
得るだけでよい。最初のATGコドンが最初のアミノ酸であると考えられる。既
に知られているPV配列、特に下記に指摘する型特異的配列との比較、または例
えばコンピューター処理による比較を利用した共通の相同領域を比べることによ
り、ヌクレオチド配列内の可変領域、即ちPV型特異性を付与することのできる
領域の決定が容易にできる。
このようにDNA配列中にPV型型具異的可変領域位置するのであるから、次に
は、(1)型特異的プローブとしてこのDNA配列自体を標識化した形で利用し
、(2)PV型型具異的競合アッセイおいて、DNA配列から誘導できるペプチ
ド配列を、標識化した形で利用し、(3)DNA配列から誘導できるペプチド配
列から、Pv型型具異的実質上純粋な抗体を製造し、(4)免疫測定アッセイ用
に、標識化したpv型型具異的抗体製造し、(5)P V型持異的免疫原性を付
与するためのアミノ酸配列を製造し、そして、(6)PV型型具異的アミノ酸フ
ラグメントらPv型型具異的ワクチン製造することができる。−言で言えば、本
明細書に別個に記載された型特異的可変領域のヌクレオチド配列に対して述べら
れた任意の且つ全ての用途は、本発明、即ち全てのPVに振替可能な技術および
概念の結果として、今や当分野における通常の知識を有する者にとって利用可能
である。
例えば、第1図に示されるのは、ハツシュのマトリックスアルゴリズムを用いた
コンピューター解析による3つの関連の無いウィルス、BPV−+5HPV−1
aおよびHPV−6bのLlヌクレオチド配列の比較である。第1図は、かなり
の程度の配列の相同性を有する領域があることを示している。対角線はL1読み
取り枠内の相同領域を表わす。対角線に沿った各データの点についての相同性の
程度を、各々の図の下の棒グラフに示す。図AはBPV−1(X軸)対HPV−
1aの比較であり、図BはBPV−1(X軸)およびHPV−6bの比較であり
、図CはHPV−6b(X軸)とHPV−1aとの比較である。
BPV−1とDPVについてのL1読み取り枠のアミノ酸配列を比較すると、遺
伝暗号の過剰のために、Llポリヌクレオチド配列について示されるより高度の
一致が現われている(第2図)。Ll開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳
によって、アミノ酸配列が決定された。このアミノ酸は1文字暗号で表現しくレ
ーニングジ干−1A、L、、バイオケミストリー(B iochemistry
)第2版72頁(1975)を見よ)、ポリペプチド配列に最初のメチオニン残
基がら番号を付ける。BPV−1配列は全て大文字であり、DPV配列上に食い
違いが生じた場合、そのアミノ酸は小文字である。配列のずれは、整列の目的の
ために採用した。一致箇所は2つの対応残基間の縦線として印を付けた。
第3図においては、約lθ%のD N A配列相同性を有しく液相ハイブリダイ
ゼーション)、抗原性のうえで交差反応性(ごく弱く働く)である2種のウィル
ス、BPV−1およびDPVを比較している。
5個の領域を除きアミノ酸の一致は極めて高い。DPVアミノ酸配列配列実質的
な一致を示さない、長さにして6個のアミノ酸より長いBPV−1アミノ列配列
上の領域(El読み取り枠の最初のメチオニン残基から教える)は、27〜31
位、46〜57位、260れは型特異性を司っている可能性のある領域を表わす
。BPV−1アミノ酸量列を部分的BPV−2アミノ酸配列と比較した場合、3
42〜348位および464〜495位のアミノ酸によってつながった領域に殆
んど完全な一致があり、これら2つの密接に関連するウィルス間に示されるアミ
ノ酸の一致からの実質的な逸脱を示す262〜283位の領域がある。第3図に
おいて、アミノ酸配列はLl開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳によって
決定した。アミノ酸は1文字暗号で表現し、ポリペプチド配列には最初のメチオ
ニン残基から番号を付けである。BPV−1配列は全て大文字とし、BPV−2
またはDPV配列上に食い違いが起こった時、そのアミノ酸を小文字としである
。配列のずれは整列の目的のために採用した。“は、未知のBPV−2L1ヌク
レオチド配列の領域を示す。
一致箇所は2つの対応残基間の縦線として印を付けである。
第4図は、BPV−1、DPV、HPV−1a、HPV−6b、CRPVおよび
BPV−2の一部についてのLl読み取り枠のアミノ酸配列を示す。それぞれの
Llの開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳によってアミノ酸配列を決定し
た。アミノ酸は1文字暗号で表現してあり、各配列に最初のメチオニン残基から
番号を付けである。2またはそれ以上が一致する場合アミノ酸を大文字とし、小
文字のアミノ酸は不一致を示している。配列のずれは整列の目的のために導入し
た。“は、未知のBPV−2ヌクレオチド配列の領域を示す。「−」は、少なく
とも2個のアミノ酸が同一であることを、そして「*」は、全てのアミノ酸が同
一であることを示す。
BPV−I L 1読み取り枠の262〜283位(両端を含む)のアミノ酸に
よりつながっている領域が型特異的免疫原を示すという概念を確認するため、2
74〜283位間のアミノ酸に見出されるデカペプチドを合成し、これに対する
抗体を生成した。BPV−ILl配列から導き出されるデカペプチドは、以下の
配列(N末端より)lys −asn −asn −1ys −gly −as
p −ala −thr −1eu −1ysを有する。この配列は1文字暗号
を用いると、KNNKGDATLK
となる。
合成ポリペプチドに対して抗体を生成させる方法の完全な詳細ならびにその結果
は、下記の実施例1に報告する。ウサギ由来の無傷のBPV−1に対する超免疫
血清はBPV−1と交差反応するとわかった。さらに約10倍の低希釈でBPV
−2と反応することられかった。デカペプチドに対し生成された抗体はl:2の
希釈でさえBPV−2線維乳頭腫と反応しなかったが、一方これはl:50の希
釈でBPV−1の線維乳頭腫と反応した。この結果は、デカペプチドに対する抗
体はBPV−1型特異的である事を強く指示し、そしてより重要なことに、この
型特異的抗体は、乳頭腫ウィルスの型とサブタイプ間の分類(即ちDNA配列の
一致が50%より多いか少ないか)を規定するために用いられる2種のウィルス
(BPV−1およびBPV−2)を識別することができる。BPV−1ウイルス
およびBPV−2ウイルスは50%のDNA配列相同性ををする。
本発明の1つの局面は、それ自身型特異的であって、やはり型特異的である比較
的小さなアミノ酸配列をコードしている、Ll読み取り枠中の成るヌクレオチド
配列の発見に向けられている。この隔離された配列は、独自の用途、即ち標識化
した形でのDNAハイブリダイゼーション分析のための用途を有する。「隔離さ
れた配列」という語は、フラグメントとして天然に存在せず、自然の状態で見出
し得ないDNAフラグメントを包含することを意味している。この配列は、典型
的には長さにして5〜75のヌクレオチド、好ましくは最低18ヌクレオチドの
長さである。
第5図は、BPV−1ゲノムおよびB P’V −2ゲノムの6040〜675
4間のヌクレオチドのDNA配列の相同性の比較を示している。棒グラフはウィ
ルスゲノム間の相同性の程度を表わしており、6440位からすぐ上流の領域は
最低度の配列相同性を示している。
上方のヌクレオチド配列は、この領域内の相同性の程度を示す。同一のヌクレオ
チドに「*」印を付けである。この配列相同性の低い領域は、アミノ酸の相違が
あるL1開放読み取り枠の領域を表わす。
棒線はBPV−1型特異的抗体を生成するために合成し使用したポリペプチドを
コードしている領域を示す。
L1開放読み取り枠中、最も興味深い領域は、最初のメチオニン残基から教えら
れた場合、RPV−1についてはアミノ酸位置262〜283(22のアミノ酸
、66のヌクレオチド)、DPVについてはアミノ酸位置263〜283(21
のアミノ酸、63のヌクレオチド)、HPV−1aについてはアミノ酸位置27
1〜294(24のアミノ酸、72のヌクレオチド)、ワタオウサギ乳頭腫ウィ
ルス(CRPV)についてはアミノ酸位置266〜29(25のアミノ酸、75
のヌクレオチド)、HPV−6bについてはアミノ酸位置263〜283(21
のアミノ酸、63のヌクレオチド)、モしてBPV−2についてはアミノ酸位置
262〜283(22のアミノ酸、66のヌクレオチド)である。各ウィルスに
ついてのこの領域のヌクレオチド配列を以下に示す:
GAACTCAAA
HPV−1a
GGAGAGGCAAATGCCAACATTGMACTCTMAA
この、型特異性を与えるDNAQ域は、型特異的アミノ酸配列、即ち主要なキャ
プシド蛋白質を形成しているアミノ酸配列内の比較 □的小さなアミノ酸配列で
あるポリペプチドをコードしている。本発明に対し、「比較的小さな型持異的ア
ミノ酸量’IAJおよび「比較的小さなフラグメント」という語は、そのペプチ
ドに免疫原的および/または免疫学的特異性を与えるアミノ酸配列を包含する。
それ自身としでは、このペプチドは最低6個のアミノ酸を含み、その両側に位置
する大体3個までの天然に存在するアミノ酸を含み得る。ただし、この天然に存
在する非特異的な側面のアミノ酸は、ペプチドをしてはならない。このアミノ酸
配列に関する上限として15〜25のアミノ酸残基が本発明に包含される。しか
しながらさらに、本発明の範囲内にあるためには、このポリペプチドが免疫特異
性でなければならない。
「型特異的ポリペプチド」および「特定のPVに対し特異的なアミノ酸配列を有
するポリペプチド」という語は、Llキ千ブシド蛋白質に対応し型特異性(上記
定義による「型特異的」および「型特異性」)を付与するポリペプチドを包含す
ることを意味している。本発明のポリペプチドは。好ましくはBPV−1のLl
キャプシド蛋白質の残基251〜2911最も好ましくは残基262および28
3によって結合したアミノ酸配列に対応する。この語は、天然に存在するポリペ
プチド、天然に存在するポリペプチドとホモローガスな合成ポリペプチドおよび
その誘導体の両者を包含する。「その誘導体」とは、天然の配列とは異なるがな
お型特異性を付与するポリペプチドを意味する。
さらにこの発明は、型特異性を付与する領域内からの型特異的な免疫原的および
/または免疫学的特性を与えるに充分な残基を含み、さらに天然配列の一部では
ない他の残基をも含むよう合成された合成ペプチドをも包含する。
本発明に係る比較的小さな型特異的アミノ酸セグメントは、下記の実施例1に記
載の技術を利用して、例えば型持異的PV抗血清を製造するのに利用することが
できる。しかしながら本発明は抗血清および抗体が製造される方式によって決し
て制限されず、この発明は、単離された抗原からの抗体の産生を含む既知のまた
はなお決定されるべき技術を包含するものである。
上のように、天然に存在するペプチドセグメントは、可変領域内に、型特異性を
付与するに充分な量のアミノ酸を含み、ただし可変当業者には理解できるように
、配列を適正に並べるために、時としてアミノ酸配列中に空白を挿入することが
必要である。
アミノ酸配列を調整するとき、各配列において対応する残基の位置と正確な相同
関係を示す個々の配列内の特異的領域が用いられる。
数字で参照するために塩基配列としてBPV−1(第4図)アミノ酸配列を用い
、再び第4図に着目すると、正確な配列相同関係を示す6つの乳頭腫ウィルス全
部についてアミノ酸配列内に5つの領域が存在することが容易に認められる。こ
れらの領域は、両端も含めて、残基105および110間(6−アミノ酸配列、
RGQPLG、以後領域Aとする)、残基193および196間(4−アミノ酸
配列、DGDM、以後領域Bとする)、残基200および203間(4−アミノ
酸配列1、GFGA、以後領域Cとする)、残基227および230間(4−ア
ミノ酸配列、YPDY、以後領域りとする)および残基29゛2および295間
(4−アミノ酸配列、PS G S 、以後領、域Eとする)である。
第4図かられかるように、そこに示されたPVの各々の主たるキャプシド蛋白質
についてのアミノ酸配列を調整すると(各々のポリヌクレオチドを配列させるこ
とにより測定)、特に配列の相同性が全く無い一領域が存在するが、それはBP
V−1残基251〜2911好ましくは262〜283に対応する残基間の領域
である。領域りのテトラペプチドおよび領域Eのテトラペプチドにおける一致並
びに可能な場合領域りおよびEにより結合されたアミノ酸残基における一致に特
に注意することにより、第4図に示されたスペーシングを測定した(およびする
ことができる)。この方法で、どのPvの場合でも型特異的配列を容易に決定す
ることができる。
BPV−1について上記で示されたように、両端を含めた位置251〜291、
好ましくは262〜283に対応するPVのアミノ酸配列は、PVのL1キャプ
シド蛋白質内の型特異性領域を定める。
同様に、L1キ量プシド蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列内の対応する
領域は型特異的なりNA領域を定める。
前述し、また示唆したように、どのようなPVについても型特異性DNA配列(
およびアミノ酸配列)を容易に測定することができる。
必要なことはただ、主たるキャプシド蛋白質をコードする遺伝子のDNAを配列
し、そこから蛋白質のアミノ酸配列を推測し、BPV−1のような既知の配列を
用いて配列を調整しく特に「標識配列」、領域A−Eを利用する)、そしてBP
V−1アミノ酸量列のアミノ酸残基250〜2911好ましくは262〜283
に対応するDNAセグメント(または対応するアミノ酸セグメント)を選択する
ことである。
この発明の意図として、[型特異的乳頭腫ウィルスDNAJまたは「既知の乳頭
腫ウィルス型について特異的なポリヌクレオチド配列」の語は、BPV−1アミ
ノ酸量列または同様に型特異性を示す場合にはそのアミノ酸配列の誘導体の残基
251〜2911好ましくは262〜283に対応する主キャプシド蛋白質の型
特異的部分をコードするポリヌクレオチドを包含するものとする。当技術分野に
精通していれば理解できることであるが、前記の語は、天然配列、天然配列に由
来する合成配列、遺伝コードの結果としての同義配列および「ゆらぎ(wobb
le)Jによる第3番目の塩基における可変性による弯形体である配列[ワトソ
ン等、[リコビナントDNAニア・ショート・コースJ(Recombinan
t DNA:A 5hort Course)、38頁(1983年Xフリーマ
ン・アンド・カンパニー、ニューヨーク)参照、以後「ゆらぎ誘導体」とするコ
を包含するものとする。
さら前記の語は、型特異性を与えるのに充分なヌクレオチドを目的とするポリヌ
クレオチド配列内に含むDNA配列、すなわちどちらかの端部で重複することに
よりPVゲノムの「型特異性フラグメント」を表わす配列を包含する。
「型特異的な」または「型特異性」を示すこの発明のポリヌクレオチドには、常
套のハイブリダイゼーション技術を用いてPV型(ただしPVは50%未満のD
NA配列相同性を有する)を識別する能力を示すポリヌクレオチドが含まれる。
この発明の範囲内の特異的ポリヌクレオチドには、BPV−1配列上の位置25
1〜2911好ましくは262〜283に対応するポリペプチドをコードする前
記ポリヌクレオチド、遺伝コードの結果としての同期配列および「ゆらぎ」によ
る変形体が含まれろ。
この発明の別の具体例ではまた、乳頭腫ウィルスの主キャプシド蛋白質をコード
するDNAの特異的ポリヌクレオチドセグメントは乳頭腫ウィルスにおける「共
通抗原」であるポリペプチドをコードすることが見出された。
「型特異的」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについて前述したものと同じ
方法論を用いると、BPV−1が番号付けを目的として塩基アミノ酸配列を示す
場合、標識領域Aとして前記で決められた残基105および112間のへキサペ
プチドに対応する全PVのアミノ酸配列が相同性であることが決定された。コー
ドされたこの6−アミノ酸配列は「共通抗原」を表わす、すなわち種物異的な抗
体を産生する。これらの種特異的抗体は全Pvと交差反応性を示し、様々なイム
ノアッセイにおいて有用なものである。標識されたペプチド配列およびその誘導
体もまたイムノアッセイにおいて有用である。要するに、型特異的ポリペプチド
に対して予想された有用性はまた種特異的ポリペプチドにも当てはまるのである
(すなわち、標識抗体、アブセイキット等)。同様に、B、CSD、Eまたは他
の「共通」領域から選ばれた相同性領域を含むヘキサペプチドもまたこの発明の
範囲内に含まれる。
第4図かられかるように、この発明の態様の一興体例は、ヘキサペプチド
Arg−Gly−Gin−Pro−Leu−Glyを含むものである。当技術分
野に精通しておれば容易にわかるように、それをコードする種特異的ポリヌクレ
オチドもまた含まれる。
「誘導体」の語は、配列の種特異性は不変であるが、対応する天然ポリペプチド
とは異なるアミノ酸配列を意味する。
一興体例において、主キャプシド蛋白質の型特異的および種特異的アミノ酸配列
に対してあげられた抗体は当業界においてよく知られた常用の標識技術を用いて
検出可能に標識され得る。すなわち、抗体は、例えばtHSLtSI 、 12
11およびS″′Sのような放射性同位元素を用いて放射能標識され得る。
同様に、ペプチド配列自体も例えば放射性同位元素により検出可能標識され得る
。
型特異的もしくは種特異的抗体または種もしくは型特異的なペプチド配列抗原も
また蛍光標識、酵素標識、遊離基榎識またはバクテリオファージ標識を用い、当
業界で周知の技術(チャード、前出)により標識され得る。
一般的な蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィ
コエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドがあ
る。
特異的酵素は共有結合により他の分子に結合され得るため、トレーサー物質の製
造における標識として用いられ得るという可能性も存在する。適当な酵素には、
アルカリホスファターゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコース−6−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、マレニートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ
がある。2種。
の主な酵素イムノアッセイは、エンザイムリンクトイムノソルベントアツセイ(
ELISA)およびエンザイムマルチプライドイムノアッセイ(EMIT、シバ
・コーボレイーション)としても知られているホモジ二千スエンザイムイムノア
ッセイである。ELISAシステムの場合、例えば固相に結合した抗体を用いる
ことにより分離が行なわれ得る。EMITシステムはトレーサー抗体複合体にお
ける酵素の不活性化によるものである。すなわち分離段階を必要とせずに活性を
測定することができる。
さらに、化学ルミネッセンス化合物も標識として用いられ得る。
一般的な化学ルミネッセンス化合物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族
アクリジニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類およびオキシ
レートエステル類がある。同様に、生物発光化合物も標識に用いられ得、ルシフ
ェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
一度標識されると、抗原ポリペプチドまたはこれに対する抗体は、当業界でよく
知られた技術を用いて免疫カウンターパート(抗体または抗原ポリペプチド)を
同定および定量化するのに用いられ得る。
ラジオイムノアッセイ(RI A)に関する詳しい記載は、ワーク等による「ラ
ボラトリ−・テクニクス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・
バイオロジーJ(Laboratory Techniquesin B io
chemistry and Mo1eコular B iology)中、特
にチャードによる「アン・イントロダクション、・トウ・ラジオイミューン・ア
ッセイ・アンド・リレイテッド・テクニクス」と題する音に見い出され(ノーズ
・ホーランド・パブリッシング・カンパニー、ニューヨーク、ニューヨーク、1
978年)るが、これを引用して説明とする。
様々な型の一般的免疫測量アッセイに関する詳しい記載は、次の米国特許、43
76110(デビット等)または4098876(ピアジオ)に見ることができ
る。
特に興味深いアッセイは、PVを含有する疑のある試験液の小試料をPV型特異
的抗原と反応性のある精製抗体で被覆された不溶性ディスクとインキュベートす
ることを含む。PV型特異的抗原(アミノ酸配列)が液中に存在する場合、免疫
化学結合が抗原および固定化抗体間に生じる。可溶性物質をすべて洗浄除去後、
不溶性ディスクを今度は酵素または放射能標識されたコンジュゲート試薬と2回
目のインキュベーションに付す。試料中に抗原が存在する場合、第2免疫化学結
合がディスク上の固定化抗原および標識抗体間に生成する。再び非結合物質をす
べて洗浄除去後、ディスクを測定、例えば基質と3回目のインキュベーションに
付し、固定化酵素の触媒影響下で化学反応させることにより検出可能な最終生成
物を製造する。この最終生成物は抗原が試料中に存在する場合のみ溶液中に存在
し得るものであり、抗原が存在しないと固定化された標識が存在しないため最終
生成物は製造され得ない。
さらに、この発明のアッセイに用いられる物質は理想的にはキットの製造に敵し
たものである。このようなキットは、バイアル、試験管等のよ、うな1個または
それ以上の容器手段を閉鎖制限状態で受け入れるように区画された担体手段を有
し得るものであり、前記容器手段の各々は、方法で使用される分離要素の1つを
含む。
例えば、前記容器手段の1つは、凍結乾燥形態または溶液に可溶性の検出可能標
識抗体を含有し得る。別の容器の場合不溶性抗体を含有し得る。また担体手段も
さらに複数の容器を含み得、各容器は相異なる予め測定された既知量の抗原を含
む。次にこれら後者の容器を用いて未知量の抗原を含む試料から得られた結果を
間にはさむことのできる標準曲線をつくることができる。
(DNAハイブリダイゼーションアッセイ〕ウィルスゲノムは、独特で複雑さが
限られているため、様々なハイブリダイゼーションアプローチに特によく用いら
れる。これらの技術は、プローブとして用いられる核酸の放射能標識、固定化核
酸を用いたDNA−DNAおよびRNA−DNAハイブリダイゼーション、サイ
トハイブリダイゼーション並びに溶液におけるDNA−DNAおよびRAN D
NAハイブリダイゼーションの反応速度分析方法をともなう。プローブとして用
いられた核酸の純度および比放射能は非常に重要であり、一般に高い比放射能を
有する核酸を用いる。
プローブとして用いられる核酸の純度は特異的ハイブリダイゼーションにおける
非常に重要な要素である。感染細胞ではなく細胞外流体から得られたウィルスを
用いるのが好ましく、特に相補RAN(cRAN)または相補DNA(cDNA
)が用いられる。細胞から得られたウィルスは、汚染された細胞DNAをともな
うが、これはデオキシリボヌクレアーゼ処理により必ずしも除去されない。すな
わち、第1段階は、デオキシリボヌクレアーゼ処理が封入されたゲノムの分断を
ひき起こさないようにウィルス粒子の完全さを保つ当業界で周知の方法により高
度に精製されたウィルスを製造することである。
抽出されたウィルスD N Aをこの時点で厳密に精製するべきであり、精製後
に現われるゲノムは大して分断されていないため、大きさおよび密度またはスー
パーコイル状態のような物理特性に基づいて細胞核酸から分離され得る。この後
、高度精製エンドヌクレアーゼで処理して同フラグメントとし、次に型特異的ま
たは種特異的ウィルス蛋白質をコードする所望のヌクレオチド配列を含むフラグ
メントを単離および回収する。別法として、特異的ポリヌクレオチドプローブを
独立して合成することができる。最後に、プローブを検出可能標識するが、最も
用いられる標識は3H13″P、l!J1酵素、ビオチン/アビジン等である。
核酸ハイブリダイゼーション技術のさらに完全な説明は、フアツジ等、第6巻、
457〜497頁(1977年)で見ることができるが、これを引用して説明と
する。
ポリ、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは原子または無機基で標
識され得るが最もよく用いられるのは放射性核種であり、また、重金属も用い得
る。場合により、−重鎖D N Aに交雑(ハイブリダイズ)されたプローブに
特異結合する抗体を用いることも可能である。オリゴヌクレオチドプローブ技術
は、スジスタック等、「メソッズ・イン・エンザイモロジーJ(Meth、 E
nzymol、)68巻419−428(1979年)に記載されているが、こ
れを引用して説明とする。
最も、一般的には、放射性標識が用いられ、適当な放射性標識には”P% 3H
% ”C等がある。充分なシグナルを発し、充分な半減期を有するものならいず
れの放射性標識でも用いられ得る。他の標識には、配位子、蛍光剤、化学ルミネ
ッセンサー、酵素、抗体等がある。
6種の単独PV型、BPV−1,DPV、HPV−1a、HPV−6b、CRP
VおよびBPV−2のヌクレオチド配列のコンピュータ分析により、完全に非相
同性であり、抗原型特異的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を確認した。配
列は次の通りである。
BPV−1
TCGGAGAAACAAGCCCCTACCACAGATTTTTATTTA
AAGAATAATAAAGGGGATGCCACCCTTAAA
CAAA
BPV−1a
TCGTTGGGTGATAGGGAGGCAGTCCCACAAAG CTT
GTATTTAACAG CAGATG CTGAACCAAGAACAACT
TTA
CRPV
GGGGACAAGGAAAATGTGAAGAGCAGGGCCTACATA
AAACGCACACAGATGCAGGGAGAGGCAAATGCCAAC
ATT
BPV−6b
GAGG、TGGGGGAACCTGTGCCTGATACACTTATAAT
TAAGGGTAGTGGAAATCGCACGTTCTGAAAAAGAAG
CACCCAGTAAAGACTTCTACCTCAAAAATGGTAGA
GGTGAAGAAACTCTAAAA
標識DNAプローブ製造の公知技術を用いると、ハイブリダイゼーションを特徴
とする特異的DNAプローブを構築することができる。すなわち、この発明の一
態様は、PV型型具異的DNA配列あり、これは配列分析の結果として確認する
ことができる。
この発明の意図するところでは、「型持異的DNA配夕1月の語は、免疫学上特
異的な主キャプシド構造蛋白質をコードするPVゲノムにおける高度可変領域を
包含するものとする。従って、所望のヌクレオチド配列は側面に位置する天然ヌ
クレオチドも含むが、ただし、これらの側面に位置するヌクレオチドはDNA配
列のハイブリダイゼーション特異性を変えるような数では存在し得ないものとす
る。
一般に、DNA配列は少なくとも18個のヌクレオチドを含む。さらに、最低限
18個のヌクレオチドからなり、また免疫学上特異的な構造蛋白質をコードする
ヌクレオチドであればいかなるものもすべてこの発明の範囲内に含まれるものと
する。
ペプチド配列自体の生成に有用であることに加えて、PVの型特異的D N A
配列はまた、当業界でよく知られた技術を用いてDNAプローブを製造する場合
にも有用である。一般的なりNAプローブ製造技術は、マンアチスによる「モレ
キュラー・クローニングJ (M 。
1ecular Ctoning)(コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−11982年)に記載されている。記載されたー技術の場合、工シエリヒ
ア・コリ(E 、coli)D N Aポリメラーゼ■を用いて、二本鎖DNA
分子の一方の鎖に切り込みを入れたときに生じる3′−ヒドロキシ末端にヌクレ
オチド残基をつけ加えることができる。さらに、酵素は、その5′〜3′外核小
体活性により、ニックの5′側からヌクレオチドを除去し得る。5″側からヌク
レオチドを除去後、3′側へヌクレオチドをつけ加えるとDNAに沿ってニック
が形成にツク翻訳)される[ケリー等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J、Biol、Chem、)245巻、39(1970年)]。
先在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドと置き換えることにより、10
@cpR1/μgを超える量の特異活性を有する標識DNAを製造することがで
きる[リグビー等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーJ(J
、Mo1.B iol、) 113巻237頁(1977年)〕。
分子ハイブリダイゼーションの幾つかの技術が組織におけるウィルスDNA配列
の検出に用いられる。各々が何らかの利点および不都合さを有する。大量の組織
が利用できる場合、ハイブリダイゼーション反応速度論分析により、存在するウ
ィルスDNAの量を正確に定量し、またプローブと緊密な関連性はあるが同一で
はない配列を識別し、パーセント相同性を測定する機会が得られる。反応は、プ
ローブの再会合速度が最適となるハイブリダイゼーション条件(TIll−25
℃)下で行なわれる[ウエトマー等、[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジーJ(J 、Mo1.B iol、) 31巻、349〜370頁(19
68年)]。組織の配列がプローブの配列と同一であるとき、反応速度は2次的
である。しかしながら、プローブ配列が組織の配列と部分的相同性を有する場合
、反応は複雑な反応速度を示す[シャープ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー」(J 、Mo1.Biol、)86巻、709〜726頁(
1974年)]。
一般的に、DNAは、冷凍器上で切断し、5DS(ドデシル硫酸ナトリウム)の
ようなデタージエントおよびEDTAのようなキレート剤を用いて薄片を溶解さ
せ、所望により一液プロテイナーゼK(50μs/m(りで消化することにより
組織が単離され得る。蛋白質はフェノールおよびクロロホルム抽出により除去さ
れ、核酸はエタノールにより沈殿する。RNAは、加熱処理されたりボヌクレア
ーゼ(RNase)Aで処理することにより除去され、DNAはフェノールおよ
びクロロホルムにより再抽出される。反応速度研究のために、DNA溶液を音波
処理により一律の一重鎖片サイズ(約500ヌクレオチド)に切る。3H−チミ
ジントリホスフェートまたはアルファ3tp−デオキシヌクレオチドホスフェー
トを用いてニック翻訳によりプローブDNAを標識して高比活性とする(リグビ
ー等、前出)。
細胞DNAに対するプローブの濃度を所望の感度で測定する。l細胞当たり1乳
頭腫ウィルスゲノムを検出するためには細胞DNA 1Hg当たり1 、3 p
gのプローブが必要である(ゲルブ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジーJ(J、Mo1.B iol、)、57巻、129〜145頁(19
71年)コ。DNAを混合し、変性させ、適当な塩濃度および温度にし、様々な
時間放置してハイブリダイズさせる。水酸化リン灰石クロマトグラフィー[ブラ
イデン等、「サイエンスj(S cience)、161巻、529〜540頁
(1968年)]またはSlヌクレアーゼ消化[サトン、[ビオキミカ・工・ビ
オフィシ力・アクタJ(B iochim、B 1ophys、Acta)、2
40巻、522〜531頁(1971年)]によりハイブリダイズされたプロー
ブの量を定量することにより再会合速度を測定することができる。
ハイブリダイゼーションのさらに簡単な方法は、サザーンブロツティング技術で
ある[サザーン、[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーJ(J、M
o1.B iol、)、93巻503〜617頁(1975年)]。この技術は
、ハイブリダイゼーション反応のストリンジエンシーにおける可変性および分析
下の試料におけるウィルス配列状態の決定をもたらす。細胞DNA(5〜20μ
g)は、制限エンドヌクレアーゼにより消化されるかまたは未消化のままでアガ
ロースゲル電気泳動に付され得る。DNAをその場でアルカリにより変性させ、
中和し、ニトロセルロース膜に移す。未消化またはPoI配列を含むゲルにおけ
るDNAの移動を容易にするために、変性前に希HCeでゲルを処理することに
よりDNAを除プリン化する[ワール等、[プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズJ(Proc、Natl、Aca
d、Sci、)76巻、3683〜3687頁(1979年)]。洗浄後、膜を
80℃で2時間真空下で焼き、60°Cで4時間50μg/mQの音波処理およ
び変性したサーモン***DNAを含む4XSSC(SSC=0.15モルN a
CQ 5O105モルクエン酸ナトリウム)中10xデンハルツ(D enh
ardts)溶液(フィニル、うし血清アルブミン、ポリビニルピロリドン各々
0.2%)においてプレハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション(Tm−25℃)は、37℃で16〜24時間1−5XIO’カウント
/分!tp標識ニック翻訳DNA(1−2,X 108カウント/ m/ u
g(D N A )の比活性)、1モルNaCQs I Xデンハルツ、0.1
5モルTBS[トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン
酸コ、pH7,5,50μg/m(lの音波処理および変性したサーモン***D
NAおよび50%ホルムアミドを含む溶液中で行なわれる。0.1xSSCにお
いて52℃で膜を広範に洗浄し、風乾し、X線フィルムにあてる、非ストリンジ
ェントハイブリダイゼーション(Tm−43℃)の場合、全細胞DNAはHPV
配列の検出を妨げる基底値ハイブリダイゼーションをもたらす。これらの反応の
場合、前述と同様、ただし除蛋白質前に組織薄片を溶解させることにより、上清
フラクションを単離し、粘稠溶液を1モルNaCffに導入し、−夜4°Cに保
つことにより高分子量配列が沈殿する。高および低分子量フラクションを低温で
20分間12000Xgの遠心分離により分離する。上清を除蛋白質し、沈殿し
たD N Aをサザーン分析に用いる。反応は前記と同様に行なわれるが、ただ
しサーモン***DNAの代わりにヒトリンパ球DNAを用い、ハイブリダイゼー
ションは30%ホルムアミドを含む。膜を52℃で4xssc中広範に洗浄し、
風乾し、X線フィルムにさらす。乳頭腫ウィルスは非ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下で検出され得るDNA配列を維持しているため、非ストリ
ンジェントハイブリダイゼーションは型特異的PvではないP’Vを同定するの
に有用である。
乳頭腫ウィルスのハイブリダイゼーション分析にともなう主たる問題は、研究試
料に存在する配列とプローブの関連度である。このことはサザーンブ・ロツティ
ング技術の場合に重要である。その理由は、試料におけるプローブおよび配列が
異なるウィルス型を示している場合でもハイブリダイゼーションのストリンジェ
ント条件下で配列相同性の程度が適度であれば強いシグナルを得ることができる
からである。HPV−6およびHPV−11のストリンジェント条件下における
配列相同性のシェアは約25%であり[ギスマン等、[ジャーナル・オブ・パイ
ロロジー(J 、Virol、 )、44巻、393〜400頁(1982年)
]、また制限酵素分析が行なわれなければ、シグナルがHPV−6またはHPV
−11配列によるものであるがどうかを決定するのは困難である。これらの2種
のウィルスタイプおよびそれらのサブタイプを区別するためにはPstI消化が
有用であると判明した[ギスマン等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−、オブ・サイエンシーズJ(Proc、Natl、Acad、
S ci、) 80巻、560〜563頁(1983年)コ。このクロスハイ
ブリダイゼーションの例を後記実施例2および第5図に示す。
前述のように、標識プローブは、型持異的PV検出の一般的分析方法を提供する
。この方法は、適当な速さであり、簡単なプロトコルでよく、市販キットとして
標準化され、提供され得る試薬を用いるものであり、大量の試料を速くスクリー
ニングできるものである。
処理を行なう一方法の場合、ゲノムを含む臨床単離物を処理することにより一本
鎖ゲノム核酸を得、次いで一重鎖ポリヌクレオチドを支持体に固定する。付着し
た核酸、DNAまたはRNAを、型特異的キャプシド蛋白質をコードする遺伝子
のコード(解読)鎖に相補的な塩基配列を有する標準ポリヌクレオチドと接触さ
せる。
主たる試薬はRNAまたはDNAであり得る標識プローブである。
一般に、プローブは少なくとも約25個の塩基を、さらに通常は少なくとも約3
0個の塩基を有し、それ以上の場合もあり得る。この点に関する制限は、プロー
ブがコードされる蛋白質に関するPV型特異性を維持するのに要求される最低数
より多いヌクレオチドを含まないということである。
概して、プローブは、メツセンジャーRNAから、逆転写酵素によるメツセンジ
ャーRNAの逆転写またはゲノムの開裂により得られたcDNAから、好都合に
はエンドヌクレアーゼ消化を行ない、次いで公知技術にしたがって遺伝子もしく
は遺伝子フラグメントのクローニングにより得ることができる。例えばコーンバ
ーブ、「DNAレブリケーションJ(DNA Replication)、ダブ
リュ+eエッチ・フリーマン・アンド・カンパニー・サンフランシスコ、198
0年、670〜679頁参照。別法として、遺伝子は、メリフィールドによる「
ジャーナル・オブ・M・ケミカル・ソサエティー」(J。
M 、 Chem、 S oc、) 85巻2149頁(1962年)に記載さ
れた技術にしたがい合成され得る。DNAフラグメントの単離後、フラグメント
をプローブ製造に用いることができる。
特定のハイブリダイゼーシジン技術はこの発明において本質的なものではなく、
当業界で一般に用いられている技術はすべてこの発明の範囲内に含まれる。代表
的なプローブ技術は、米国特許4358535(ファルコウ等)に記載されてい
るが、これを引用して説明とする。
前記イムノアッセイの場合のように、この発明の11イブリダイゼーシヨンアツ
セイは、キット形態の体裁で商品化するのに特によく適しており、前記キットは
1個またはそれ以上の容器手段(バイアル、試験管等)を閉鎖制限状態で受け入
れるように区画された担体手段を含み、また、前記容器手段の各々はハイブリダ
イゼーションアッセイで使用される分離要素の1つを有するものである。
例えば、1個のバイアルが可溶性で検出可能標識された型特異的または種物異的
DNA配列(標識プローブ)を含み、1個またはそれ以上の異なるバイアルが相
異なる予め測定された量のPv抗原を含み得る。後者の容器は、未知の試料から
得られたデータを間に入れるための標準曲線をつくるのに用いられ得る。
この発明の一態様は、PV型型具異的ワクチン開発を含む。ウィルスに対するワ
クチンの様々な製造方法がある。ワクチンおよびワクチンの製造方法に関する基
本的な好ましい必要条件は、(1)生成したワクチンが宿主において抗体形成を
誘発するのに必要な抗原決定因子を含むこと、(2)ワクチンが高い免疫原能を
有すること、(3)生成したワクチンが受容側または受容側の接触に関して臨床
感染の危険を一切ともなわずに投与されるほど充分安全なものであり、したがっ
て(危険性カリ完全には除去されない場合予防接種にともなう危険性を最少域に
すること、(4)生成したワクチンが有毒な副作用、例えば死んだ細胞または抽
出された細胞に存在するエンドトキシンによる発熱を一切もたらさないこと、(
5)生成したワクチンが有効な径路による投与、例えば経口、鼻腔内、局所また
は非経口投与に適していること、(6)生成したワクチンが自然、感染状況によ
く似ていること、(7)生成したワクチンが長期貯蔵条件下で安定しており、し
かも前記長期貯蔵が室温でなされていること、並びに(8)生成したワクチンが
常用の不活性ワクチン担体と融和性であることである。それらの条件はこの発明
のワクチンにより達成され得る。
この発明の一具体例において、Llリーディングフレームの免疫原的型持異的ア
ミノ酸配列から製造されたワクチンは、ワクチンの抗原成分を含む。抗原を免疫
原担体すなわちうし血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンと
共有結合させるのが必要であるかまたは好ましい。この発明のワクチンは乳頭腫
ウィルスに感染されやすい哺乳動物すべてに投与され得る。ヒトおよびヒト以外
の哺乳動物に宿主として利益がもたらされ得る。
自然の感染径路により異なり、非経口投与され得るが、好ましくは経口または鼻
腔内投与される。投与量は、年齢、健康状態、体重、同時処置をしているとすれ
ばその種類および乳頭腫ウィルスの性質により変化し得る。ワクチンは、経口投
与の場合カプセル、液剤、けん濁液またはエリキシルのような投与形態で用いら
れ、非経口または鼻腔内投与の場合液剤またはけん濁液のような滅菌液体製剤で
用いられ得る。好ましくは食塩水または燐酸緩衝食塩水のような不活性の免疫原
的に許容される担体が用いられる。
この発明の方法は、L1キャプシド蛋白質の免疫原的活性ヘプチドをコードする
核酸配列の特異的部分が既知のPVに対するワクチンの製造を可能にするもので
ある。さらに、同概念によりPVのDNA内における任意の免疫原型特異的核酸
配列からのワクチン製造も可能となる。
総括的に発明の記載を行ない、次に実例として下記実施例を挙げるが、特記しな
い限りこれらに限定するわけではない。
実施例I
BPV−I Ll配列の274〜283部分由来のデカペプチド、lys −a
sn −asn −1ys −gly −asp −ala −thr −1e
u −1ys(N末端から)を合成した。クロマトグラフィー分析はデカペプチ
ドの純度を98%を越えるものとして示した。このデカペプチドをポリーDL−
アラニンーポリーL−リジンに連結し、このコンジュゲートをアジュバントペプ
チドN−アセチルムラミル−L−アラニン−D−イソグルタミンに連結した。コ
ンジュゲートをフロイント完全アジュバント中においてホモジネートした。ウサ
ギにコンジュゲートデカペプチドを筋肉的接種、すなわち2週間隔でこの製剤を
3回注射し、次いで非コンジュゲートデカペプチドを2週間隔でさらに3回注射
した。3度目のコンジュゲート注射の2週間後、非常に弱い抗体応答がBPV−
1線維孔頭腫のアセトン固定凍結部分の免疫蛍光により検出された。3度目のコ
ンジュゲートペプチド注射後、抗体応答がl:50希釈率で免疫蛍光により検出
され得た。これとは対照的に、インタクト(intact)なりPV−1に対し
てあげられた高度免疫ウサギ血清は、免疫蛍光により約10倍高い滴定濃度アッ
セイを有する。
このような高度免疫血清はBPV−1と反応したが、これはまた約1:125の
希釈率で線維乳頭腫を含むBPV−2とも反応した。
しかしながら、デカペプチドに対してあげられた抗体は、l:2の希釈率でBP
V−2線維孔頭腫と反応しなかった。これらの結果は、デカペプチドに対する抗
体がBPV−1型特異的であることを示す。
第6図は、デカペプチドに対する抗血清によるBPV−1形質転換活性の中和反
応速度を示す。デカペプチド(0)に対する抗血清、デタージエント崩壊BPV
−1(>に対する抗血清または正常なウサギ血清(0)の存在下にBPV−1を
インキュベートした。C127マウス細胞の単層を血清処理ウィルスで感染させ
、3週間後にフォーカス形成を調べた。デタージエント崩壊BPV−1に対する
抗血清のウィルス形質転換活性の50%中和は約1:10000であり、正常な
ウサギ血清はBPV−1形質転換活性を抑制しなかった。
発明について詳しく記載したが、当技術分野にある程変精通しておれば請求の範
囲である種の変化および修正がなされ得ることは明白であろう。
孔同注%
相同注%
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oXOz −j −j O’−Ch r−(N(’J m鳴 ff1ffi
ζζ ζζ 嶋国際調査報告
Claims (56)
- (1)所与の乳頭腫ウィルス(PV)型に対して特異的な、検出可能標識された ポレヌクレオチド配列。
- (2)配列が15〜75個のヌクレオチドを含む、請求の範囲第1項記載の検出 可能標識されたポレヌクレオチド配列。
- (3)最低限18個のヌクレオチドを含む、請求の範囲第2項記載の配列。
- (4)標識が放射能標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、酵素標識、抗体 標識および遊離基標識から選ばれたものである、請求の範囲第1項記載の検出可 能標識された配列。
- (5)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポレヌクレオチド配列。
- (6)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポリヌクレオチド配列。
- (7)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポリヌクレオチド配列。
- (8)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポリヌクレオチド配列。
- (9)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポリヌクレオチド配列。
- (10)【配列があります】 遺伝コードの結果としてのその同義変形体またはそのゆらぎ誘導体を含む、請求 の範囲第1項記載の検出可能標識されたポリヌクレオチド。
- (11)型特異的PV遺伝子生成物をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチ ドセグメント。
- (12)遺伝子生成物がPVキャブシドの主たる構造蛋白質の免疫原性型特異的 アミノ酸配列である、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌクレオチドセグメン ト。
- (13)配列に15〜75個のヌクレオチドを有する請求の範囲第12項記載の 単離ポリヌクレオチドセグメント。
- (14)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (15)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (16)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (17)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (18)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (19)配列が、【配列があります】 またはその型特異性フラグメントを含む、請求の範囲第11項記載の単離ポリヌ クレオチドセグメント。
- (20)特定の乳頭腫ウィルスに特異的なアミノ酸配列を有し、天然産生L1オ ープンリーディングフレームポリペプチドの比較的小さなフラグメントまたはそ の誘導体を表わすポリペプチド。
- (21)6〜14個のアミノ酸を含む請求の範囲第18項記載のポリペプチド。
- (22)ポリペプチドの各端の側面に位置する天然配列として3個以下の天然ア ミノ酸を含む、請求の範囲第21項記載のポリペプチド。
- (23)アミノ酸配列【配列があります】を含む請求の範囲第21項記載のポリ ペプチド。
- (24)検出可能標識形態をした請求の範囲第21項記載のポリペプチド。
- (25)ポリペプチドが放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス 標識、抗体標識および遊離基標識からなる群から選ばれた標識により標識された 、請求の範囲第24項記載のポリペプチド。
- (26)標識形態をした請求の範囲第23項記載のポリペプチド。
- (27)放射能標識された請求の範囲第26項記載のポリペプチド。
- (28)請求の範囲第20、21、22または23項のいずれか1項記載のポリ ペプチドに対して生起したPV型特異的抗体。
- (29)標識形態をした請求の範囲第28項記載の抗体。
- (30)抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、抗 体標識または遊離基標識された、請求の範囲第29項記載の抗体。
- (31)乳頭腫ウィルス由来のDNAを含有する試料を検出可能標識された型特 異的ポリヌクレオチドプローブと接触させ、DNAおよびプローブ間でハイブリ ダイゼーションを進行させ、そして標識を検出することからなる型特異的乳頭腫 ウィルスの検出方法。
- (32)ポリヌクレオチドプローブがPV型特異的標識DNAプローブである、 請求の範囲第31項記載の方法。
- (33)ポリヌクレオチドプローブがPV型特異的標識プローブである、請求の 範囲第31項記載の方法。
- (34)プローブが15〜75個のヌクレオチドを含む、請求の範囲第31項記 載の方法。
- (35)プローブが少なくとも18個のヌクレオチドを含む、請求の範囲第31 項記載の方法。
- (36)プローブが放射能標識、酵素標識、抗体標識、化学ルミネッセンス標識 、蛍光標識および遊離基標識からなる群から選ばれたもので標識された、請求の 範囲第31項記載の方法。
- (37)型特異的PVを含有する試料を前記ウィルスの抗体に免疫原的に特異的 な配列を有する標識されたアミノ酸フラグメントおよび前記ウィルスに対する抗 体と接触させ、抗体およびフラグメント間の結合程度を測定することからなる型 特異的PVの確認方法。
- (38)型特異的PVを含有する試料を前記ウィルスに免疫学的に特異的な標識 された抗体と接触させ、抗体とウィルスの結合程度を測定することからなる型特 異的PVの確認方法。
- (39)請求の範囲第20、21、22または23項記載のポリペプチドおよび ワクチン担体を共に用いてうさぎを高度免疫化することからなる型特異的PVウ ィルス抗体の製造方法。
- (40)請求の範囲第20、21、22または23項記載のポリペプチドを含む 乳頭腫ウィルス型特異的ワクチン。
- (41)さらに生理学的に許容される担体またはアジュバントを含有する請求の 範囲第40項記載のワクチン。
- (42)動物に請求の範囲第40項記載のワクチンの有効量を投与することから なる、動物における乳頭腫ウィルスに対する免疫化方法
- (43)アミノ酸の属特異的配列を有するL1キャプシド蛋白質のポリペプチド フラグメントまたはその誘導体。
- (44)6〜14個のアミノ酸を含む請求の範囲第43項記載のポリペプチド。
- (45)ポリペプチドの各端の側面に位置する天然配列に3個以下の天然アミノ 酸を含む請求の範囲第43項記載のポリペプチド。
- (46)アミノ酸配列:RGQPLGを有する請求の範囲第43項記載のポリペ プチド。
- (47)検出可能標識形態をした請求の範囲第43項記載のポリペプチド。
- (48)ポリペプチドを放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス 標識、抗体標識および遊離基標識からなる群から選ばれた標識により標識した、 請求の範囲第47項記載のポリペプチド。
- (49)請求の範囲第47項に記載のポリペプチドに対して生起した属特異的P V抗体。
- (50)標識形態をした請求の範囲第49項記載の抗体。
- (51)抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、抗 体標識または遊離基標識された、請求の範囲第50項記載の抗体。
- (52)属特異的乳頭腫ウィルス由来のDNAを含有する疑のある試料を検出可 能標識された属特異的ポリヌクレオチドプローブと接触させ、前記のDNAおよ びプローブ間のハイブリダイゼーションを進行させ、そして前記標識を検出する ことからなる属特異的乳頭腫ウィルスの検出方法。
- (53)ポリヌクレオチドプローブがPV属特異的標識DNAプローブである、 請求の範囲第52項記載の方法。
- (54)ポリヌクレオチドプローブがPV属特異的標識RNAプローブである、 請求の範囲第52項記載の方法。
- (55)プローブが15〜75個のヌクレオチドを含む、請求の範囲第52項記 載の方法。
- (56)プローブが、放射能標識、酵素標識、抗体標識、化学ルミネッセンス標 識、蛍光標識および遊離基標識からなる群から選ばれたものにより標識された、 請求の範囲第57項記載の方法。
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