JPH04506747A - リサウィルス感染症の検出法および／または同定法、モコラリサウィルスのペプチドおよび／またはペプチドの断片をコードする遺伝子のクローン化と発現、モコラウィルスおよび／またはリサウィルス群に対するワクチン、および遺伝子工学による前記ワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リサウィルス感染症の検出法および／または同定法、モコラリサウィルスのべブ チドおよび／またはペプチドの断片をコードする遺伝子のクローン化と発現、モ コラウィルスおよび／またはリサウィルス群に対するワクチン、および遺伝子工 学による前記ワクチンの製造方法 この発明は、リサウィルス（　Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）感染症の検出・同定法、 モコラリサウィルス（Ｍｏｋｏｌａ　Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）のべブチドおよび ／またはペプチド断片をコードする遺伝子のクローン化と発現、モコラウィルス および／またはリサウィルス群に対するワクチンおよび遺伝子工学による上記ワ クチンの製造法に関する。

過去２０年間かかって、狂犬病ウィルスに類縁のラブドウィルス（Ｒｈａｂｄｏ ｖｉｒｕｓ）は、その分類が交差血清中和法と補体結合法とに基づいて確認され たが、世界中で単離されている。かくしてリサウィルス属は、狂犬病ウィルス（ 血清型１）、ラゴスこうもりウィルス（血清型２、アフリカ）、モコラウィルス （血清型３、アフリカ）およびデューベンハーグウィルス（血清型４、南アフリ カ）によってそれぞれ表される４種の異なる血清型に分離された。北ヨーロッパ とスペインのこうもりから単離されたリサウィルスのウィルス株は現在分類中で ある。これらのウィルスは、現在こうもりからのみ単離されているが、人類など の動物種の保護の問題、特にこれらのウィルスに対するワクチンによる保護の問 題を提起している。モコラウィルスは、アフリカにおいてヒトを含む多数の種に おける致命的な狂犬病脳炎の単離された症例、特に犬を含むジンバブエでの肉食 性家畜動物にたとえ狂犬病に対する予防注射がなされても起こる流行病の原因と されているから、特に重要である。

狂犬病ウィルスのヌクレオチド配列とこれに由来するワクチンについては、いく つもの数の文献に記載されている。

’ｙイア、９＝７ンステイｆユ（ＷｉＳＴＡＲｒＮｓＴｒＴＵＴＥ）　（７）７ −７　ンス特許は、狂犬病ウィルスのＥＲＡ株の糖タンパク質をコードし、その ヌクレオチド配列、その開始コドンＡＴＧおよびその終止コドンＴＣＡで定義さ れ、前記糖タンパク質のｍＲＮＡのコピーでありかつ一本鎖ＲＮＡである合成の 相補ＤＮＡを提起している。

２つの切断部位間の上記ｃＤＮＡのポリペプチド断片は５０以上のアミノ酸であ ることはない。

この糖タンパク質の演えきアミノ酸配列は、アミノ末端リシン残基に先行し、成 熟タンパク質に切断されるＩ９の非極性アミノ酸で構成されたシグナルペプチド を育する５２４アミノ酸を含有している。

その分子量は約６７、０００である。

狂犬病ウィルスのｃＤＮＡと糖タンパク質のｍＲＮＡは、免疫化を実施するのに 充分な量でポリペプチドを産生させるために、細菌を形質転換するのに用いるこ とができる。

ＴＲＡＮＳＧＥＮＥのヨーロッパ特許願下９４．８８７号は、狂犬病の抗原タン パク質特に糖タンパク質を発現するファージもしくはプラスミドのようなベクタ ーに関し、これらのベクターは前記タンパク質をコードする少なくとも一つの有 効ＤＮＡ配列と、細菌中で上記の配列の発現のためのプロモーターとを含有し、 そのコードする有効ＤＮＡ配列は、２つの定義された切断部位間に含まれる全有 効ＤＮＡ配列もしくは部分配列であることができる。

このベクターは、それがプラスミドもしくはファージであるかによってきまるが 、細菌を形質転換もしくはトランスフェクトするのに用いられ、その細菌を舎養 することによって所望の狂犬病抗原タンパク質が得られ、そのタンパク質がその アミノ酸配列で定義され、抗狂犬病ワクチンの活性成分として用いられる。

アンスチチュ　パスツールとＣＮＲ５のヨーロッパ特許願下２３７、６８６号（ １９８６年３月１８日）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４巻、 ６号、２６７１−２６８３頁、１９８６年とＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ、８３巻、３９１４−３９１８頁、１９８６年に記載されている主 データを再現しているが、狂犬病ウィルスの分節されていない（ｕｎｓｅｇｍｅ ｎｔｅｄ）未変性一本ｆｆ１ＲＮＡの部分配列（５５００位まで）を提示し、こ れを特許請求しているが、この配列は上記ＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡのよう である。

しかしこの出願の特許請求の範囲は主として、核タンパク質をコードする部分ポ リヌクレオチド配列７１〜１４２１．Ｍｌタンパク質をコードする部分配列１５ １４−２４０４、Ｍ２タンパク質をコードする部分配列２４９６−３１０２、お よびＬタンパク質のＮ末端タンパク質をコードする部分配列５４１７−５５００ に関する。

またこれらのヌクレオチド配列とそれらの断片などはベクターに挿入するとベク ターを改変することが、この出願では示唆されており、これらのベクターを適切 な宿主細胞内に導入すると、これらベクターは宿主細胞に、前記ＤＮＡ配列を転 写・翻訳させて対応するタンパク質を産生させ、次いでそのタンパク質は前記宿 主細胞の細胞抽出物から単離することができる。

またこの出願は、ＳＶ４０ウィルスのゲノム由来のプロモーターの制御下におか れている上記の挿入断片の１つを含有する組換えＤＮＡを扱っている。このＤＮ Ａは、真核細胞（例えばベロ細胞）を形質転換し免疫特性を有するタンパク質を 産生ずるのに使用できるベクターであり、そのプロモータはより一般的に、選択 された細胞のポリメラーゼによって認識されるウィルスもしくは真核細胞プロモ ーターである可能性があり、さらに上記ＤＮ’Ａは挿入断片の下流に適切なポリ アデニル化部位を含有している。この特許願はさらに、その発明の主な利点が、 ゲノム自体ではなくて、核タンパク質を欠いた形態で単離できる狂犬病ウィルス のゲノムＲＮＡから誘導されるＤＮ’Ａ配列を提供することであると述べている 。この特許願のｃＤＮＡは、例えば雑種形成法によって、生体液中に狂犬病ウィ ルスが存在するのを検出するプローブとして用いることができる。

上記の特許願および上記文献に、そのペプチド構造によって定義されているよう なポリペプチドであるＮ５Ｍ１、Ｍ２は、それ自体、生体液中にウィルスポリペ プチドが存在するのを生体外で診断するのに使用でき、Ｍ１タンパク質は、特に ワクチンの製造に用いられる賦形剤と組合わせて免疫原性組成物として非常に特 有な利点を示している。

Ｎ、　ＴＯＲＤＯらは、Ｖｉｒｏｌ、、１６５巻、５６５〜５７６頁、１９８８ 年に狂犬病ウィルスゲノムの完全配列の決定法を記載している。彼等は、分節さ れていない未変性ＲＮＡを含有するウィルスのしタンパク質（ポリメラー）中に 、高度に保護されたドメインを見出した。

０、　ＰＯＣＨらは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ　、　７０４１２．１０１９−１０２ ９頁、１９８８年に、狂犬病ウィルスの無毒性株（Ａ’１０１　）のゲノムのｃ ＤＮＡ断片を記載している。３′末端から３３８６のヌクレオチドの配列が、遺 伝子間の領域のみならず、リーダー配列ＲＮＡ５Ｎ核タンパク質、Ｍ１リンタン パク質およびＭ２マトリックスタンパク質をコードする遺伝子をスパンしている 。ＡＶＯ１配列を狂犬病ウィルスの他の菌株の配列と比べた結果、ヌクレオチド とアミノ酸の両者のレベルに高い保存性が明らかになっている。

狂犬病ウィルスのゲノムを、非分節の負の一本鎖ＲＮＡ〔ラブドウィルスおよび バラミクソウィルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ））を含有する他のウィルス のゲノムと比較すると、転写の開始および終止シグナルがタンパク質をコードす る各遺伝子の末端に局在し、転写工程に関与しているリンタンパク質とマトリッ クスタンパク質の領域は同じ全体構造を保持している。

この文献に示されている結果は、狂犬病ウィルスの転写の特有の特徴が、別個に 変動する遺伝子開領域にあるということを示唆している。

モコラウィルスはいわゆる“類縁”狂犬病ウィルスであり、狂犬病ワクチンは、 モコラウイルスによる感染症に対してはごく弱い防護しかしない。

予防接種の失敗が実験室で耳環された。３種の市販ワクチン（ＰＶ株（パスツー ル）、ＰＶ株（Ｍｅｒｉｅｕｘ）　；　Ｆｌｕｒｙ株（Ｂｅｈｒｉｎｇ）を予防 接種したマウスはモコラウイルスの感染に対して非抵抗性であった。その結果、 これらの血清は、生体外でモコラウイルスを中和することができる抗体を少量し か含有しておらず、それらのリンパ球は、モコラウイルスが感染した標的細胞に 対して低い細胞毒性を示す。

Ｔ、　Ｊ、ＷｉｋｔｏｒらのＤｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄ、　、 　５７巻、１９９〜２１１頁、１９８４年には、モノクローナル抗体を用いて、 狂犬病ウィルスとモコラウィルスの抗原性の分析が記載され、狂犬病ウィルスに 類縁の他のウィルスと異なり、モコラウイルスは、狂犬病に対して予防接種され た個体の血清ではほとんど中和されないと明確に述べられている。

Ｅ、ＣｅＬｉ５らの文献Ｊ、Ｖｉｒｏ１．．　３巻、３１２８−３１３４頁、１ ９８８年には、ヒト末梢血液の単核細胞と、ＰＭ抗狂犬病ワクチンで免疫化した 個体のＴクローンを、狂犬病ウィルスおよび狂犬病類縁ウィルスの抗原決定基を 認識する性質について、抗原で誘発される増殖試験（Ａ［ＰＡ）で試験した。Ｔ 細胞の全部ではないか、いくらかは、狂犬病ウィルスの各種の実験質菌株および デユーベンハーブ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）とモコラのような類縁ウィルスと交差 反応を示す。これらのＴ細胞はウィルスの糖タンパク質もしくはリポ核タンパク 質のエピトープと反応する。

これらの刊行物は、モコラウィルスのような狂犬病ウィルスに類縁のウィルスの ゲノムのｃＤＮＡクローンの製造法、またはその予防剤、治療剤もしくは診断剤 としての用途については何も記載していない。

さらにこれら文献のいくつかは、狂犬病ウィルスと、狂犬病ウィルス類縁ウィル スとの間には交差反応性が存在するが、その抗狂犬病ワクチンは、モコラウィル スのような類縁ウィルスに対して防護をしないことを示している。

それ故に、感染の危険がある集団（獣医、動物飼育者、実験室職員）および家畜 の感染を防止し、感染の危険に暴露された後の個体を治療するために、ヒトおよ び／または動物に用いる上記ウィルスに対するワクチンを提供することが必要な ことは明らかである。

弱毒化ワクチンは、細胞培養で得られるウィルス力価が１０７〜１０’のオーダ ーで低いために、現在は工業規模で製造されていないようである。

したがって、遺伝子工学による抗モコラワクチンの製造は大きな利益を提供する ものである。

狂犬病の診断に関する限り、疑わしい試料中に狂犬病ウィルスが存在することを 明らかにするのに現在次の２種の方法が用いられている。

＊免疫蛍光法（ＩＦ）もしくは免疫酵素試験法（ＲＲＥＩＤ　’）によって、狂 犬病抗原について研究するために抗体を使用する方法＊マウスにウィルスを接種 するかまたは細胞培養（ＣＣ）でウィルスを検出する方法が、特に述べられてい る。

各種の狂犬病株を同定することができる一群のモノクローナル抗体が現在入手可 能である。これらのモノクローナル抗体のいくつかはリサウィルス属に属するい くつかの血清型と、特にこれと同じ血清型に属する単離物に対して特異的である 。それ故にこれらのモノクローナル抗体は、各種のリサウイルス株の正確な特性 決定をすることができ、疫学的研究に利用できる。

しかしこの方法で可能な菌株の同定は、一般に、これら菌株を予め細胞培養する 必要があるから長時間かかる。さらに新しい単離物各々は、融合を実施して新し い特異的なモノクローナル抗体をつくる必要がある。

Ａ、　Ｅｒｍ１ｎｅらのＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｐｒｏｂｅｓ　、　２巻、７５−８ ２頁、１９８８年には雑種形成法による狂犬病感染症の迅速診断法が記載されて ’％ｓる。

この雑種形成法は、脳内の狂犬病の転写産物を検出するのに用いられる。Ｐ■狂 犬病株（血清型ｌ）のゲノム由来の２１ｐで標識をつけたｃＤＮＡプローブが、 非常に少量の特異的ウィルスＲＮＡを固定するのに用いられる。精製ウィルスＲ ＮＡがフェノール抽出後に得られる。そのＲＮＡをナイロン膜に固定し、各狂犬 病遺伝子および各ｍＲＮＡの２００〜４００ヌクレオチドに相補的なＭ１３挿入 断片のプールと雑種形成させる。雑種形成させた標識プローブをオートラジオグ ラフィーで検出する。雑種形成は、狂犬病ウィルスパルバイン（Ｖｕｌｐｉｎｅ ）株（血清型ｌ）を接種した動物からの脳の試料について観察された。８０ｎｇ の全ＲＮＡの量について陽性反応が得られた。ウィルス転写産物の検出は、動物 が死んでから１週間後に集めた脳の試料についても可能であった。蛍光抗狂犬病 抗体を用いるかまたはマウスの神経芽細胞種細胞上で狂犬病ウィルスを単離する ことによって、狂犬病抗原を検出するような他の方法と比較して完全な相関関係 が観察されている。

しかし、これらの方法は、一方では、唾液もしくは器官の試料を用いてリサウィ ルスの感染を迅速に検出することができず、特に生物学的試料中のモコラウィル スを直接に検出・同定することはできない。

フランスのディナールで、１９８８年９月１８〜２３日に開催された、負の一本 鎖ウィルスに関する第７回国際会議において、発明者らは、遺伝子工学によって 、ワクチンを製造できるようにするのを目的としたモコラウィルスのクローン化 についての彼等の研究を記載した情報文を提供した。この情報文の要約には、感 染させたＢＨＫ２１細胞の上澄液から回収したモコラウイルスを精製し、それか らゲノムＲＮＡを抽出したと述べられている。

この発明の目的は、免疫応答に主として関連するウィルス抗原を発現させること によって得られる、モコラウイルスに対する特異的ワクチンと、すべてのリサウ イルス血清型に対する多価ワクチンとを提供することであり、遺伝子工学による ワクチン製造には、ウィルス産生の問題点を解決し、リサウィルス感染症に対し て特異的でかつ非常に敏感な診断剤を提供するという利点がある。

この発明の他の目的は、唾液もしくは器官の試料からリサウィルス感染症を迅速 に検出する方法を提供することである。

この発明の課題は、生物学的試料中に存在する少量のリサウィルスを迅速に検出 および／または同定する方法であり、前記試料が、任意に存在するリサウィルス のウィルスＲＮＡおよび／または転写産物を抽出するために、以下のように処理 することを特徴とする方法である。すなわち、 （１）ゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを得るためにリサウィルス類に 対する、少なくとも１つの適切なプライマーと接触させ、 （２）次いで上記ｃＤＮＡ配列の少なくとも１つの断片を増幅させるために、上 記ｃＤＮＡ配列を、リサウィルスに対する適切なプライマーの１対と接触させ、 このプライマーの一方は上記工程（］）のブブライマと異なり、他方のプライマ ーは工程（１）のプライマーと同一かもしくは異なり、 （３）次いで、増幅されたｃＤＮＡ配列を適切な手段で検出する、ことからなる 方法である。

ＰＣＲ法は、特に、５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｓｅ　、２３９．４８７．１９８ ８年と、ｃｅｔｕｓのヨーロッパ特許願第２００３６２号と同第２０１１８４号 に記載されている。しかし本願発明の方法は、驚くべきことには、唾液もしくは 器官の試料からリサウィルス感染症を迅速に検出１、（１２時間以下）、次いで そのリサウイルスを同定できる。

前記検出法の有利な実施態様によれば、プライマーは、菌株に対して特異的なプ ライマーからなる群、すなちリサウィルス血清型の場合、リサウィルス血清型に 特異的なプライマーと、すべてのリサウィルスに共通の遺伝子の保存配列で構成 されているプライマーであって以後多価プライマーと呼称されるプライマーとか らなる群から選択される。

この発明の多価プライマー自体、この発明によて、リサウイルスの診断もしくは 検出用のプライマー（リサウイルス感染症、イエス／ノー堅の応答）と、鑑別診 断もしくは型別（タイピング）用のプライマー〔リサウィルス感染症、型（タイ プ）の解明〕とに区別をすることができる。

この実施態様の有利な特徴によれば、プライマーは、狂犬病とモコラのゲノムの １〜１８位に局在している３′狂犬病プライマーである。

この実施態様の他の有利な特徴によれば、プライマーは狂犬病ゲノムの２９０１ 〜２９１８位に局在しているＭ２狂犬病プライマーである。

この実施態様の他の有利な特徴によれば、プライマーは、狂犬病ゲノムの４６６ ５〜４６８７位置およびモコラゲノムの４６７５＝４６９７位に局在する２３の ヌクレオチドからなる狂犬病プライマーであり、以後Ｇプライマーと呼称する。

この実施態様の別の有利な特徴によれば、狂犬病ゲノムの５５２０〜５５４３位 と、モコラゲノムの５５４５〜５５６８位に局在している２４のヌクレオチドで 構成されている狂犬病プライマーであり、以後Ｌプライマーと呼称する。

この実施態様のさらに他の有利な特徴によれば、プライマーは狂犬病とモコラの ゲノムの５８７〜６０５位に局在する１８のヌクレオチドからなるモコラプライ マーもしくは狂犬病プライマーであり、以後Ｎａプライマーと呼称する。

この実施態様のさらに別の有利な特徴によれば、プライマーは狂犬病とモコラの ゲノムの１０１３〜１０２９位に局在する１６のヌクレオチドで構成されたモコ ラプライマーまたは狂犬病プライマーであり、以後Ｎｂプライマーと呼称する。

前記方法の有利な実施態様によれば、増幅されたヌクレオチド配列の検出は、各 種のリサウイルスに適切な、１つのプローブもしくはプローブ群による雑種形成 で実施される。

前記の方法の他の有利な実施！１１！！様によれば、増幅されたヌクレオ７チド 配列の検出は、少なくとも１群の適切な制限酵素で前記配列を切断し、次に、得 られた断片を電気泳動法で分離することによって実施される。

この実施態様の有利な特徴によれば、その酵素群は、ＢａｍＨＴ　。

Ｈｉｎｄ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＰｓｔ　［で構成されている。

この実施態様の他の有利な特徴によれば、その酵素群は、Ｒｓａ　ｒ、Ｔａｑ　 Ｅ、ＢｓｔＸ　ＩおよびＦｎｕ４Ｈ［で構成されている。

現在、リサウィルス類のなかで最も分岐している血清型１と３との間の配列相同 性の分析法によって、特異的プライマーもしくは多価のプライマーに対するそれ ぞれの選択を決定する保存領域もしくは可変領域を定義することができる。

選択された多価プライマーがリサウィルスの保存領域を増幅させることができる 場合、試料中の少量のリサウィルスを迅速検出するこの発明の方法は、現在の慣 行とは異なり、初期感染、またはヒトの汚染の原因になる疑いかある家畜から採 取した唾液試料について、リサウィルス感染症の診断をすることができ、実際に 、例えば、Ｎ遺伝子生瓦いに余り離れずに（４００ｂｐ）位置している、この発 明で定義されるような１対のプライマーすなわちＮａプライマーとＮｂプライマ ーは、リサウイルスがごく少量しか存在せずしかもたとえ試料がひどく分解して いても、リサウィルスを検出（ＹＥＳ／Ｎｏ応答）することができる。実際に、 通常の方法の感度は、１２時間以下で診断を実施することができる迅速なこの発 明の方法に比べて低い。

選択されたプライマーが、リサウイルスの可変領域（例えば偽遺伝子Ｐｓｉもし くはＭｌ遺伝子のある領域）の合成と増幅を実施できる場合は、この発明の方法 は、検出すべき感染症に関与しているリサウィルスの同定と型別を行うことがで きる。実際に、上記定義のような１対のプライマーすなわち狂犬病Ｇプライマー と狂犬病Ｌプライマーは、一群の適切な酵素と結合されて、狂犬病ウィルスの各 種苗株、モコロウイルスおよびこうもりから単離されたリサウイルスの菌株を型 別することができる。上記の２つのプライマーは、一方がＧ遺伝子の遠位位置に あり、他方かＬ遺伝子の近位位置にあるリサウイルスの保存領域に対応し、これ ら領域を、全狂犬病法とモコラウイルス中で約８６０のヌクレオチドによって分 離する領域（偽遺伝子Ｐｓｉ）を増幅できるように選択される。その増幅された バンドは、適切な菌株に対して多少とも特異的なプローブとの雑種形成、または 菌株に対して多少とも特異的な制限酵素の存在下での雑種形成骨こまって検出さ れ乙。

また直接配列決定法は、増幅されたバンドを含存するアガロース片に直接適用す ることができる。

さらにこの発明は、モコラウィルスの特異的な配列に関し、この配列によって、 リサウィルス属中の保存領域と可変領域を検出することかでき、また、狂犬病ゲ ノムとモコラゲノムを比較することによって、各ゲノム領域の可変性を評価する ことかでき、上記リサウィルスの検出および／または同定する方法を開発するこ とができる。モコラウィルスのゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡヌクレオチド配列は 、約１２０００のヌクレオチドからなるという特徴を育する。

ゲノムＲＮＡからの前記ｃＤＮＡ配列は、さらに、３′　と５′の末端が相補的 で、５°末端の１２のヌクレオチドが狂犬病ウィルスのＰＶ株のそれと同一であ り、３′末端から５°末端にわたって連続して、“リーダー”配列ＲＮＡをコー ドする遺伝子と次にタンパク質をコードする遺伝子Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２、ＧおよびＬ をもっているという特徴がある。

モコラウィルスのゲノムＲＮＡからの前記ｃＤＮＡ配列の有利な実施態様によれ ば、そのｃＤＮＡ配列は下記のヌクレオチド配列と演えきアミノ酸配列（１）を もっている。

（以下余白　最下行に続く） この発明は、モコラウィルスのペプチド及び／又はフラグメントをコードする前 記シーケンスのフラグメントならびに、モコラゲノムの変動ゾーンすなわちリサ ウィルス科に共通の遺伝子の非保存帯（ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｚｏｎｅ） に対応する前記シーケンスの非コードフラグメントに関する。

前記コードフラグメントの中には、シーケンスは、ことに次のものかある。

・ＮＭ蛋白をコードし、前記ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド７１−１４２０ に対応するフラグメント、・Ｍ１蛋白をコードし、前記ｃＤ’ＮＡシーケンスの ヌクレオチド１５２４−２４３２に対応するフラグメント、・Ｍ２蛋白をコード し、前記ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド２５１６−３１２１に対応するフラ グメント、・Ｇ蛋白をコードし、前記ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド３３２ ８−４８９３に対応するフラグメント及び・Ｌ蛋白のＮＨ，末端をコードし、ｃ ＤＮＡシーケンスのヌクレオチド５４４３−６８３１に対応するシーケンス。

非コードフラグメントには、シーケンスはことに前記シーケンスのヌクレチド４ ８９７−５４４２に対応するフラグメントで、かつそのフラグメントは狂犬病ｐ ｓｉ凝遺伝子に対応するものが含まれる。

さらに、この発明は、約１２０００のヌクレオチドからなり、非分節・非ポリア デニル化陰性の単一ストランドＲＮＡであり、３゛から５′へ、連続的に“リー ダー”シーケンスＲＮＡをコードする遺伝子と次いでＮ核蛋白、Ｍ１ホスホ蛋白 、Ｍ２マトリクス蛋白、Ｇグリコ蛋白、Ｌポリメラーゼ蛋白をコードする遺伝子 を育し、そのゲノムが常にＮ核蛋白と結合していることを特徴とするモコラウィ ルスゲノムＲＮＡシーケンスに関する。

その上、この発明は、３゛末端から蛋白Ｎ、　Ｍｌ、　Ｍ２．　Ｇ及びＬをコー ドする５連続モノジルトロニツク　フラグメント、すなわち、 ・ポリＡと結合した式Ｉのシーケンスのヌクレオチド５９−１４８４に対応する フラグメント、 ・ポリ八と結合し、式Ｉのシーケンスのヌクレオチド１４９５−２４８９に対応 するフラグメント、 ・ポリＡと結合し、式■のシーケンスのヌクレオチド２５０１−３２８３に対応 するフラグメント、 ・ポリ八と結合し、式■のシーケンスのヌクレオチド３３０７−５３８０に対応 しＧ蛋白をコードするフラグメント、・Ｌ蛋白をコードする大きなフラグメント 、ならびにビシストロニックフラグメントＭｌ−Ｍ２、 からなることを特徴とするモコラウィルスの転写産物に関する。

さらに、この発明は３′末端から５゛末端に至る全ゲノム、すなわち ・４１５０のヌクレオチド（以後ｐＭＤ１０と称す）を計測し、“リーダー”シ ーケンスＲＮＡ、Ｎヌクレオ蛋白、Ｍ１蛋白、Ｍ２蛋白とＧ蛋白をコードするシ ーケンスのフラグメントに対応するフラグメント、 ・２８５０のヌクレオチド（以後ｐＭＡｌｏと称す）を計測し、Ｇ蛋白をコード するシーケンスのフラグメントと、Ｌ蛋白をコードするフラグメントに対応する フラグメント、・３゛末端に６８３０のヌクレオチドからなり、リーダーシーケ ンスＲＮＡ、蛋白Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２とＧならびにＬ遺伝子の最初の１４２０ヌクレ オチドをコードするシーケンス（以後ｐＭ７と称す）を含有する、ＢｇＩＩ［部 位内に挿入片ｐＭＤ１０とｐＭＡｌｏを連結させて得られたフラグメント、 ・約３３００のヌクレオチド（ｐＭＢ５と称す）を有し、Ｌ蛋白をコードするシ ーケンスのフラグメントに対応するフラグメント、・約２８００のヌクレオチド （９Ｍ１２と称す）で、Ｌ蛋白をコードするシーケンスのフラグメントに対応す るフラグメント、・約７００のヌクレオチド（ｐＭＲ１５ａと称す）を存し、Ｌ 蛋白をコードするシーケンスのフラグメントならびにゲノムの未転写５′末端に 対応するフラグメント、これらのフラグメントは、別々のとき、各々モコラゲノ ムの転写又は復製で誘導されたＲＮＡ又はｃＤＮＡフラグメントを特異的にバイ ブリド化する能力を育する、 に対応することを特徴とするモコラウィルスのゲノムＲＮＡからのｃＤＮＨクロ ーンに関する。

この発明によれば、クローンｐＭ７は、アンスティチュバストゥール（［ｎ５ｔ ｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）所有のコレクシオン　ナシオナル　ドウ　キュルチ ュール　ドウ　ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ ｌ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　ＩＪｉｃｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｓ）　ｌこ 、１９８９年３月２２日に１−８４７号として寄託された。

この発明によれば、クローンｐＭＢ５は同上の寄託機関に、１９８９年３月２２ 日にｌ−８４８号として寄託された。

この発明によれば、クローンｐＭ１２は、同上の寄託機関に、１９８９年３月２ ２日にｌ−８４９号として寄託された。

この発明によれば、クローンｐＭＲ１５ａは同上の寄託機関に、１９８９年３月 ２２日にｌ−８５０号として寄託された。

さらに、この発明は、上に定義したようなヌクレオヂドシーケンス又はそのフラ グメントを、放射性同位元素、適当な酵素又はフルオロクロムのようなマニ′カ ーでラベルしたものからなることを特徴とするヌクレオチドプローブに関する。

このプローブの具体例によれば、シーケンス４６７５−５５６８又はそのフラグ メント、特にフラグメント４８９７−５４４２又はその相補ストランドが挙げら れる。

このようなクローンは、モコラウィルスに特異である。

その上、この発明は、上で定義した少なくとも１つのフラグメント、その一部又 はいくつかのフラグメントの組合せでコードされていることを特徴とするペプチ ド又はそのフラグメントに関する。

この発明の有利な具体例によれば、そのペプチドは、Ｎヌクレオ蛋白遺伝子でコ ードされ、次の式■のアミノ酸シーケンスを有する。

（：工） 他の有利な具体例によれば、ペプチドは、Ｍ１蛋白遺伝子でコードされ、次の式 ■のアミノ酸シーケンスを育する。

（：：工） 他の有利な具体例によれば、ペプチドはＭ２蛋白遺伝子でコードされ、次の式■ のアミノ酸組成を育する。

され、式■のアミノ酸シーケンスで特徴付けられる。

（Ｖ］ 池の有利な具体例によれば、ペプチドはＬ蛋白遺伝子でコードされ、次のアミノ 酸シーケンスを有する。

式（Ｖ［）シーケンス： ｍ） 式（Ｖ［Ｄシーケンス： 閃：］ この発明によるペプチド及び／又はそのフラグメントの有利な具体例では、それ らは合成で得られる。

さらに、この発明は、上で定義したような少なくとも１つのヌクレオチドシーケ ンス又はその１部を含むことを特徴とするベクターに関する。

その上、この発明は、天然撞のバクロウィルスと、少なくとも（１）バクトウィ ルスの表現用調節シーケンスと（２）モコラウィルスのゲノム又は少なくともゲ ノムのフラグメントを挿入するのに適するポリリンカーからなる適当なシャトル ベクター間の対応組み換えで得られることを特徴とするモコラウィスルのペプチ ド、ペプチドのフラグメント、ペチドのフラグメントの組合せ用の表現ベクター に関する。

この発明による表現ベクターの有利な具体例によれば、シャトルベクターは、（ １）ポリヘトリン遺伝子の５゛　コントロール領域からなるバクトウィルスのゲ ノムのフラグメント、（２）モコラウィルスの遺伝子又は少なくとも遺伝子のフ ラグメントを挿入するのに適するポリリンカーと（３）特にポリヘトシンポリア デニル化部位を育する３°　コントロールシーケンスからなり、コンストラクト の増殖をしうるものである。

この発明の具体例の有利な特長としては、モコラウィルスのＧ糖蛋白遺伝子又は 遺伝子フラグメントが、ポリリンカーのレベルで、ポリヘトリン遺伝子のプロモ ータ・−のコントロール下、その糖蛋白でチャージされた表現ベクターか得られ るように挿入される。

モコラウィルスの少なくとも１つのペプチド、そのフラグメント又はペプチドの フラグメントの組合せの表現方法には、所望のポリペプチドを表現する組換えバ クロウィルスを得るため、天然タイプのバクロウィルスの存在下、適当なレビド ブテラ細胞特にカテルピラ−５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ中で この発明による表現ベクターを使用する。

組換えバクロウィルスの選択は、得られたプラーグの生態によるであろう。ポリ ヘトリンの存在は、エビルミネセンスを照射すると光マイクロスコープで、天然 タイプのウィルスプラーグに対し屈折した外観を与える。反対に、組換えウィル スプラーグの鈍い外観は結晶が存在しないためで、これらを容易に区別さすこと かできる。この表現系による利点は多くある。すなわち、 バクロウィルスは容易に、グリコジル化、リン酸化、パルミチル化等ができる。

これによって、Ｇグリコ蛋白の場合のように、翻訳後修正を育する多くの蛋白の 表現を考案することか可能となる。

一表現レベルは、培養物ｌリゾトル当り１〜ｌＯ■のオーダーで極めて高い。

一しビドフテラ細胞を懸濁液中で培養することが可能である。

−ポリヘトリンは、ウィルス複製とヌクレオカプシドの形成か行われた後で表現 される後期遺伝子である事実から、ウィルス増殖用の毒性蛋白を表現しうること になる。

さらに、この発明は、この発明による少なくとも１つのペプチド及び／又はその フラグメントと、任意に少なくとも１つの医薬的に受容な賦形剤と組合せてなる ことを特徴とするヒト及び／又は家畜用のモコラウィルスに対するワクチンに関 する。

このワクチンの有利な具体例によれば、ワクチンはＧ糖蛋白及び／又はそのフラ グメント、及び／又はＮｉ蛋白又はそのフラグメントからなる。

これら２つのウィルスペプチドを組合すと、免疫応答の各種のレベルに介在する 。実際、Ｇ糖蛋白は、優先的に抗体の中和形成を誘因し、一方Ｎ核蛋白は特に細 胞仲介免疫に介在する。

この発明は、また、この発明による少なくとも１つのペプチド及び／又はそのフ ラグメントと、任意に少なくとも１つの他のりサウィスル血清型の少なくとも１ つのペプチド及び／又はそのフラグメントと組合せてなることを特徴とするりサ ウィスル多価ワクチンに関する。

血清型４リサウイルス狂犬病ウィルス）、血清￥２リサウィルス（ラゴスこうも りウィルス（Ｌａｇｏｓ　Ｂａｔ　ｖｉｒｕｓ）　、血清型４リサウイルス（ド ユベンハージウィルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ　ｖｉｒｕｓ））及び血清型４に関 連したヨーロッパこうもりから分離のリサウィルスが特に挙げられる。

この発明によれば、ペプチド及び／又はそのフラグメントは、適当な賦形剤及び ／又は受容なアジュバント特にヒト及び家畜用ワクチンの通常のワクチンと併用 するのが有利である。

この発明は、哺乳動物、特にげっし動物よりくわしくはマウスを、この発明のペ プチド及び／又はそのフラグメントで免疫化してえられるモコラウィスルのペプ チド及び／又はそのフラグメントに特異なモノクロナール抗体に関する。

この発明は、生体サンプルをこの発明によるペプチド又はそのフラグメントと接 触させ、それによって生体中の抗体が存在すると抗モコラ抗体は結合し、結果を 適当な手段特にＥＩＡ。

ＲＩＡ又は蛍光で読み取り、生体サンプル中に存在しつる抗モコラ抗体を検出す ることからなる抗モコラウィルスベブチド及び／又はペプチドフラグメントの抗 体を検出する免疫法に関する。

この方法の有利な具体例では、そのペプチド又はそのフラグメントは適当な固形 賦形剤に固定化される。

その免疫法は、直接タイプ、又は間接タイプでもよく、サンドイッチ又はビサイ ド法を使用してもよい。

ナン：’６ｙチ法亡齋１．・た際の他の有利な具体例では、適宜ラベル化した、 アッセイされる抗体に対する第２抗体によって検視で行われる。

この方法は、血清抗体を滴定することを可能にし、かつワクチン化固体の血清変 換を評価するか、免疫学的目的の血清学的探索を行うことを可能にする。

この発明はまた、概略処理された生体サンプルをこの発明による少なくとも１つ ヌクレオチドプローブと接触させ、サンプル中にモコラウィルスのゲノムＲＮＡ 及び／又は転写産物か存在するとプローブと結合し、結果を適当な手段で読んで 、生体中のモコラウィルスを検出することからなるモコラウィルスの迅速かつ特 異的な検出法に関する。

また、この発明は、検出を行うのに適切な有用量の緩衝液と試薬、適切な量の少 なくとも２つの適当なプライマー、適切な量の少なくとも１つのプローブと適切 量の少なくとも１つの制限酵素とからなることを特徴とする少なくとも１つのリ サウィルスの検出及び／又は同定のための本発明方法を実施する簡易キットに関 する。

この発明は、また、少なくとも、この発明による少なくとも１つのペプチド及び ／又はそのフラグメントの適量、検出を行うのに適当な緩衝液の有用量とからな ることを特徴とする抗モコラ抗体の測定法を実施する簡易キットに関する。

このキットの有利な具体例ではペプチドは、適当な固形賦形剤に固定化されたＮ 核蛋白又はそのフラグメントである。

このキットは、酵素、蛍光物質又は放射同位元素をラベルした、アッセイすべき 抗体に対する第２抗体の適量を加えてもよい。

この発明は、さらに、少なくとも、この発明による少なくとも１つのブローベ及 び／又は蛋白ブローベのフラグメントの適量、検出用の適当な緩衝液の有用量か らなることを特徴とするこの発明によりモコラウィルスの検出法を実施するため の簡易キットに関する。

上記の特長に加えて、他の特長は、実施例を用いての以下の記述によって明らか になろう。しかし、実施例はこの発明主題を例示することを意図したもので、そ れによって限定させるものではない。

実施例１　モコラウィルスのゲ７ノムＲＮＡと相補的な、ＤＮＡのクローニング と配列決定 ａ）ウィルスの培養 研究対象のモコラウィルス株を、ジンバブエ原産のネコより採取した。

ＣＥＲ細胞培養物に得られた溶菌斑からそのウィルス粒子を精製する。

このように選択したモコラウィルスをＢＨＫ−２１細胞上で培養し、ＷＩＫＴＯ Ｒらの方法（Ｊ、　Ｖｉｖｏｌ、、１９７７年、２１巻、６２６−６３５頁）の 変法に従って精製する。

ｂ）ゲノムＲＮＡの精製 モコラウィルスのゲノムＲＮＡを分離すべく、上記のｆｆ１Ｍウィルス粒子を、 １．５％ＳＤＳ、Ｉ００ｍＭｈリスーＨＣｌ、ｐＨ７，５，１００ｍＭＮ　ａ　 Ｃ１および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中のブロティナーゼＫ　（ｌｅｒｃｋ）とともに 、３０分間３７°Ｃでインキュベートする。続いてフェノールクロロホルム（ｖ ｏｌ／ｖｏｌ）で２回抽出し、エタノールで沈殿させた。

Ｃ）モコラウィルスゲノムのし遺伝子と５′末端を表出するｃＤＮＡクローンの 特性決定と分離 １、　ＣｃＤＮＡの合成 第１ｃＤＮＡ鎖を、１０倍高いモル分率（ｍｏｌａｒ　ｒａｔｉｏ）を用いて、 １８ｇのゲノムＲＮＡの存在下、また、１８量体のプライマー（例えば、狂犬病 ゲノムの１−１８位に局在する３′プライマーまたは２９０１−２９１８位に局 在するＭ２プライマー）の存在下、また５０単位の逆転写酵素と、５０ｍＭのト リス塩酸（ｐＨ８，３）、８ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化カリウ ム、０．８ｍＭのｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ、　０．８ｍＭのｄ　Ｇ　Ｔ　ｐ、　０．３ｍ ＭのｄＣＴＰｌｏ、　３ｍ　ＭのｄＴＴＰ、０．２μＭの”ＰｄＣＴＰ、０．２ μＭの３２ＰｄＴＴＰおよび３０Ｕ／μｉ’のＲＮａｓｉｎを含む緩衝液との存 在下で、２時間、４２℃で合成する。

ガブシー（ＧＵＢＬＥＲ）とホフマンＣ）ＩＯＦＦＶＡＮ）の方法によって二重 量ｃＤＮＡを調製し、バイオゲル、Ａ−５０ｍカラムで、大きさによって分離す る。

最大のｃＤＮＡに相当する断片（約１５〜２０ｎｇのｃＤＮＡ）を、ｄＣ／ｄＧ 延長法で、ＰＢＲ３２２プラスミドのＰｓｔ（部位のレベルに挿入する。

イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）　ＤＨ５のコンピテント菌株を形質変換し、特異的 なモコラ挿入断片を含有する形質変換体は、ニトロセルロースのフィルター上で ハイブリッドを形成させることより検出される。

２、　Ｃ得られたクローンの特性゛決定図１に示すように、Ｍ２プライマーで始 まる第１　ｃＤＮＡライブラリーから、狂犬病プローブすなわちＰＶ株（血清型 ｌ）によって選択された３つの特異的なモコラウイルスクローンすなわち、９Ｍ Ｂ５．９Ｍ１２、およびモコラゲノムの５゛部分にスパンするｐＭＲ１５ａの特 性決定を行う。

３゛プライマーで得られるｃＤＮＡライブラリーによって第１のクローニング由 来のモコラブローブで９ＭＡ１０クローンを選択することができる。これからｐ ＭＤ１０クローンが選択される。

挿入断片ｐＭＲ１５ａとｐＭＤｌｏは配列決定され、それぞれゲノムＲＮＡの５ °末端と３°末端をスパンしている。このことは、上記の５つのクローンがモコ ラウイルスのゲノム全体をスパンするのに充分であることを証明している。

図２ではモコラウィルスゲノムの３゛末端と５′末端とを狂犬病ゲノムのＰＶ株 ３“末端と５°末端と比較している。この２つの末端の間の相補的なヌクレオチ ドは、長い垂直線で表しである。

Ｎ遺伝子に対するｍＲＮＡの開始部とＬ遺伝子に対するｍＲＮＡ末端とＮタンパ ク質に対する開始シグナルを特定する共通配列が示してあ’′！Ｊａ モコラウィルスの３′　と５′のゲノム末端のヌクレオチドは、ＰＶ株のそれと 同一であり、短い垂直線で示しである。その残基はゲノム末端から番号をつけで ある。

図３は、モコラウィルスあるい１よ狂犬病ウィルスを感染させた細胞のサザンプ ロットと、Ｎ及びＬ遺伝子上に局在する狂犬病プローブとの非相同及び相同的な ハイブリダイゼーションをそれぞれ示している。ＢＨＫ−２１細胞から得られた 全細胞質ＲＮＡを、モコラウィルスに感染させた後（レーン１）あるいは狂犬病 ウィルスに感染させた後（レーン２）６．１２．２４あるいは４８時間後に回収 し、同様に負の対照（感染させない細胞）に相当するレーン３からも回収し、１ ．２％アガロースホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかける。分離したＲＮＡ はナイロン膜上に堆積させて、狂犬病ゲノムのｃＤＮＡの３７７から１０３９ま での配列（プローブＮ　Ａ）または狂犬病ゲノムのｃＤＮＡの７０３４から７１ ３４の配列（プローブＬ　Ｂ）から成る２２Ｐでラベルしたプローブと雑種形成 させる。

実施例２　生体内で合成されたモコラｍＲＮＡの特性決定ＢＨＫ−２１細胞がモ コラウィルスに感染している間の生体内での転写産物の特性を決定するために、 図１にしたがってｃＤＮＡプローブを選択する。図４に示すように、６つの異な る転写産物がノザンプロット分析で観察される。また図４は、モコラウィルスゲ ノムのＮ、Ｎ＋Ｍ、Ｍｌ＋Ｍ２、ＧおよびＬｃＤＮＡと雑種形成したモコラウィ ルスのｍＲＮＡを示している。

感染されたＢＨＫ−２１細胞から得られたモコラウィルスの全細胞質ＲＮＡは５ ０％ホルムアミド存在下で変性させ、その１５μｇのサンプルをホルムアルデヒ ド含有の１％寒天ゲル上で電気泳動にかける。分離したＲＮＡは、２２ｐでラベ ルしたｃＤＮＡのプローブ（Ｎ、Ｍ１＋Ｍ２、Ｎ＋Ｍ１、ＧおよびＬ）でナイロ ン膜上に堆積させる。矢印は臭化エチジウムでの染色で表出された１８Ｓ及び２ ８ＳのリボゾームＲＮＡの位置を示している。各種ｍＲＮＡはオートラジオグラ フィーで固定される。

これらのモコラ転写物の特性決定と大きさによってモコラウィルスの転写地図か 狂犬病ウィルスの転写地図と同一であることかわかる。実際に、５つのモノシイ ストロニックｍＲＮＡは、ゲノムの３′末端から連続的に始まっているように見 える。それらの長さは、寒天ゲル上で１７５０．１２５０．１０００．２４００ ヌクレオチドと推定され、テイル（尾部）はポリアデニル化されている。

それらはそれぞれＮ、Ｍｌ、Ｍ２およびＧタンパク質をコードしている。第５の ｍ　ＲＮ　Ａは、長さが４８００ヌクレオチドと推定されＬタンパク質をコード するが、ゲノムの長さによる期待値より小さい。第６の転写産物は目に見え、ｂ ｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　Ｍ　１−Ｍ　２　ｃ　Ｄ　ＮＡ　（ＬｉｎｅＭ　１　＋ Ｍ　２　）に相当する。その長さは２２００ヌクレオチドと推定される。

実施例３　生物学的製剤もしくは液体中のモコラウィルスＧ箇タンパク質を、こ の発明にしたかって西洋ワサビオキシターゼに接合した抗Ｇ糖タンパク質抗体の 存在下で測定する方法。

懸濁液を１５００Ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離にかけて透明にする。遠心分離 後各サンプルの透明な上澄み液を、本発明に従って抗Ｇ糖タンパク抗体でコーテ ィングしたマイクロタイタープレートのウェルに２回分注する（ウェル当たり２ ００μり。次にそのマイクロプレートは３７°Ｃで１時間インキュベートする。

ＰＢＳ−トウウィーン緩衝液で繰り返し洗浄したのち、各ウェルに西洋ワサビペ ルオキシダーゼに接合した抗Ｇ糖タンパク抗体２００μｌを加える。次にそのマ イクロプレートを３７°Ｃで１時間インキュベートし、再び洗浄する。

ペルオキシダーゼの基質を加えた場合の着色の度合によってウィルス抗原が定量 される。その基質は、０−）二二レンチアミンと過酸化水素の混合物である（ウ ェル当り２００μり。着色反応を促進させるため、マイクロプレートを室温で２ ０分間放置する。Ｈ２ＳＯ，Ｎを加えることによって（ウェル当り５０μり反応 を停止させる。分光光度計を用いて着色の度合を測定する。

実施例４　この発明にしたがってフルオレセインイソチオシアネートを接合させ た抗Ｇ糖タンパク質抗体の存在下で、モコラウィルスのＧ糖タンパク質を測定す る方法。

モコラウィルスを感染させた細胞培養物を冷アセトン中で３０分間固定する。染 色は、フルオレセインイソチオシアネートに接合したモコラウィルスの抗Ｇ糖タ ンパク質抗体で、３０分間３７℃にてスライドガラスをカバーすることによって 実施される。エバンスブルー（１１５０００）をカウンター染料として用いる。

スライドガラスをｐＨ７，６のＰＢＳ中に５分間浸すことによって洗浄する。グ リセリンをのせた培地を使用し、スライドガラスをエブフルオレソセントマイク ロスコピー法で試験する。

実施例５　本発明によってペプチドおよび／あるいはペプチド断片をワクチン接 種した個体の血液中におけるモコラウィルスの抗Ｇ糖タンパク抗体の検出法と滴 定法この試験はウィルス糖タンパクが固定される固体相と、酵素接合体、ペルオ キシダーゼと結合させたスタフィロコッカス・アウレウスＣ３ｔａｐｈｙｌｏｃ ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロティンＡの使用に基づいている。

血清の正と負の対照血清を２倍系列希釈する。未確認の血清あるいは血漿は１０ ０倍に希釈する。これらの各種血清を１００μｌずつウェルに注入する。

そのウェルを粘着フィルムでカバーしてから、プレートをサーモスタットにより 自動的に温度調節のできるマイクロプレートオーブン内で３７℃で６０分間イン キュベートする。

粘着フィルムをはずして各プレートの内容物を吸い出す。ウェルを続けて３回洗 浄してからプレートを乾燥させる。

上記接合物の溶液を１００μｌずつ全プレートのすべてのウェルに分注し、粘着 フィルムでカバーして３７℃で６０分間インキュベートする。

ウェルの内容物を吸い出し、ウェルを４回洗浄し、プレートを乾燥させる。

展開液（Ｍ前液とペルオキシダーゼ基質を混合したもの）をｉ００μβずつ各ウ ェルに分注し、室温で３０分間暗所にて反応させる。

停止溶液を５０μβずつ加え各ウェルの光学濃度を４９２ｎｍで読みとる。

未知の血清の光学濃度を、μｌ当たりの国際単位とし２て表わされる力価の正の 検量線と比較することによって、各ウェルの力価をｍ／当たりの当量単位で測定 することができる。

実施例６　本発明のヌクレオチドプローブこのプローブはベクターＭ１３内でゲ ノム方向（一方向）もしくは抗ゲノム方向（＋方向）にクローン化された一本鎖 ブローブに関するものである。

クローン化したＭ２Ｓの鋳型３．５μ！（約０．５ピコモル）をユニバーサルプ ライマー１μ！！（０，５ピコモル）と０．５μｌの緩衝液に接触させる。その 緩衝液は、ｌＯｍＭｈリスＨＣＩ、ｐＦ（７，５，１０ｍＭ塩化マグネシウム、 ５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＤＴＴを含有している。容器に入れ密閉した混 合液をつす一ターバス中にっけ、沸点まで加熱してその後、実験台上で徐々にさ ます。半時間後、水が４０″Ｃになってハイブリダイゼーションが完了する。

ハイブリダイズした鋳型５μｌを、 ＊２ｘ　（４μｌ！の”ｐ−ａ−ｄＮＴＰ）　４０００Ｃｉ／ｍｍｏｆ、１ｍＣ １／ｍｆ　； ＊４種のｄＮＴＰ各々１２５ピコモル／μβづつの混合物Ｉμｉ！： ＊イー・コリポリメラーゼ（クレノー断片）の１μｌ（約ＩＵ）で作る。

この反応は、３７℃で２０分間行い、その後６５°Ｃで３分間加熱することによ って停止される。

実験のこの時点で、鋳型Ｍ１３はユニバーサルブライマーからポリメラーゼによ ってコピーされ、最初に培地に導入されたモノヌクレオチドの量によって決まる 長さにわたって二本鎖になる。さらにこの長さは、クローンごとに統計的に変動 する。プローブの大きさを均一にするために、プライマーに充分近いところに位 置するひとつの制限部位で切断され、その結果、このレベルにおいてベクターは ２本鎖である。

この末端に対して、合成反応混合液（１５μ！りは、選択された制限酵素に適し た塩濃度に調整しくＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年）、そして切断は、最終体 積２０μｌで適当な温度にて１時間行う。

次に変性ローディング緩衝液を同じ体積だけ加える。その混合物を、加熱により 変性させたのち６％変性アクリルアミド−尿素ゲル（０，５１１１［１１厚）上 にデポジットさせる。１２００ボルトで１時間泳動を続ける。オートラジオグラ フィーによって放射性プローブの位置が特定され、次に切取る。４００塩基を越 えない大きさをもつプローブの場合、放射性の８０％を抽出するのには、適した 緩衝液（０，５ＭＮＨ＝　Ｃ０ＯＨ，１０ｍＭ　ＭｇＣＩＬｌｍＭ　ＥＤＴＡ） の中で１時間３０分間撹拌すれば充分である。

４００塩基を越えるプローブの場合、電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ ）＜ＭＡＮｒＡＴＩＳら１９８２年）を実施するとより安全である。溶出液は続 いて同容積の飽和フェノールで抽出し、次いで常法通りエタノールを加えてプロ ーブを沈殿させる。７０％エタノールで２回洗浄したのち、乾燥し、沈殿物を２ ０μｌの水に溶解させる。

４０００から１００００のｃｐｍ（ｃｅｒｅｎｋｏｆ）／μｌの標識プローブが 常法によって得られる。

このプローブは次に、プロット上での直接のハイブリダイゼーションに、あるい はＳ１ヌクレアーゼマツピングに用いることができる。／これに続く方法はいく らか変形されているが常法通りである。以下にその詳細を述べる。

実施例７　本発明によるプローブによるモコラウィルスＲＮＡの検出（ＲＮ、　 Ａプロット） 下記成分： ・ＮａＨ２ＰＯ＋とＮ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４の混合液　０．５Ｍ４：ＤＴＡ　１ ｍＭ ・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１％を含有するハイブリダイゼーション培地 は、プレハイブリダイゼーション（最長２時ｒｔｓ＞とハイブリダイゼーション （一般には一夜）の両方に適切であり、これらのハイブリダイゼーションはいず れも６５°Ｃで実施する。フィルターの洗浄は同じ温度で行うか、次の緩衝液を 用いて、１０分間づつ４回続けて行う。

・Ｎ　ａ　＋　Ｈ２Ｐ　Ｏ４、Ｎａ１Ｈ＋ＰＯ＜ａ合液　４０ｍ　Ｍ（ｐＨ７， ４） ・ＳＤ３　１％ ４：ＤＴＡＳ　ｐＨ７，５１ｍＭ 所望の転写物と厳密に相補的なプローブのハイブリダイゼーションを行うために は、この方法が非常に優れた結果をもたらす。特にバックグランドが非常に小さ い。

実施例８　少量のリサウィルスを迅速に同定（型別）する方法リサウィルス（パ スツールの通常の狂犬病棟、ｐｖ、ｃｖｓ。

ＡｖＯＬ　ＰＭ、ＥＲＡ、“ガボン　ドッグ′野生型狂犬病ウィルス株、“ブラ ジルコラモリ″　“ヨーロピアン　）オツクス２、モコラなど）を感染合せたＢ ＨＫ２１繊維芽細胞もしくはＮ２Ａマウスニユーａン細胞由来の全ＲＮＡの約１ μｇを約１００μｇの“Ｇ”プライマーとハイブリダイズさせる。この“Ｇ″プ ライマー（＋）方向のオリゴヌクレオチド２３個のヌクレオチド長さに相当し、 ＰＶ狂犬病ゲノムの４６６５から４６８７位の間に伸びており、またそのゲノム と相補的な（＋）方向のＤＮＡは、実施例１に記載したように特異的にプライム され合成される。反応培地を、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ処理 後、下記成分を含む液５０μ！で洗浄する。

Ｌ“プライマー　１００１ｇ トリス−ＨＣＩ、ｐＨ８，８６０ｍＭ 硫酸アンモニウム　１７ｍＭ Ｍｇ　Ｃ１＊　６．７ｍＭ β−メルカプトエタノール　ｔｏｍＭ ＥＤＴＡ　５μＭ ＢＳＡ　Ｉ７０μｇ／ｍｆ ＤＭＳ０　１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） ｄＮＴＰｓ　２５ｍＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　２単位 プライマー“Ｌ”は（−）方向のオリゴヌクレオチド２４個のヌクレオチド長さ に相当しＰＶ狂犬病ゲノムの５５２ｏから５５４３の位置に伸びている。

プライマー〇を、上記ヌクレオチド配列（１）の４６７５’−４６９７の領域に ハイブリダイズさせる。また、プライマーＧはモコラウィルスの配列（１）の４ ６７５−４６９７領域に約８０％の相同性を示す。

プライマーしは、モコラウィルスの配列（１）のヌクレオチド配列の５５４５− ５５６８位に特異的にハイブリダイズされる。

反応混合物は、１．５ｍＡ’容量のエッペンドルフ管に移し、蒸発を防ぐために 上からミネラルオイル１００μｌを加えて層を作る。

そして、“Ｐ、Ｃ，Ｒ，装置“内で次のような段階に従ってインキュベートする 。

＋９５°Ｃ５分間　変性 ＋５０℃　２分間　プライマーのアニーリング＋７２℃　２分Ｍ　Ｔａｑポリメ ラーゼを作用させｃＤＮＡ鎖を伸張させる。

この段階を、１回実施したのち、続けて４０回繰り返すがただし変性時間は２分 間に限定する。

最後に４１回目を繰り返すが、反応を完了するためにｃＤＮＡ合成時間を１０分 間に延長する。

反応生成物が適当な寒天ゲル上を移動させた後、増幅されたｃＤＮＡバンドを視 覚化することができる。転移後、すでに分析した株あるいは別のリサウィルス株 ゲノムのクローニング由来の適当なプローブによって特性の決定をすることがで きる。

これらのプライマーは、図７に示すように固定化したか、あるいは野生型の狂犬 病棟の利用できるものすべてとモコラウィルスについて連続的にテストした。こ れらのプライマーは、特に、いずれのリサウィルスのｐＳｉ偽遺伝子も増幅する ことかできる。約８６０ヌクレオチドの増幅された領域は下記のような特徴を有 する。

＊リサウィルス株に多少とも特異性をもつ放射性プローブとのハイブリダイゼー ション、あるいは、数棟に多少とも特異性をもつ制限酵素での加水分解あるいは 免疫学に依存せずに１２時間以内にサンプルに存在するリサウィルス株を型別し 同定するために問題の領域から推論される制限地図と直接的配列決定法。

図７は電気泳動のゲルを表しており、下記の１６レーンよりなる。

１、大きさを示すマーカー ２〜９二各種狂犬病株：すなわち狂犬病ウィルスの、ＰＭ株、狂犬病ウィルスの Ａ、ＶＯ２株、狂犬病ウィルスのＣＶＳ株、狂犬病ウィルスのＥＲＡ株、狂犬病 ウィルスの２７株、狂犬病ウィルスのパスツール株、野生型狂犬病ウィルス（羊 ）、野生型狂犬病ウィルス（羊） ｌＯ：モコラウィルス １１〜１５：各覆工と負の対照液 Ｉ６・大きさを示すマーカー 増幅されたｃＤＮＡバンドは、さらに以下のものを迅速に区別しうる選択された 制限酵素を用いて加水分解される。

・各種固定化狂犬病棟 ・フランスに現存する野生型狂犬病棟 ・モコラウィルス 次の８つの制限酵素、ＢａｍＨｒ、ＢｓｔＸＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｈｉｎｄ　Ｍ、 Ｈｉｎｄ　ＴＫ、ＰｓＴ　Ｉ、Ｒｓａ　Ｌ　Ｔａｑ　［によって、次のようにし て各種の株の型別ができる。

まず初めに、表■に示すように、一連の４つの制限酵素を用いて、前述したＧお よびＬプライマーによって区別される種々の増幅した断片のソースを識別する。

表１から明らかなようにＲｓａ　ｒは、ＥＲＡ−ＳＡＤからＰＶを定性的に分離 し、Ｔａｑ　ＩはＳＡＤからＥＲＡを定量的に分離する。

他の２つの酵素は次のように、より強いグループ特異性を示す。

・ＢｓｔｘｌはＰＶ、ＥＲＡおよびＳＡＤのみを切断する・Ｆｎｕ４Ｈは野生型 狂犬病棟とモコラウイルスのみを切断する。

図８はＥＲＡおよび０７３株由来の増幅されたバンドがそれぞれ、特異的にＢｓ ｔＸ［およびＢａｍＨ［によって切断されることを示している。

実施例９　少量のリサウィルスの迅速検出方法（Ｙｅｓ／Ｎ。

応答） 本発明において定義されたプライマーＮａ及びＮｂは、例えば、リサウィルスの 保存域であるモコラウイルスの式（１）のヌクレオチド配列の５８７〜１０２９ ＠域を増幅することができる。

表Ｉ 次に下記のような酵素によって識別が改善される。

表■ また本発明によるサンプル中の少量のりサウイルスを迅速（；検出するこの方法 は、現在行われている方法と違って、感染初期の段階で、あるいは、人間への感 染の恐れのある、死亡まであと数日という家畜の唾液のサンプルでリサウイルス 感染症を診断することができるという利点を有する。実１１ｉ：、Ｎａプライマ ーおよびＮｂプライマーは本発明で定義するよう（こ、Ｎ遺伝子内に位置し、互 いにあまり離れておらず（４００ｄｐ）　、’Ｊサウィルスが極めて少量しか存 在していないときでさえ、およびたとえ試料がかなり分解していても検出するこ とができる（Ｙｅｓ／Ｎｏ応答）。

事実上、通常の方法の感度は本発明による方法にくらべて低く、この発明の方法 は迅速で１２時間以下で診断することができる。

（以下余白　次頁に続く） 実施例１０　モコラウィルスＧ箇タンパク質の発現モコラゲノムのクローニング 化によって誘導される挿入断片ｐＭＤ１０及びｐ　ＭＡ　１０はそれぞれＧ糖タ ンパク質遺伝子の１／２をスパンしている。これら挿入断片が共通に有している Ｂｇｌ　Ｉ［制限部位によって、６８３０のゲノムの３′　ヌクレオチドをスパ ンしている単一挿入断片ｐＭ７に結合することができる。これから、Ｇ糖タンパ ク質遺伝子のｃＤＮＡは、制限酵素ＦｎｕＤ　Ｉｆ及びＳｓｐ　Ｉを組み合わせ て二重消化によって単離することができ、バクロウィルスのポリヘトリン遺伝子 の５゛プロモータ領域の内部と、特にポリアデニル化シグナルに対応するその３ ′領域とに挿入される。この構造物は増殖を可能とするためにｐＵＣベクター内 部で調製される。次に、それは、野生型のバキュロウィルスで、懸濁液中で培養 されるキャタピラ−・スボドブテラ・フルギペルダＳ　ｆ　９　（ｓｐｏｄｏｐ ｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞に共トランスフェクトされる。Ｇ糖タン パク質遺伝子は二重組み換えによって、野生型ウィルスポリヘトリンのその場所 に挿入される。クローニングの後、組み換えバクロウィルスのプラークはエビル ミネセンス中でぼんやりした外観で見いだされるが、野生型ウィルス・プラーク の屈折性外観からは容易に区別することができる。

いくつかの選択組換えクローンをキャタピラ−細胞培養菌を感染させるために用 いた。感染してから３日後、総タンパク質細胞抽出物が調製された。モコラ糖タ ンパク質のそれと同様のサイズの付加タンパク質バンドが、組み換えクローンか ら誘導された抽出物にのみ観察された。この付加タンパク質のさらなる試験のた めに、他の培養物を、メチオニンを除き、さらに標識したメチオニンを補充した 培地中で感染させた。その後、Ｇ糖タンパク質がより強烈に現出し、たしかに、 ラベルした際に培養物↑に量り寓度に発現したポリベブチジを示している（図５ ａ）。

図５ｂは負の対照を示す。

組換えバクロウィルスで感染させた細胞の表面でのモコラウィルス糖タンパク質 の発現の例証は、モコラウイルス糖タンパク質を発現する組み換えバクロウィル スを感染させた後スボドブテラ・フルギペルダ細胞上で実証される。その細胞を 一２０″Ｃで３０分間アセトン中で固定した。その後、それらをモコラウィルス 糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ａ　ｃ　ｍ）とインキュベートした 。

洗浄後、発生はフルオレセインイソチオシアネー）　（ＩＴＣＦ）にカップリン グしたマウスの抗免疫グロブリン抗体とインキュベートすることにより行った。

洗浄後、紫外線励起下顕微鏡を用いて観察したＣ図５ａ及び５ｂ）。

上記糖タンパク質はまた、モコラウィルス糖タンパク質に対して特異的な蛍光モ ノクローナル抗体によって、組み換えウィルス−感染細胞の表面に明らかに見い だされた（図６）にの図６において、レーン！、２及び３はモコラウィルスＧ塘 タンパク質を発現する組み換えバクロウィルスに感染させたのちのスボドプテラ ・フルギペルダに対応する。また、矢印は６ｗタンパク質のゲルの位置を示して おり、レーンＴは負の対照に対応する。

実施例１１　モコラウィルス糖タンパク質（Ｇ、ＭＯＫ）の免疫力の証明 バクロウィルスに感受性のスボドプテラ・フルギベルダ（ＳＦ９）、ＩＩ胞は、 Ｇ、ＭＯＫを発現するバクロウィルス、あるいはポリヘトリン遺伝子（ＮＰＥＶ 　ｃｌｅｌ）を発現しない野生型バクロウィルスで感染させた。感染してから３ 日後、これらの細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した。その後、これらの細胞の種々の 希釈を、修正バーベル試験法によってマウスでこの細胞の懸濁液の防置値を試験 するために行った。１０匹のマウス一群に一週間間隔で２回腹腔内にワクチンを 接種し、１回目のワクチン接種してから２週間後、種々のウィルス希釈物を脳内 接種して感染させた。そして、これらのマウスを脳内感染してから４週Ｗ！Ｉ後 に観察した。この期間が終了した後、比死亡率を計算した。

図９は非ワクチン接［（ＮＶ）マウス及びＮＰＥＶｄｅｌ感染ＳＦ９細胞をワク チン接種したマウスの死亡率曲線が殆ど異ならないことを示している。つまり、 ＮＰＥＶｄｅｌ感染ＳＦ９細胞はマウスに非特異的防御を示さない。

図１０は、１０００００の５ＦＥ９−Ｇ、ＭＯＫ細胞のワクチン投与量はマウス を防御するのに十分であり、１０’５ＦＥ９−Ｇ、ＭＯＫ細胞は、２．５よりも 高い防ｉ１１指数を得るのに十分であることを示している。

上記のことから明らかなように、本発明は、より明ら力）（こ記述した実施、実 施例及び用途に何ら限定されず、それところ力１本発明の領域または範囲から逸 脱することなく、この分野の専（以下余白　次頁に続く）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．任意に存在するリサウィルスのウィルスＲＮＡ及び／又は転写産物を抽出す るために概略処理された生体サンプルを、（１）ゲノムＲＮＡ又はｍＲＮＡから ｃＤＮＡを得るために、積に特異的なプライマー、リサウィルス血清型の場合、 リサウィルスに特異的なプライマー及び全てのリサウィルスに共通な遺伝子の保 全シーケンスからなるプライマー（以後多価プライマーと称す）から選択された リサウィルスに適する少なくとも１つのプライマーと接触させ、（２）次いでｃ ＤＮＡシーケンスを、そのｃＤＮＡの少なくとも１つのフラグメントを増幅する ためにリサウィルスの一対の適当なプライマー（但し、プライマーの１つは工程 （１）のものと異なり、他のプライマーは工程（１）のものと同一又は異なる） 、 （３）その後、増幅したｃＤＮＡシーケンスを適当な手段で検出すること、 特徴とする生体サンプル中に存在する少量のリサウィルスの迅速な検出及び／又 は同定をする方法。 ２．プライマーの１つが、狂犬病及びモコラゲノムの１−１８位に局在の３′狂 犬病プライマーである請求項１による方法。 ３．プライマーの１つが、狂犬病ゲノムの２９０１−２９１８位に局在のＭ２狂 犬病プライマーである請求項１による方法。 ４．プライマーの１つが、狂犬病ゲノムの４６６５−４６８７位及びモコラゲノ ムの４６７５−４６９７位に局在の２３ヌクレオチドからなる狂犬病プライマー であり、以後Ｇプライマーと称する、請求項１による方法。 ５．プライマーの１つが、狂犬病ゲノムの５５２０−５５４３位とモコラゲノム の５５４５−５５６８位に局在の２４のヌクレチツドからなる狂犬病プライマー であり、以後Ｌプライマーと称する請求項１による方法。 ６．プライマーの１つが、狂犬病及びモコラゲノムの５８７−６０５位に局在の １８のヌクレオチドからなるモコラプライマーであり、以後Ｎａプライマーを称 する請求項１による方法。 ７．プライマーの１つが、狂犬病及びモコラゲノムの１０１３−１０２９位に局 在の１６のヌクレオチドからなるモコラプライマーであり、以後Ｎｂプライマー と称する請求項１による方法。 ８．増幅ヌクレオチドシーケンスの検出が、各種のリサウィルスに適するプロー ブ又は一連のプローブの手段によるハイブリッド化で行われる請求項１〜７に何 れか１つによる方法。 ９．増幅したヌクレオチドシーケンスの検出が、そのシーケンスを少なくとも１ つの適当な制限酵素で分解し、次いで得られるフラグメントを電機泳動で分離す ることにより行われる請求項１〜７の何れか１つによる方法。 １０．一連の酵素が、ＢａｎＨｌ，ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔｆか らなる請求項９による方法。 １１．一連の酵素が、Ｒｓａｌ，ＴａｇＬＢｓｔｘｌとＦｎｕ４Ｈｌからなる請 求項９による方法。 １２．約１２０００のヌクレオチドからなり、その非コードシーケンスが： 【配列があります】 であるモコラリサウィルスのゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡヌクレオチドシーケン ス。 １３．３′と５′末端が相補的で、５′末端の１２ヌクレオチドが狂犬病ウィル スのＰＶ種のものと同一であり、３′から５′に連続して“リーダー”シーケン スＲＮＡをコードする遺伝子と次いで蛋白Ｎ，Ｍ１，Ｍ２，Ｇ及びＬをコードす る遺伝子を有する請求項１２によるヌクレオチドシーケンス。 １４．次のヌクレオチドシーケンスと由来アミ酸シーケンス（Ｉａ−Ｉｇ）、 −ヌクレオチド１からヌクレオチド５５２８：リーダーシーケンスＲＮＡ 【配列があります】 【配列があります】−ヌクレオチド５５８８からヌクレオチド５６３３【配列が あります】 −ヌクレオチド５６３５からヌクレオチド６０１７【配列があります】 −ヌクレオチド６０２０からヌクレオチド６８３１【配列があります】 −ヌクレオチド８６４１からヌクレオチド８７０３【配列があります】 −ヌクレオチド１１５２５からヌクレオチド１１９３９【配列があります】 からなる請求項１２又は１３によるモコラウィルスのゲノムＲＮＡからのｃＤＮ Ａシーケンス。 １５．Ｎ核蛋白をコードし、ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド７１−１４２０ に対応する請求項１２〜１４の何れか１つによるシーケンスのフラグメント。 １６．Ｍ１蛋白をコードし、ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド１５２４〜２４ ３２に対応する請求項１２〜１４の何れか１つによるシーケンスのフラグメント 。 １７．Ｍ２蛋白をコードし、ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド２５１６〜３１ ２１に対応する請求項１２〜１４の何れか１つによるシーケンスのフラグメント 。 １８．Ｇ蛋白をコードし、ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド３３２８−４８９ ３に対応する請求項１２〜１４の何れか１つによるフラグメント。 １９．Ｌ蛋白のＮＨ２末端をコードし、ｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド５４ ４３−５２８、５５８８−５６３３、５６３５−６０１７と６０２１−６８３１ に対応する請求項１２〜Ｋの何れか１つによるフラグメント。 ２０．前記シーケンスの非コードフラグメントであり、前記シーケンスの４８９ ７−５４４２に対応する請求項１２〜１４の何れか１つによるフラグメント。 ２１．約１２０００のヌクレオチドからなり、非分節、非ポリアデニル化陰性の 単一ストランドのＲＮＡであり、３′から５′に連続して“リーダー”シーケン スＲＮＡをコードする遺伝子及び次いでＮ核蛋白、Ｍ１リン蛋白、Ｍ２マトリッ クス蛋白、Ｇ糖蛋白、次のシーケンスを有する、 【配列があります】 ｐｓ１凝遺伝子と称する非コード遺伝子及びＬポリメラーゼ蛋白をコードする遺 伝子を有し、そのゲノムは常にＮ核蛋白と結合しているモコラウィルスゲノムＲ ＮＡシーケンス。 ２２．３′末端から、蛋白Ｎ，Ｍ１，Ｍ２，ＧとＬをコードする５つの連続モノ シストロニックフラグメント、すなわち−ポリＡと結合して式Ｉのシーケンスの ヌクレオチド５９−１４８４に対応するフラグメント、 −ポリＡと結合した式Ｉのシーケンスのヌクレオチド１４９５−２４８９に対応 するフラグメント、 −ポリＡと結合した式Ｉのシーケンスのヌクレオチド、２５０１−３２８３に対 応するフラグメント、 −ポリＡと結合し、Ｇ蛋白をコードする式Ｉのシーケンスのヌクレオチド３３０ ７−５３８０に対応するフラグメント、−シーケンス５４１６−５６３３、５６ ３５−６０１７、６０２０−６８３１、８６４１、８７０３、８８０９−９２１ ７、及び１１５２５−１１８５８からなりＬ蛋白をコードするフラグメント、 −ならびにビシストロニックＭ１−Ｍ２、からなる、モコラウィルスの転写の産 物。 ２３．３′末端から５′末端の全ゲノム、すなわち、−４１５０のヌクレオチド を有しかつ“リーダー”シーケンスＲＮＡ、Ｎ核蛋白、Ｍ１蛋白、Ｍ２蛋白をコ ードするシーケンスとＧ蛋白をコードするシーケンスのフラグメントに対応する フラグメント、 −２８５０のヌクレオチドを有し、Ｇ蛋白をコードするシーケンスのフラグメン トとＬ蛋白をコードするフラグメントに対応フラグメント、 −３′末端から６８３０のヌクレオチドからなり、リーダーシーケンスＲＮＡ、 蛋白Ｎ、Ｍ１、Ｍ２とＧ、ならびにＬ遺伝子の最初の１４２０のヌクレオチドを コードするシーケンス（以後ｐＭ７と称す）を含有する、Ｂｇ１ＩＩ部位内に挿 入物ｐＭＤ１０とｐＭＡ１０の連結によって得られたフラグメント、−ｐＭＢ５ と称する約３３００のヌクレオチドからなり、Ｌ蛋白をコードするシーケンスの フラグメントに対応するフラグメント、 −約２８００のヌクレオチド（以後ｐＭ１２と称す）からなり、Ｌ蛋白をコード するフラグメントに対応するフラグメント。 −約７００のヌクレオチド（以後ｐＭＲ１５ａと称す）からなり、Ｌ蛋白をコー ドするシーケンスのフラグメントならびにゲノムの非転写５′末端に対応するフ ラグメント、そのフラグメントは、別々の際、それぞれモコラゲノムの転写又は 複製で誘導されたＲＮＡフラグメント又はｃＤＮＡフラグメントに特異的にハイ ブリダイズする性能を奏する、モコラウィルスのゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡク ローン。 ２４．アンスティチュバストゥールのコレクシオンナショナルドゥキュルチュー ルドゥマイクロオルガニスム（ＣＮＣＭ）へ１９８９年３月２２日に、１−８４ ７号として寄託されている請求項２３によるｐＭ７と称するｃＤＮＡクローン。 ２５．前記寄託機関に、１９８９年３月２２日、１−８４８号として寄託されて いる請求項２３によるｐＭＢらと称するｃＤＮＡクローン。 ２６．前記寄託機関に１９８９年３月２２日、１−８４９号として寄託されてい る請求項２３によるｃＤＮＡクローン。 ２７．前記寄託機関に１９８９年３月２２日、１−８５０号として寄託されてい る請求項２３によるｃＤＮＡクローン。 ２８．放射性同位元素、適当な酵素又はフルオロクロムのようなマーカーで標識 された、請求項１２〜２７の何れか１つによるヌクレオチドシーケンス又はその フラグメントからなる、ヌクレオチドプローブ。 ２９．部位４６７５−５５６８又はそのフラグメント、特にフラグメント４８９ ７−５４４２又はその相補ストランドに対応する、請求項２３によるヌクレオチ ドプローブ。 ３０．請求項１２〜２７の何れか１つによる、ヌクレオチドシーケンス、フラグ メント又はいくつかのフラグメントの組合せでコードされているペプチド又はペ プチドのフラグメント。 ３１．Ｎ核蛋白遺伝子でコードされ、下記の式ＩＩのアミノ酸シーケンスを有す る、 【配列があります】 を有する請求項３０によるペプチド。 ３２．Ｍ１蛋白遺伝子でコードされ、下記の式ＩＩＩのアミノ酸シーケンスを有 する、 【配列があります】 を有する請求項３０によるペプチド。 ３３．Ｍ２蛋白遺伝子でコードされ、下記の式ＩＶのアミノ酸組成を有する、 【配列があります】 請求項３０によるペプチド。 ３４．Ｇ糖蛋白遺伝子でコードされ、下記の式ＶａとＶｂアミノ酸シーケンスで 特徴付けられる 【配列があります】 （Ｖａ） 【配列があります】 （Ｖｂ） 請求項３０によるペプチド。 ３５．Ｌ蛋白遺伝子をコードし、次のアミノ酸シーケンスの１つを有する、 式ＶＩａのシーケンス： 【配列があります】 式ＶＩｂのシーケンス： 【配列があります】 式ＶＩｃのシーケンス： 【配列があります】 式　ＶＩｄのシーケンス： 【配列があります】 請求項３０によるペプチド。 ３６．合成によって得られるものである請求項３０〜３５の何れか１つによるペ プチド及び／又はそのフラグメント。 ３７．請求項１２〜２７の何れか１つによる、少なくとも１つのヌクレオチドシ ーケンス又はそのシーケンスの１部を含有するベクター。 ３８．天然積のバクロウィルスをつくなくとも（１）バクロウィルスの表現用調 節シーケンスと（２）請求項１３〜２８の何れか１つによるモコラウィルスの遺 伝子又は少なくとも遺伝子のフラグメントを挿入するのに適するポリリンカーか らなる適当なシャトルベクターの相同組み換えによって得られる、モコロウィル スのペプチド、そのフラグメント又はフラグメントの組み合わせ用の表現ベクタ ー。 ３９．シャトルベクターが（１）ポリヘドリン遺伝子の５′コントロール領域か らなるバクロウィルスのゲノムのフラグメント、（２）モコロウィルスの遺伝子 又は少なくともそのフラグメント、（３）特にポリヘドリンポリアデニル化部位 を有する３′コントロールシーケンスからなり、そのベクターは構築の増殖をし うるものである請求項３８による表現ベクター。 ４０．モコラウィルスのＧ糖蛋白遺伝子又はそのフラグメントが、ポリリンカー のレベルで、ポリヘドリン遺伝子のプロモターのコントロール下、前記糖蛋白で チャージされた表現ベクターが得られるように挿入されている請求項３８又は３ ９による表現ベクター。 ４１．前記寄託機関に１９８９年３月２２日、Ｉ−８５１号として寄託されてい る請求項４０による表現ベクター。 ４２．Ｎ核蛋白遺伝子又はそのフラグメントが、ポリリンカーのレベルで、ポリ ヘドリン遺伝子のプロモーターのコントロール下で、前記蛋白質でチャージされ た表現ベクターが得られるように挿入されている請求項３８又は３９による表現 ベクター。 ４３．請求項３０〜３６の何れか１つによる少なくとも１つのペプチド及び／又 はそのフラグメントと、任意に少なくとも１つの医薬的に受容のベヒクルとの組 合させてなるヒト及び／又は家畜用のモコロウィルスに対するワクチン。 ４４．Ｇグリコ蛋白及び／又はそのフラグメント、及び／又はＮ・ヌクレオ蛋白 及び／又はそのフラグメントからなる請求項４３によるワクチン。 ４５．請求項３０〜３６の何れか１つよる少なくとも１つのペプチド及び／又は そのフラグメントと、任意に、少なくとも１つの他のリサウィルスセロタイプの 少なくとも１つのペプチド及び／又はそのフラグメントからなるリサウィルス多 価ワクチン。 ４６．ペプチド及び又はそのフラグメントが、適当な賦形剤及び／又は受容なア ジュバント、特にヒト及び家畜用ワクチンの通常のアジュバンドと有利に結合さ れている請求項４３〜４５の何れか１つによるワクチン。 ４７．哺乳動物、特にげっし動物さらにはマウスを、請求項３０〜３６の何れか １つによるペプチド及び／又はそのフラグメントで免疫化して得られるものであ るモコラウィルスのペプチド及び／又はそのフラグメントに特異なモノクロナー ル抗体。 ４８．生体サンプル中の存在しうる抗モコラ抗体を請求項３０〜３６の何れか１ つによるペプチド又はそのフラグメントと接触させ、抗モコラ抗体が分析させる 生体サンプル中に存在すれば結合し、その結果を特にＥＩＡ、ＲＩＡや蛍光のよ うな適当な手段で判断し、前記抗体を検出することからなる抗モコラウィルスの ペプチド及びそのフラグメントの抗体を検出する免疫法。 ４９．前記ペプチド又はそのフラグメントが、適当な固形キャリヤーに固定され ている請求項４８による方法。 ５０．サンドイッチ法が用いられた際、適宜ラベル化したアッセイすべき抗体に 対する第２抗体を用いて行われる請求項４８又は４９によるる方法。 ５１．生体サンプル中に存在しうるモコラウィルスを適宜処理し、請求項２８又 は２９による少なくとも１つのヌクレオチドプローべと接触させ、このプローブ に、モコラウィルスのゲノムＲＮＡ及び／又は転写産物がサンプル中に存在する と結合し、結果を適当な手段で読み取ることからなるモコラウィルスの迅速・特 異的に検出をする方法。 ５２．検出を行うのに適切な有用量の緩衝液と試薬、適量の少なくとも２つの適 当なプライマー、適量の少なくとも１つのヌクレオチドプローべと適量の少なく とも１つの制限酵素が、加えてなる請求項１〜１１の何れか１つの少なくとも１ つのリサウィルスの検出及び／又は固定の方法を実施するための簡易キット。 ５３．請求項３１〜３７の何れか１つによる少なくとも１つのペプチド及び／又 はそのフラグメントの適量、と検出を行うもの適する緩衝液の有用量が少なくと も含まれてなる、請求項４３〜５０の何れか１つによる、生体サンプル中の抗モ コラ抗体の測定法を実施するための簡易キット。 ５４．ペプチドが請求項３５又は３７によるＧ糖蛋白量は又はそのフラグメント で、適当な固定キャリヤーに固定化されている請求項５３によるキット。 ５５．ペプチドが請求項３１又は３６によるＮ核蛋白又はそのフラグメントで、 適当な固形キャリヤーに固定化されている請求項５３によるキット。 ５６．請求項２９又は３０による少なくとも１つのプローブ及び又はヌクレオチ ドプローブのフラグメントの適量と、その検出を行うのに適する緩衝液の有用量 を少なくとも含むことからなる請求項５２によるモコラウィルスの検出法を実施 するための簡易キット。