JPS59113898A - 腫瘍形成性の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物細胞の悪性に対する機構は従来から又現在にお
いてもなお真剣に検討されている主題である。この機構
の解明に有望と考えられている分野の一つは腫瘍を起こ
す遺伝子（以下、単に腫瘍遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ
　）と称す）の分野である。腫瘍遺伝子の発生は、最初
にレトロウィルスについて検出されたが、現在ではウィ
ルス腫瘍遺伝子が細胞の相手を有することが合理的根拠
のある確固たるものとなっているように思われる。細胞
の相手の役割は明確でない。腫瘍遺伝子、それらの特性
及び特にと透遺伝子についての優れた総説がＪ、マイケ
ル・ビ７ヨツゾによる記事に見られる（Ｊ。

Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂｊｓｈｏｐ％５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８２年３月、８１〜９３頁）
。この記事は又各種ウィルス腫瘍遺伝子のリストを提供
し、それらの多くがす／酸化民心を含んでいることを示
している。

このｓｒｃ遺伝子は、ニワトリの悪性細胞中において活
性であるのみならず、正常細胞においても活性であるこ
とが判明している。その相違は用遺伝子により表現され
る酵素が正常細胞に比べて悪性細胞においてはるかに高
い濃度で存在するように思われる点において、種類とい
うよりもむしろ程度の差であるように思われる。

腫瘍細胞の存在乞決定することが可能となるためには、
正常細胞と腫瘍細胞の区別を行うことが可能である必要
がある。従って、腫瘍細胞と診断すべく観察される性質
は、正常細胞からの区別。

或いは細胞よりもむしろ流体が測定される正常宿生の生
理学的流体からの区別が可能でなければならない。更に
、その性質は個人に特異的なものであるべきでなく、細
胞の悪性の性質に共通のものでなければならない。

診断及び治療の両者において、悪性細胞を特異的に検出
するための好機は極めて重要である。悪性の疑いがもた
れる高い割合の状況において、如何なる技術も悪性細胞
を正常細胞から区別する能力を有するべきである。更に
１診断技術は多くの人口に対して有用であるべきであり
、１人或いは数人の人口に対して特異的であるべきでは
ない。

癌細胞は正常細胞に由来するものであるので、悪性細胞
の性質及び成分の殆んどは正常細胞と同一である。更に
、悪性は自然の過程の結果であり、一定の状況において
悪性となるという見解が次第に増大している。悪性が、
問題の時点において常軌を逸した結果を有する正常な過
程に基づくものであるとの事実に鑑みれば、広汎な範囲
の異質遺伝子的な宿主にわたって正常細胞と癌細胞間の
観察可能な差異を示すことに実質的な困難があったとし
ても驚くに足りない。

次の論文は＠瘍遺伝子、及び腫瘍形成におけるレトロウ
ィルスの役割についての一般的記述を゛提供するもので
ある：　Ｂｊｓｈｏｐ％５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ。

前記；　Ｂｊｓｈｏｐ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、
　ｏｆ　Ｍｅｄ、　（１９８０）３０３　：　６７５〜
６８１頁；　Ｌａｎｃｅｔ、　１９８２年り月消日、１
９５〜１９６頁；　Ｃｏｏｐｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　
（１９８２）　２１８　：８０１　ゝ８０６頁；　Ｖａ
ｒｍｕｓ、　５ｃｊｅｎｃｅ　（１９８２）　２１６　
：８１２〜８２０頁。特別の腫瘍遺伝子に関する論文と
しては、ＢｅｃｋｅｒらのＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９８
２）　７９　：３３１５　＼３３１９　；　Ｔｓｕｃｈ
ｉｄａらの５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８２）２１７　：　
９３７〜９３８及びＤｈａｒらの同上の（１９８２）２
１７　：　９３４〜９３６などが挙げられる。

ヒト宿主における新もだな腫瘍の悪性細胞を同定し、治
療するための方法及び組成物が提供されている。低級を
椎動物の細胞を悪性に形質転換することのできるＤＮＡ
配列についての知識から、該ＤＮＡのヒト細胞における
転写の程度を決定するためのポリヌクレオチドゾローブ
を作成することができ、該ＤＮＡ配列のペプチド生成物
の決定因子部位を特異的に認職することのできる受容体
を生成することができる。これらのプローブ及び受容体
は、診断及び治療のための各種のラベルで標識を付する
ことかできる。

本発明によれば、ヒト及びその他の霊長類における癌の
診断及び治療のための新規方法及び組成物が提供される
。低級を椎動物の細胞を悪性に形質転換することのでき
るＤＮＡが臀トの細胞中に存在し、それが悪性細胞にお
いて正常細胞におけるよりもはるかに高程度の転写及び
表現を有することが此の度判明した。即ち、このより高
い割合のメツモノジャーＲＮＡ或いはその様なメツセン
ジャー　ＲＮＡの表現生成物を検出することができるこ
とにより宿主中の悪性細胞の存在な診断することが可能
である。更に、悪性細胞中の高割合のペプチドの生成は
悪性の治療に対する基礎となり得る。

血液のような生理学的流体中にポリペプチド表現生成物
を見出すことが可能であり、その表現生成物の割合が悪
性の存在或いは不存在において実質的に異る場合には、
その生理学的流体馨特別の峠瘍の存在に対する徴候とし
て検査することができる。

本発明は、一定の群の細胞、特に生体内のヒト細胞或い
はヒト宿主から新うたに散出されたヒト細胞における悪
性細胞の可能性或いは存在を評価するための方法及び組
成物を提供する。この方法は悪性細胞の可能性のある存
在の徴候とじてｍＲＮＡ或いはその表現生成物のような
細胞生成物に着目するものである。検出のために選択さ
れるｍＲＮＡは、哺乳動物細胞を悪性に形質転換するこ
とのできるレトロウィルスのゲノム中Ｋ　ＲＮＡが存在
する結果として通常選択される。更に、選択されたレト
ロウィルス中のＲＮＡは、レトロウィルスの本質的機能
ケ暗号化するものではなく、事実。

サイレントであってもよい配列である。

本発明の方法は、第１工程として、哺乳動物細胞におい
て悪性を引起こすことのできるＤＮＡ配列の決定を含む
ものである。一度ＤＮＡ配列が決定されると、高割合の
メツセンジャーＲＮＡ　？検出するためのプローブとし
ての役割を果すポリヌクレオチド配列馨提供することが
でき、細胞が悪性であるかどうかを決定することができ
る。又、この配−列を使用してペプチド配列に対して高
い特異性を有する相補的受容体な決定することのできる
ポリペプチド配列を決定することもできる。これらの受
容体は次いで、細胞或いは生理学的流体中のペプチドの
存在或いは濃度の決定、および受容体を悪性細胞に向け
ることができる場合には治療のために使用することがで
きる。又、ペプチドの性質及びその機能を知ることによ
り特別のペプチドの上昇した産生を制御するためのその
他ゐ手段も利用可能である。

本発明の方法における第１工程は、ＤＮＡ配列を決定す
ることである。レトロウィルス腫瘍遺伝子のＤＮＡ配列
な決定するために各種方法を使用することができる。例
えば、低級を椎動物の細胞を悪性に形質転換することの
できるレトロウィルスが見出されている。これまでに特
性化されているレトロウィルスｉは、宿主中に存在する
野性型遺伝子、即ち、現在では即瘍遺伝子と呼ばれてい
る遺伝子、に匹敵するＤＮＡ配列を有することが示され
ている。更に、ラウス肉腫ウィルスの場合には、その遺
伝子の表現生成物が単離され、特性付けられキナーゼで
あることが示されている。このキナーゼは、細胞により
正常状態でも産生されているが、しかし、ラウス肉腫ウ
ィルスからの、シ浅遺伝子が導入された場合よりもはる
かに低割合であることも示されている。各種を椎動物に
おいて既に多数のウィルス腫瘍遺伝子が検出されており
、次表は一連の＠瘍遺伝子及びそれ等の起源種を示すも
のである。

表　　　　１ ｖ−ｓｒｃ　　　　　ニワトリ ｖ−ｆｐｓ　　　　　　ＪＦ ｖ−ｙｅｓ　　　　　　＃ ｖ−ｆｏｓ　　　　　　ｔｔ ｖ−ｍｙｃ　　　　　　ｇ ｖ−ｅｒｂ　　　　　　ｔｔ ｖ−ｍｙｂ　　　　　　ｐ ｖ−ｔｅｌ　　　　　　シチメ／チョウｖ−ｍｏｓ　　
　マウス ｖ−ｂａｓ　　　　５ ｖ−ａｂｌ　　　　ｐ ｖ−ｒａｓ　　　　　　　　　ラ　　ッ　　トｖ−ｆｅ
ｓ　　　　　　　ネ　　　　コｖ−ｆｍｓ　　　　　　
　　　　　　Ｉｖ−ｓ　ｉ　ｓ　　　　　　　サ　　　
ルを椎動物細胞中に悪性形質転換をもたらす能力を有す
るその他のＤＮＡ配列源としては、悪性細胞或いは細胞
系から単離されたＤＮＡ、ゲノムの図書館からクローン
化されたＤＮＡ、或いは悪性細胞σつ全メツセンジャー
がＤＮＡに逆転写されクローン化される場合のメツセン
ジャーＲＮＡ図書館からのクローン化ＤＮＡなどが挙げ
られる。これらの図書館のいずれについても、その悪性
乞誘発する能力についてスクリーニングすることができ
る。スクリーニング技術における改良は正常細胞から全
メツセンジャーを取出し、このメツセンジャーからｃＤ
ＮＡを調整することにより達成される。次Ｖ）でこの一
本鎖ＤＮＡを、悪性細胞からの全メツセンジャーＲＮＡ
より正常細胞に関連したメツセンジャーＲＮＡを除去す
るプローブとして使用することができる。残りのメツセ
ンジャーＲＮＡは悪性に関連した遺伝子により表現され
るメツセンジャーを含むことになる。次いでこのメツセ
ンジャーなゲノムの図書館をスクリーニングするために
使用し、悪性に形質転換する能力を決定するための培養
アッセイにおいてメツセンジャーとハイブリッド化する
クローン化ＤＮＡを使用することができる。正常細胞を
形質転換することができるＤＮＡ配列を検出及び決定す
るためのその他の方法もやがて利用可能となるであろう
。

悪性細胞からのメツセンジャーＲＮＡ　ｙ用いて胎児か
らのＣＤＮＡｙスクリー二／グすることによって更に別
の分析を用いることが可能である。特に、腫瘍遺伝子が
、胚においては棲めて活性であるが。

成熟したを椎動物においてサイレント或いは比較的静か
である遺伝子の場合にはこのスクリーニングは被スクリ
ー二／グ配列分野を更に狭めるのに役立つことが可能で
ある。

一度、悪性を誘発することのできるＤＮＡ配列が同定さ
れると、クローン化されたウィルスの腫瘍遺伝子、即ち
、短いポリヌクレオチド配列な悪性の疑いのもたれる細
胞におけるメツセンジャーＲＮＡの生成割合を検出する
ためのプローブとして使用することができる。ＲＮＡ及
びＤＮＡヌ、クレオチド配列の調製、これらの配列の標
識化、及び配列の好ましい大きさは文献上十分な説明及
び例示が行われている。通例、配列は少なくとも約１４
個のヌクレオチド、通常少なくとも約１８個のヌクレオ
チド、を有すべきであり、及びポリヌクレオチドプロー
ブは１キロ塩基（ｋｉｌｏｂａｓｅ）以上であり得る。

各種ラベルが使用可能であるが、最も普通には放射性核
種、特に（３２ｐ　〕が使用される。しかしながう、例
えばビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）変性ヌクレオチドをポリ
ヌクレオチド導入のために使用するようなその他の技術
も又使用することができる。このビオチンは次いで各種
のラベル、例えば放射性核種、螢光体、酵素などにより
標識化することのできるアビジｙ　（ａｖｉｄｉｎ）或
いは抗体と結合する部位として機能する。或いは又、Ｄ
ＮＡ−蛋白質二重らせんを含む特別の二重らせんを認識
することのできる抗体を使用することもできる。この抗
体は次いで標識化され、この二重らせんが表面に結合し
た場合に測定を行うことが可能となり、二重らせんが表
面上に形成された際に二重らせんに結合した抗体の存在
を検出することができる。

全腫瘍遺伝子のヌクレオチド配列を単離することにより
、塩基の配列を公知の手段により決定することができる
。例えば、マクサム及びギルノ々−）　　（Ｍａｘａｍ
　　、ｉｎｄ　　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、　　ＰＮＡＳ　　
ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０参照。この配列な使用
して腫瘍遺伝子により表現される蛋白質のアミノ酸配列
の決定を行うことができる。表現を妨げる停止コド／を
有さない配列が続くメチオニ／のコドノ乞同定すること
によりメチオニノコド／を有するフレーム中にｈａ遺伝
子を決定するための単一配列を通常見出′１−ことが可
能である。

あるいは又１表現を得るためにノ・イブリッドＤＮＡ技
術を使用することもできる。このＤＮＡ配列について制
限マツピングを行い、適当な切断部位を決定する。この
様にして配列Ｙ切除し適当な制御信号ゲ有するベクター
中に導入する。ＤＮＡ配列の表現な得た後に、ポリペプ
チドに対する抗体を作成することができる。次いで、翻
訳されて腫瘍遺伝子により表現されるペプチド？生成す
るメツセンジャーＲＮＡの表現のために卵母細胞ン用い
ることにより、このメツセノジャーにより決定される蛋
白質を生成することができる。ハイブリッドＤＮＡの表
現により生成されるペプチドである卵母細胞からのペプ
チドの同一性が次いで決定される。

蛋白質が一度同定され、立証されると、この蛋白質或い
はサブユニットペプチドを診断及び治療のための抗体産
生用抗原として使用することができる。抗体は、モノク
ローナル或いはポリクローナル抗体のいずれかが所望さ
れるかに応じて各種方法で調製することができる。ポリ
クローナル抗体のためには、を推動物、通常は家畜が抗
原により超免疫化され、繰返し免疫化後間もなく血液を
集め、ガンマグロブリノを単離する。モノクローナル抗
体については、小さな動物を超免疫化させ、肺臓を取出
し、リンＡ球を適当な融合相手と融合させる。得られた
ハイブリドーマを次いで限定稀釈下に生育し、所望の抗
体を与えるクローンを選択する。

全ペプチドを製造するよりもむしろ、決定因子部位であ
ると思われる各種領域を決定し、少なくとも約８個のア
ミノ酸１通常は少なくとも約ｌＯ〜加以下のアミノ酸、
通常は約１８個のアミノ酸、を有するこれらのオリゴペ
プチドを用いて抗体形成を誘発するのに用いることので
きるハプテ／（ｈａｐｔｅｎ　）を決定することができ
る。このオリゴペプチドは適当な免疫原に結合され、を
推動物に導入され、前記のようなポリクローナル或いは
モノクローナル抗体のいずれかを産生ずる。

従って、本発明は、レトロウィルス＠Ｓｔ遺伝子に存在
するＲＮＡのペプチド表現生成物中の抗原領域に対応す
る一連のオリゴペプチド類も提供するものである。本発
明に従った有用な抗原性オリゴペプチド類の具体例を、
以下に、オリゴペプチドから生成した抗体により認識さ
れるレトロウィルス暉瘍遺伝子（表現生成物）に基づい
た群毎に掲げである。

Ａ、　　　Ｍｙｂ Ｂ、　　　　Ｓｒｃ ａｒｇ−１ｅｕ−１ｌｅｕ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ａｓｎ−
ｇｌｕ−ｔｙｒ−ｔｈｒ−ａｌａ−ａｒｇ−ｇｉｎ−ｇ
ｌｙ−ａｌａ−１ｙ８−ｐｈｅ−ｐｒ。

Ｃ，ＲａｇＫ′ Ｄ、　　　Ｒａｓ” ｖａｌ−ｇｌｙ−ｖａｌ−ｇｌｙ−１ｙｇ−ｇｅｒ−ａ
ｌａｍｅｔ−廿ｗ−ｇｌｕ−ｔｙｒ−１ｙｓ−１ｅｕ−
ｖａｌ−ｔｒａｌ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ａｌａ−Ｅ、　　
　　Ｆｅ５ Ｆ、　　　Ｍｙｃ ａｓｐ　−ｇｌｎ−ｇｌｎ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｇｌｙ−
ａｒｇ−ａｒｇ−ｔｈｒ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａ
ｒｇ−ｇｌｎ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａ８ｎ−ｇｌｕａｒｇ
−１ｅｕ−１ｌｅｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−１ｙｓｓ−ｇｌ
ｕ−ｇｌｎ−１ｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｇｌｕ
−ｇｌｎ ａｒｇ−１ｙｓ−１ｙｓ　−ａ　ｓｎ−１ｙｓ　−１ｙ
ｓ−’１ｙｓ−５ｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−１１ｅｕ−５
ｐ ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−ａ
ｓｐ−８ｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｇｌ
ｕ ａｒｇ−ｔｈｒ−１ｅｕ−ａｓｐ−５ｅｒ−ｇｌｕ−ｇ
ｌｕ−ａｓｎ−ａｓｐ−１ｙｓ−ａｒｇ−ａｒｇ ｇｌｕ−ａｒｇ−ｇｌｎ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｓｎ−ｇ
ｌｕ−１ｅｕ−１ｙｓ−１ｅｕ−ａｒｇｇｌｕ−ｇｌｎ
−１ｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｕｒｇ−ｇｌｕ−
ｇｌｎ−１ｅｕ−１ｙｓＧ、　　　　Ｆｏｓ ｇｌｕ−ａｒｇ 上記小分類Ａ〜Ｆに挙げたオリザマーペゾチド配列の各
々の一端或いは両端に更にアミノ酸残基を、得られるペ
プチドの抗原特性を変えることなく付加することができ
るので、本発明は又、上記Ａ〜Ｆに掲げたアミノ酸配列
の少なくとも１つな含有する約５０までの、好ましくは
乙の、アミノ酸の一連の抗原性オリゴペプチドを包含す
るものである。

上記Ａ〜Ｆの小分類において与えた１以上のアミノ酸配
列を含有する本発明による抗原性オリゴペプチド類は１
合成技術及びハイブリッドＤＮＡ技術を用いて調製する
ことができる。約５０までのアミノ酸残基な含有する本
発明のポリペプチド及びオリゴペプチドについては、通
常の固相ペプチド合成が使用するのに適している。この
一般的ペプチド合成技術は、例えば、米国特許第４，３
４１，７６１号明細書に記載されており、公知の側鎖保
護基及び通常の支持体１例えば、クロロメチル化樹脂。

ヒドロキシメチル樹脂、或いはベンズヒドリルアミ／樹
脂などのポリスチレノ樹脂支持体、を用いてアミノ酸カ
ップリングを行っている。組換え或いはハイブリッドＤ
ＮＡ技術な利用する技術においては、本発明の例えば２
Ｄｆ固までのアミノ酸を含有するオリゴペプチド類を用
いて問題のオリゴペプチドな暗号づけするヌクレオチド
（ＤＮＡ）のためのコドノ配列を推定することができる
。このコドン配列を鋳型として用い二本鎖ＤＮＡを公知
の技術を用いて合成し、ベクターＤＮＡ或いは大腸菌（
Ｅ。

Ｃｏｌ　ｉ　）プラスミドなどのクロー二／グビヒクル
中に挿入することができる。適当な宿主、例えば。

大腸菌などの微生物或いは、例えば、その他の組換えベ
クターを有する細胞系の形質転換により所望のオリゴペ
プチドの表現？得る手段が得られる。

ヒトの遺伝子がｖ−ｏｒ匹と異なる場合、例えば、ヒ）
ｃ−リリの場合は、上記技術は遺伝子、ｍＲＮＡ或いは
偽遺伝子を単離し、ヒト表現生成物に対する抗体馨得る
ために使用することができる。ヒトの１腫瘍遺伝子は関
連するｖ−ｏｎｃに実質的な相補性を有するものと思わ
れ、通常塩基の相違が約５％未満であり、一般的に表現
生成物中のアミノ酸の相違が５％未満である。

これらの抗体は各種方法により使用することができる。

特に、それらは診断のために使用することができる。悪
性が存在する時にのみ高濃度で抗原が生理学的流体中に
見出される場合においては、血清、血漿、全血液或いは
脳を髄液などの生理学的流体を検定することができる。

検定に使用される抗体は標識化されたものでも、されな
いものでもよい。未標識化抗体は凝集反応に粘いて使用
することができる。標識化抗体は各種検定法において、
各種ラベル、例えば、放射性核種５酵素、螢光物質、酵
素基質或いはコファクター（ｃｏｆａｃｔｏｒｓ　）な
どを用いて使用することができる。これらの技術は文献
に十分に記載されており、具体的検定法は米国特許第３
，８１７，８３４号、同第３，９３５，０７４号。

同第４，２３３，４０２号及び同第４，３１８，９８０
号各明細書に例示されている。

ある技術においては、抗体よりもむしろ抗原或いはその
断片にラベルを付し、ラベルを付した抗原と試料中の抗
原との間に抗体に対する競争をさせることか有用な場合
がある。この状況においては、最適の感度及び精度を与
える蔽での標識化抗原或いは標識化断片と抗体との組合
わせを有するキットを提供することが通常行われている
。

その他の状況において、抗原或いは抗体のいずれかが結
合されている固体支持体を有することが望ましい。多抗
原決定基性抗原は検定媒体内において支持体に結合した
抗体と標識化抗体との間のブリッジとしての役割をはた
し得る。或いは又限られた凝の抗体に対する標識化抗原
と試料中の任意の抗原間の競争乞有することも可能であ
る。

抗原が生理学的流体内にない場合、或いはあっても悪性
を診断することができない場合には、細胞を単離して細
胞についてメツセンジャーＲＮＡ或いは抗原の存在を検
定しなげればならない。メッセｙ　シャーＲＮＡの検出
方法については既に説明した。抗原を検出するためには
組織試料ン通常の方法、例えば、塩基、洗剤、などを用
いて溶解し、細胞の残渣’ＫＷ過或いは遠心分離により
分離し、Ｐ液酸いは上澄液を単離して検定すればよい。

治療目的のために、治療の性質及び外来抗体が免疫応答
を誘発するかどうかに応じて異形発生的（ｘｅｎｏｇｅ
ｎｅ　ｉｃ　）或いは異質遺伝子的（ａｌｌｏｇｅｎｅ
ｉｃ　）抗体のいずれかを使用することができる。文献
にはヒト抗体な作成する多くの方法が記載されており、
それらにおいてはマウスその他の哺乳動物の抗体は満足
・できないものであることが判明されている。

これらの抗体は各種方法において使用することができる
。適当なＩｇＧ　（ＩｇＧ１以外）を使用することによ
り、自然相補過程により溶解を誘発することができる。

或いは又、毒素の溶解部分を抗体、特に、ｐａｂ断片に
連結することができろ。これらの抗体をリポソームに結
合し、リポソームな悪性細胞に指向け、膜を合体するこ
とにより細胞に敗り入れられるようにすることもできる
。その他のラベル、例えば、放射線核種、螢光物質、酵
素なども又抗体に結合することができる。抗体乞生体内
に導入すれば、抗体はラベルを悪性細胞に指向け、これ
によって悪性の存在を診断或いは治療することができる
。

抗体の配合はラベルの性質、抗体の目的、抗体が指向け
られる箇所などに応じて広範に変化する。

通常、抗体は生理学的に許容可能な担体１例えば。

塩水或いはリノ酸緩衝塩水中に配合され、宿主中に、可
能である場合には所望の箇所に注射し、これが不可能な
場合には血液のような循環系統中に注射される。

本発明に従って得られる抗体は又、腫瘍遺伝子を表現す
る細胞を単離するために、及び腫瘍遺伝子を表現する細
胞な含有する不均一細胞群から１ｎｖｉｔｒｏでその細
胞を取り出すために使用することも可能である。分離は
螢光活性化細胞分類機（ＦＡＣ８）を用いて達成するこ
とができる。この同一の技術を用いて腫瘍遺伝子を表現
する細胞を同定及び単離することができる。細胞の混合
物から腫瘍遺伝子な表貌する細胞を取り出すために本発
明の抗体を補体と結合し、毒素の溶解断片（Ａ断片）に
結合しくＥ、Ｐ、Ｏ，出願第１７，５０７号明細書及び
英国特許第２，０３４，３２４号明細書参照）或いは細
胞を凝集し、物理的手段により分離してもよい。

以下の具体例は例示を目的として提示されるものであり
、本発明を限定するものではない。

のであった。生育可能な腫瘍のみを得、該組織をメツセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の劣化を避けるためになる
べく迅速に加工する努力がなされた。標本はすみやかに
冷凍され、ＲＮＡに加工される壕で液体窒素中で貯蔵さ
れた。外科標本が広範囲の正常組織部分を含む場合には
、その一部’１ｃ−ｏｎｅ遺伝子表現の水準の内部コン
トロールとして分析用に取り出した。ｅ−Ｏｎｅ遺伝子
表現は次いで同一患者からの正常及び悪性組織において
比較することができた。細胞当り３キロ塩基（ｋｂ）の
ほぼ一つのＲＮＡ転写、即ち、フィルターに適用された
ほぼ２マイクログラムのポリＡ　ＲＮＡに等価の２０ｐ
ｇ程度の少量のＭａｌｏｎｅｙネズミ肉腫ウィルスをこ
の方法［Ｋａｆａｔｏａ等Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄａ
−Ｒｅｓ、　（１９７９）　７：１５４１）　　で検出
することができた。未関連のＲＮＡのものを含む適当な
対照を使用することにより、ポリＡ−陰性画分ＲＮＡ　
、プラスミドＤＮＡ。

及びマウス及びヒ）ＤＮＡ、偽−陰性並びに偽−陽性結
果を合理的に排除することができた。ドツト・プロット
（ｄｏｔ　ｂｌｏｔｓ）はソフトレーザー走査濃度計を
用いて定量的に計画した。十分な材料が利用可能な場合
には、ｍＲＮＡは更にフープ／（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分
析により特性化付けし、特異的転写の存在を確認し、そ
の大きさを測足した（Ｔｈｏｍａｓ、　ＰＮＡＳ　ＵＳ
Ａ　（１９８０）　７７：５２０１’３゜１４の腫瘍に
おける１３の細胞腫瘍遺伝子の表現をＤＮＡ−ＲＮＡハ
イズリツＰ化技術により調べた。これらのデータを表２
にまとめて示す。

次の３つのＡターンが観察された：１）全て或いは殆ん
ど全ての腫瘍試料における特異的ｅ”’ＯｎｅｍＲＮＡ
配列の表現（例、ｃ−ｍｙｃ）；　２）散発性腫瘍にお
けるｅ−Ｏｎｅ表現の検出（例、ｃ−ｆｅｓ）；及び３
）検出可能な表現のないもの（例、ｃ−ｍｏｓ）。

ｃ−ｅｒｂ　、　ｃ−ｙｅｓ　％　ｃ−ａｂｌ　、　ｃ
−ｍｏｓ　、ｃ−ｆｍａ或いはｃ−ｓｉ８に相応するｍ
ＲＮＡ配列の有意な表現を検出することができなかった
。これらの全てのプローグの相応物をヒトゲノムのＤＮ
Ａ中において検出することは可能であるので、これは、
ウィルス遺伝子プローグとヒトメツセンジャーＲＮＡ間
の相同関係の欠乏の結果によるものではない。顕微鏡的
に正常な組織からのＲＮＡはこの分析による検出可能な
転写物を全く含有していなかった。

４つの細胞肺癌遺伝子は各種ヒト腫瘍において１尾−員
した表現ノにターンを示した。これらはｃ−ｍｙｅ　、
　ｃ−ｆｏａ　Ｘｃ−ｒａｇ”、及びｅ−ｒａｇ”であ
った。ハイグリッド化の強さについて比較を行ったが、
これは全てのプローブがほぼ同一の特異活性に標識化さ
れていたために可能であった。ｕ−ｍｙｃ及び−ｖ−ｆ
ｏｓはヒトの腫瘍ＲＮＡのものに対して最も高いノ゛イ
ブリッド化強度を示し、細胞当りの多数のｍＲＮＡのコ
ピーを示唆した。これらの両者の遺伝子の表現は試験さ
れた全ての悪性において観ｓされｉ。ｃ　−ｒ　ａ　ｓ
　”、及？ｊ　ｃ−ｒａａＫ’　配列モ殆１ｖ　トのヒ
ト腫瘍において検出されたがそのハイブリッド化の強度
はより弱いものであった。

ｃ−ｆｅｓに関連したメツセンジャーＲＮＡ配列は試験
された１４の腫瘍のうち２つのみに検出された。

これらのいずれも肺癌であった。

ｃ−ｍｙｂ表現は１４の腫瘍のうち１つのみに検出され
た。これも又肺癌であった。

ｃ−ｓｒｃメツセンジャーＲＮＡ配列はリンパ肉腫を有
する患者の循環腫瘍細胞にのみ観察された。

細胞の腫瘍遺伝子配列の表現が腫瘍、新生に関連するか
否かを試験するために同一患者の同一部位から同時に大
体正常に見える組織及び明らかに悪性の組織の両者を得
る努力がなされた。次いで、腫瘍からのＲＮＡ試料及び
隣接の非罹患組織からのＲＮＡ試料についてハイブリッ
ド化研究を行った。

１４人の患者のうち６人についてこの分析を行うことが
可能であった。これらの６つのケースの１つにおいて正
常と推定された組織は引続き組織構造分析によって腫瘍
によりじりじり入り込まれていることが示された。残り
の５つのケースのうち４つにおいて腫瘍及び正常組織間
に異った表現が見られ、正常な組織においては低い或い
は検出不可能な程度の表現が見られるのに対し、悪性に
分いては、扁い程度の表現が見られた。３つの腎臓細胞
癌及び１つの結腸癌がこの現象を示した。

細胞からのＲＮＡのプロット分析は、ＩＩＩ！Ｊ試料及
び対照試料の領域において、腫瘍及びｅ−Ｏｎｅ遺伝子
表現の存在或いは不存在間の相関関係を示した。

１つの腫瘍、即ち、小腸の腺癌においてｃ−ｏｎｅ関連
配列が組織学的に正常な隣接組織に見出された。

腫瘍及び対照組織からのポリＡＲＮＡの分析は、ノーザ
ン技術により行われた。４．０及び２．０　ｋｂの２つ
のｃ−ｍｙｃ関運転本物は全ての検査された腫瘍に見出
された。これらの転写物の他に、これらのハイブリッド
化分析において、メツセンジャーＲＮＡのあるものの明
らかな劣化があったが、おそらくは組織の外科的取り出
し後の期間における組織の酸素欠乏の際に起こった劣化
の結果によるものと思われる。

上記操作を用いて新鮮な外科標本から得られた幾つかの
その他の腫瘍の型についてｅ−Ｏｒｌｅ遺伝子表現′ｆ
、調べた。この一連の試験において、９個の腫瘍におけ
る１０個の異った細胞の腫瘍遺伝子の表現を探すために
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド化を使用した。得られたデ
ータを下記の表３に示す。

表３の結果は、細胞の腫瘍遺伝子ｅ−ｍｙｅ。

ｃ−ｆｏｓ　％ｃ−ｒａｓ”、及びＣ−ｒ、、Ｋｌが調
べられた追加の腫瘍型において首尾一貫した表現のパタ
ーンを示す点において前に表２において報・告された結
果とかなり十分な相関関係を示すものである。更に、い
くつかの追加の腫瘍型においてｃ　−ｍｙｂ　。

ｃ−ｓｒｃ及びＣ−ｆｅｓも又検出されたのに対し、調
べられた追加の腫瘍型のいずれにもｃ−ｒｅｌ　。

ｃ−ａｂｌ、及びｃ−ｍｉｓ表現は観衆されなかった。

興味あることに、探索された細胞の腫瘍遺伝子のいずれ
もが評価された単一の子宮癌においていかなる有意量に
おいても表現されていなかった。

悪性細胞に高い微にて存在することが示されたメツセン
ジャーＲＮＡが胚形成に関与する遺伝子と関連するか否
かを決定するために一般的に次の様な実験が行われた。

全ＲＮＡはランダムに受精させたスイスマウスの胚／胎
児から妊娠の６日目（***プラグの日を出生前発育の０
日とした）から毎日の間隔で単離した。出生前発育の１
００日目り開始して胚そのものを胚外膜及び胎盤から分
離した。

１０日目前の小径のものは分離を妨げ、従って６〜９日
目の胚は子宮壁から切断された全受胎産物を表わす。

ぼり（Ａ）−含有ＲＮＡ（ポリ（Ａ＋）　ＲＮＡ　〕の
アリコートをアフイニテイクロマトグラフイーによりオ
’Ｊ　−／　（ｄＴ）−セルロースカラム上に単１１１
１Ｌ、ニトロセルロース紙上にスポラトラ付した（ｒッ
トブロット）　　（ＫａｆａｔｏｓらのＮｕｃｌ、Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９７９）７：　１５４１〜１５５２　）。これらの
試料を（３２ｐ　〕−標識化され、分子的にクローン化
された腫瘍遺伝子−特異性プローブにハイブリッド化さ
せた。ドツト・プロットはソフトレーザー走査濃度計に
より定量的に評価した。ｅ−Ｏｎｅの転写活性は更によ
り詳細に、新生及び１００日目マウスの各種組織におい
て追加研究された。アガロースゲル電気泳動後にニトロ
セルロース紙上におけるブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　（Ｔｈｏｍａｓ。

ＰＮＡ８　ＵＳＡ　（１９８０）　７７：　５２０１〜
５２０５　）を用いてドツト・プロット分析により得ら
れた結果を確認し、更に、異ったｅ−ｏｎｅ関運転写物
の大きさを決定した。

より具体的には、ＲＮＡはグアニジンチオシアネート法
を用いて各種発育段階のスイス−ウェブスター（５ｗ１
ｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ　）マウスの胚胎光から単離され
た。（Ｃｏｘ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（
１９，６７）１２　：　１２０−１２９　；　Ａｄａｍ
ｓ　らのＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９８０）７４　：　３
３９９−３０４３）。

上記の如く、６〜９日目のスイス−ウェブスターマウス
の胚は、全ての胚性組織、例えば膜及びより後期の発育
段階において胎盤を発生させる細胞など、を含む全受胎
産物を表わすものである。

全てのより遅い段階においては、胚そのものが胚性組織
なしに切断された。ＲＮＡの（ポＩＪ（Ａ＋）−ＲＮＡ
の選択ハオリ：ｒ　（ｄＴ）セルロースカラム上の１サ
イクルのクロマトグラフにより行われた（　Ａｖｉｖ　
ａｎｄ　Ｌｅｄａｒ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９７２
）　６９：１４０８−１４１２　）。（ポリ（Ａ＋）Ｒ
ＮＡを水に溶解し、沸騰し、氷上で迅速に冷却し、３ｕ
ｇ　（１−５ｕｌ）を予め２０Ｘ　ＳＳＣ（Ｉ　Ｘ　Ｓ
ＳＣは０．１５　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナト
リウム）で平衡化されたニトロセルロース紙に適用し、
風乾した。８０℃で一昼夜焼いた後、これらのプロット
を、４５℃において少なくとも４時間、０．７５Ｍ　Ｎ
ａＣ１、０，０５Ｍリン酸ナトリウム（１）Ｈ７，５）
、０．００５Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．２％ＳＤＳ。

１０　ｍｇのグリシン／ｍｌ、５Ｘデンハル、）　（Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ　）の試薬（１×デンハルト試薬は各々
０．０２％のフィニル、ウシ血清アルノミン及びポリビ
ニルピロリドンである）、０．２５ｍｇの変性ニシンＤ
ＮＡ　／　ｍ　１及び５０％ホルムアミドを含有する緩
衝液中において前ハイブリッド化した。

これらのプロットヲ、４５″Ｃにおいて約加時間ＩＸＩ
Ｏ６ｃｐｍのニック−翻訳プローブ／ｍｌハイブリッド
化緩＋＆［（デンハルト試薬を１×で用いた前ハイブリ
ッド化緩衝液）を用いてハイブリッド化した。調製アガ
ロースゲル電気泳動によりベクター配列から精製された
クローン化腫瘍遺伝子断片を（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ　（
３２００Ｃｉ／　ｍｍｏ　１　）の存在下に１〜２　Ｘ
　１０９ｃ　ｐｍ　／ｕｇ　（ｉり　ＤＮＡの特別の放
射活性にまでニック−翻訳した（ａｔｇｂｙらのＪ、　
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

（１９７７）　１１３　：　２３７−２５１　）。ハイ
ブリッド化後、プロットを３回Ｉ　ｘ　ｓｓｃ中で５０
’Ｃにおいて全部で合計約２時間洗浄し、補力スクリー
ンを有する前閃光されたＸ−線フイルムに一７０℃にお
いて７２時間曝露した。

上記操作を用いて、多くの公知の腫瘍遺伝子のスクリー
ニングを行い、それらが胚に表現されるか否かを決定し
た。次の表は個々の腫瘍遺伝子及びそれらの胚細胞にお
ける表現に関する観察事項を示す。

表４ ａｂ１２°　　　Ａｂｅｌｓｏｎ白血病　　　　リン、
ｅ腫ｒａ８”ａ”’　　Ｈａｒｖｅｙ肉１挿　　　　　
赤白血病、肉腫’　　　Ｍａｌｏｎ＠ｙ肉腫　　　　肉
腫□ ｍｙｃ５゛　　　鳥類の骨髄細胞陣症　癌腫、肉腫、白
血病ｅｒｂ　　　　鳥類の赤芽球症　　　　白血病、肉
腫、肉腫６゜ ”　　　　Ｒｏｕｓ肉１座ウィルス　肉腫＾竪 ｍｙ　ｂ　”　　　鳥類の骨髄芽球症　　白血病ｆｅ、
ｇ、５ｎｙｄｅｒ−Ｔｈｅｉｌｉｎ　　　　肉腫□　　
　ネコの肉腫 ’　ＩＯ’　　　Ｓｉｍｔａｎ肉腫　　　　　肉ＩＩ！
ｌ！−髭す− １、Ｃｕｒｒａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ
、　　（１９８２）２、Ｇｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ
ｅ１ｌ　　（１９８０）　２２ニア７７−７８５　　　
　（３、Ｅｌｌｉｓ旦旦、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、（１
９８０）３６：４０８−４２０　　’ｉ４、Ｏ＠ｋａｒ
ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、’５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８
０）　　　　　　Ｅ２０７：１２２２−１２２７；　Ｊ
ｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、′ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９
８０）７７：２６５１−２６５５１（ ｍＲＮＡ産生肝 十−＋ 十＋＋ 十＋＋ 十　　　　　　＋ ＋ ＋＋ ＋＋ 、Ｅｖａ　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ（１９’８
２）２９５：１１６、　Ｇｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ　、　
、Ｍｏ’ｌ　、Ｃｅ　ｌ　ｌ　、Ｂｉｏｌ　、　（１９
８２）　２：６１７、Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、（１９
７７）Ｊｊ／１ｒｏ１．２４：６４、、Ｖｔ５ｔｅｒ　
ｅｔ　　ａｌ、、　　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　［１９８２）
７９：３６７７−３６８１ １、　Ｆｅｄｅｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　（１
９８２）、ｉｎ　ｐｒｅｓｓｌ、Ｄｅｖａｒｅ　ｅｔ　
ａｔ、、　ＰＮＡＳ　　（１９８２）７９：３１７９−
３１８２比較的高割合のｃ−ｆｏＢ関連配列が胚そのも
の及び胚性組織を含有する６、７．８及び９日目の受精
産物から調製された（ポＩＪ　（Ａ＋）−ＲＮＡ中に検
出された。胚性組織から切断された後の発背段階の胚に
は１０倍よりも低い凪表現が観察された。ｌＯ〜１８日
目からの胎盤及び胎児の胚外膜からのデータは、表現は
主としてそれらの組織にあることを示した。出生後の組
織においては、検討された全ての組織においてｃ−ｆｏ
ｅ表現を観察することができ、骨からのｆｏｇ−特異性
プローグに特に強いノ・イブリッド化が見られた。

ハイブリッド化はｃ−ａｂｔについて６．７及び９日目
の受胎産物中に見られる濃度に対比して妊娠ＩＯ０日目
おいて胚外膜および胎盤よりも胚そのものにおいて約３
倍より高い割合が見られることを示した。ｃ−ａｂｌの
胎児における表現は、出生前発育の１１日目抜に減少す
るように思われる。腫瘍遺伝子ｃ−ａｂｌは牌臓を用い
て調べられた全ての出生後のマウス組織において転写活
性を有し、胸腺の（ポＩＪ　（Ａ＋）−ＲＮＡはその他
の組織からのものよりも僅かにより強いハイブリッド化
を示す。

腫瘍遺伝子ｃ　−ｒ　ａ　ｓＨａは胚そのもの並びに胚
性組織の両者において相当な割合で、しかし出生前の発
育の全ての段階において同程度で表現されることが判明
した。新生成いはＩＯ０日目マウスの各種組織特に骨、
脳、腎臓、皮膚及び牌臓において高割合のｅ’ｒｌＬ１
１”の表現が見られた。

腫瘍遺伝子ｅ−ｍｙｅは７日目及び８日目に検出可能で
あったが、後の胚発育（１７日及び１８日）において、
はる７５９に高い割合が観察された。

腫瘍遺伝子ｃ−ｅｒｂは１３３日目最高ハイブリッド化
を有したが、６日目には全くハイブリッド化が観察され
なかった。

ｌＩ！！！瘍遺伝子ｃ−ｓｒｃはマウスの胚発胃の後半
において最高に検出され、増加が１４４日目始まり１５
５日目ピークに達し、その後次第に減少した。腫瘍遺伝
子ｃ−ｓｉｓについては、ピーク表現は７日目及び１６
６日目見られ、７日目のピークはその１也の全ての日よ
りも１．５〜３倍であり、１６６日目ピークは９〜１３
日及び１７日及び１８８日目りも１．５〜２倍高かった
。

次の研究においては、鳥類の骨髄芽球症ウィルスｍｙｂ
の推定された腫瘍遺伝子領域のヌクレオチド配列が使用
された〔前記Ｖｉｓｔｅｒらのもの（１９８２）　）。

刊行されたヌクレオチド配列を用い、畿つかの抗原性分
１Ｊ　ｊ”ペプチド配列を導き、その様にして導いた７
個のポリペプチドを合成し、潜在的に抗原性であること
を評価した。これらの７つのオリゴペプチドは本発明に
よる抗原性オリゴペプチドとして既に前記リストに示し
たものであるが、次の式を有するものである。

（１）　　ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｈｉｓ−１ｙａ−ａｓｐ−
ｇｌｎ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｇｌｕ−ｔｙｒ−ａｒｇ−１
ｙｓ−ｍｅｔ（２）　　ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｐｒ
ｏ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｈｉｓ−ｇｌｙ−ｃｙｓ−１ｅｕ
−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｓｅｒ　
−ｐｒｏ−ａｌａ−ａｒｇ （３）　　ａｓｐ−ａｓｎ−ｔｈｒ−ａｒｇ−ｔｈｒ−
ｇｅｒ−ｇｌ−ｙ−ａ８ｐ−ａｓｎ−ａｌａ−ｐｒｏ−
ｖａｌ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−１ｅｕ−ｇｌｙ−１ｕ （４）　　ｐｒｏ−ｇｉｎ−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−
１ｙｅ−ａｌａ−ｇｌｙ　−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−
ｇｌｙ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ｇｌｙ（５）　　ｍｅｔ−ａ
ｌａ−ｐｈｅ−ａｌａ−１ｓ−ａｓｎ−ｐｒｏ−ｐｒｏ
−ａｌａ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−
ａｌａ（６）　　ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｈ
ｉｓ−ｇｌｙ−ｃｙａ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｇｌ
ｕ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ａｌａ（７）　
　ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｈｉｓ−１ｙｇ−ａｓｐ−ｇｌｎ−
ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｇｌｕ−ｔｙｒ−ａｒｇ−１
ｙｓ−ｍｅｔ−ｈｉｓ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｖａ
ｌ これらのポリペプチドは常法に従って［Ｄｏｃｋｒａｙ
。

Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（１９８０
）　１　：　１６９　）キーホール笠貝（ｋｅｙｈｏｌ
ｅ　ｌｉｍｐｅｔ　）のヘモシアニンに結合し、得られ
た免疫原を使用して、完全７０インドアジユバ／トとと
もに最初の注射においてウサギを免疫化し、引続いて不
完全フロインドアジュバントを用いた注射により３〜４
週間に亘ってウサギを超免疫化させた。ウサギを６ケ月
間に亘υ繰返し採血した。抗体の産生の結果得られた７
つのオリゴペプチドのうち２つのペプチド（５及び７）
に対する抗体を更に詳細な分析のために選択した。これ
らの抗体は鳥類の骨髄芽球症ウィルスの多数のコピーを
含有する細胞系からの放射線活性標識を付された細胞リ
ゼイト及び適当な非感染細胞系からのリゼイトと反応さ
せた。抗体遡５はウィルス感染細胞系には存在するが対
照例には存在しない約５８．０００ダルトンの特別の蛋
白質である。

ポリペゾチｒ５に対する抗体は、又、ａｍｖ　により訪
発された腫瘍を有するニワトリの血漿と反応させた。上
記リゼイトで見られたものと同様な約４８，０００ダル
トンのノ々ンドが同定された。

ポリペプチド遡５に対する抗血清は、又、ｃ−ｍｙｂ遺
伝子のメツセンジャーＲＮ、Ａ転写物を表現することが
知られている（Ｇａｌｌｏ及びＷｏｎｇ−８ｔａａｌ。

Ｂｌｏｏｄ　（１９８２）　６０　：　５４５　）骨髄
性ヒト白血病細胞系（ＨＬ−６０）のリゼイトと反応さ
せた。この抗体は約９０００ダルトンの蛋白質と反応し
た。新らたに単離された骨髄性白血病細胞においてこの
抗体は正常の白血球には存在しない１４ｋｄ〜７０　ｋ
ｄの一連の蛋白質を固定する。

ｍｙｂ蛋白質の断片遡５に対するポリクローナル抗体に
ついてその正常細胞及び白血病細胞を殺す能力の試験を
行った。使用された方法は以下に示すＴｅｒａｓａｋｉ
及びＭｃＣｌｅ　ｌ　ｌ　ａｎｄ　　の文献に記載され
ている。データを次表に示す。

上記結果はｍ）ｒｂ遺伝子の表現生成物は抗体と反応し
て補体との溶解ケもたらすことができることを示す。こ
の様にｍｙｂ蛋白質は抗体との結合に利用可能な表面膜
蛋白質であるように思われる。特異的抗体が結合し、悪
性を表示する診断価値を有する蛋白質を同定することに
より、悪性細胞を同定し、処理することができる。この
実験において、用いた抗体の特異性或いは交差反応性に
ついては何等の測定も行われなかった。抗体の調製には
断片のみを用いたに過き゛ないので、より大きな結合特
異性及び結合活性を有する抗体を全蛋白質、特に膜内の
全蛋白質を用いて調製することが可能であると期待でき
るであろう。この対象抗体を使用して同−或いはその他
の決定基部位に結合する抗体を選択することが可能であ
る。

上記データは、正常なり一及びＴ−細）１＠に影響を及
はさず、補体と組合わされて各種悪性細胞に対して細胞
毒性を示す抗体を調製することがａＪ能であることを示
している。従って、この抗体は癌の治療に免疫系を実質
的に不活性化する危険を有することなく使用することが
できる。

上記結果より、腫瘍遺伝子の転写及び／又は表現生成物
を測定することによりヒト宿主中の悪性の存在を検出す
ることが可能である。を推動物を悪性に形質転換するレ
トロウィルス類又はその他の核酸源のスクリーニングを
行うことができる。

次いで、これらの核酸を用いてペプチド組成を推定し、
転写物或いはペプチド類に対する悪性細胞をスクリーニ
ングすることができ、前者の場合はハイブリッド化によ
り後者の場合は適当な受容体を用いて行うことが可能で
あるが、各棟診断検定法の任意のものを使用することが
できる。これらのベプチ１′類に対して抗体全製造する
ことができ、この抗体はラベルを付された後悪性の症状
を示すペゾチｒの存在を診断するために使用することが
できる。この連部形成性蛋白質は表面膜蛋白質としての
抗体に結合するために利用可能であることが判明した。

この抗体は悪性の存在の測定及び悪性細胞の位置の測定
の診断試薬として役立ち得る。

この抗体は又、放射性核種、毒素を宿主補体系或いはオ
ゾンエン類、或いはその他の抗体依存性溶解系統などと
組合わせて用いることにより１ｎｖＩｖｏでの腫瘍の治
療に役立ち得る。この抗体は前及び後手術系においても
用途を有し、後者においては完全な除去が行われたか或
いは転移が存在するかを測定するのに使用することがで
きる。これらの抗体を手術後に用いて切除されなかった
かもしれない腫瘍の残りを破壊することがｐＪ能である
。

以上、本発明の理解を明らかにする目的のために具体例
についてより詳細に説明したが、特許請求の範囲内にお
いて変史及び修正を行うことが可能である。

出願人代理人　　猪　　股　　　清 第１頁の続き 優先権主張　０１９８３年５月１９日■米国（ＵＳ）［
有］４９６０２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト宿主中の細胞の悪性の確率を評価する方法にお
   いて、＋１）細胞生成物に対して特異的なプローブ（該
   細胞生成物はｍＲ，ＮＡ或いはその表現生成物であり、
   該ｍＲＮＡは正常細胞を悪性に形質転換することのある
   レトロウィルスのＤＮＡ　配列に相補的である）、及び
   （２）細胞生成物を含有すると疑われた該ヒト宿主から
   の試料源を密接に合体させ、そして細胞悪性の存在を示
   すものとしての該プローブの該細胞生成物に対する結合
   程度を測定することを特徴とするヒト宿主中の細胞の悪
   性の確率を評価する方法。 ２、該試料源が該ヒト宿主からの細胞である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、該試料源が該ヒト宿主からの生理学的流体である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該ＤＮＡ配列が腫瘍遺伝子と王、Ｂす、ｖ社。 ム猥、思び、り力、亜沙、田、民、埠す、独」、■ム膿
   、棒、及び復」よりなる群から選ばれる。特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５、該プローブが抗体である、特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項或いは第４項のいずれか一項に記載の方
   法。 ６、該抗体が検知可能な信号を与えることのできるラベ
   ルで標識化されている、特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７、該プローブが該ｍＲＮＡに相補的な少なくとも１４
   個の塩基のポリヌクレオチドである、特許請求の範囲第
   １項、第２項、第３項或いは第４項のいずれか一項に記
   載の方法。 ８、＠瘍遺伝子思四に特異的な抗体よりなるプローブと
   白血病を有することが疑われたヒト宿主からの血球より
   なる細胞生成物とを合体し、そして白血病宿主の症状を
   示すものとしての該抗体の該宿主連球への結合程度を測
   定し、ヒト宿土中の白血病の確率な評価する、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ９、該抗体が１蛋白質の立体配置の一部を模倣するオリ
   ゴペゾチドに対応して産生されたものである、特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０、ヒトの悪性及び正常細胞の組合わせからヒトの悪
   性細胞を実質的に除去する方法において、該組合わせ細
   胞なレトロウィルスゲノム中に存在するＤＮＡ配列の表
   現生成物に特異的な或いは該ＤＮＡ配列に実質的に相補
   的な抗体と合体しく但し、該配列は該悪性細胞中に表面
   蛋白質として表現され、該合体は細胞毒的条件下に行わ
   れる）、そして実質的に悪性細胞のない正常細胞を単離
   することを特徴とする、ヒトの悪性及び正常細胞の組合
   わせからヒトの悪性細胞な実質的に除去する方法。 １１、該分離が神体の該細胞毒的条件としての存在下で
   起こる、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、該抗体が該細胞毒的条件として放射性核種で標識
   化されている、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、該ＤＮＡ配列が逆遺伝子である、特許請求の範囲
   第１０項、第１１項或いは第１２項のいずれか一項に記
   載の方法。 １４、ヒト腫瘍遺伝子Ｃ−堡、Ｃ−膿、　ｃ−ｒ朋１８
   ５ｃｍ、□に’１ｃｍｆｅｓ、　ｃ−ｍｙｂ、及びＣ−
   シ３の表現生成物に対して特異的な抗体。 １５、検出可能な信号を与えることのできるラベルで標
   識化された、特許請求の範囲第１４項記載の抗体。 １６、細胞毒試薬で標識化された、特許請求の範囲第１
   ４項記載の抗体。 １７、下記の群から選ばれた抗原性オリサペゾチド：５
   ｅｒ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ａｌａ。 ａｒｇ−１ｙｅ−ｍｅｔ。 ｔｈｒ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｃｙｓ−ｖａｌ−１ｙｅ−１
   １ｅｕ−１ｙｓ−１ｙｓ　。 （ｋ）　ａｓｐ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ａｒｇ−廿
   ｈ−ｖａｌ−ａｇｐ−ｔｈｒ−１ｙｓ−ｇｌｎ−ｖａｌ
   −ｇｌｙ−ｖａｌ−ｇｌｙ−１ｙｓ−ｓｅｒ−ａｌａ。 ｓｅｒ−ｔｙｒ−ａｒｇ−１ｙｓ−ｇｌｎ−ｖａｌ　。 （ｓ）　ａｒｇ−ｈｉａ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−ｇｅｒ−ｓ
   ｓｅｒ−ａｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｇｌｕ−ａｒｇ−ｇ
   ｌｕ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ　ｔ （ｔ）　ｓｅｒ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ａ：Ｌａ−
   ａａｐ−ｇｌｙ。 （ｕ）　ａｓｎ−ｇｌｎ−ｇｌｎ−ｔｈｒ−ａｒｇ−ｇ
   ｌｕ−ｐｈｅ−ｖａｌ−ｇｌｕ−１ｙｇ−ｇｌｙ−ｇｌ
   ｙ−ａｒｇ。 （ｖ）　ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｖａｎ−ｇｉｎ−１ｙｓ−ｐ
   ｒｏＪｅｕ−ｈｉｓ−ｇｌｕ−ｇｌｎ。 （ｗ）　ｐｈｅ−１ｅｕ−ａｒｇ−ｔｈｒ−ｇｌｕ−ｇ
   ｌｙ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｓｐ−ｇｌｕ−１ｙ
   ｓ−廿ｈ−１ｅｕ−１ｅｕ。 （ｙ）　ｓｅｒ−ａｌａ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｓ
   ｅｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｔｒ
   ｐ−ｓｅｒ−ｓｅｒ。 （ｃｃ）　ａｒｇ−１ｙｇ−１ｙｓ−ａｓｎ−１ｙｓ−
   １ｙｓ−１ｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−１１ｅｕ−
   ａｓｐ　ｅ （ｄｄ）　ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−
   ｓｅｒ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇ
   ｌｎ−ｇＥ−ｕｅ （ｅｅ）　ａｒｇ−ｔｈｒ−１ｅｕ−ａｓｐ−ｓｅｒ−
   ｇｌｕ−ｇｌｕ−ａｓｎ−ａｓｐ−１ｙｓ−ａｒｇ−ａ
   ｒ’ｇｅ （ｆｆ）　ｇｌｕ−ａｒｇ−ｇｉｎ−ａｒｇ−ａｒｇ−
   ａｓｎ−ｇｌｕ−１ｅｕ−１ｙｓ−１ｅｕ−ａｒｇ。 （ｉｉ）　ａｒｇ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−１ｅｕ−
   １ｙ８−ｈｉｓ。 （ｊｊ）　ｌｙｓ−ｇｌｕ−１ｙｓ−ｇｌｕ−１ｙｓ−
   １ｅｕ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−１１ｅｕ−１ｅｕ。 （ｋｋ）　ｐｒｏ−ｇｌｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｕ
   −１ｙｓ−ａｒｇ−ａｒｇ−１１ｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ
   −ｇｌｕ−ａｒｇ。 （１１）　ｌｅｕ−ｇｌｎ−ｇｌｕ−８ｅｒ−ｓｅｒ−
   １ｙｓ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｖ
   ａｌ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｓｅｒ。 （ｍｍ）　ａｓｎ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｖａｌ−１ｙｓ−
   １ｙｓ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｔｒｐ−ｔｈｒ−ｇｌｕ−（
   ｏｏ）　ａｌａ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｔｙｒ−ｐｒｏ−ａ
   ｇｎ−１ｅｕ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ｇｌｎ−ｔｈｒ−ａｒ
   ｇ。 １８、特許請求の範囲第１７項記載の抗原性オリゴペプ
   チドに対して産生された抗体。 １９、検知可能な信号を与えることのできるラベルで標
   識化された、特許請求の範囲第１８項記載の抗体。 ２０、細胞毒試薬で標識化された、特許請求の範囲第１
   ８項記載の抗体。 ２、特許請求の範囲第１７項のアミノ酸配列な１以上含
   有する約犯個までのアミノ酸残基よりなる抗原性オリゴ
   ペプチド。 ２２、約５個までのアミノ酸残基を特徴する特許請求の
   範囲第２１項記載の抗原性オリゴペプチド。 ２、特許請求の範囲第１７項、第２１項、或いは第２２
   項のいずれか一項に記載の抗原性オリゴペプチドを製造
   する方法において、適当な支持体上にオリゴペプチド式
   により与えられた順序で遂次アミノ酸カップリングを行
   うことを特徴とする上記の方法。 ２４、支持体がボリスチレ／樹脂支持体よりなる、特許
   請求の範囲第ｎ項記載の方法。 ２５、ボリスチレノ樹脂支持体がクロロメチル化樹脂、
   ヒドロキノメチル樹脂及びベンズヒドリルアミ／樹脂か
   ら選ばれる、特許請求の範囲第あ項記載の方法。 ２６、該オリゴペプチドが約２０個までのアミノ酸を含
   有する特許請求の範囲第１７項、第２１項或いは第四項
   のいずれか一項に記載の抗原性オリ２ペフｆＦ’ノ［遣
   方法において、そのオリゴペプチド構造のアミノ酸配列
   を暗号化する二本鎖ＤＮＡ配列ケ合成的に調製し、この
   二本鎖ＤＮＡをクロー　＝　ノブビヒクル或いはベクタ
   ー中の適当な部位に挿入して組換えＤＮＡ分子を形成さ
   せ、そして適当な宿主馨該組換えＤＮＡ分子で形質転換
   してそのオリゴペプチドの表現な得ることを特徴とする
   上記の方法。 ・２、特許請求の範囲第１７項記載の抗原性オリゴペプ
   チドの抗体形成誘発における利用。 ２８、悪性細胞を有する疑いのあるヒト宿主治療用の、
   正常細胞内に悪性を誘発することのできるレトロウィル
   スゲノムの部分である遺伝子或いは該レトロウィルスゲ
   ノムの該遺伝子に対して実質的に相補的である遺伝子の
   表現生成物に対する抗体。