JPS59167549A - 新規抗原およびそれらを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、口てい病ウィルス（ＦＭＤＶ）に対する免役
を刺激するのに有効な新規抗原性ポリペプチド、それら
の製造方法、該抗原を含有するワクチンおよび抗原およ
びワクチンをＦＭＤの予防に用いることに関する。

口てい病（ＦＭＤ）は家畜のもつとも病原性のあるそし
て伝染性のある病気である。この病気は世界のいくつか
の地力での風土病で、アフリカ、アジアおよび南アメリ
カの多くの国に見出た′され、免役計画で稙々の程度に
防〈されている。この病気のない国では、厳隼な輸入お
よび検疫上の規制か行なわれ、病気が発生した時にはと
殺される。

Ｆｆｖ＋ＤＶは、Ｐｉｃｏｒｎａｕｉｒｉｄａｅ科のＡ
ｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ属に分類されるＲＮＡ　（リボ核
酸）ウィルスである。

Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｐ、Ｄｌ等、■ｎｔｅｒｕｉｒｏｌｏ
ｇｙ、　１０．１６５−１８０、１９７８をみよ。ＦＭ
ＤＶには７柚の血清型が既知である。つまり、ヨーロッ
パ血清型Ａ、０およびＣ１南アフリカ循５ＡＴ１．５Ａ
Ｔ２および５ＡＴ３、およびアジア１型である。これら
の血清型中には、いくつかの遺伝学的に異なるサプクイ
ブが存在する。

玩在、Ｆ’ＭＤの予防には不活性化されたウィルス全粒
子が用いられている。

口てい病は一重釦のＲＮＡおよび４個のポリペプチドっ
まりＶＰ□、ｖｉ１■３および■４を含有し、これらの
ペプチドがウィルスのキャブジッド蛋白質を形成する。

ｖｐ工と称する蛋白質はこの分野のｔｄｊ究者によりＶ
Ｐ３、■ＰＴｈｒおよびＶＰ、などとも言われる（　Ｂ
ａｃｈｒａｃｈ、　Ｈ，Ｌ、等、Ｊ、■ｍｍｕｎｏｌｏ
ｇ７゜１１５＋　１ａ３６−１６４１　＋　１９７５；
　Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒ、　Ｋ、等、Ｂｉｏｃｈｓｍ、
Ｂｉｏｐｌｘｙｓ、Ｒｅｓ、Ｏｏｍｍ、、　　８５．１
６４０−１６４５＋　１９７８　；　Ｂａｃｈｒａｃｈ
、　Ｈ，Ｌ、　ｅ、工ｎｔｅｒｕｉｒｏｌｏｇｙ。

１２、６５−７２．１９７９　）。ポリペプチドｖＰ□
、ＶＰ２およびＶＰ３のそれぞれの分子〜は約２６．０
０１０、他力ｖｐ４の分子量は約８，０００である。そ
して、ウィルス中にはそれぞれの絢６０コピーが存在す
ると考えられている。ウィルスＲＮＡから晶羽ｄ尺され
る他のポリペプチドも恐らくウィルスの複製にある役割
を有しているのであろう。

一−ｉｆＱ　ＦＭＤＶ　ＲＮ４　ハ約２．６　×１０６
１／）　分子ｉｔ　テ約８０００ニュクレオチドに相当
する。そして、ポリペプチドへの翻訳およびＲＮＡ合成
の双方のために＠型として作用するプラスの極性を有す
る。最初の翻訳生成物のひとつはＰ８８と称する蛋白質
であり、これは切ｖ）１されてキャブジッド蛋白質ＶＰ
工からｖｐ、を与える。

上記のようにキャブジッド蛋白質ｖｐ□は、ウィルスを
トリプシン処理した時に切断されて、ＦＭＤＶの大部分
の株に４６いて感染性は著しく減少する−　（Ｗｉｌｄ
、　Ｔ、Ｆ６％よびＢｒｏｗｎ、　Ｆ、、　、Ｔ、　Ｇ
ｅｎ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　　１．　２４７　−　２５０．　
１９６７　　）　　。　　ト　リ　ゾシ　ン処理はまた
、ウィルスかＤＬ体生首を刺隊する能力を減少させる。

そして、ＶＰ工は、ＦＭＤＶによる感染に対する効釆問
防票をおこしうる１次的免役原となる。それで、ウィル
ス粒子より分けたＶＰ□は中オ目尻体を生成し、ウィル
スに対する効呆的防京を誘免する（　Ｌａｐｏｒｔｅ、
　Ｊ、等、Ｃ，ＲｏＡｃａｄ、、Ｓｃ。

Ｐａｒｉｓ、　ｔ、　２７６５ｅｒｉｅＤ＋　３３９９
−３４０１．１９７３；Ｂａｃｈｒａｃｈ、Ｊ　Ｌｏ等
、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１ｏｇｙ、　１１５．１６３６−１
６４１．１９７５　）。より安全なワクチンをうるため
に、天然に存在するＢ’ＭＤＶキャブジッド蛋白質、特
に■Ｐｌを分けることは、力えい不活化条件の使用が必
要とノＺす、最市の免役原性を保ち有効なワクチンを住
良するのに不利であるとされた。

より最近になって、ｖＰよのある部分か、ＦＭＤＶのサ
ブタイプでの抗原性の変動を与えるのに升−吸なことが
分った。さらに、と粁らの領域のある音１５分に相当す
る短かいペプチドはそれだけで、ＦＭＤＶに対する免＆
）ＪＡとして有効なことか分った（たとヘハ、：ｒ、Ｌ
、　Ｂｉｔｔｌｅ　寿、Ｎａｔｌｌｒ’９．１９８２．
２９８．３０−６６　）。

今や、治用な免役原性を有するかまたは、それらの組込
まれている大型ペフ０チドまたはボリベフ０チドにそう
した性質を与える、いくつかの新規ペプチドが同定され
たのである。

抛１の特徴として、本発明は血清型Ａ２４０ｒｕｚｅｉ
ｒｏ、　０３工ｎｄａｉａｌまたは０１ＢＦＳより分離
されたＶＰ１蛋白員の抗原サイトのアミノ酸配夕１」を
含有することを％似とする新規ペプチドを提供する。

本発明の範囲に含まれるのは、少なくとも６１１句のア
ミノ酸を含有するペプチドのフラグメントおよび該ペプ
チドまたはフラグメントの誘導体である。

特に、本発明は、第４図に示す番号で、４２−６１、７
９−８５、９５−１０２、１２９−１６０（または１６
２）、１７０−１７６および１９３−２０４（０１２０
９）に相当する領域およびそれらの７ラグメントおよび
誘導体である。

これらのベラ０チドのうちで、７９−８５．１２９−１
６０（または１６２）および１９３−２０４に相当する
領域か拘利である。

４２−６１および１２９−１６０　（−１：たは１６２
）フラグメントおよびその誘導体に相当するペプチドの
うちで、４２−５１．５６−６１．１２９−１４７．１
５１−Ｌ６０および１４３−１６２に相当するフラグメ
ントおよびそれらの誘導体か特に問題となる。

本発明範囲内の新規ペプチドには、たとへはっきりもの
がある。

（ａ）　　ＶＶＲＨｇＧＮ　　　　　　　　　　　（以
下ペプチド１と記す）（１））　　ＡＶＴＨＴＧＫ　　
　　　　　　　　　（ペプチド２）（ｃｌ　　ＡＶＫ’
ＨＥＲＤ　　　　　　　　　　　（ペプチド３）（ｃｌ
）　　ＶＹＮＧＴＳＫＹＡＶＧＧＳＧＲＲ（ペプチド４
）（ｅｌ　　　ＴＹＴＧＴＴＡＹＴＡＳＡＲＲ（ペプチ
ド５）（ｆ）　　　ＶＹＮＧＥＯＲＹＳＲＮＡＶＰＮＬ
Ｒ（ペラ０チド６）（ｇ）　　　ＧＳＬＡＡＲＶＶＫＱ
　　　　　　　　　（ペプチド７）（ｈｌ　　　Ａ…Ｌ
ＡＡＡＨＡＲＨ（ベラ０ナト８）（１）　　　ｖＬｐｖ
Ｑ、ｐＴｏＤＲｕ　　　　　　　　　（ペラ０テド９）
（ｊｌ　　　ＩＱ８ＬＳＰＴＨＶ工　　　　　　　　（
ペブ′テド１０）（ｋｌ　　ＶＨＶＳＧＮＱＨＴＬ　　
　　　　　　　（ペラ０チド１ｌ）（１）　　　Ｖ）Ｉ
ＫＤＳ工（ペプチド１２）（ｍ）　　ＶＰＳ）ＩＴＬ　
　　　　　　　　　　　（ペラ０テド１６）（ｎ）　　
　ＥＳＡＬＬＮＴＳ　　　　　　　　　　（ペプチド１
４）（ｏ）　　ＶＳＡＬＤＮ、ＴＡ　　　　　　　　　
　（ペプチド１５）（１）ｌ　　　工ＫＡＤＡ工Ｈ（ペ
プチド１６）（（１１ＶＫＡＥＴＩＴ　　　　　　　　
　　　（ペプチド１７）（ｒ）　　　ＧＳＧＲＲＧＤＭ
ＧＥＩＬＡＡＲＶＶＫＱＬＰ　　（ペラ０チド１８）（
ｅ）　　ＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ　　　
（べ１−ｙ−ド１９）（ｔ）　　ＡＳＡＲＲＧＤＬＡＨ
ＬＡＡＡＨＡＲ（ベラ０チド２０）（ｕ）　　　ＡＲＲ
ＧＤＬＡＨＬＡＡＡＨＡＲＨＬＰ　　　（ペプチド２１
）（ｖ）　　　ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ、ＫＶＡＲ
ＴＬＰ　　（ベニ？チド２２）（ｗ）　　’ＶＬＰＶＱ
ＰＴＧＤＲＨＫＱＰＬ工　　　　（ペプチド２６）およ
び少なくとも６個のアミノ酸を含有するそれらのフラグ
メントおよび該ペプチドまたはフラグメントの誘導体Ｉ
ノ）ある。

ここでのペプチドおよびポリペプチドを形成するアミノ
酸は、それぞれ、つき０１字で表わす。

Ａ　アラニン Ｃシスティン Ｄ　アスパラギン酸 Ｅ　グルタミンＩＶ Ｆ　フェニルアラニン Ｇ　グリシン Ｈヒスチジン エ　インロイシン Ｋ　リジン Ｌ　ロイシン Ｍ　メチオニン Ｎ　アスパラギン 酸 ｑ　グルタミン Ｒアルギニン Ｓ　セリン Ｔ　スレオニン Ｖ　バリン Ｗ　　　　ト　リ　フ０　ト　フ　ァ　ンＹ　チロシン 本明細薔で使用する１フラダメント“の用語は、上記定
義のペプチドの配列内に見出だされるフラグメント（た
とえは、該ペプチドの部分配列を含む）の配列を有する
、少なくとも６個のアミノ酸乞含有するペプチドのすべ
てをさす。

上Ｒｃ：　定ｉ４ｉのペプチドのうちで、ペプチド１か
ら９まで、およびそれらのペプチドの７ラグメントが有
利である。

不発明のペプチドはそれら自身、Ｆ’ＭＤＶへのワクチ
ン処理に用いるための抗原に用いうる。しかし、抗原と
して用いる時に、本発明のペラ０チドを、適当な担体、
なるべくはポリペプチドたとえは十皿清アルゾミン（Ｂ
ＳＡ）またはキーホールリンベントヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）と結合さすのか有利である。

本発明のさらに別の％ｔｋとして、Ｊ：記定義のような
ペプチドを、それに対する担体と結合さすことを含むこ
とを％徴とするＦＭＤＶに対する抗原を提供する。

本究明のペプチドは、また、より大型のペプチドおよび
ボリペブ′チドに南Δζすな性質を付与するのにも４（
用である。それで本発明のペラ０チドば、より大型のペ
ラ０チドまたはポリペプチド申に存在しつる。このよう
な犬１ｒｌ￥！ペプチドは、ひとつたけまたはいくつか
の追加のアミノ融残基を含有してよいし寸たばより多く
のアミン版残丞を言有しうる。

このような大型のペラ０チドまたはボリペフ０チドはた
とえね、２個またはそれ以上の本発明のペプチドまたは
ポリペプチドを、直接にかまたは１１１ｋ１１または１
個より多くの追加のアミノｒＭ残基をｐｌ＃由して結−
８君゛冶しうる。このような大型のペプチドまたはポリ
ペプチドはＩＩ’ＩｔｌｌＤＶからのキャブジッド蛋白
質のずべてまたは部分、特にＶＰｌを、それたけか、ま
たは、たとえはＶＰ２、ＶＰ３、ｖｐ４またはｐ８８を
追加して含有する大型の蛋白質の部分として含有する大
型蛋白質としであるＶＰを含有しうる。ポリペプチドは
、■Ｐ１蛋白寅のすべてまたは部分またはそれに類似す
る、類似の抗原特性を有するＦＭ己列を含有するのが有
利である。

それで、不発明は別の特徴として、ＦｌφＤＶに対し免
没原的で、部分配列として上ｔ１ル定敦のようなベン０
チドまたは上記定襲のようなそれのフラグメントビ含有
することを特徴とするペプチドまたはポリペプチドを提
供する。

本発明のペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまた
はポリペプチドを製造するだめのこの方面の技術で知ら
れている方法のいずれかで製造しう　る。

そｉｔで、第１の方法として、個々のアミノ酸、小△ヱ
のベン０チド、またはそれらの組合わせより、歳知の方
法により、ペア′チドまたはボリペフ０チドを合成日９
に製造しうる。

カ２の方法として、大型のポリペプチドまたは蛋白質重
切断し、そして場合によっつり型してペプチドおよびポ
リペプチドをうろことができる。

さらに、不明細壺に参考文献として引用する、Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　
Ｎｏ、Ｑ［］４８４５５中にＦＭＤＶ抗涼に特゛に関し
て記載したような遺伝子工学により製造しつる。

つ寸り本発明は、別の萄・徴として、本発明のペプチド
またはポリペプチドの製造法を提供する。

（ａＪ　　（１）不発明のペフ゛チドをコードする二ｆ
ｉ　９　ＤＮＡ配列または本発明のペプチドをコードす
る配夕υを置市する二氷飼ｉＱ　ＤムＡ配タリと９（２
）クロン化ビヒクルのＤＬＵＡ配列と、（３）ＤＮＡの
発現のためのイニシエーターおよびターミネータ−を含
有する、組換えＬＩＮＡで宿主細胞を形りば転換し； （ｂ）　　ＦＭＤベゾチドを発現するに適当な条件で宿
主細胞を培養し； （（’）　　細ノ地培養ｑ＞ｉビ尿取し；そして（ＣＬ
）　　該ペプチドを分ける ことの、これらの方法は包含する。

さらに、あとから定義するよなイニシエーター配列含七
オペロン１．Ｉ（よひ、本発明のペプチドを夫質的にコ
ードするニュクレオチド配列またはそのような配列を含
有するニュクレオチドを、オペロンのイニシエーター配
列とターミネータ−配列とのあいだに含有する組換えＤ
ＮＡ分子を（λ供する。

本会明はまた、イニシェークー配列およびターミネータ
−配列を有するオペロン、および、オペロンのイニシエ
ーター配列とターミネータ−配列とのあいたに仁政する
、不発明のペプチドを笑質的にコードするニュクレオチ
ド配列を含有する、不発明のペプチドのすべてまたは部
分を発現しうる、組換えＤＮＡクロン化ビヒクルを提供
する。

本発明はさらに別の特徴として、上記定義のような組換
えＤＮＡクロン化ビヒクルおよび（また（・ま）組換え
ＤｌｌＡを含有する宿主細胞を提供する。

本発明は、また、前記定義のような組換え′ＤＮＡクロ
ン化ビヒクルで転換された宿主細胞により注意された、
前記定義のようなりＮＡ分子の発現により製造される本
発明のペプチドを含有する、哺乳ｍ＊においてＦＭＤＶ
に対する抗体産生を刺激するための抗原を提供する。

本発明は、また、 （ａ）　　ＦＭＤＶ　−ｇ鎖ＲＩＪＡを分離し；（ｂ）
　　このｌｌ’ｌφＤＡ　ＲＮＡの一重鎖に相補的な第
一の一里釦ＤＮＡ順とし； （Ｃ）　　この第一の−Ｍ　ａＤＮＡ鎖に相補的で水素
結合した第２の一重鎖り矧へを１周製し、二重鎖ＤＮＡ
とすることを恒常する、本発明のペプチドを実質的にコ
ードするｌ）Ｎへ分子の製造方法を提供する。

そのように製昂した二重鎖ＤＮＡをクロン化ビヒクルに
挿入する。つまり、クロン化ビヒクル？制眠エンドニュ
クレアーゼで消化し、クロン化ビヒクルの末端をＤＮＡ
分子に結合させ組換えクロン化ビヒクルとする。

本明卸１１中に用いる用胎はつきの意味をン角する。

ニュクレオテド：据’Ｈｌ１分（ペントース）、ホスフ
ェートおよび室糸惟へテロ壌塩基を含凋するＤＮＡまた
はＲＮＡ単位。塩基（・工、クリコシド炭糸（ペントー
スの１′炭糸）を経由して糖に結合し、そして塩基がニ
ュクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ塩基ハ、アデ
ニン（Ａ）　、グアニン（Ｇ）、シトシン（０）および
チミン（Ｔ）である。４イ固のＲＮＡ塩基は、ハ、Ｇ、
、Ｏおよびウラシル（Ｕ）である。

組換えＤＮＡ　：天然に存在しない第一の配列を第二の
配列とあわせて含有する、少なくとも２′）ｉの二重鎖
ＤＮＡニュクレオチド配列を名南するハイブリドニ重鎖
ＤＮＡ配夕１」。

クロン化ビヒクル：単細胞微生寂・中に入れた時に複製
されうる非クロモシーム性二重鎖ＤＮＡシラスミド：ウ
ィルスまたは細凶に由来するクロン化ビヒクル。

偽造遺伝子：特定のボリベフ′チドに特徴的なアミノ配
列をコードするＤＮＡニュクレオチド゛配列。

イニシエーター配列：転写または翻訳の開始をｊｌ？ｊ
１（ｊ　するＤＮＡニュクレオチド配列。

ターミイ・−ター配列：転写または翻訳を１苧止させる
ＤＮＡニュクレオテドの自己夕Ｊ。

転写：メツセンシャ−１（ＮＡを形成するＩＪＮＡ配列
に沿ってＲＮＡポリメラーゼを移動させる過程闘訳：メ
ッセンジャーＲＮＡよりポリペプチドを製造するための
課程。

オペロンニイニシェークー配列が先行しそしてターミ４
−ター配列が続く、ポリペプチド発現のための構造遺伝
子。

光現：構蹟遺伝子よりポリペプチドを産生ずることに含
まれる課程。

本発明を図面によりさらに説明する。

第１図において、配列に用いるフラグメントか１ト丸で
示しである。ここで、　　・　」はデベルさ「 れた末端を示１′。ラベルされた末端を生成するための
用いた制限耐糸も示しである。制限酵素のサイトは、つ
きのように略記する。Ａ　、　Ａｖａｉｌ　；　Ｂ　。

ＢａｍＨＩ　；　Ｊ　Ｅｃｏｌ（Ｉ　；　Ｇ、　Ｂｇｌ
　ｌｌ　；　Ｈ，Ｈｌｎｄｌｌｌ　；ｓＡ、　Ｓｍａ　
Ｉ；　Ｐ、　Ｐｓｔ　Ｉ；　（Ｐ）、　Ｐｓｔｌと予想
されるが、わつかムエキソニュクレアーゼの混入で失わ
れたらしい；　Ｒ＋　Ｍｓａｌ　＋　ｂ　＋　ｂｓ　ｔ
　ｌ　ｏ各領域でコードされるポリペプチドも示しであ
る。

第２図に、（ａｌ　Ａ２４　ｃｒｕｚｅｌｒｏ、　（ｂ
）　Ｃ３工ｎｄａｉａｌ　。

（Ｃ）　ＱＩＢ１１’ＳのＶＰ　（節ｋに対するニュク
レオチドおよび示されるアミノ飽配列が示しである。

（ａ）　Ａ、、、におけるＶＰｉの最初の１１のコドン
は失なわれているとした。

（’ｂ）　ｐＦｏ、　３０１プラスミド中で、＊ＣはＴ
として絖まれたか、親シラスミドｐＦｃ　３ｒ　３　　
中ではＣと仮定される。

（Ｃ）アンダーラインさ才した閂己夕１４　ｆｌ−、ｐ
Ｂ’０１℃３５１　およびｐＦｏ１ｒ２　　の両刃のフ
０ラスミドに由来する。

十〇はｐＦＱ　ｌｒ　２に由来し、ｐＢ　０１　ｔＪ　
５１で＆ｉ　Ｔによりおきかえられ、メチオニン残端を
示すであろう。

第６図で％　（ａｌ　Ａｌ１　ｒ　Ａ２４およびＡ１　
Ｏｒ　（ｂｌ　Ａ１　ｏ　ｌ　０３および０ＩＢＦＳ、
　（ｃ）　Ｏ□ＢＦＳおよびＯＩＫのあいたのアミン版
配列が比較しである。アミノ酸は相同性が最大になるよ
うに配列されて、できるたけ少なくしたか、−で示すギ
ャップか尋人しである。ＶＰｌ甲の谷位置は、ギャップ
を含めて１から２１６まで査れるか、ｐＦｏ□ｔ３５１
中にはメチオニンが示唆される。

第４図でＡ１０”Ｉ　Ｃ３工ｎｄａｉａｌおよび０ＩＢ
ＦＳの変動性か示しである。（ａＣ）はＡ□。、Ｃ３ま
たは０１の親水性でプロットしてあり、（ｄ）は免役原
性について調べたペプチドを緑葉に表現しである。ブロ
ットの谷邪は、各点か、５個の各群の中火（つまり６査
目）馨衣わずとして、配夕ＩＪ中の５個の位置のスコア
を合わせてつくり出したもので゛ある。変動性・ノ）プ
ロット（−）は、それぞれの位置についての同じ比較の
すべてについて０のスコアを用い、それぞれの位置の異
なる比較については１のスコアを用いている。それで、
５つの位置の谷位置については最大スコア６七なり、各
杵については１５となる。−６，４から＋６．０までの
範囲の、各アミ位ｔθのそれぞれの硅について、最大コ
スア１５および最小スコアー１７を与える。２つの７０
ロツトを廉ぺるために、変動性プロットに用いた第６１
囚中の相応する配夕１」中のギヤツノに対応して親水性
プロットに尋人した。主な親水性ビークには１がら５の
番号を付した。

（ｄＪ　　　　　免疫原１ゴペゾチド、−−−−一非免
投原性ペフ”チド。トリフ０シンで生ずる（Ａ、Ｂ）ペ
プチド；マウス和下崩、フ０ロチアーゼで生ずる（０．
Ｄ）チド（Ｂｒｔｔ（ｅ　ｃ＋　ｃＬｌ、、　＋９９２
　）。

不発明のさらに別の％歓をつきに笑施例で示す。

これらはＲ発明のためのもので、不発「力を制限するわ
げでない。

？１１１ （ａｌ　　ｎ’ｙｌＤＶ　ＲＮＡのＹ　製Ｅａｇｌｅ　
４地中で゛調製したての１イ’ＭＤＶタイグＡ２４０ｒ
ｕｚｅｉｒｏの約１Ｑｍｔ、を、約１０””Ｋ２１　ｆ
ｊｉ胞単７Ｍを含冶するＲＯｕｘ　Ｑ＜んのそれぞれに
加えた。培地中で３０分おだやかに撮ってから培地をぐ
いしやして除ｇ、２Ｑｍｂ苑の新しいｉ＠地をそれぞれ
のＯ・んにカロえた。ウィルスの感染で帷胞牟層か破撤
されなら（６−４時間）、培地をけ、いしやして除き、
１２．０００χＩで１５分間４°Ｃで遠心して府ｊ廊残
脣を除いた。４℃で１時間９０，０００　Ｘ、９で遠心
してウィルスをベレット状にした。つ龍緩衝液（１０ｍ
ル１トリスＨ○ｌ　（ｐＨ７゜５　）　１５０ｍＭ　　
封ａｃｌおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミノ
テトラ酢酸）の２　ｍｌ中にウィルスベレットを再懸濁
させ、懸濁液は、約５，０００　ｘｙで２０℃で１０分
遠心して澄明化した。澄明化上清はナトリウムドデシル
スルフニー　）　（ＢＤＳ）中１％ｗ／ｖとし、ＴＮ　
ｘｍ’ｔｆｒｉｉ＆、　（１００ｍＭ）リス−Ｈ０Ｉ、
　ｐｉ−ｉ　７．ｔ５　、’ｌＱ［１ｍＭ　ＮａＣ！ｌ
　）中にあらかじめ形成させたクラゾエント（スクロー
ス１５−４５％ｗ／ｖ）に加えた。そして１００．Ｏ［
］Ｏｘ、９で１０℃で２１１．ＩｍＪ遠心した。１ｍｌ
宛の分画な２６０　ｎｕｌｌで゛調べ、ウィルスを冨肩
する分画を寺各煽テのフェノール：りロロポルム（１：
　１　）テ抽出し、水相を２′８量のエタノールを加え
、マイナス２０００に１夜放直し、沈殿させた。ＲＮＡ
沈殿物を、４°０で３０分で５，０００　ｘｉで埋めし
て］−（ＮＡを沈殿させた。上７４をすて、ベレットを
除水し、０５　）ｎｅ　の　ＴＮＥＳ　　Ｒｍｉｊ　＆
　　（１０］コｑＭ　　Ｔｒｉ　θ　−）４０１　　ρ
１」７．６．１５Ｑ　ｍＭ　ＮａＵ土、１ｎ＋Ｍ　ＥＤ
ＴＡおよび０．２％Ｗ／ｖＳＵ−）Ｓ）に浴ｍした。Ｒ
−ｉ　’Ｒ欠は、あらかじめ生成させたスクロースダラ
シエン）　（ＴＮＥｓ　中５から２５％）に加え、２（
、Ｊ℃で６．５時間、２００，０００ｘ９で遠心した。

３５８で洗牌するＲＩＩＩＡ含有分画（０，５ｍｌ　）
　集メ、フェノール−クロロホルムで１度抽出し、エタ
ノール沈殿、揚酢丹１することは、上孔ウィルスの場合
と同様である。生ずる浴液はエタノール沈殿させ、最後
に丙蒸留水の０．０５ｍ１に８浴解した。俗液をエタノ
ール沈殿させ、鼓佐に２回蒸留水の０．０５廐に溶解さ
せた。

同様に、ＦＭＤＶタイ７１″Ｃ５工ｒｉｄａｉａｌおよ
び０ＩＢＦ’ＳよりもＦＭＤＶ　ＲＮＡを得た。

（ｂ）　　二重知相袖的ＤＩＪＡ　（ＤＩ９ｃＤＮＡ　
）の合成ＦｔｖＤｖ　ＲＮＡ　（１０ｐ＆　’）と、オ
リゴ−ｄＴ（１２−１８）グライーｑ　−（Ｑ、５　μ
ｊ９　；　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）かまたは牛胸腺ＤＮＡ　Ｉ）ＮＡ　ａ　ｅｅＩ消
化物とを、０゜４ｍＭジチオスレイトール３　ｍＭ　Ｉ
Ａｇ、＋１２．５ＱｍＭ　）リス−Ｊ（Ｃ１、ｐｋｉ８
．１．１４８ｍＭ　Ｎａ１ｌ　、０，２１１１Ｍ　ｄＡ
ＴＰ（２，５０ｉ／ｍモ／Ｌ／　／　”　ｐ　／　ｄＡ
ＴＰＸＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｅｎｔｒｅ、　Ａ
ｍｅｒｓｈａｍより）、０．２　ｍＭ　　ｄＴＴＰ　、
　　０．２ｍＭ　ｄＯＴＰ　、　０．２　ｍＰ　ｄＧＴ
Ｐ　、　４　ｍＭ　Ｎａ４Ｐ２Ｏ７および２８率位ＡＭ
Ｖ逆転写酵％　（Ｄｒ、’Ｊ、　Ｂｅａｒｄ、　Ｌｉｆ
ｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｌｏｒｉｄａ捷供）官有最終
容量１００μｍ中で６０６Ｃで２時間消化した。ＥＤＴ
Ａ　（２ＱｍＭ　）およびＳＤＳ　（０，２％ｗ／ｖ）
を加え反応を止めた。反応停止混合物の試Ｑ　（２％　
）を、２，５ｃｍＤＥ８１ベーパーディスク（Ｗｈａｔ
ｍａｎ　）にスポットした。

５％（ｗ／ｖ）　Ｎａ２ＨＰＯ４申で十分に洗い、ｋフ
悄水で短時間（５分）抗い、乾燥し、シンチレーション
カウントした。このつり、作で、約２μｙのＣＤＮＡの
葉状し・をイ（１′だ。反応？Ｊ、゛１合物の残りはフ
ェノールークＯロホルム＃ｉｌ　ｆ：ＨＬ　、そして、
エタノール沈殿させたか、これは上記のようである。し
っ）シ、エタノール控加の前に、０．２Ｈ余度となるよ
うに、酢酸ナトリウムをｊＪＩＪえた。乾燥ベレットは
１００ρＩＵ、　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨＫ　俗解し、２０分
７０°Ｃでインキュベートし、鋳ハリ、つまり、ＦＭＤ
ＶパＮＡを除いた。

イ合欣は酔り゛中第１」シ、ビード−でフェノール−ク
ロロホルムのカラム（１００ｘ　１５＋ｕ＋）を通して
分解ＲＮＡよりｃＤＮＡを分りた。乾・譲ベレットな、
５１　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ｋ［；ｌ　Ｐｒ１８゜６．２
０　ｍＭジチオスレイトール、　ｊ　ＩＪｕ＋Ｍ　Ｍｇ
Ｏユ２、［１，４ｍＭ　ｄＯＴＰ　、　　Ｑ、４　ｍＭ
ｄｏＴｐ　１０．４　ｍＭ　（ｉＡＴＰ　（５，５ａ１
／／Ｉ１１ｍｏ１ｅ７３２Ｐ／ｄＡＴＰ；上（ａ（ｉｉ
Ｏｃｋｌ、ｔｌｌｉｃａｌ　　ＣＣ＋ｎ　ｔｒ６１　、
　　　Ａｍｅｒｅｈａｍ　　）　　、　　Ｑ　、４　　
ｍＭｄＴＴＰおよび６６単位ＡＭＶ逆転与酪索中再懸濁
させて９０鳳の取終芥菫とした。４５°Ｃで４時１−’
ｄｉインキュベートしてからＥＤＴＡ　（２０ｍＭ）お
よび５ＤＳ（０，２％／ｖ　）を加えて反応を止めた。

混合９り１はフェノール−クロロホルム抽出したあト、
Ｎａ１ｌを加えて０．２Ｍとし、マイナス２０°Ｃで１
夜をかけ、２容重倍のエタノールを加え沈殿させた。乾
燥ペレットは、５Ｑ　ｍＭ　Ｎａ１ｌ、Ｑ、　１　％　
Ｗ／Ｖ　ＳＤＳの２００μｌに栴＠濁させ、５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｃ）ｊＱＱ　カラムを通した。これは、前記し
たようである。浴出されたピークは、２００μｙのクリ
コーデン担体の存在でエタノール沈殿させた。ＤＥ８１
ペーパーディスク分析を上記のように実施した。このこ
とから、二厘知台成は、理論値の６０％であることか分
った。エタノール沈殿よりの乾燥ベレットは、’：ｉ：
Ｌ　後側ａ　（２５ｍＭ　ｐＨ４，６酢ｆｈ　Ｇｆ　（
ｋｉ液、１５０た。残り（試料Ｂ）は５単位のＳ□ニュ
クレアーゼ（Ｓｉｇｍａ社）と６７°Ｃで３０分インキ
ュベートした。フェノール−クロロホルムで抽出して反
応を止め、水イ・−をエタノールで沈殿させた。乾燥さ
ぜたベレットは２０／ｌＬｔのり、ｏに置部ｒ＝させた
。二車％）３　ＣＤＮＡ中の猿を除（Ｓ１ニユクレアー
セ゛処理の効果をみるためにβ武制ＡおよびＢの少知（
２矛）をｉｏｏ’ｃで６分加熱し、６０’Ｃに冷却し種
々の時ＩＮＪ（Ｄ、θ、２５．１および１４時１ｄ１）
に６単位のＳｌを加え、３７°Ｃで６０分インキュベー
ションした。８１に対する抵抗性は、上記のようにＤ’
ｍ８１ペーパーディスクパインディングで分ソ「シた。

そのボ古朱６０°Ｃにすぐに冷却してからＳｌとインキ
ュベーションした時に、試料Ａの５６％以上かＳ１消化
に抵ｖＬ性で、他方試料Ｂの２％以下か抵仇１」二であ
る。試料＊　６００ｃとしてから０．２５１、Ｔ間抜に
Ｓｌを加えると、これらの数字は８１％および１５％と
なった。それで第２の鎖合成後に存在する環は、最初の
８１処理で効果的に切れることｆＪ）分った。

（ｃ）　　”ｙ″ラスミドよび二爪鉛ｃＤＮＡ　（ｄｓ
　ｃＤＮＡ　）のホモ斥台体によるテーリング （１）　　ベクターの（ＩＧ−テーリング　ベクタ一つ
まりプラスミドｐＡＴ１５３の約７μｇは、酵素の供給
者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）の推薦する条件でＰｓｔ
１エンドニュクレアーセ゛で処理した。反応は酢酸ナト
リウムを０．６Ｍを加えて反応を止め、エタノール沈殿
させる。乾燥ベレットは１００μｍのｄＧ、−７−−！
／ングｅａｒＪＩ数（１００ｍＭのカニ７　シルｐ　−
４（Ｃ１、ｐｉ−１７，１）、５　ｍＭｌｙ−ｇ０１２
．５０　ｌ’ｊｊ／ｍｌ牛皿清アルブミ７’ｊｃｊよひ
１　ｍＭ　ａＧＴＰ　（２Ｑ　ＯｍＣｉ／３−”ｈ／ｄ
ＧＴＰ／ｍ　ｍｏｌｅ）甲に得意７４（Ｉさせた。これ
に、２μｍ（６８単位）のターミナルトラスフエラーセ
゛（ＴＴ）を加え、３７°Ｃでインキュベートした。２
．５．５および１０分［１」］に試料を採取した。それ
ぞれについて水冷しそしてＥＤＴＡを２ＱｍＭを７ｊＤ
えて反応を止めた。それぞれの５μＩＫ科のトリクロル
酢酸沈殿を分析すると、２．５分佐にはもにや３Ｈｃｌ
ＧＭＰは取り込まれない。

ここぽでのホモ重合体テールの平均長は２５ニユクレオ
チドである。２．５分餓科の残りはＴＥｉ側敢（１Ｑ　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈｃｌｐｉ−４８，Ｑ　、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）で布釈し１００μｍとした。等容ｍのＴＥ
−飽和フ工ノールで１度抽出した。水相はエーテルで４
度抽出した。酢絃ナトリウムを０．６Ｍまで刀口えて試
料をエタノール沈殿させた。乾燥ベレットは４Ｕμｍ０
に一１２０中に４与＆ｉ　ｈ６さ→Ｊ−マイツース１０
°Ｇに貯１紙した。

こり最終浴１代中でのＤＲＡ仏、を度は１５μＶｍｌで
゛あった。

（ｉｌ）ｄｅｃＤＩＶＩＡのｄｏ−テーリング　ｄＣ−
チーリンダＡＩ２’１ｋ１１（Ｉｌ、（Ｉ　Ｃ１ＯｍＭ
カコジル（Ｍｆ　ト’）　”）ＬＨＣ’　（ｐＨ７，１
）、ｉｍｃｏａ１２、Ｕ。ｉ　ｚｎＭ　Ｄ１’Ｔ　、　
５０１４／ｍ’の生血前アルブミン、Ｑ、　５　＋ｎ１
ｕ′’ＨａｃＴＰ　（６ＱＱｍＣｉ、１５−Ｆ′Ｈ／−
０ＴＰ／ｍｍｏｌｅ　）巾約０．４ｔｔｊＪのｄｓｃＪ
）ＩＱＡ　’２１μＩＴＴ　（１９単位）とインキュベ
ートした。２および５労使試料を取り、５μｌ試料をＴ
ＣＡ沈殿させ取り込み付分析した。それから２分後で約
７０ニユクレオチドまで、そして５分後１・６０ニユク
レオナドの半均ホモ１合体の平均永となることが分った
。これら２試料をブールし、１１象フェノール抽出し、
４回エーテル拙出゛シ、エタノール沈殿させ、５０μｌ
　）１２０中に書浴牌し、マイナス１０゛Ｃで冷却した
。

（（１１アニーリングされたプラスミドおよびｄｅｃＤ
１４Ａを用いた形質転換 絢０．１２μｇの（１１）−テールテラスミドｐ、ＡＴ
１５３（０，［Ｊ　５　ｐｍｏｌｅ　）および０．１　
μｊＪ　ｄｏ−テール（１ＢＣＤ１１１Ａ（肌２−口、
４　ｐｍｏｌｅ　）を、１０ｃｌμｌＴＮｇ稜イ＠Ｂ　
　（１Ｑ　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　−０１ｐＨ８，Ｑ　
　、　　２　０　０　　ｍＭＮａｉｌ　、　　１ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）中で６５°Ｏ，［１，５時ｔｆＪｊインキ
ュベートした。インキュベーション渦ルニは４時間をか
けて２０℃まで序々に冷却させた。ついで急速に０℃と
した。この溶成は、最終的に、１５ｍＭＴｒｉｓ　−）
（Ｃ１ｐｉ′Ｉ７．５．１ＱＱ　ｍＭ　Ｎａ１ｌ、１Ｑ
ｍＭ　ＭｇＯ１２、ｉ［，１ｍＭ　（Ｅａｒ１２、Ｑ、
５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の２００　μｌ　Ｋ希釈した。Ｌ
ｉ　００に約３時曲保った。

土、三三：　ＨＢｌｏｌの形質転換用培養物をうるのに
、１ｎｔｌの靜止相培養物を、６５ｍτＬ−グロス（１
％Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、　Ｑ、
５％ＤｉｆＣＯＢａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃ
ｔおよび０．５％Ｎａ１ｌ　ｐＨ７，２）に接種し６７
℃で約６時間振った。Ａ６５０は０．４であった。３，
０００　Ｘ！９で５分間４℃で遠心しベレットとした。

細胞は２５ＭのＱ、’ｌ　Ｍ　ＭｇＯ１゜（０’Ｃ）に
再懸ｌ蜀させ、再ペレットとした。ベレットＱ：］、２
　ｍｌｌのＱ、１Ｍ　０ａＯ１２（ＱｏＣ）で再悲淘さ
せ０°Ｃで６０分放寵した。転侯用Ｍ胞の０．２ｍ１．
を（Ｊ、’１ｔｎ１３のアニーリングされたｐＡＴ　１
５３／ｄｓｃＤＮＡとおだやかに混合し、０℃に３θ分
放置し、４２’０で２分、最後に０　’Ｏに６０分放置
した。これに１１ｎ１４のＬ−ブロスを加えた。転惨混
合物はついで２５　分６７　’Ｃテ４　ン＋ユヘ−）　
シタ。Ｑ　、１　ｍ１３　＋’）　Ｎｌ’１科１０イ同
を、Ｌ　−Ｔｃブレート（Ｌ−プロス、１．５％寒天、
１５μｊ７　／　ｍ１３テトラサイクリン（シグマ社）
にそれぞれ拡げた。これら１０枚のブレートより１５０
個のテトラサイクリン抵抗荘のコロニーを倚だ。それの
約８７％はアンピシリン感受１生（１００μｙ；シグマ
）で、ｐＡＴ　１５３のＰａｔ１サイトにｃＪＪＮＡが
挿入されたことを示す。

（８３組決えプラスミドの大規俟調製 ５０Ｑｍｔｏ−）Ｌ−ブロスに１０解の静止培養物を倭
打し、６７℃で約４時ｍｊ振とうしてＡ３９０が約１．
０となるまでとすることにより、フ０ラスミド宮准私」
央物を大知培養した。りＡフェニコール（シグマ社）を
［］、１ｍｙ　／　ａｔ；まで加え、ろ７°Ｃで１伎’
Ｅｆｊ貢した。増殖段階のあと、５分間、４℃で５．０
００　Ｘｇで遠心し細胞をベレットとした。上宿は奴困
じてすてた。細胞のベレットは１２ｍ１の”ＲＹｉｊ畝
（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４０１（ｐ＋−１８−０）、４
０ｉａｌｌＥＤＴＡ　Ｍ　２５％スクロース）甲に、ｉ
ｌ４．懸濁させた。

ＬｙｓｏｓｙｍｅおよびＥＤＴＡをそれぞれ１．４　ｍ
にｌ／ｍｅ　、６０ＩＬＩＭに力ｎえ、忽濁δダを５分
間氷上に放置した。この１６成に５Ｑｍ！；のＴｒｉｔ
Ｏｎミックス（０，１％Ｔｒｉｔｃｎ　Ｘ−１００，６
２，５ｍＭ　［ＤＴＡ、　５ＱｍＭ　Ｔｒｉｅ　−ＭＯ
ｌ、ｐＨ８，ＣＩ）を加え、退合物は約１０分またはＲ
５ａＡＩ化するまで放置した。４℃で１５分４８，００
０Ｘトで遠心して澄明とした。上宿は注意してけいしや
して除き、０．９５　、？の０ｓＣ１および１０〃ｌ？
／ｍｔのエチシ゛ウムブロマイドの０．１　ｄを加えた
。

ＢｅｃｋＩＩ！ａｎ　５０Ｔｉ　ｏ−ター甲で１２００
０Ｘ＆で２０℃で４０時ｍＪ遠心した。プラスミドは長
波長Ｕ、Ｖ’。

螢九で−Ｉａ！化し、チューブの側聞にシリンジを指し
込み取り出した。プラスミドＤＮＡは、第２のＣ！ｓｏ
ｌ／Ｍ化エチジウムグラジェント中で遠心して平衡させ
た。生ずるバンドはＮａ１ｌおよび水で飽オロさせたプ
ロパン−２−オールで４度抽出した。

エタノールで沈殿させ、ＴＥ中に再溶解させそして再沈
殿さぜた。最終乾沫ベレツ）　２００ＲτＴＥ緩衝故に
再）論畠ｌさせ４°Ｃで保存した。

（ｆ＋　　組換え生成物のスクリーニング上記に得られ
た転換細胞は、コロニーハイブリダイゼーシＥ　７’（
Ｍａｎａｈａｎ　ａｎｄ　ＭｅｓｅｌＯｎ、　Ｇｅｎｅ
乱６３−６７　（１９８０）　）でスクリーニングした
。

Ｃ３およびＡ□２組侠えグラスミドで転換された細胞は
、■Ｐ３およびｖｐ□の両方の大部分をおおう、Ａｌｏ
６１に由来するＤＮＡ配列を官有する、ｐＦＡ□。ｔ７
６のＰｖｕｌｌフラダメント（Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ等、
Ｇｅｎｅ１７、１５３−１６１（１９８２）　）でグロ
ーブした。０□転換細胞は、プラスミドｐＦ０１　ｔ　
２：５１（ＢＯＯｔｈ　ｒ　ｏ７ｄ等、Ｎａｔｕｒｅ、
　２９０．６口０−８０２　（１９８１）　）に由来し
ＶＰｉの６１禾躊を含壱する、ｐＦＯ１ｔ３５１の小型
九ａ’／ＨｉｎｆＩフラグメントでグローブした。

それらのグラスミドＤＮＡの制限マツピングにより、ｆ
易１４コロニーをさらにスクリーニングした。

これらのマツプは、Ａ１ｏ６１のｃＤＮＡ配列（Ｂｏｏ
ｔｈ−ｒＯｙｄ等Ｎａｔｕｒｅ、　２．９０．８００−
８０２　（１９８１）　）およびＡ１２１１９のｃＤＮ
Ａ　（Ｋｌｅｉｄ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４゜１１
２５−１１２９　（１９８１））およびＯユＫ（Ｋｕｒ
ｚ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
　９．１９１９　１９３１（１９８１））のＣＤＮＡと
の類推から、ＦＭＤＶケツムの蛋白寅コード年位の直線
状マツプと並べた。場合により、あいまいさを解決する
のに、過当な制限フラグメントの５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇか必要であった。

配夕１」の決定および配列データの分析ＤＮＡの配列は
、Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ　等（Ｇｅｎｅ、　１７．１５３
−１６１　（１９８２）　）記載のように、１φａｘａ
ｍおよびｔ）ｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｋｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　６５゜４９９−５６
０．　（）ｒｏｓｓｍａｎ、　Ｌ、およびＭＯ工ｄａｖ
ｅ、　Ｋ。

（ｌｊｄｓ）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　、）で決定した。

制限サイトのＤＮＡ配列を調べそして相当する蚤白負の
配列を知るためにＡｐｐｌｅｌコンピューターを用いた
。ＬａｒｓｏｎおよびＭｅｓｓｉｎｇのプログラム（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１０
．３９−４９（１９８２））を変型して用いた。それは
、ＫｙｔｅおよびＤＯＯｌｉ　ｔｔｌｓにおけるプログ
ラム（：ｒｌｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１５７．１Ｑ５
−１３２　（１９８２）　）を用いて親水性グロットを
作るのにも用いた。５ｔａｄｅｎのフ０ロダラム（Ｎｕ
ＣｌｅｉＣＡｃｉｄｓ　ｈｅｓｅａｒｃｈ　４．４０３
７　４０５１　（１９７７）およびＮｕｃｌｅｉａ　Ａ
Ｃｉｄｓ　ｈｅｓｅａｒｃｈ、　８．３６７３　３６９
４（１９８０））を用い、ジニュクレオチドの頻度およ
びコドンの１史用を街１］定するのにＰＤＰ　ｌミニコ
ンピユータ−を用いた。

６髄の血清型Ａ２４　Ｃ３およびＯ，、ＢＦＳについて
の■Ｐｌコード配列をこのようにして決定し、示唆され
たアミノ酸配列を、既知の６個のＶＰ１配列Ａ１゜（Ｂ
ｏｏｔｈｒｏｙｄ寺Ｇｅｎｅ　１７．１５５　１６１　
（１９８２）　）、Ａ１２（ｈｌｅｉａ　等、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２１４．１１２５−１１２９（１９８１）　）
およびＣＩＩＫ　（Ｋｕｒｚ　”Ｊ＝、Ｎｕｃｌｅｉａ
　Ａｃ１ｄｓ１−ｔｅｓｅａｒｃｈ、　９．１９１９−
１９６１　（１９８１）　）と比較した。

結果をＪ、２図および第６図に示す。

アミノ酸配タリの比較 ６つの血清型Ａ２４、Ｃ３およびＯ□ＢＦＳよりのＶＰ
ｌについてのアミノ取配列を、第２図に示したように、
上記決足ニュクレオチド配列より示した。配列は３つの
他の系統についてのＶＰｌの既知のアミノ酸配列と比較
した。

配列が最大の相同性を有するように並べるには、ギヤラ
グ（点線で示す）の尋人か必女であったか、それらは最
小に留めた。（ｂ）　２Ｍ々の血＠共’＜　（ＡＩＯｚ
ｃ３、ｏｌＢＦＳ）のあいた、（ａ）同じ血清型の種々
のサブタイプ（Ａよ。、Ａ□２、Ａ２４）および（ｂ）
同じサブタイプの種々の分離物（０１ＢＦＳ　、　　Ｏ
□Ｋ）のあいたの比較かできるように並べた。介在する
配列もあるか、ＶＰ□のみに番号を付した。種々の配列
のあいだの一員・註ヲ保つために、番号を付するシステ
ムにはキ゛ヤツゾを入れた。結果を第３図に示す。

免役原注のアミノ酸配列の決定 ＦＭＤＶの１里々の系統よりのｖｐ工閂己タ１ｊを上ヒ
較してみると、いくつかの変動する領域か保存された領
域のあいたにあった。免役原注の堰板は、強いとうた圧
のも　とで、宿主の免役系を逃がれるために変化したよ
うである。それで、変動汀碩域のいくつかが免投涼性で
あるようである。免役原性の領域かウィルスの表面に存
在することはほとんどた１−かなので、それらはそれら
自体親水性であるか東たは親水性／ｐＭ域に近く存在し
ているようである。第４１′ｙ、１は、Ａ、。、Ｃ３，
０□ヨリノｖＰ１　ノＫ　ｈｉ性のフ゛ロット土に、３
つの血清型のそれぞれよりの１示された工Ｊｌ水快ＶＰ
１の調べられたグロットを里ねてｉ　ｉｆ、このことが
ら、オーバララフｏした親水１．＋：領領域イＪし、そ
れゆえに免役原性であるらしい変動１午の領域を示した
。

例　　２ ペプチドフラグメント ４４　＆　ＵＳ（ＩＲＲ（）ＤＭＧｓＬＡＡｆ（ＶＶＫ
Ｑ：ＬＰを有するＡ２４０ｒｕｚｅｉｒｏ　　ＶＰ□の
領域１４３−１６２に対応するべブチドフラクメントを
、目止り合成装置屯を月づい、クロルメチルポリスチレ
ン上で、同相法で合成した。

ｔＢＯｃ−ｐｒｏ−Ｒｅｓｉｎはシグマ社（　Ｐｏｏｌ
ｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）より［１人した。すべてのカッ
プリング反応で６倍輩のｔｂｏｃアミノ酸およびシシク
ロヘキシルクルボシイミドを用いた、ニンヒドリン（１
１）で試験した。反応か９９％完結しなかった時に、カ
ップリング操作を反復した。

ベヒチドは担体よりはつしそして５　ｍ１３のアニソー
ルをスカベンジャーに加えた２　０　ｉｎｌ；のフッ化
７に一ｇ　ｈよび２．５廐のエチルメチルスルファイド
（これはメチオニンを保護する）を除保＾した（４°０
１６０分）。フッ化７に累は室索派で除いた。ペン０テ
゛ドおよび樹脂は減圧で乾床し、痕跡紺の）ｉＦをすべ
てを味いた。ついでエーテルで洗いアニソールおよびエ
チルメチルスルファイドを除いた。樹脂は風曳しエーテ
ルを除いた。

ペプチドは１０％酢酸で抽出した。純度は、アばノ畝分
タ丁およびＨＰＬＯ　（　０．１％トリフルオル液オよ
ひ０から６０％のアセトニトリルダラシエントを用いる
Ｚｏｒｂ．ｑｘ　Ｃ８（ＤｕＰｏｎｔ　）の逆第１：１
カラム）で分析した。ペプチドはＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
１Ｑ上で脱塙し、蒸発乾こし、必要生成物とした。

（ｂｌ　Ｑ□Ｊ：ｌＦ８　１８６０　ｖＰｌの１４３−
１６２領域に対応する、配列ＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫ
ＶＡＲＴＬＰ配列を肩するぺｙチドフラグメントを同様
に製造した。

【図面の簡単な説明】

第１図はフィジカルマッグおよび用いた配夕Ｕ決定の手
順を示す。 第２図は、ＦＭＤＶの３１向の血清型のＶＰ□領域につ
いての、ニュクレオチドおよびＴ’ｉ４　”Ｍされるア
ミン取を示す。 第６図は、第２図のアミノ酸自已夕１ｊ馨、ｖＰｌにつ
いての３つの報告されている配列とあわせて示す。 脂４図は、　　　　　　　　　　　　　　−　゛二゛ー
■Ｐｌの配列の６１向の変わり方を示す。 代理人　　浅　村　　　晧 図６＋ｌのｉｆ＋冴（内容に変更なし）戊 し５　　實湧　　北　　實η　　詳ヨ　　已５　　吊　
　し手　　８♀　　陀　　ご定　　＝己ｏく　　くく　
Φく　　Ｑ工　　ΦΦ　ｏ（（ＪＪ　　（）−Ｑ［Ｌ　
　　（Σ　　くく　ヒ」助禮５Ｈ市園１閤酩固匪珀尼 Ｃｌ２Ｒ，１／１９） 優先権主張　＠１９８２年１２月３日の）イギリス（Ｇ
Ｂ）■８２３４６３８ （ｌ　　明　者　アンドリュー・ジョセフ・マコフ イギリス国エスダブリュ１６ノー ベリイ・メルローズ・アベニュ ６２ 手続補正書（方式） 昭和１７年り月７２日 特許庁長官殿 ］、事件の表示 昭和２年特許願第１υ２７７号 ３、補正をする者 事件との関係　特ｒ［出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）血清型Ａ２．０ｒｕｚｅｉｒｏ、　０３工ｎｃＬ
   ａｉａｌまたばｏ。 ＢＦＳよりユ醪択したＶＰ１蛋白質の抗原サイト、それ
   の７ラグメントおよびｇ４体のアミノ酸配列を含泡する
   ことを特徴とする、ペプチド。 （２）　４２−’６１　；　７９−８５　；　９５−１
   ０２　；１２９−１６０（またば１６２）　：　１７０
   −１７６；１９３−２０４（または２０６）より選択し
   た、ｖＰｌのすべてまたは部分に対応することを特徴上
   する、上記（１）項記載のペプチド。 （３Ｊ　　７９−８５；１２９−１６０（または１６２
   ）および１９３−２０４（または２０９）より１と択し
   たＶＰ□の部分に対応することを特徴とする、上記（１
   ）または（２）現記ＩＬのペプチド。 （４）　　　４２−５１　　；５６−６１　　；　　１
   ２９−１４７　７１５’ｌ−１６０および１４３−１６
   ２より選択したｖＰｌの部分にｘｖｊ；ｅｘすることを
   ％徴とする、上記（１）から（３）項までのいずれかに
   記載のペプチド。 （５）上記（１）から（４１項までに記載した、（ａ）
   　　ＶＶＲＨＥＧＮ （ｂｌ　　ＡＶＴＨＴ（）Ｋ （ｃ）　　ＡＶＫＨＥＲＤ （ａ）　　ＶＹＮＧＴＳＫＹＡＶＧＧＳＧＲＲ（ｅ）　
   　、ＴＹＴＧＴＴＡＹＴＡＳＳＡＲＲ（ｆ）　　ＶＹｌ
   ｉＧＥＯＲＹＳＲＮＡＶＰＮＬＲ（ｇ）　　Ｇ８ＬＡＡ
   ：ＲＶＶＫＱ （ｈＪ　　ＡＨＬＡＡＡＲＡＲＦｉ （リ　　ｖＬｐｖＱｐ：ＧＤ、ｕａ ｌ）　　工Ｑ、５ＩＬＳＰＴＨＶ工 （ｋ）　　Ｖ）ｉＶｓＧＮＱＨＴ］Ｌ （１）　　　Ｖ）ｉＫＤｓ工 （ｍｌ　　　ＶＰ８ＨＴＬ （ｎＪ　　ＥＳＡＬＬＮＴＳ （ｑ）　　ＶＫＡＥＴ工Ｔ （ｒ）　　ＧＳＧＲＲＧＤＭＧＳＬＡＡＲＶＶＫＱＬＰ
   （ｓ）　　ＩＪＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ、ＫＶＡＲＴＬＰ
   （ｔ）　　ＡＥＩＡＲＲＧＤＬＡＨＬＡＡＡＨＡＩ（（
   ｕ）　　　ＡＲＲＧＤＬＡＨＬＡＡＡ）ｉＡＲＨＬＰ（
   ｖ）　　　ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬａＱＫＶＡＲＴＬＰ
   （ｗｌ　　　ＶＬＰＶＱＰＴＧＤＲＨＫＱ、ＰＬ工より
   選択したペプチド。 （６Ｊ　　ＧＳＧＲＲ（）ＤＭＧ　Ｓ　ＬＡＡｌ（ＶＶ
   ＫＱＬＰ自己列を有するペプチド。 （ｔ）　　ＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ配列
   を有するペプチド。 ＋８Ｊｍ３図に示ず、ＦＭＤＶ血清ＭＡ２４０ｒｕｚｅ
   ｉｒｏ。 Ｃ３工ｎｄａｉａｌ　または○、ＢＦＳのＶＰ１構造を
   有する蛋白質。 （９）　　担体に結合した、上記（１）から（８）項ま
   でのいずれかに定義のペプチドを官有する免疫原。 ｕＯＪ　　上り附１）から（８１Ｍまでのいずれかに定
   義のベン０チドまたは上記（９）項に定義の免疫原な、
   それらに対する薬剤とじで許容されうる担体とあわせて
   官有するワクチン。 （１υ　Ａ、１１印々のアミノ酸、小型ペプチド結合ま
   たはそれらの組合わせよりの既知技術による合成的調製
   ； Ｂ、より大きなボリペフ０チドまたは蛋白質の切断、そ
   して場合によりつつく変型；または、Ｃ，（ａ）　　（
   １）上記（１）から（８）項までのいずれかに定義の蛋
   白質またはペプチドをコードする二１（鎖ＤＮＡ配列才
   たはそれらをコードする配列を言上する二重Ｓ　ＤＮＡ
   配列と、（２）クロン化ビヒクルＤＮＡ配列と、（３＋
   　ＤＮＡ発現のためのイニシエーターおよびターミネー
   タ−を含Ｍする組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換し く’ｂ）　　該宿主細胞をＦＭＤペフ゛チド発現に通農
   な条件で培養し； （Ｃ）　　細紀培養物を採取し；そして（ｄ）　　ｙペ
   プチドを分服することの、これらＡ、Ｂ、Ｏを包１゛す
   る、上記（１）から（８）項までのいずれかに定義のペ
   ラ０ナトまたは蛋白質の製造方法。 贈　上記（１）から（８）項までのいずれかに定義の蛋
   白質またはペプチドに対応するニュクレオチド配夕１］
   を含有するＤ’ＮＡ分子または上記（ｔＪから（８）項
   までのいずれかに定義のペプチドまたは蛋白質を含有す
   るポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。 旧　本明細書に定義のような、イニシエーター配列を翁
   するオペロン、オペロンのイニシエーター配列とターミ
   ネータ−配列とのあいだに存在する、上Ｎｃ；（１）か
   ら（８）狽テでのいずれかに定俄の蛋白質またはペプチ
   ドを実質的にコー−するニュクレオテド配列またはその
   ような配列を含冶するニュクレオチド配列を包含した組
   換えＤＮＡ分子。 （貝イニシエーター配列およびターミネータ−配夕１］
   を南するオペロン、および、上記（１）から（８）項ま
   でのいずれかにホ１先の蛋白質またはペプチドを実質的
   にコードする、オペロンのイニシエーター配列とターミ
   ネータ−配列とのあいだに存在する、ニュクレオチド配
   夕１」を包含する、それらの蛋白質またはペプチドのず
   へてまたは部分を発現しうる、組換えＤＮＡクロン化ビ
   ヒクル。 （１５）上ＴＪ（”＝　（１２Ｊから圓項までのいずれ
   かに泥波のＡ■侯えＤＮＡクロン化ビヒクルおよび（−
   １：たば）ｍ換えＤＮＡ分子を金力するイｄ主細胞。 （Ｉ６）本明細薔に定義するような組換えＤＮＡクロン
   化ビヒクルで形質転換された宿主細胞により生性される
   ところの、本明細書に定畿のようなりＮＡ分子の発現で
   製造された、上記（１）から（８）項までのいずれかに
   定義のような蛋白質またはペプチドを含有する、呻乳動
   物におけるＦＭＤＶに対する抗体産生を刺倣する抗原。 （１７）　　（ａ）　ＦＭＤＡ　−１鎖ＲＮＡを分離し
   ；（ｂ）　ＦＭＤＶ　Ｉ（ＮＡ　Ｉ）　−Ｍ、　ＨＫ　
   相補的に’）　ＤＮＡ　ノ第一の一１順を調製し；そし
   て （Ｃ）第一の一重鎖に相補的でそれに水素結合する第二
   の一重鎖を調製して二ｚ　鎖ＤＮＡとすることを包含す
   る、上記（］）から（８）項までのいずれかに定義の、
   ペプチドを実質的にコードするＤＮＡ分子の表か方法。 、１８１　　治療に用いるための、上日己（１）から（
   ８）項までのいずれかに定義のペプチド。