JPS6239598A - 標識付けした核酸 - Google Patents
標識付けした核酸Info
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- JPS6239598A JPS6239598A JP61191191A JP19119186A JPS6239598A JP S6239598 A JPS6239598 A JP S6239598A JP 61191191 A JP61191191 A JP 61191191A JP 19119186 A JP19119186 A JP 19119186A JP S6239598 A JPS6239598 A JP S6239598A
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- nucleotide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、核酸の、同位体（アイソトープ）を用いない
標識付けに関する。
標識付けに関する。
従来の技術
核酸の標識付けは医学および研究の両方における多くの
分析目的のために必須である。例えば、このような標識
付けした分子は、複雑な細菌群の中で、特殊な細菌の遺
伝子の単一コピー（ｃｏｐｙ）の存在を検出するために
使用することができ、こうして感染の迅速な診断を行な
うことができる。伝統的に、こうした標識付けは、放射
性をもつように傳識付けられたヌクレオチドを、ＤＮＡ
Ｊリメラーゼを用いて核酸内に、酵素により組み入れる
ことを包含していた。
分析目的のために必須である。例えば、このような標識
付けした分子は、複雑な細菌群の中で、特殊な細菌の遺
伝子の単一コピー（ｃｏｐｙ）の存在を検出するために
使用することができ、こうして感染の迅速な診断を行な
うことができる。伝統的に、こうした標識付けは、放射
性をもつように傳識付けられたヌクレオチドを、ＤＮＡ
Ｊリメラーゼを用いて核酸内に、酵素により組み入れる
ことを包含していた。
同位体を用いない核酸の標識付は法も存在する。
このような方法の一つは、核酸内へのビオチンで標識付
けたヌクレオチドの組み入れを要する。
けたヌクレオチドの組み入れを要する。
〔ランジャー（Ｌａｎｇｅｒ）外、プロシーデインダス
・オブーナショナル・アカデミ−・オプｅサイエンシー
ズ（ＰｒＯｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＮａｔｉＯｎａｌ
Ａｃａ、ｄｅｍｙＯｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）＋ ７
８．６６３３． １９８１）。この標識付けした核酸の
、フィルターに結合された標的ＤＮＡへのハイブリッド
形成（交ＩＡ）後に、これを比色法による検定により検
出することができる（１９８３年９月２日にランデス（
Ｌａｎｄｅｓ）が出願し、本出願人と同一人に譲渡され
た、ＵＳＳＮＳＳＮ第５２５芳４４ アヒシンとの複合体の形成；下記酵素がアビジン更複合
するための、ビオチンで標識付けした酵素の添加；およ
び比色法基質の添加による酵素の検゛出；を含む。
・オブーナショナル・アカデミ−・オプｅサイエンシー
ズ（ＰｒＯｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＮａｔｉＯｎａｌ
Ａｃａ、ｄｅｍｙＯｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）＋ ７
８．６６３３． １９８１）。この標識付けした核酸の
、フィルターに結合された標的ＤＮＡへのハイブリッド
形成（交ＩＡ）後に、これを比色法による検定により検
出することができる（１９８３年９月２日にランデス（
Ｌａｎｄｅｓ）が出願し、本出願人と同一人に譲渡され
た、ＵＳＳＮＳＳＮ第５２５芳４４ アヒシンとの複合体の形成；下記酵素がアビジン更複合
するための、ビオチンで標識付けした酵素の添加；およ
び比色法基質の添加による酵素の検゛出；を含む。
本発明は、アクリジンエステル類または発光ランタニド
で標識付けしたポリヌクレオチドを提供する。これらの
ｑ識付けしたポリヌクレオチドは、相同のポリヌクレオ
チド配列の直接検定の手段を与える。
で標識付けしたポリヌクレオチドを提供する。これらの
ｑ識付けしたポリヌクレオチドは、相同のポリヌクレオ
チド配列の直接検定の手段を与える。
アクリジンエステル類〔キャンプベル（Ｃ姐ｐｂｅｌｌ
）外、ヨーロッパ特許第００８２６３６号〕または発光
ランタニド〔ヘミン（Ｈｅｍｍｉｌａ） 、ヨーロッパ
特許第００６４４８４号〕、最も好ましくはユーロピウ
ム、テルビウムまたはサマリウムをポリヌクレオチドに
くみ入れることにより同位体を用いないで標識づけられ
たポリヌクレオチドを合成する方法は、一般に、官能化
試薬のこのポリヌクレオチト９への組み入れ、およびこ
れに続くアクリジンエステル、発光ランタニド、または
発光ラン。
）外、ヨーロッパ特許第００８２６３６号〕または発光
ランタニド〔ヘミン（Ｈｅｍｍｉｌａ） 、ヨーロッパ
特許第００６４４８４号〕、最も好ましくはユーロピウ
ム、テルビウムまたはサマリウムをポリヌクレオチドに
くみ入れることにより同位体を用いないで標識づけられ
たポリヌクレオチドを合成する方法は、一般に、官能化
試薬のこのポリヌクレオチト９への組み入れ、およびこ
れに続くアクリジンエステル、発光ランタニド、または
発光ラン。
タニドキレートのこれらの試薬への結合を包含する。こ
れらの官能化試薬は、化学的または酵素的て組み入れる
ことができる。一つの具体化では、シトシンの同族体が
ポリヌクレオチド９の合成の間に化学的に付加され、別
の具体化では、単一または二重鎖の鋳型（テンプレート
）から合成されるポリヌクレオチド内に、例えば三リン
酸化塩基の同族体を組み入れるのにＤ Ｎ Ａ ＄ ＋
）メラーゼが使用される。このような三リン酸化塩基の
例を下に示す： ○ＨＸ 式中、ＸはＨまたはＯＨであり、ｚくｎ＜−ｔｏである
。もう一つの方法には、先に標識付けたヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドを、例えばカルボジイミド結合（
ｃｏｕｐｌ工ｎｇ）によシ存在するポリヌクレオチドへ
共有結合させる方法が包含される。
れらの官能化試薬は、化学的または酵素的て組み入れる
ことができる。一つの具体化では、シトシンの同族体が
ポリヌクレオチド９の合成の間に化学的に付加され、別
の具体化では、単一または二重鎖の鋳型（テンプレート
）から合成されるポリヌクレオチド内に、例えば三リン
酸化塩基の同族体を組み入れるのにＤ Ｎ Ａ ＄ ＋
）メラーゼが使用される。このような三リン酸化塩基の
例を下に示す： ○ＨＸ 式中、ＸはＨまたはＯＨであり、ｚくｎ＜−ｔｏである
。もう一つの方法には、先に標識付けたヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドを、例えばカルボジイミド結合（
ｃｏｕｐｌ工ｎｇ）によシ存在するポリヌクレオチドへ
共有結合させる方法が包含される。
標識付けしたポリヌクレオチドは、酵素または酵素基質
の添加を必要とすることなく、ニトロセルロースのよう
な適当な媒体上のＲＮＡまたはＤＮＡの相同配列の直接
検出のための標準法に使用することができる。
の添加を必要とすることなく、ニトロセルロースのよう
な適当な媒体上のＲＮＡまたはＤＮＡの相同配列の直接
検出のための標準法に使用することができる。
本発明のその他の特徴および利点は、以下に示すその好
ましい具体化の説明および特許請求の範囲から明らかで
あろう。
ましい具体化の説明および特許請求の範囲から明らかで
あろう。
構造
「ポリヌクレオチド」という語は、２またはそれ以上の
ヌクレオチビ塩基対を含有するヌクレオチド配列を指す
。これらは、鋳型なしで化学的に、または単一または二
重鎖のボ゛リヌクレオチド鋳型を用いて酵素により合成
することができ、あるいは、ゲノム、プラスミＬ” （
ｐｌａｓｍｉＪ ウィルス、またはその他のベクター中
に遺伝子または遺伝子の部分として存在する天然配列か
ら誘導することができる。本発明に従えば、ポリヌクレ
オチドは１またはそれ以上のアクリジンエステル基また
は発光ランタニド９を用いて標識づけられる。
ヌクレオチビ塩基対を含有するヌクレオチド配列を指す
。これらは、鋳型なしで化学的に、または単一または二
重鎖のボ゛リヌクレオチド鋳型を用いて酵素により合成
することができ、あるいは、ゲノム、プラスミＬ” （
ｐｌａｓｍｉＪ ウィルス、またはその他のベクター中
に遺伝子または遺伝子の部分として存在する天然配列か
ら誘導することができる。本発明に従えば、ポリヌクレ
オチドは１またはそれ以上のアクリジンエステル基また
は発光ランタニド９を用いて標識づけられる。
アクリジンエステル
アクリジンエステルおよびこれらの合成は、キャンプベ
ル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）外（前述）、マクカプラ（Ｍｃ
Ｃａｐｒａ） 外の英国特許第１，４６１，８７７号お
よびシーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）の米国特許第３５３９
５７４号に記載されておシ、これらは両者ともここで参
照されている。
ル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）外（前述）、マクカプラ（Ｍｃ
Ｃａｐｒａ） 外の英国特許第１，４６１，８７７号お
よびシーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）の米国特許第３５３９
５７４号に記載されておシ、これらは両者ともここで参
照されている。
本発明に有用なアクリジンエステルは、一般式：（式中
、Ｔは、サルファイド基、アミド基まだは１またはそれ
以上のヒドロキシル基、を含有シテいてもよい飽和また
は不飽和脂肪族鎖である）を有する。Ｔの長さは、相同
ポリヌクレオチドのハイブリット９形成を有意には妨げ
ないようなものでなくてはならない。好ましくは、Ｔの
脂肪族鎖中の炭素原子の数は１−１０であシ、最も好ま
しくは、２から５までである。Ａは離脱基である。好ま
しくは、Ａは： である。
、Ｔは、サルファイド基、アミド基まだは１またはそれ
以上のヒドロキシル基、を含有シテいてもよい飽和また
は不飽和脂肪族鎖である）を有する。Ｔの長さは、相同
ポリヌクレオチドのハイブリット９形成を有意には妨げ
ないようなものでなくてはならない。好ましくは、Ｔの
脂肪族鎖中の炭素原子の数は１−１０であシ、最も好ま
しくは、２から５までである。Ａは離脱基である。好ま
しくは、Ａは： である。
発光ランタニド
発光ランタニドは一般に、キレートとして使用される。
ランタニビキレートの例は、ヘミ２（ＨｅｍｍｉｌａＸ
前述）、ヒント、シュア（Ｈｉｎｄｓｈｕｒｅ）外のヨ
ーロッパ特許第００６８８７５号、ソイニ（Ｓｏｉｎｉ
） 外の米国特許ｍ４３７４ｔ２ｏ号；フランク（Ｆ
ｒａｎｋ） 外の米国特許第４．２８３３８２号；フラ
ンク（１’ｒａｎｋ）外の米国特許第４２５Ｑ３１３号
；ウイーダー（Ｗｉｅｄｅｒ）外の米国特許第４，３５
２，７５１号；ウイーダ−（ｗｉａｅｒ）外の米国特許
第４，４３２，９０７号；およびソイニ（Ｓｏｉｎｉ）
外のヨーロッパ特許第０１０３５５８号；に示され
ており、上記のものはここで参照されている。本発明で
使用されるキレート化剤は、次の性質を有していなくて
はならない：（ａ）分子の一端は発光ランタニドをキレ
ート化することができなくてはならず、そして（ｂ）分
子の他端は、ポリヌクレオチド配列上のアミン、アミノ
プロピルまたは他の反応基と共有結合することができる
基を有していなくてはならない。一般に、これらのキレ
ート化剤は、下記（Ａ）、 （Ｂ）の２構造の１つを有
している； （Ａ） 〔式中、２は、 （ａ） Ｎ＝Ｃ＝８ 。
前述）、ヒント、シュア（Ｈｉｎｄｓｈｕｒｅ）外のヨ
ーロッパ特許第００６８８７５号、ソイニ（Ｓｏｉｎｉ
） 外の米国特許ｍ４３７４ｔ２ｏ号；フランク（Ｆ
ｒａｎｋ） 外の米国特許第４．２８３３８２号；フラ
ンク（１’ｒａｎｋ）外の米国特許第４２５Ｑ３１３号
；ウイーダー（Ｗｉｅｄｅｒ）外の米国特許第４，３５
２，７５１号；ウイーダ−（ｗｉａｅｒ）外の米国特許
第４，４３２，９０７号；およびソイニ（Ｓｏｉｎｉ）
外のヨーロッパ特許第０１０３５５８号；に示され
ており、上記のものはここで参照されている。本発明で
使用されるキレート化剤は、次の性質を有していなくて
はならない：（ａ）分子の一端は発光ランタニドをキレ
ート化することができなくてはならず、そして（ｂ）分
子の他端は、ポリヌクレオチド配列上のアミン、アミノ
プロピルまたは他の反応基と共有結合することができる
基を有していなくてはならない。一般に、これらのキレ
ート化剤は、下記（Ａ）、 （Ｂ）の２構造の１つを有
している； （Ａ） 〔式中、２は、 （ａ） Ｎ＝Ｃ＝８ 。
（Ｃ） ”３１
（ここで１＜ｎ＜１０．）
（ここで１≦ｎ＜１０．）
または
（ｇＪ−ＣＨ−Ｃ−ＣＨ２−Ｗ （ここでＷはハロゲ
ン、好ましくは臭素である）；αＤ であり、Ｙはポリアミノカルボキシレート配位子、好ま
しくは、 または （ここでｎ、ｍおよびｐの各々は別個に、２−４である
） である〕；または （Ｂ） 構造 ここで２≦ｎ（１０そして２≦ｒｎ ＜ ４のＤＴＰＡ
Ａｏ （勾に示されたキレート化剤は、一般的にヘミラ（Ｈｅ
＋ｎｍ１ｌａ）外、〔アナリテイカル・バイオケミス
ト リ イ （Ａｍａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｎｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ） ｌ ３７ ：３３５．１９８４
）に記載されているように、市販品として入手できる化
合物から合成することができる。ＤＴＰＡＡ （上記
Ｂに示されている）の合成は、エムΦビー・ベイリイ（
Ｍ、Ｐ、Ｂａ１ｌｅＹ） 外、アナリスト（Ａｎａｌ
ｙｓｔ）、 １０９．１４４９．１９８４に示されてい
る。ポリヌクレオチドヲ、Ｚが上記式〇〇に示された通
りであるキレートで標識付けしようとするときは、この
ポリヌクレオチドは、キレートが結合できるようにする
ために、まずアミノチオランと反応させねばならない。
ン、好ましくは臭素である）；αＤ であり、Ｙはポリアミノカルボキシレート配位子、好ま
しくは、 または （ここでｎ、ｍおよびｐの各々は別個に、２−４である
） である〕；または （Ｂ） 構造 ここで２≦ｎ（１０そして２≦ｒｎ ＜ ４のＤＴＰＡ
Ａｏ （勾に示されたキレート化剤は、一般的にヘミラ（Ｈｅ
＋ｎｍ１ｌａ）外、〔アナリテイカル・バイオケミス
ト リ イ （Ａｍａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｎｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ） ｌ ３７ ：３３５．１９８４
）に記載されているように、市販品として入手できる化
合物から合成することができる。ＤＴＰＡＡ （上記
Ｂに示されている）の合成は、エムΦビー・ベイリイ（
Ｍ、Ｐ、Ｂａ１ｌｅＹ） 外、アナリスト（Ａｎａｌ
ｙｓｔ）、 １０９．１４４９．１９８４に示されてい
る。ポリヌクレオチドヲ、Ｚが上記式〇〇に示された通
りであるキレートで標識付けしようとするときは、この
ポリヌクレオチドは、キレートが結合できるようにする
ために、まずアミノチオランと反応させねばならない。
合成
官能基の導入
標識付けされるべきポリヌクレオチドは、最初に、アク
リジンエステルと反応することができるアミノプロピル
または第一アミン基のような反応基、または発光ランタ
ニドをキレート化することができる成分１またはそれ以
上の導入により官能化しなくてはならない。このような
官能基は、次にポリヌクレオチドの化学的または酵素的
合成に使用されるヌクレオチドに結合させることができ
る。別法として、官能基を、存在するポリヌクレオチド
に化学的に結合させることもできる。
リジンエステルと反応することができるアミノプロピル
または第一アミン基のような反応基、または発光ランタ
ニドをキレート化することができる成分１またはそれ以
上の導入により官能化しなくてはならない。このような
官能基は、次にポリヌクレオチドの化学的または酵素的
合成に使用されるヌクレオチドに結合させることができ
る。別法として、官能基を、存在するポリヌクレオチド
に化学的に結合させることもできる。
モツク（Ｍ○ｃｋ）により記載された（１９８５年５月
１５日に出願され、本出願人と同一人に■渡された米国
特許出願筒７３４，３２３号、これによって参照されて
いる）もののような塩基同族体を、通常の塩基の代りに
、ポリヌクレオチドの合成の間に組み入れることができ
る。これらは、分子の末端に組み入れられ、次に続く塩
基を必要に応じて加え得るものであり、そしてアクリジ
ンエステルまたは発光ランタニドキレート化化合物を結
合させることのできるアミノプロピル基、または発光ラ
ンタニドを直接キレート化するのに使用することができ
る基を導入する役目を果す。このような同族体の一般構
造を下に示す： 式中、Ｄはあらゆる保護基、好ましくは４４７−ジメト
キントリチル基であり、Ｇは他のヌクレオチドへの化学
的結合を可能にする基、例えば：であり、Ｊはアクリジ
ンエステルまたはランタニドキレート化化合物と反応す
ることができるか、または発光ランタニド９をキレート
化することのできる基である。Ｊの例は： （ａ） −ＨＮ（ＣＨ） ＮＨＣＯＣＦ’ ここ
で１≦ｎ＜１０゜２ ｎ ３′ および（ｃ） である。
１５日に出願され、本出願人と同一人に■渡された米国
特許出願筒７３４，３２３号、これによって参照されて
いる）もののような塩基同族体を、通常の塩基の代りに
、ポリヌクレオチドの合成の間に組み入れることができ
る。これらは、分子の末端に組み入れられ、次に続く塩
基を必要に応じて加え得るものであり、そしてアクリジ
ンエステルまたは発光ランタニドキレート化化合物を結
合させることのできるアミノプロピル基、または発光ラ
ンタニドを直接キレート化するのに使用することができ
る基を導入する役目を果す。このような同族体の一般構
造を下に示す： 式中、Ｄはあらゆる保護基、好ましくは４４７−ジメト
キントリチル基であり、Ｇは他のヌクレオチドへの化学
的結合を可能にする基、例えば：であり、Ｊはアクリジ
ンエステルまたはランタニドキレート化化合物と反応す
ることができるか、または発光ランタニド９をキレート
化することのできる基である。Ｊの例は： （ａ） −ＨＮ（ＣＨ） ＮＨＣＯＣＦ’ ここ
で１≦ｎ＜１０゜２ ｎ ３′ および（ｃ） である。
ホＩＪヌクレオチビを官能化するには、後の２つの例（
ｂおよびＣ）を、合成ポリヌクレオチドへの組み入れ後
に塩基によって加水分解しなくてはならない。このよう
な反応は、結果的に、構造二〇 ０−Ｐ−０ （ここで、ｌおよびｍばＯまたは正の整敬であり、ｋば ＯＨＯＨ または の、ｄ ＋）ヌクレオチドを形成することになる。発光
ランタニドは直接、これらの後者の化合物にキレート化
されることができる。
ｂおよびＣ）を、合成ポリヌクレオチドへの組み入れ後
に塩基によって加水分解しなくてはならない。このよう
な反応は、結果的に、構造二〇 ０−Ｐ−０ （ここで、ｌおよびｍばＯまたは正の整敬であり、ｋば ＯＨＯＨ または の、ｄ ＋）ヌクレオチドを形成することになる。発光
ランタニドは直接、これらの後者の化合物にキレート化
されることができる。
このような化学的に合成された官能化ｄ ＩＪヌクレオ
チビの例は、自動化された亜リン酸塩合成によシ、合成
３３塩基対ポリヌクレオチドの両末端にＣ−４アミノプ
ロピル−変形されたシチジンが組み入れられているもの
である。このようなポリヌクレオチド９は、次式： ％式％ の構造を有している。
チビの例は、自動化された亜リン酸塩合成によシ、合成
３３塩基対ポリヌクレオチドの両末端にＣ−４アミノプ
ロピル−変形されたシチジンが組み入れられているもの
である。このようなポリヌクレオチド９は、次式： ％式％ の構造を有している。
酵素によるポリヌクレオチド合成
下に示したもののような、反応性またはアミン官能性を
有する変形されたヌクレオチ）” ［ｏ１族体を、単一
または二重鎖の鋳型を利用して、ポリヌクレオチド標識
付けの間に、通常の三すン酸化ヌクンオチド塩基の代り
に組み入れることができる。このような三すン酸化ヌク
レオチビの例は：（ここでＸはＨ（ＤＮＡ）まだは０Ｈ
（ＲＮＡ）であり、２≦ｎ≦１０） である。
有する変形されたヌクレオチ）” ［ｏ１族体を、単一
または二重鎖の鋳型を利用して、ポリヌクレオチド標識
付けの間に、通常の三すン酸化ヌクンオチド塩基の代り
に組み入れることができる。このような三すン酸化ヌク
レオチビの例は：（ここでＸはＨ（ＤＮＡ）まだは０Ｈ
（ＲＮＡ）であり、２≦ｎ≦１０） である。
このような酵素法の例には、ＤＮＡアーゼＩを加えるか
または加えないで、ＤＮＡポリメラーゼを用いる二重鎖
ＤＮＡのニックトランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉＯｎ） ； Ｄ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（
フレノウ断片）を用いる二重鎖領域からの単一鎖ＤＮＡ
のゾライマ−（ｐｒｉｍｅｒ）伸長；ＤＮＡの末端デオ
キシトランスフェラーゼテーリング（ｔａｎｉｎｇ）；
または糖成分上に２′および３′ヒドロキシル基を有す
る同族体および二重鎖領域を滲なう単一鎖ＤＮＡ祷型に
ついてのＲＮＡポリメラーゼの使用〔マニアテイス（Ｍ
ａｎｉａｔ、ｉｓ）外、１９８２モレキユラー・クロー
ニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｕｎｎｉｎｇ） 、ア・
ラボラトリイ・マニ二アル ゛（Ａ Ｌａｂｎｒａｔｎ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング＋１ ハ
ーバ−研究所（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒＬ
ａｂｎｒａｔｎｒｙ） 、 ニュー ヨーク州、コール
）”＠、Ｘプリン／拳ハーバー２私書箱１００）；が含
まれる。
または加えないで、ＤＮＡポリメラーゼを用いる二重鎖
ＤＮＡのニックトランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉＯｎ） ； Ｄ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（
フレノウ断片）を用いる二重鎖領域からの単一鎖ＤＮＡ
のゾライマ−（ｐｒｉｍｅｒ）伸長；ＤＮＡの末端デオ
キシトランスフェラーゼテーリング（ｔａｎｉｎｇ）；
または糖成分上に２′および３′ヒドロキシル基を有す
る同族体および二重鎖領域を滲なう単一鎖ＤＮＡ祷型に
ついてのＲＮＡポリメラーゼの使用〔マニアテイス（Ｍ
ａｎｉａｔ、ｉｓ）外、１９８２モレキユラー・クロー
ニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｕｎｎｉｎｇ） 、ア・
ラボラトリイ・マニ二アル ゛（Ａ Ｌａｂｎｒａｔｎ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング＋１ ハ
ーバ−研究所（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒＬ
ａｂｎｒａｔｎｒｙ） 、 ニュー ヨーク州、コール
）”＠、Ｘプリン／拳ハーバー２私書箱１００）；が含
まれる。
存在するポリヌクレオチドの官能化
ポリヌクレオチドは、例えば、ＢＳＰＳＥ （ランデ
ス（Ｌａｎｄｅｓ ） ＊ 前述〕を用いる、主にアデ
ニンおよびシトシン残基でのアルキル化によって化学的
に変形されることができる。別法として、先に標識付け
したポリヌクレオチドまたはポリリジンは、例えば、カ
ルボジイミド結合〔・・ロラン（Ｈａｌｌｎｒａｎ）外
、ジャーナル・オメ・イムノロシイ（Ｊｒ＋ｕｒｎａｌ
ｎｆ 工ｍｍｕｎｎｌｏｇｙ）、 ９６ ： ３７３
゜１９６６） を用いて、第二のポリヌクレオチドに
共有結合により結合させることができる。ポリリジンは
また、ここに参照されているワード’（Ｗａｒｄ）のヨ
ーロッパ特許第００６３８７９号によシ記載されている
ように標識付けの前にｇ ＩＪヌクレオチビの５１末端
に結合させることもできる。
ス（Ｌａｎｄｅｓ ） ＊ 前述〕を用いる、主にアデ
ニンおよびシトシン残基でのアルキル化によって化学的
に変形されることができる。別法として、先に標識付け
したポリヌクレオチドまたはポリリジンは、例えば、カ
ルボジイミド結合〔・・ロラン（Ｈａｌｌｎｒａｎ）外
、ジャーナル・オメ・イムノロシイ（Ｊｒ＋ｕｒｎａｌ
ｎｆ 工ｍｍｕｎｎｌｏｇｙ）、 ９６ ： ３７３
゜１９６６） を用いて、第二のポリヌクレオチドに
共有結合により結合させることができる。ポリリジンは
また、ここに参照されているワード’（Ｗａｒｄ）のヨ
ーロッパ特許第００６３８７９号によシ記載されている
ように標識付けの前にｇ ＩＪヌクレオチビの５１末端
に結合させることもできる。
アクリジンエステルの付加
１またはそれ以上の反応性第一アミン基を用いて官能化
されたポリヌクレオチド９は、下記の実施例に示すよう
に、アクリジンエステルで容易に標識付けされる： 実施例 ポリヌクレオチドの標識付けの前に、アクリジンエステ
ルのは下に示すようにして合成されるニアクリジン−９
−カルボ／ｒ１！（８７０ｒｎ９）を塩化チオニル（ｌ
ＯｍＪ）に加え、混合物を３時間油浴中で還流させる
。この反応混合物を回転蒸発器上で真空蒸発させ、転像
残留物を６０℃よシ低温に加熱しながら無水ピリジン（
５０ｍ／）中に再溶解させる。この溶液を水浴中でｌ”
Ｌぼ２０℃に冷却した。ｐ−ヒドロキシフェニルプロピ
オン酸ｎ−ヒドロキシこはく酸イミビエステル（１ｇ）
を無水ピリジン（ｌＯ＋＋＋／）に溶解させ、かくはん
しながら、上記のアクリジン−９カルボン酸塩化物−ピ
リジン溶液に加える。この反応混合物を１５−３０℃で
ほぼ３０分間かくはんした後、かくはんしながら氷水（
２５０ｒｄ”）中に注ぐ。この混合物を分液ロート中に
移して酢酸エチル（２５０ｘｔ）で抽出する。有機相を
分離し、無水硫酸す） ＩＪウム上で乾燥させ、濾過し
て、真空蒸発させる。残留物を無水トルエン（５０ｒ）
）から３回蒸発させて、無水ジメトキシエタン（５ＯＷ
ｌ）に再溶解させる。こうして得られる溶液を、光線を
通さない容器で約１５時間１５−３０℃に置く。この保
温中に形成されるすべての沈殿を濾去し、溶液をシリカ
ゲルカラム（３００グラム）にかけ、溶離溶媒として酢
酸エチルおよびヘキサン（２：１）の溶液を用いてフラ
ッシュクロマトグラフィー〔ダブリュー・シー・ステイ
ル（Ｗ、Ｃ，５ｔｉｌｌ）外、ゼネラルφオプ・オーガ
ニック・ケミストリイ（Ｇｅｎｅｒａｌ ｎｆ Ｏｒｇ
ａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９７８） 。
されたポリヌクレオチド９は、下記の実施例に示すよう
に、アクリジンエステルで容易に標識付けされる： 実施例 ポリヌクレオチドの標識付けの前に、アクリジンエステ
ルのは下に示すようにして合成されるニアクリジン−９
−カルボ／ｒ１！（８７０ｒｎ９）を塩化チオニル（ｌ
ＯｍＪ）に加え、混合物を３時間油浴中で還流させる
。この反応混合物を回転蒸発器上で真空蒸発させ、転像
残留物を６０℃よシ低温に加熱しながら無水ピリジン（
５０ｍ／）中に再溶解させる。この溶液を水浴中でｌ”
Ｌぼ２０℃に冷却した。ｐ−ヒドロキシフェニルプロピ
オン酸ｎ−ヒドロキシこはく酸イミビエステル（１ｇ）
を無水ピリジン（ｌＯ＋＋＋／）に溶解させ、かくはん
しながら、上記のアクリジン−９カルボン酸塩化物−ピ
リジン溶液に加える。この反応混合物を１５−３０℃で
ほぼ３０分間かくはんした後、かくはんしながら氷水（
２５０ｒｄ”）中に注ぐ。この混合物を分液ロート中に
移して酢酸エチル（２５０ｘｔ）で抽出する。有機相を
分離し、無水硫酸す） ＩＪウム上で乾燥させ、濾過し
て、真空蒸発させる。残留物を無水トルエン（５０ｒ）
）から３回蒸発させて、無水ジメトキシエタン（５ＯＷ
ｌ）に再溶解させる。こうして得られる溶液を、光線を
通さない容器で約１５時間１５−３０℃に置く。この保
温中に形成されるすべての沈殿を濾去し、溶液をシリカ
ゲルカラム（３００グラム）にかけ、溶離溶媒として酢
酸エチルおよびヘキサン（２：１）の溶液を用いてフラ
ッシュクロマトグラフィー〔ダブリュー・シー・ステイ
ル（Ｗ、Ｃ，５ｔｉｌｌ）外、ゼネラルφオプ・オーガ
ニック・ケミストリイ（Ｇｅｎｅｒａｌ ｎｆ Ｏｒｇ
ａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９７８） 。
第４３巻、２９２３）によシ精製する。純粋な分画を合
わせて、テフロン（Ｔｓｆｌｎｎ） ４７ ｔｒｙｓ
０．４５μｍフィルターを通して清適し、真空蒸発させ
る。
わせて、テフロン（Ｔｓｆｌｎｎ） ４７ ｔｒｙｓ
０．４５μｍフィルターを通して清適し、真空蒸発させ
る。
収率はほぼ３６％である。これを無水クロロホルム（２
５＋、ｘｌ ）に再溶解させ、混合物にフルオルスルホ
ン酸メチル（１，１ｍ１）を加えて、１５−３０℃で約
２０時間かくはんする。形成される沈殿を濾去し、無水
トルエンで３回すしてジメトキシエタンで２回洗浄する
。乾燥させた結晶を乾燥させ、−２０℃で光から保護し
て貯蔵する。最終的な収量は、純粋なアクリジンエステ
ル１２３ ）１ぼ５５６■である。
５＋、ｘｌ ）に再溶解させ、混合物にフルオルスルホ
ン酸メチル（１，１ｍ１）を加えて、１５−３０℃で約
２０時間かくはんする。形成される沈殿を濾去し、無水
トルエンで３回すしてジメトキシエタンで２回洗浄する
。乾燥させた結晶を乾燥させ、−２０℃で光から保護し
て貯蔵する。最終的な収量は、純粋なアクリジンエステ
ル１２３ ）１ぼ５５６■である。
官能化ＤＮＡ（構造（２２に示されたように両端を第一
アミン基で官能化されだ３３塩基対の、ｌ ＩＪヌクレ
オチビ）１００μ９を、水（１９０μｌ）、ＮａＣ１（
５Ｍ溶液ｔｏμｌ）およびＮａＨＣＯ３（５チ溶液２５
μｌ）と混合する。０，１０および２０分で、アクリジ
ンエステル（２り（ンメチルホルムアミビ中の６０μＭ
原液８３μｌ）を加える。
アミン基で官能化されだ３３塩基対の、ｌ ＩＪヌクレ
オチビ）１００μ９を、水（１９０μｌ）、ＮａＣ１（
５Ｍ溶液ｔｏμｌ）およびＮａＨＣＯ３（５チ溶液２５
μｌ）と混合する。０，１０および２０分で、アクリジ
ンエステル（２り（ンメチルホルムアミビ中の６０μＭ
原液８３μｌ）を加える。
さらに１０分後に、Ｎａ（Ｊ （２００ｍＭ）を含有す
るクエン酸塩（１００ｍＭ溶液５００Ａ７．ｐＨ５，５
）を加える。こうして得られる標識付けしたポリヌクレ
オチドを、Ｎａ（Ｊ（２００ｍＭ）を廿有するクエン酸
塩（ｌ ＯＯｍＭ、 ｐＥ（５）で平衡させたセファ
デクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ ２５カラム上で精製し
た。
るクエン酸塩（１００ｍＭ溶液５００Ａ７．ｐＨ５，５
）を加える。こうして得られる標識付けしたポリヌクレ
オチドを、Ｎａ（Ｊ（２００ｍＭ）を廿有するクエン酸
塩（ｌ ＯＯｍＭ、 ｐＥ（５）で平衡させたセファ
デクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ ２５カラム上で精製し
た。
１ ｕ
ポリヌクレオチド鎖
のポリヌクレオチドゝが得られる。
■ま光はそれ以上のアミノプロピル基で官能化されたポ
リヌクレオチド〔モツク（Ｍｎｃｋ） 外、前述、参照
〕を、発光ランタニドがこのポリヌクレオチげに結合す
ることができるように、発光ランタニドヤレートと混合
する。例えば、ポリヌクレオチド５０μ９（構造器に示
されている）を、トリエチルアミン（５μ９）および式
： のユーロピウムキレート（３１５μ９．硼酸ナトリウム
緩衝液０．２ Ｍ、 ｐ）１９．５に溶解させたもの
）と混合して、１５°−３０℃に３時間放置する。
リヌクレオチド〔モツク（Ｍｎｃｋ） 外、前述、参照
〕を、発光ランタニドがこのポリヌクレオチげに結合す
ることができるように、発光ランタニドヤレートと混合
する。例えば、ポリヌクレオチド５０μ９（構造器に示
されている）を、トリエチルアミン（５μ９）および式
： のユーロピウムキレート（３１５μ９．硼酸ナトリウム
緩衝液０．２ Ｍ、 ｐ）１９．５に溶解させたもの
）と混合して、１５°−３０℃に３時間放置する。
この標識付けしたポリヌクレオチドを、硼酸ナトリウム
（０，１Ｍ、ｐＨ８，０）で平衡させたセファデクス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ ５０−８０カラム上で精製
し、必要があれば、移動相として酢酸トリエチルアンモ
ニウム（０，１Ｍ、 ｐＨ７，０） およびアセト
ニトリルの混合物を用いる逆相ＨＰＬＣによシ゛さらに
精製する。この方法によれば、構造：■ のポリヌクレオチドが形成される。別の出発キレートを
使用すると、上記の方法で構造：Ｑ−ＮＨ−［（−Ｌ または Ｑ−ＮＨ−Ｃ−Ｌ ＮＨ （ここでｌ≦ｎ＜ｉ ｏ ） または Ｑ、−ＮＨ−Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（ここでｌ
≦ｎ≦１０） またば Ｑ−１（Ｈ−ＣＨ２ＴＣＨ２−Ｌ（ここでＱは
ポリヌクレオチドであり、Ｌば である） （ここでｌ≦ｎ≦１０） ＣＨ−Ｃｏ − （Ｅ ｕ３ ＋ ） ＯＨ 罰 ■ または ２〈尤＜１０．） のポリヌクレオチドが形成されることになるであろう。
（０，１Ｍ、ｐＨ８，０）で平衡させたセファデクス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ ５０−８０カラム上で精製
し、必要があれば、移動相として酢酸トリエチルアンモ
ニウム（０，１Ｍ、 ｐＨ７，０） およびアセト
ニトリルの混合物を用いる逆相ＨＰＬＣによシ゛さらに
精製する。この方法によれば、構造：■ のポリヌクレオチドが形成される。別の出発キレートを
使用すると、上記の方法で構造：Ｑ−ＮＨ−［（−Ｌ または Ｑ−ＮＨ−Ｃ−Ｌ ＮＨ （ここでｌ≦ｎ＜ｉ ｏ ） または Ｑ、−ＮＨ−Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（ここでｌ
≦ｎ≦１０） またば Ｑ−１（Ｈ−ＣＨ２ＴＣＨ２−Ｌ（ここでＱは
ポリヌクレオチドであり、Ｌば である） （ここでｌ≦ｎ≦１０） ＣＨ−Ｃｏ − （Ｅ ｕ３ ＋ ） ＯＨ 罰 ■ または ２〈尤＜１０．） のポリヌクレオチドが形成されることになるであろう。
検出
標的ホＩＪヌクレオチドへの標識付けされたポリヌクレ
オチビプローブのハイブリット９形成は、ポール（Ｐａ
ｌｌ）ナイロンフィルターまたはそれらの同等物に関す
る標準方法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ）外、
前述〕Ｋより実施した。結合された発光ランタニドで標
識付けしたポリヌクレオチドは、ＬＫＢ蛍光計による時
間分割蛍光を使用して測定“°これは試料中の標的ｙＮ
＋）ヌクレオチドの尺つる０シグナルの強化は、標識
付けしたフィーにＬＫＢ”強化１溶液を加えることによ
つ１することができる。
オチビプローブのハイブリット９形成は、ポール（Ｐａ
ｌｌ）ナイロンフィルターまたはそれらの同等物に関す
る標準方法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ）外、
前述〕Ｋより実施した。結合された発光ランタニドで標
識付けしたポリヌクレオチドは、ＬＫＢ蛍光計による時
間分割蛍光を使用して測定“°これは試料中の標的ｙＮ
＋）ヌクレオチドの尺つる０シグナルの強化は、標識
付けしたフィーにＬＫＢ”強化１溶液を加えることによ
つ１することができる。
アクリジンエステル
１されるべき試料のホＩＪヌクレオチドは、標二よって
普通にニトロセルロースフィルターボさせられた後、次
のようにハイブリッド形成させられる： これらのフィルターは、フィルタ−１立方センチメート
ルあたり１００μｌの予備ハイブリッド緩衝液を用いて
、４８℃で２時間予備ノ・イズリツ１した後、４８℃の
アクリジンエステルで標識付けしたオリゴマープローブ
（１ｄあたり５０℃ｇ）を含む緩衝液中で、遮断剤とし
てメチル硫酸メトキシフェナジンを用いるかまたは用い
ないで、２時間ハイブリッド形成させる。この予備ハイ
ブリッドおよびハイブリッド形成緩衝液は、塩化テトラ
メチルアンモニウム（０，９Ｍ）、クエン酸ナトリウム
（５０ｍＭ）、デフ ハーノ（Ｄｅｎｈａｒ ｔｓ ）
（５Ｘ）、５ＤＳ（Ｑ、１％）、ピロリン酸ナトリウム
（０，１％ ）、および大腸菌（Ｅ、ｃｎｌｌ） ｔＲ
ＮＡ（５０η／罰原液Ｌ ｍ、ｌあたり２μｌ）より成
っている。次にフィルターを１５−３０℃で、クエン酸
ナトリウム（ｌ ＯＯｒｎ！Ｊ、 ｐＨ６，５）を含
有する塩化テトラメチルアンモニウム（０，９Ｍ ’）
中で４回５分間洗浄する。次に、ポリヌクレオチドが結
合されている領域を切り取って、１２Ｘ４７＋＋Ｌ！ｎ
プリスチレン管に入れた酢酸ナトリウム（１０ｍＭ。
普通にニトロセルロースフィルターボさせられた後、次
のようにハイブリッド形成させられる： これらのフィルターは、フィルタ−１立方センチメート
ルあたり１００μｌの予備ハイブリッド緩衝液を用いて
、４８℃で２時間予備ノ・イズリツ１した後、４８℃の
アクリジンエステルで標識付けしたオリゴマープローブ
（１ｄあたり５０℃ｇ）を含む緩衝液中で、遮断剤とし
てメチル硫酸メトキシフェナジンを用いるかまたは用い
ないで、２時間ハイブリッド形成させる。この予備ハイ
ブリッドおよびハイブリッド形成緩衝液は、塩化テトラ
メチルアンモニウム（０，９Ｍ）、クエン酸ナトリウム
（５０ｍＭ）、デフ ハーノ（Ｄｅｎｈａｒ ｔｓ ）
（５Ｘ）、５ＤＳ（Ｑ、１％）、ピロリン酸ナトリウム
（０，１％ ）、および大腸菌（Ｅ、ｃｎｌｌ） ｔＲ
ＮＡ（５０η／罰原液Ｌ ｍ、ｌあたり２μｌ）より成
っている。次にフィルターを１５−３０℃で、クエン酸
ナトリウム（ｌ ＯＯｒｎ！Ｊ、 ｐＨ６，５）を含
有する塩化テトラメチルアンモニウム（０，９Ｍ ’）
中で４回５分間洗浄する。次に、ポリヌクレオチドが結
合されている領域を切り取って、１２Ｘ４７＋＋Ｌ！ｎ
プリスチレン管に入れた酢酸ナトリウム（１０ｍＭ。
ｐＨ４，７５のもの５０−）で処理する。試料を、注入
試薬として過酸化水素（０，１％ ）を含有するＮａＯ
Ｈ（０，ｌ Ｍのもの１０（ｉｔ／）を用イーＣ、ベル
トールド（Ｂｅｒｔｂｎｌｄ） ９５００ Ｔ光子計数
装置で、化学発光ングナルについて測定する（ピーク領
域積分型）。得られる形を、ポリヌクレオチドを含まな
かったフィルターから得られたものと比較する。遮断剤
試薬は、非特異結合を消去する。
試薬として過酸化水素（０，１％ ）を含有するＮａＯ
Ｈ（０，ｌ Ｍのもの１０（ｉｔ／）を用イーＣ、ベル
トールド（Ｂｅｒｔｂｎｌｄ） ９５００ Ｔ光子計数
装置で、化学発光ングナルについて測定する（ピーク領
域積分型）。得られる形を、ポリヌクレオチドを含まな
かったフィルターから得られたものと比較する。遮断剤
試薬は、非特異結合を消去する。
その他の具体化は前記の特許請求の範囲内にある。
Claims (13)
- （１）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中にアクリ
ジンエステルまたは発光ランタニドを組み入れることよ
り成る、アイソトープを用いないで標識付けしたヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチドを合成する方法。 - （２）アクリジンエステルが構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔは、飽和脂肪族鎖、不飽和脂肪族鎖、サルフ
ァイト基を含有する脂肪族鎖、アミド基を含有する脂肪
族鎖、２つのヒドロキシル基を含有する脂肪族鎖から選
択され、Ａは離脱基である） を有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３）発光ランタニドが、式（１）または（２）：▲数
式、化学式、表等があります▼（１） 〔式中、Ｚは、 （ａ）Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、 （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここでＷは
ハロゲンである）、 （ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｄ）Ｎ＿３ （ｅ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＶはアルキル基またはフェニル基であり、１≦
ｎ≦１０） （ｆ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここで１≦
ｎ≦１０）および （ｇ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここで１≦
ｎ≦１０）； から選択され、そしてＹは （ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼ および（ｂ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでｎ、ｍおよびｐは各々別個に２−４である） から選択される〕； ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （ここで２≦ｎ≦１０および２≦ｍ≦４） の化合物でキレート化されているものである、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 - （４）Ａ成分が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の構造を有している、特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 - （５）アクリジンエステルまたは発光ランタニドで標識
付けされた第一ヌクレオチドまたは第一ポリヌクレオチ
ド。 - （６）ランタニドがユーロピウム、テルビウムまたはサ
マリウムである、特許請求の範囲第５項に記載の第一ヌ
クレオチドまたは第一ポリヌクレオチド。 - （７）ユーロピウムをキレート化することができる基で
標識付けされたヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。 - （８）キレート団が、 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでｎ、ｍおよびｐは各々別個に２−４である） または ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで２≦ｍ≦４） である特許請求の範囲第７項に記載のヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド。 - （９）アクリジンエステルが、第一ヌクレオチドまたは
第一ポリヌクレオチド上のアミン基に化学的に結合して
いる、特許請求の範囲第６項に記載の上記第一ヌクレオ
チドまたは第一ポリヌクレオチド。 - （１０）下記アミン基を包含する第二ヌクレオチドまた
は第二ポリヌクレオチドを下記第一ヌクレオチドまたは
第一ポリヌクレオチドに化学的にまたは酵素を用いて結
合させることにより、アミン基が第一ヌクレオチドまた
は第一ポリヌクレオチドに導入されたものである、特許
請求の範囲第９項に記載の第一ヌクレオチドまたは第一
ポリヌクレオチド。 - （１１）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがユーロ
ピウム、テルビウムまたはサマリウムにキレート化され
ている、特許請求の範囲第８項に記載のヌクレオチドま
たはポリヌクレオチド。 - （１２）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを化学的
に変形し、アクリジンエステルまたは発光ランタニドを
この変形されたヌクレオチドまたは変形ポリヌクレオチ
ドに結合させることより成る、特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 - （１３）上記変形が、上記ヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドの塩基のアルキル化である、特許請求の範囲第
１２項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76603885A | 1985-08-15 | 1985-08-15 | |
| US766038 | 1985-08-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6239598A true JPS6239598A (ja) | 1987-02-20 |
| JP2509574B2 JP2509574B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=25075208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61191191A Expired - Lifetime JP2509574B2 (ja) | 1985-08-15 | 1986-08-14 | 標識付けした核酸 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0212951B1 (ja) |
| JP (1) | JP2509574B2 (ja) |
| AT (1) | ATE94557T1 (ja) |
| DE (1) | DE3689019T2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0217445A (ja) * | 1988-05-02 | 1990-01-22 | Perkin Elmer Corp:The | ランタニド標識ヌクレオチドの時間分解型螢光分析検出法 |
| JPH04503403A (ja) * | 1988-09-20 | 1992-06-18 | アメリカ合衆国 | ５′―結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシヌクレオチド |
| JPH04121239U (ja) * | 1991-02-16 | 1992-10-29 | 武内プレス工業株式会社 | 通 箱 |
| JP2003517426A (ja) * | 1997-08-21 | 2003-05-27 | メイン メディカル センター | 過酸化物に基づく化学発光の検量方法、並びにそのために用いる化合物 |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4948882A (en) * | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| JPS6261969A (ja) * | 1985-09-06 | 1987-03-18 | アモコ・コーポレーション | アクリジニウムエステルの合成法 |
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| SE454781B (sv) * | 1986-10-17 | 1988-05-30 | Wallac Oy | Hybridiseringsforfarande for detektion av polynukleotidsekvens |
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| ES2074051T3 (es) * | 1987-09-21 | 1995-09-01 | Gen Probe Inc | Ensayo de proteccion homogeneo. |
| US5283174A (en) * | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
| US6004745A (en) * | 1987-09-21 | 1999-12-21 | Gen-Probe Incorporated | Hybridization protection assay |
| AU619223B2 (en) * | 1987-10-05 | 1992-01-23 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
| US5185439A (en) * | 1987-10-05 | 1993-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
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