JP4211948B2 - 標的核酸配列の増幅方法 - Google Patents
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Description
本発明は、標的核酸配列の増幅方法に関する。
文献：EP-A-0 285 057は、ヌクレオチドの構成要素、すなわち糖、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸エステル基の１つに種々の用途、特に標識の用途を持つ官能基を導入することからなる核酸処理方法を開示している。このように処理されて得られたヌクレオチドは、該文献によれば、ポリヌクレオチドに、特にこのヌクレオチドの存在により不安定になる二重らせんを有することなく二本鎖型へと組み込むことができた。
しかしながらこの場合、先行技術によれば、ヌクレオチドに結合している官能基は、立体障害、疎水性相互作用または複合現象などの種々の現象を示し、これらが、該処理ヌクレオチドを組み込んだポリヌクレオチドが、該処理ヌクレオチドが組み込まれていない相当するポリヌクレオチドを認識するであろう大部分の酵素によって認識されることを妨げるものである。
文献：WO−A−９２／００９８９は、標的核酸を増幅させることによって、特に標識されたプローブを得るために、核酸配列を標識するための蛋白質を使用する方法を提案している。該方法によれば、反応性官能基の存在によって天然のヌクレオチドとは異なる修飾ヌクレオチドが使用され、増幅は予め官能化されたプローブを得るために行われ、得られたプローブは蛋白質レベルと反応性官能基によって反応するものである。最後に、修飾ヌクレオチドの反応性官能基は、適当な箇所において保護されていてもよいチオール官能基およびアミノ官能基から選択された求核性官能基である。
該方法の欠点は、幾千のオーダーである分子量を有することによって、その大きさのために、該標識と該官能基との間の共有結合の収率および／または速度が実質的に制限されてしまうことにあり、該問題点は、プローブに組み込まれた修飾ヌクレオチドの数が増すにつれてより問題となるものである。さらに、該標識は、得られたプローブが含有されている反応、特にハイブリダイゼーションを減速してしまう可能性がある。
本発明は、前記の欠点を解消し、特にヌクレオチドの組み込みを妨害せず、その結果として標的とする増幅反応における収率および／または感受性に有意な影響を示さず、さらには標識の組み込みに従来付随していた標識の不安定現象を回避することにより、増幅産物の優れた標識を得ることを可能にする増幅方法を提供する。
かくして、本発明は、
−標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、１以上のヌクレオチド酵素活性とが少なくとも得られ、
−特に、単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的配列を増幅させる、
標的核酸配列の増幅方法であって、
少なくとも１つの予め官能化したヌクレオチドを含む予め官能化した増幅産物を得るために、少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも、保護されておらず、かつ、そのヌクレオチドの塩基の所定の部位の少なくとも１つに配置されている、少なくとも１つの共有反応官能の存在により、他のヌクレオチドとは異なる予め官能化したヌクレオチドであることを特徴とする方法に関する。
本発明の有利な方法によれば、この方法はさらに、
−予め官能化したヌクレオチドの反応性官能に特異的な共有結合性の抗反応官能と官能基を含んでなる試薬が得られ、
−官能化した増幅産物を得るために、予め官能化した増幅産物を該試薬と直接または間接的に反応させる行程を含んでなる。
本記載中で用いられるいくつかの用語を以下に定義し、その後、本発明を詳細に説明する。
本発明のヌクレオチドは以下に定義される天然または修飾ヌクレオチド単量体と理解される。
このように、該ヌクレオチド単量体は、その構成要素が糖と、リン酸エステル基と、窒素塩基である天然の核酸ヌクレオチド（その糖はＲＮＡにおいてはリボースであり、またＤＮＡにおいては2’-デオキシリボースであり；その核酸がＤＮＡかＲＮＡかによって、窒素塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択されている）であってもよいし；または、３つの構成要素のうち少なくとも１つで修飾されているヌクレオチドであってもよく（例示すれば、その修飾は、イノシン、メチル-5-デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ-5-デオキシウリジン、ジアミノ-2,6-プリンまたはブロモ-5-デオキシウリジンなどの修飾生成物、およびハイブリダイゼーションが可能な他の種々の修飾塩基が生じてもよい塩基のレベルで、糖のレベル、すなわち例えば少なくとも１つのデオキシリボースでの類似体による置換（例えば：P.E. Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500（1991））で、リン酸エステル基、例えばボロネート、アルカリホスホネートまたはホスホロチオエート誘導体のレベルで起こってもよい。
保護基は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの化学合成において従来より使用される基として理解される（例えば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Leroy B. Townsend編, Plenum Press, New York and LondonおよびProtocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Sudhir Agrawal編, Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照）。
本発明の標識官能基は検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じることができる分子である。この基は特に放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびb-ガラクトシダーゼから選択される酵素、ならびに発色団、発色、蛍光団、蛍光または発光化学化合物、発色、蛍光または発光基質を加水分解できる酵素から選択される酵素、ヌクレオチド塩基類似体およびビオチンなどのリガンドから選択される。
該標識が直接シグナルを生じることができない場合、例えば該標識が酵素である場合は、視認化物質、例えば検出可能な複合体、例えば発色化合物または発光化合物を生じる酵素／基質反応を伴う酵素に対応する基質を加える必要がある。例示すれば、該視認化試薬はオルト-フェニレンジアミンまたはリン酸4-メチルアンベリフェリルであってよい。
この予め官能化したヌクレオチドの共有結合性官能基とこの試薬の抗反応官能基は、それぞれ求電子性および求核性有機化学官能基であり、この逆であってもよい。
該求電子性有機化学官能基は、有利にはアルデヒド、活性化エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、ハロアシル誘導体および塩化スルフォニル官能基から選択される。
該求核性有機化学官能基は、有利にはアミノ、チオール、オキシアミノ、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され；好ましくはそれはアルコキシアミノ官能基である。
本発明の１つの変法によれば、修飾されたヌクレオチドの共有結合性官能基はカップリングアームにより塩基に結合されており、かつ／または該試薬の共有結合性の抗反応官能基はカップリングアームにより該官能基に結合している。
該カップリングアームは、特に飽和または不飽和ヒドロカーボン鎖から選択され、適切なところにアミノ、アミドおよびオキシ官能基が挿入されている。
好ましい方法によれば、該共有結合性官能基はオキシアミノ官能基であり、該試薬の共有結合性抗反応官能基はアルデヒド官能基であり、この後者は蛍光または発光官能基などの標識官能基に結合している。
アルデヒド官能基をカップリングアーム-NH-CS-NH-（CH2）3-により官能基に結合させることが有利であり、この試薬の官能基はフルオレセインである。
予め官能化したヌクレオチド産物は、１以上のヌクレオチドを組み込んだ１以上の同一または異なる共有結合性官能基を含んでなればよい。該共有結合性官能基は１以上の同一または異なる試薬と同時に、あるいは順次に反応させることができる。官能化された生成物の標識官能官能基は同時に、あるいは順次に検出することできる。
この標識方法は、特に異なる標的に由来する予め官能化した産物を識別するために、予め官能化した１以上のヌクレオチド産物に適用され得る。
標識された官能化増幅産物は、均一相または不均一相にて、定性的かつ／もしくは定量的に検出することができる。
均一相において、この試薬と予め官能化したヌクレオチド産物とは、同じ液体培地中で相互作用する。不均一相においては、この予め官能化した産物は、固体の支持体に取り込ませる前、または取り込ませた後に試薬と反応させることができ、すなわち直接的または間接的といわれる。固体支持体への取り込みは、吸着、共有結合など公知の手段を用いて、特に固体支持体の表面に用いることのできる共有結合性の抗反応官能基を用いて、またはポリヌクレオチド化合物を用いるハイブリダイゼーションにより達成できる。
管、円錐、くぼみ、マイクロ滴定プレート、シート、チップまたは可溶性ポリマーなどの適した形態の固体支持体はすべて、ポリスチレン、スチレン-ブタジエン共重合体、ポリスチレンを配合したスチレン-ブタジエン共重合体、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン-アクリロニトリル共重合体およびスチレン-メチル＝メチルメタクリレート共重合体から、合成繊維および天然繊維から、多糖類およびセルロース誘導体から、さらにはガラスおよび珪素およびそれらの誘導体から選択される。
本発明の方法の好ましい変法によれば、
標的核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、酵素活性はＲＮＡ依存性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含んでなり、
該酵素活性はさらに、一連の逆転写、転写および消化（digestion）反応に従い、標的核酸配列を増幅させるためのリボヌクレアーゼH活性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を含んでなる。
リボヌクレアーゼHおよびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、ある単一の酵素または互いに異なる酵素により提供されてもよい。
例示すれば、本発明の方法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）またはTMA（転写介在増幅（transcription-mediated amplification））、またはNASBA（核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification））法、もしくは他の酵素増幅法などの当業者に公知の技術に従い、サンプル中の標的核酸を増幅させるために使用することができる。
本発明はまた、予め官能化され、かつ、酵素処理を受けることが可能なヌクレオチド類似体または核酸に関する。
核酸類似体またはヌクレオチドの酵素処理は、その活性がヌクレオチドに結びつけられている少なくとも１つの酵素が関与する間のin vivoまたはin vitroのすべてを含む。このように、それは、ヌクレオチドが、酵素工程中、形質転換されていようといまいと、酵素に対する基質として働く少なくとも１種の酵素工程のあらゆる反応を含んでなり；例示すれば、このような工程は転写、連結反応、伸長および制限などの分子生物学技術で、さらに特には増幅技術（WINN-DEEN, Journal of Clinical Assay, 第19巻, 21-26頁（1996））で使用されるものから選択される。
このように、その活性がヌクレオチドに結びつけられている酵素は、網羅的ではないが特に以下のリストから選択される：大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Taqポリメラーゼ、T7、T4またはT5ＤＮＡポリメラーゼ、a、bおよびgウイルスまたは真核細胞ポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；AMV（トリ骨髄芽球症ウイルス）およびMMLV（モロニーマウス白血病ウイルス）ポリメラーゼなどのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；T7、T3、SP6、N4およびPBSIIＲＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ；制限エンドヌクレアーゼおよびＲＮアーゼ（ＲＮAse）Hなどのヌクレアーゼ活性を有する酵素；またはQ-ベータレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼまたはリガーゼなどのその他のポリAポリメラーゼ、レプリカーゼ。
好ましい具体例によれば、ここに参照して組み入れられる国際出願WO91/01384に記載されている、標的ＲＮＡ核酸配列を増幅させる、または逆転写工程の後に標的ＤＮＡ核酸配列を増幅させるTMA技術が本発明の方法を適用するために選択される。
本発明によって予め官能化した核酸類似体は式（I）
｛式中、
Bは核塩基を表し、
Zはカップリングアームを表し、
nは0または1に等しい整数であり、
Xは核塩基B中の少なくとも１つの部位に結合している共有結合性反応性官能基を表し、
R1はHまたはOHを表し、
R2はH、OH、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基、もしくはO-R基（ここでRは保護基を表す）を表し、
R3はH、保護基、または一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基を表す｝に相当する。
好ましくは、R1およびR2は各々互いに独立にHまたはOHを表し、かつ、R3は一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基を表す。
本発明の予め官能化したヌクレオチドは以下のヌクレオチドから選択される：
−その核塩基がシトシンから誘導され、ピリミジン環の4位の少なくともアミノ基において、保護されておらず、かつ、該ヌクレオチドの酵素処理に有意な影響を有さない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応性官能基を含み、該共有結合性反応性官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され、かつ、該共有結合性官能基が、（-CH2-）n1および（-O-CH2-）n1（ここで、n1は1から12までの間の整数である）；（-CH2-O-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2および（-CH2-O-CH2-CH2-）n2（ここで、n2は1から6までの間の整数である）；および-NH-CH2-O-CH2-CH2から選択されるカップリングアームによりピリミジン環の4位にある該アミノ基に結合している核酸。該共有結合性官能基は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-およびNH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利である。
−その塩基がウラシルから誘導され、少なくともピリミジン環の5位に、保護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴とし；該共有結合性反応官能基が、-C≡C-CH2-および-C≡C-CH2-NH-CO-CH2-、-CH=CH-CH2-NH-CO-CH2-および-CH2=CH-CH2から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利である核酸。
−その塩基がアデニンから誘導され、ピリミジン環の6位の少なくともアミノ基において、保護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴とし；該共有結合性反応官能基が、（-CH2-）n1および（-O-CH2-）n1（ここで、n1は1から12までの間の整数を表す）；（-CH2-O-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2および（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2（ここで、n2は1から6までの間の整数を示す）；および（NH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームによって該アミノ基に結合しているヌクレオチド。該共有結合性反応官能基は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-およびNH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利であり；好ましくは該カップリングアームは-CH2-CH2-CH2-CH2-である。
本発明はまた、酵素的増幅処理における、前記定義に同じ予め官能化したヌクレオチドの使用に関する。
酵素処理に関しては、予め官能化したヌクレオチド類似体またはヌクレオチドの挙動は、これに対応するヌクレオチド類似体またはヌクレオチドのそれと多かれ少なかれ同じである。これは、酵素に関して生物学的、また化学的に不活性である結果、該類似体またはヌクレオチドの塩基中の部位に導入されている官能基が、その基質に関する酵素の親和性または特異性のいずれかを有意に修飾しないことによるものである。
最後に本発明は、すでに定義したようなヌクレオチドの特殊な使用に関する。好ましくは、それらは以下の文献：EP-0 721 988、WO-95/03426、US-5 409 818およびUS-5 399 491に記載されたものなどの増幅法に使用される。
以下、実施例および添付図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
図1は、4位にアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図2は、4位にアルキルオキシアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図3は、アミノ交換によるヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図4は、TMAの感受性におけるCTP-（N4）-C6O2-NH2（27a）の組み込みの効果を示す。
図5は、TMAの感受性におけるCTP-（N4）-C4-NH2（27b）の組み込みの効果を示す。
前記図4および5において、反応あたりの標的コピー数はx軸で示され、反応液（最終反応容量=100マイクロリットル）マイクロリットルあたりの得られた増幅数はy軸で示されている。凡例、例えば、■、□、▲、○、●およびパーセンテージは図4および5の曲線に与えられている。このパーセンテージはTMA増幅反応における天然ヌクレオチドと比較した場合の、予め官能化したヌクレオチドのパーセンテージに相当する。図4および5はそれぞれ、それら各々の天然ヌクレオチドと比較した場合の、種々の比率の27aおよび27bヌクレオチドの存在下で、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）16S ＲＮＡの標的領域から生じた増幅数の、ELOSA法（PCT特許出願WO92/19812に記載）による半定量化の結果を示す。
本発明のいくつかの利点を示す以下の実施例では標識のための官能基を含む試薬について言及するが、もちろん本発明の範囲はこのような特性を持つ官能基に限定されるものではないことが理解されよう。
標識および予め官能化されたヌクレオチドの合成
ヌクレオベースにおけるヌクレオチドを予め官能化するために一般的に使用されている方法は、保護されている反応性官能基を有する保護されたヌクレオシドを合成することからなる。５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修飾ヌクレオシドが遊離し、これは最終的にはLudwig−Eckstein法（J. Ludwig, F.Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）を用いて該部位においてトリホスホリル化される。
２’および３’ヒドロキシル官能基を保護し、しかもベースに導入された鎖の反応性官能基を保護している基の加水分解によって、予め官能化したヌクレオチドトリホスファートが得られる。
I−アデノシン系列
実施例１：アミノ鎖（４）を有するヌクレオシドの合成
合成法：
アデノシンの官能化および保護：
イソプロピリデン（１）：（Nucleic Acid Chemistry, part 2. Townsend, Tipson, p. ７６８, Wiley Interscience）
エチル＝オルトホルマート（１２．４４ml，７４．８mmol）を、アルゴン雰囲気下、APTS（３．９ｇ，２０．６mmol）を含むアセトン（１０ml）中のアデノシン（５g，１８．７mmol，アルドリッチ１４６５９−５）の懸濁液に滴下する。一昼夜反応後、１．８６mlの２７％アンモニアを含む１１０mlの水を次いで加える。３０分間撹拌後、反応媒体を白色結晶が見えるまで濃縮する。冷蔵庫で１２時間後、白色沈殿が得られ、これを水中で再結晶する。４．１７５g（１３．５mmol，７２％）の生成物（１）が白色粉末の形態で得られる。該生成物はプロトンNMRで同定した。
トリアゾロ（２）：（Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc., １９９４，１１６，９３３１−９３３２）
アデノシン−イソプロピリデン（１）（１g，３．２mmol）およびアミジン（１．４g，６．５mmol）をピリジン（１５ml）中、１００℃で４８時間、アルゴン雰囲気下、撹拌する。ピリジンを蒸発させ、トルエンで共蒸発させる。得られたオイルを次いで酢酸エチルに溶解し、該有機相をNaCl−飽和水で洗浄する。Na2SO4で乾燥し、濃縮すると、生成物（２）が白色粉末の形態で、６０％の収率（７００mg，１．９mmol）で得られる。生成物（２）は、質量分析およびプロトンNMRで同定された。
アミジンの合成：（Bartlett and Humphreg, J. Chem. Soc., １９６７，１６６４−１６６６）
チオニルクロリド（３９．９６g，２４．５ml，０．３３８mol）を、１０℃で、DMF（２７０ml）中のN，N’−ジホルミルヒドラジン（１２g，０．１３６mol）に滴下する。該混合物は黄色になる。撹拌を２日間続ける。得られた沈殿をろ過し、DMFで洗浄して、次いでエーテルで洗浄する。真空乾燥後、アミジンが９５％（２８g，０．１３０mol）の収率で得られる。
トリアゾロのモノ保護ジアミノブタンでの置換
１，４−ジアミノブタンのモノ保護：（３）の合成（Hassen, Nielsen, Ehrbar, Buchardt, Synthesis, １９８２，４０４−４０５）
１，４−ジアミノブタン（０．１１３mol，９．９４g，１１．４ml）のクロロホルム（２５０ml）中の溶液を０℃に冷却する。ジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（０．０２２mol，４．９５g，５．２２ml）のクロロホルム（２５０ml）中の溶液を次いで、アルゴン雰囲気下、滴下する。該混合物を室温で一昼夜撹拌する。形成された沈殿をろ過し、ろ液を濃縮する。残さのオイルを飽和塩化ナトリウム水溶液（４０ml）に溶解する。二保護生成物をろ過で除去する。水相を次いでエーテル（５X５０ml）で抽出する。有機相を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮する。生成物（３）がオイルの形態で得られ、９９％（３．８g，０．０２１８mol）の収率で得られる。生成物（３）は、質量分析およびプロトンNMRで同定した。
トリアゾロのジアミノブタン−モノbocでの置換：（４）の合成
生成物（２）（５００mg，１．４mol）を２０mlのアセトニトリルに溶解する。化合物（３）（１．３１g，７mmol）を次いで加える。反応媒体を５０℃で２日間、加熱し、HPLCで分析する。
アセトニトリルを蒸発後、残さを酢酸エチルに溶解し、該有機相を飽和食塩水で洗浄する。乾燥して、酢酸エチルを蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン、次いでCH2／MeOH、９８／２，９５／５（v／v））にかける。濃縮し、ヘキサン中で結晶化すると、生成物（４）が白色粉末の形態で、８０％の収率（５６３mg，１．１２mmol）で得られる。ヌクレオシド（４）は、質量分析およびプロトンNMRで同定した。
Eckstein法によるホスホリル化（Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
ヌクレオシド（４）（４８mg，１００mmol）を無水ピリジンに溶解し、該溶液を２回濃縮する。１００mlのピリジン、３００mlのジオキサンおよびジオキサン中の調製したばかりの２−クロロ−４H−１，２，３−ジオキサホスホリン−４−オン（１３０ml，１３０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物を２０分間撹拌し、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスファートの無水DMF溶液（３２０ml）と、１３０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl）で確認する。保持時間＝３５分。
該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。１９分の保持時間を有する新規な生成物の形成が観察される。
実施例２：オキシアミノ鎖を有するアデノシンヌクレオチドの合成
鎖の合成ルート
生成物（６）の合成
ヒドロキシフタルイミド（１０g，０．０６１mol）をDMF（３００ml）に溶解する。K2CO3（１．０５当量，９g）を次いで添加する。沈殿形成が観察される。該混合物を５０℃で１時間撹拌後、ブロム化誘導体（１当量，９．０３g）を添加し、撹拌を５０℃で２時間続ける。綿毛を通過させてろ過し、DMFを蒸発させ、残さを酢酸エチルに溶解し、有機相を次いで１N HClで洗浄し、次いで１０％のNaHCO3溶液、最後に飽和食塩水で洗浄する。有機相を乾燥させて蒸発させた後、生成物（６）が６９％（９．６６g）の収率で得られる。これは、プロトンNMR、カーボン１３NMR、および質量分析で同定した。
ヒドラジン分解：鎖（７）の調製
生成物（６）（９．５１g，０．０４１mol）を１５０mlの９５％エタノール中に入れる。ヒドラジン（２当量，４ml）を添加すると、当初の沈殿が直ぐに溶解する。フタルヒドラジドの白色沈殿の形成が観察される。該混合物を５０℃で３時間反応させた後、ろ過し、沈殿をエタノールで洗浄する。濃縮後、得られたペーストをシリカゲルのクロマトグラフィー（ジクロロメタン／アセトニトリル：９／１，v／v）で精製する。フリーのオキシアミン（７）を含有するフラクションを濃縮後、エーテル、次いで濃塩酸を添加する。生成物（７）が白色粉末の形態で、４０％（２．３０g）の収率で得られる。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRから同定した。
オキシアミンBocの形成における保護
２．３g（０．０１６mol）の生成物（７）を１０mlのジオキサンに溶解する。水酸化ナトリウムの１N水溶液を次いで添加する（２当量：０．０３２mol，３２ml）。
２０mlのジオキサンに溶解したジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（１．２当量，０．０１９mol，４．１８g）を、次いでアルゴン雰囲気下、氷中で滴下する。該混合物を０℃で３時間反応させた後、ジオキサンを蒸発させ、pHを１NのHCl水溶液で３にする。該混合物を次いでエーテルで抽出（３X５０ml）する。有機相を次いで１NのHCl水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発後、生成物（８a）が黄色のオイル形態（２．５６g，０．０１３mol，８０％）で得られる。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。
LiAlH4を用いたニトリルの還元
化合物（８a）（２．５６g，０．０１３mol）を無水エチルエーテル（５０ml）中に溶解する。該混合物を氷浴中で冷却する。LiAlH4（３g，０．０７９mol）を次いで３回にわけて添加する。撹拌を一昼夜続け、水（１０ml）および１５％の水酸化ナトリウム水溶液を次いで添加する。白色沈殿が形成され、それをろ過除去後、有機相を飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発後、生成物（９）がオイル形態（７６９mg，０．００３７mol，２９％）で得られる。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。鎖（８b）は、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。
オキシアミン鎖でのトリアゾロの置換
生成物（２）（２４６mg，０．６８mmol）を２０mlのアセトニトリルに溶解する。鎖（８b）（７００mg，３．４３mmol）を次いで添加する。混合物を５０℃に保持する。反応をHPLCで追う。非常に反応は緩やかである。１週間後、溶媒を蒸発させる。反応残さを酢酸エチルに溶解し、有機相を飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥すると、黄色のオイルが得られ、これをシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン／メタノール：９７／３，v／v）にかける。溶媒を蒸発させた後、生成物（９）が白色粉末の形態（１２０mg，０．２４mmol，３５％）で得られる。生成物（９）はプロトンNMRおよび質量分析で同定した。
ヌクレオシド（９）のホスホリル化
実施例１に記載したプロトコール（ヌクレオチド５の調製）を用いて、ヌクレオシド（９）をホスホリル化すると、ヌクレオチド（１０）が得られる。
II−ウリジン系列
実施例３：アミン鎖（１５）を有するウリジンの合成
合成ルート：
鎖の合成：
５mlのプロパルギルアミン（７３mmol）を１NのNaOH／ジオキサン（１４６ml／５０ml）混合物中に溶解する。５０mlのジオキサンに溶解した２０mlのBoc2Oを次いで、０℃でアルゴン雰囲気下、滴下する。沈殿形成が観察される。８時間後、カーボナートの沈殿をろ過除去し、pHを１Nの塩酸水で３にする。該混合物を次いでジクロロメタンで抽出する。有機相を次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、最後に蒸発させる。生成物（１１）がヘキサンを添加することによって沈殿する。８．９２g（０．０５７mmol，７９％）が回収される。生成物（１１）はプロトンNMRおよび質量分析で同定した。
該鎖のベースへの導入：Heckカップリング（Hobbs, J. Org. Chem., １９８９，５４，３４２０−３４２２）
１０mlのDMFを脱気して、アルゴン雰囲気下に置く。ヨードウリジン（１g，２．５６mmol，アルドリッチ，８５５２９−７）およびヨウ化銅（９７．５mg，０．５１２mmol）を次いで添加する。反応混合物を暗所に置き、トリエチルアミン（７１３ml，５１８mg，５．１２mmol）およびBoc鎖（１１）（１．２g，７．６８mmol）を次いでアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物をアルゴン雰囲気下に１０分間放置する。反応は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム触媒（２９６mg，０．２５６mmol）を添加することによって開始する。反応はHPLCで追う。反応を一昼夜続けた後、DMFを蒸発させ、アセトニトリルで共蒸発させる。得られた残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（固体材料負荷、溶出液：ジクロロメタン，ジクロロメタン／メタノール：９８／２，９５／５，９０／１０，８５／１５−v／v）。５２８mgの生成物（１２）（１．３mmol，５２％）が、蒸発後に得られる。生成物（１２）はプロトンNMRおよび質量分析で同定した。
イソプロピリデン形態の保護（Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part ２，p．７６５, Wiley−interscience）
エチル＝オルトホルマート（１６６ml，１４８mg，１mmol）をアルゴン雰囲気下、常温で、APTS（９．５mg，０．０５mmol）を含有するアセトン（２ml）中の生成物（１２）（２００mg，０．５mmol）の懸濁液に添加する。反応はTLC（ジクロロメタン／メタノール ９０／１０）で追う。２時間後、ジクロロメタンを添加し、有機相を１０％の炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄する。乾燥し、蒸発後、生成物（１３）が黄色の粉末形態（１６７mg，０．３８mmol，７６％）で得られる。
Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig, Eckstein, J, Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
ヌクレオシド（１３）（４４mg，１００mmol）を無水ピリジンに溶解し、該溶液を２回濃縮する。１００mlのピリジン、３００mlのジオキサンおよびジオキサン中の調製したばかりの２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリン−４−オン（１３０ml，１３０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物を２０分間撹拌し、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスファートの無水DMF溶液（３２０ml）と、１３０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl）で確認する。保持時間＝３６分。
該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。２０分の保持時間を有する新規な生成物（１５）が形成される。
実施例４：アルコキシアミン鎖２１を有するウリジンの合成
合成ルート：
カルボキシメトキシアミン−boc（１６）の合成（Kurth et al, J. Med. Chem., １９９３，１２５５−１２６１）
カルボキシメチルアミン塩酸塩（６．６g，６０．４mmol）を１３２mlの水に水酸化ナトリウム（２g，５０mmol）およびジオキサン（６６ml）の存在下、溶解する。該溶液を氷浴で冷却する。ジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（１３．９７g，６４．１mmol）のジオキサン（６６ml）中の溶液を滴下する。該混合物を常温で一昼夜撹拌する。反応混合物を乾燥するまで濃縮する。２５０mlの水を得られた沈殿に加え、全体を次いでエーテル（２X２５０ml）で抽出する。水相を１NのHClでpH３まで酸性化する。該相を次いでエチルエーテル（３X５０ml）、次いで酢酸エチル（３X２５０ml）で抽出する。有機相を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥する。蒸発後、生成物（１６）が白色粉末の形態で得られる（１０g，５２mmol，８６％）。生成物（１６）は、プロトンNMRで同定した。
ペプチドカップリングによる鎖の合成（Costa, Dominguez, Cutts, Williams, Bowen, J. Med. Chem., １９９４，３７，３１４−３２１）
生成物（１６）（２g，１０．４mmol）を蒸留したばかりのTHFに溶解する。DCC（２．１５g，１０．４mmol）を媒体を氷中で冷却後に添加する。該混合物を１５分間冷却したまま撹拌する。プロパルギルアミン（７１４ml，１０．４mmol）を次いで添加する。撹拌を常温でアルゴン雰囲気下、２時間続ける。ろ過後、溶媒を蒸発させる。得られた残さをジクロロメタンに溶解し、該溶液を１NのHCl水溶液、次いで５％の炭酸水素ナトリウム水溶液、最後に飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥後、ジクロロメタンを蒸発させ、残さをシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン，６０／４０，v／v）にかける。生成物（１７）が白色粉末の形態で得られる（１．２３g，５．４mmol，５２％）。生成物（１７）は、プロトンNMRおよび質量分析で同定した。
Heckカップリング：Hobbs, J. Org. Chem., １９８９，５４，３４２０−３４２２
１０mlのDMFを脱気して、アルゴン雰囲気下に置く。ヨードウリジン（１g，２．５６mmol）およびヨウ化銅（９７．５mg，０．５１２mmol）を次いで添加する。反応混合物を暗所に置き、トリエチルアミン（７１３ml，５１８mg，５．１２mmol）および鎖（１７）（１．７５g，７．６８mmol）を次いでアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物をアルゴン雰囲気下に１０分間放置する。反応は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム触媒（２９６mg，０．２５６mmol）を添加することによって開始する。反応はHPLCで追う。反応を一昼夜続けた後、DMFを蒸発させ、アセトニトリルで共蒸発させる。得られた残さを酢酸エチルに溶解し、有機相を飽和食塩水で洗浄する。酢酸エチルを蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロロメタン／メタノール：９０／１０，８５／１５，８０／２０，v／v）。７４７mgの生成物（１８）（１．６mmol，６２％）が、蒸発後に得られる。ヌクレオシド（１８）はプロトンNMRおよび質量分析で同定した。
イソプロピリデン形態の保護（Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part ２, p. ７６５, Wiley−interscience）
エチル＝オルトホルマート（３５５ml，３１６mg，２．１３mmol）をアルゴン雰囲気下、常温で、APTS（２０．２mg，０．１０mmol）を含有するアセトン（３ml）中の生成物（１８）（５００mg，１．０６mmol）の懸濁液に添加する。反応はTLC（ジクロロメタン／メタノール ９０／１０）で追う。３時間後、ジクロロメタンを添加し、有機相を１０％の炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄する。乾燥し、蒸発後、生成物（１９）が黄色の粉末形態（３９５mg，０．７７mmol，７３％）で得られる。保護されたヌクレオシド（１９）は、プロトンNMR、カーボン１３NMRおよび質量分析で同定した。
Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
ヌクレオシド（１９）（１０２mg，２００mmol）を無水ピリジンに溶解し、該溶液を２回濃縮する。２００mlのピリジン、６００mlのジオキサンおよびジオキサン中の調製したばかりの２−クロロ−４H−１，２，３−ジオキサホスホリン−４−オン（２６０ml，２６０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物を２０分間撹拌し、０．５Mのトリブチルアンモニウムピロホスファートの無水DMF溶液（６４０ml）と、２６０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液（４ml，３１４mmol）を添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、残さを水／ジクロロメタン抽出する。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl；Waters Protein−Pak ８HR １０X１００mm DEAEカラム）で確認する。保持時間＝３５分。
該混合物を濃縮後、残さを水（５ml）に溶解し、５mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。HPLCで観察され、３０分の保持時間を有する新規な生成物（２１）が形成される。該生成物を上記条件下でHPLCで精製し、脱塩する（isocratic milliQ 水, Macherey Nagel C１８ヌクレオシルカラム）。
III−シチジン系列
I−アルキルアミノ鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチドトリホスファートの合成
ベースの４位にアミン化アルキル鎖を導入するために、ベースをCzernecki et al.の方法（S. Czernecki, T. Lediguarher, J. M. Valery, Nucleosides ＆ Nucleotides, １９８９，５４，６３１−６３５）で、［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル］ウリジンから、トシル基を導入することによって、活性化した。
トシル基のジアミン化アルキル鎖との求核置換、次いで導入された鎖のフリーのアミノ官能基のエチル＝トリフルオロアセタートを用いた保護が１工程で行われる。
５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修飾ヌクレオシドが遊離され、これは、最終的には、前記の実施例に記載したLudwig−Eckstein法（J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）を用いて該位置においてトリホスホリル化される。
４位に導入された鎖のアミノ官能基のおよび２’および３’ヒドロキシル基を保護している基の加水分解によって、所望のヌクレオチドトリホスファートが得られる（図１）。
トランスアミネーションによってヌクレオチドの４位に直接アミン化鎖を導入することからなる他の方法も、ヌクレオチド（３３）および（３４）の調製に使用された（図３）。
実施例５：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル］ウリジン（２２）の合成
２’，３’−O−イソプロピリデンウリジン（１mmol，シグマ，I−５１２７）のピリジン（５ml）溶液をアルゴン雰囲気下、常温で、t−ブチルジメチルシリルクロリドで一昼夜処理する。反応を無水エタノール（２ml）を添加することによって止め、混合物を濃縮し、トルエンで共蒸発させる。生成物（２２）をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v，Rf＝０．３）で精製する。
実施例６：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル−４−p−トルエンスルホニル］ウリジン（２３）の合成
アセトニトリル（１７ml）中の化合物（２２）（１mmol）を、炭酸カリウム（１．３mmol，１．３当量）およびp−トルエンスルホニルクロリド（１．２mmol，１．２当量）の存在下、３時間、還流させる。出発化合物が完全に無くなった後、反応混合物を常温で、水（２ml）を添加することによって加水分解し、次いで乾燥するまで蒸発させる。得られた残さを酢酸エチル及び水のパーティション化によって処理し、以下の工程に使用する。
TLC：Rf＝０．７（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v）。
ヌクレオシド（２３）は以下のように特徴づけられる。
プロトン
実施例７：［４−N−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−t−ブチルジメチルシリル］シチジン（２４）の合成
ジアミン化アルキル剤（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（５ml）中の化合物（２３）（１mmol）の溶液に添加する。５分間撹拌後、過剰量のエチル＝トリフルオロアセタート（１５mmol，１５当量）を反応媒体に添加し、撹拌を１５分間続ける。所望のヌクレオシド（２４）を、シリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：２，v：v，Rf＝０．２）で精製する。完全に保護された中間体のヌクレオシド（２４）の構造は、プロトンNMRで確認される。
ヌクレオシド（２４a）の例：
実施例８：［４−N−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン］シチジン（２５）の合成
THF（５ml）に溶解した化合物（２４）（１mmol）を、THF中のテトラブチルアンモニウムフルオリド（１．２mmol，１．２当量）のモル溶液で処理する。常温でアルゴン雰囲気下、３又は４時間撹拌後、反応混合物を酢酸（１当量）で中性化し、次いで乾燥するまで蒸発させる。化合物（２５）はシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：１，v：v，Rf＝０．３）で精製する。
実施例９：［４−N−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（２６）の合成
化合物（２５）（０．２mmol）をピリジン（２X１ml）で共蒸発させ、４００mlのピリジン／ジオキサン（１：３，v：v）混合物に溶解する。ジオキサホスホリノンクロリド（２６０μｌ）を反応混合物に添加する。５から１０分後に白色沈殿が形成され、２０分撹拌後、DMF中のブチルアンモニウムピロホスファート（０．５M，６４０μl，１．６当量）を反応混合物に添加し、次いで、トリブチルアミン（２３０ml）を添加する。３０分撹拌後、反応混合物をピリジン／水（９８：２，v：v）混合物（４ml）中のヨウ素の１％溶液で酸化し、３０分間撹拌をつづける。過剰のヨウ素を５％の重亜硫酸ナトリウムの水溶液で処理し、反応媒体を乾燥するまで濃縮する。得られた残さを水（２０ml）に溶解し、該溶液をジクロロメタンで洗浄することによって処理する。水相を回収し、HPLCで分析する（ミリポア５X１００mm DEAE ８HRカラム，バッファA：２０mMトリス−HCl，pH７．６，バッファB：２０mMトリス−HCl，０．５M塩化ナトリウム，pH７．６，流速：０．５ml／分，勾配：０から３５％B４０分）。保持時間：２４から２９分。TLC：Rf＝０．５，溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（６：３：１，v：v：v）。
実施例１０：［４−N−アルキルアミノ−５’−O−トリホスファート］シチジン（２７）の合成
アンモニア水（１０ml）を、水（２０ml）中の化合物（２６）（０．２mmol）の溶液に添加し、該混合物を１時間撹拌する。反応媒体を乾燥するまで濃縮し、残さを水（２０ml）、次いで５０％トリフルオロ酢酸水溶液（１０ml）に溶解し、撹拌を３０分間続ける。反応媒体を再度濃縮し、次いで水を用いて乾燥するまで蒸発させる。所望の化合物は、HPLCで精製、脱塩する。分析HPLC：保持時間：１７から２０分。精製：プレパラティブ１０X１００mmプロテインパック８HR DEAEカラム、実施例９と同様のバッファおよび勾配が使用され、流速は２ml／分である。脱塩：RP１８カラム、バッファA：水、バッファB：メタノール。TLC：Rf＝０．２、溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（４：５：１，v：v：v）。
II−アルキルオキシアミン化鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチドトリホスファートの合成
末端がヒドロキシル化されたアルキル鎖をまず、シチジンの４位のトシル基の求核置換によって導入する。次いで、導入された鎖のヒドロキシル官能基とN−フタルアミドヒドロキシルアミンとのミツノブ反応を行った。
相当するアルキルオキシアミン化ヌクシオチドトリホスファートが、アルキルアミン化ヌクレオチドトリホスファート合成と同様の工程（図２）にしたがって、得られる。
実施例１１：［４−N−ヘキサニル−６−オール−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−t−ブチルジメチルシリルシチジン（２８）の合成
６−アミノヘキサノール（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（５ml）中の化合物（２３）（１mmol）の溶液に添加する。反応を３０分間進めた後、溶媒を乾燥するまで濃縮し、化合物（２８）はシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
実施例１２：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−t−ブチルジメチルシリル］シチジン（２９）の合成
ジエチル＝アゾジカルボキシラート（DEAD，３mmol，３当量）を常温でアルゴン雰囲気下、THF（１０ml）中の、トリフェニルホスフィン（３mmol，３当量）およびN−フタルアミドヒドロキシルアミン（３mmol，３当量）の存在下、化合物（２８）（１mmol）の溶液に添加する。１時間撹拌後、溶媒を乾燥するまで濃縮し、化合物（２９）をシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
実施例１３：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン］シチジン（３０）の合成
化合物（３０）は、実施例８に記載したプロトコールにしたがって合成された。
実施例１４：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（３１）の合成
化合物（３１）は、実施例９に記載したプロトコールにしたがって合成された。分析HPLC（実施例１０と同様の条件）：保持時間：４４分。TLC：Rf＝０．５、溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（６：３：１，v：v：v）。
実施例１５：［４−N−ヘキサニル−６−オキシアミノ−５’−O−トリホスファート］シチジン（３２）の合成
全保護ヌクレオチド（３２）を、実施例１０に記載したプロトコールにしたがってトリフルオロ酢酸を用いて２’及び３’位を脱保護する。アルコキシアミノ官能基は、ヒドラジンの水溶液中、常温で一昼夜で脱保護される。ヌクレオチド（３２）は次いでHPLCで実施例１０と同様の条件下、精製される。
実施例１６：トランスアミン化による［４−N−（２，２−オキシ−ビス−エチルアミン）−５’−O−トリホスファート］シチジン（３３）の合成
シチジントリホスファート（０．１mmol）を、１０Mの水酸化ナトリウム溶液で予め７．０にpHを調節した、水（２．５ml）中の２，２’−オキシ−ビス−エチルアミン塩酸塩と重亜硫酸ナトリウム（１２mmol，１２０当量）からなる溶液に添加する。該混合物を次いで３７℃で３日間撹拌する。化合物（３３）をHPLCで精製して脱塩する（実施例１０のHPLC条件参照）。
実施例１７：トランスアミン化による［４−N−（アジピン酸ヒドラジド）−５’−O−トリホスファート］シチジン（３４）の合成
ヌクレオチド（３４）は、実施例１６に記載したプロトコールにしたがって、ヒドラジド官能基を導入するためにアジピン酸ジヒドラジド（８３mg，０．４４mmol）を用いて、トランスアミン化によって調製された。ヌクレオチド（３４）はまた、実施例１０に記載されたように精製し、脱塩し、その構造はプロトンNMRで確認された。
IV−官能化フルオロホル（fluorophore）：
実施例１８：フルオレセインアルデヒド（３６）の合成
合成ルート：
FITCの保護アルデヒドへのカップリング：
フルオレセインイソチオシアナート（９１３mg，２．３５mmol，アルフォリッチ，F２５０−２）をアルゴン雰囲気下、無水DMF（１０ml）に溶解する。アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（aminobutyraldehyde diethylacetal）（４２１mg，３９２ml，２３５mmol）を次いで添加する。１時間後、DMFを蒸発させ、残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロロメタン／メタノール：９０／１０，v／v）。溶媒蒸発後、生成物（３５）がオレンジ色の粉末（１．２１g，２．２mmol，９４％）で得られる。これは、プロトンNMRと質量分析で同定した。
アルデヒドの脱保護：
保護生成物（３５）（３４２mg，０．６２mmol）を２０mlの３０％酢酸水に入れる。反応を１時間進めた後、溶媒を蒸発させ、アセトニトリルで共蒸発させる。得られた残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロロメタン：メタノール／９０／１０，v／v）。溶媒を蒸発させた後、オレンジ色の粉末（１４５mg，０．３０mol，４８％）が得られる。これは、プロトンNMRと質量分析で同定した。
実施例１９：予め官能化したポリヌクレオチドの化学合成
出発物質のヌクレオチド２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシン（３８）の合成
出発物質のヌクレオシドは、A. LAAYOUN, J. −L. DECOUT and J.LHOMME, Tetrahedron Lett, １９９４，３５，４９８９−４９９０に記載された方法を用いて得られた前駆体２’−デオキシ−８−メルカプトアデノシン（３７）を用いて合成した。
２’−デオキシ−８−メルカプトアデノシン（１６．６８mmol）を、過剰量の炭酸カリウム（３３．００mmol）の存在下、無水DMF（ジメチルホルムアミド）に溶解する。１−ブロモ−４−ペンテン（１８．３７mmol）をアルゴン雰囲気下添加し、３時間、常温で撹拌しながらインキュベート後、鉱物塩をセライトを用いてろ過し、DMFを蒸発させる。茶色の残さが得られ、ヘキサンで洗浄し、次いでエチルエーテルで洗浄する。生成物をシリカのクロマトグラフィーにかけて精製する（溶出液：ジクロロメタン／メタノール−９５／５（v／v）次いで９０／１０（v／v））。このようにして得られた出発物質のヌクレオチドは通常のスペクトル法を用いて特徴づけられる。
予め官能化されたポリヌクレオチドの化学合成：
予め合成されたヌクレオシドをまず、オリゴヌクレオチドに組み入れる。この最後に、保護された出発物質のヌクレオシドに相当するホスホラミジトシントン（３９）が、A. J. ROGERS ”Oligonucleotide synthesis”（１９８４）, pp. ２３−２４, M. J. GAIT Ed., IRL Press. Oxfordに記載された方法を用いて調製された。
アデニンの環外アミノは、ベンゾイル基で保護され、一方、５’ヒドロキシルはジメトキシトリチルで保護され、３’ヒドロキシルはN，N−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミジト基で保護される。
Lが２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシンであるポリヌクレオチド５’CGCACLCACGC３’が、製造者によって示唆されたプロトコールを用いてMilligen／Biosearch８７００装置で、自動的にホスホラミジト法によって合成された。
合成されたポリヌクレオチドは逆相HPLC（セミプレパラティブMacherey Nagel１０mmX２５cmカラム；C１８；５μm孔度；溶出液：pH６の酢酸アンモニウムの０．１M水溶液と混合された０から３０％アセトニトリル２０分勾配）。ポリヌクレオチドを含むフラクションを集め、凍結乾燥する。
酢酸（水中８０％）で常温で１０分間オリゴヌクレオチドを処理した後、ポリヌクレオチドの５’位を脱トリチル化し、ポリヌクレオチドを次いで単離して、次いでエーテルで抽出する。
次いで、前の工程に組み入れられたヌクレオチドLを、ヌクレオチドジオール５’CGCACMCACGC３’を得るために活性化する。
３４０nmolのポリヌクレオチド５’CGCACLCACGC３’を１７０μlの０．０２％のオスミウムテトラオキシド、２μlのN−メチルモルホリン−N−オキシドおよび２μlの３％過酸化水素からなる溶液で処理する。常温で一昼夜インキュベート後、ポリヌクレオチド５’CGCACMCACGC３’を前記条件を用いてHPLCで精製する。
最後に、ポリヌクレオチドアルデヒド５’CGCACNCACGC３’
が、暗所中、２００μlの５４μM過ヨウ素酸ナトリウムを２００μlの１１０nMオリゴヌクレオチドジオール５’CGCACMCACGC３’の水溶液に添加することによって得られる。１５分後、ポリヌクレオチドアルデヒド５’CGCACNCACGC３’をHPLC（セミプレパラティブMacherey Nagel １０mmX２５cmカラム；C１８；７μm孔度；溶出液：pH６のジハイドロゲンホスファートナトリウムの２０mM水溶液と混合された０から３０％メタノールの２０分勾配）で精製する。
実施例２０：実施例１９で得られた予め官能化したポリヌクレオチドの標識化：
標識化反応をダンシル核からなり、官能性蛍光基として、ジエチレングリコール鎖によってオキシアミノ（求核性）基に結合した薬剤（４０）を用いて行う。該薬剤はD. BOUTURYN et al., Tetrahedron, １９９７，５３，５４８５−５４９２に記載された方法を用いて調製した。
標識化反応は水中、オリゴヌクレオチドに対して幾分過剰量の薬剤（４０）（１．５当量）の存在下、行われる。HPLCによって反応の進行をモニターすると、出発化合物が早急になくなり、官能化ポリヌクレオチド（４１）に相当する新規生成物が形成される。プロトンNMRスペクトルの分析から、さらにダンシル標識の結合が確認される。
実施例２１：転写による予め官能化されたポリヌクレオチドの酵素合成
予め官能化されたヌクレオチド：２’−デオキシ−８−（ブタナール）−チオアデノシン−５’−トリホスファート（４３）の合成：
該合成は２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシン（３８）（実施例１９参照）を用いて行われる。出発物質のヌクレオチド（４２）は、J. LUDWIG and F. ECKSTEIN, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５に記載された方法を用いて得られる。
予め官能化されたヌクレオチド（４３）を得るために必要な酸化工程は実施例１９に記載したように行われる。
予め官能化したヌクレオチド（４３）の酵素的組み込み：
a）プロモーターを有するＤＮＡ鋳型の作製：
標準プライマーおよび標準プライマー配列の上流にファージT7RNAポリメラーゼに関するプロモーターのセンス配列を有するプライマーを用い、直鎖状pGEMプラスミドに含有される遺伝子HIVgagについてPCRを行った。
プライマー配列：
この結果、158塩基対の生成物が得られ、フェノール／クロロホルムを用いてそれを抽出し、ミクロコン30を通すことにより精製する。
b）転写反応：
エッペンドルフ管内で、40mMトリス塩酸緩衝液、pH8.1、20mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、1mMスペルミジン、8%ポリエチレングリコール、0.01%トリトンX100、50μg/mlのウシ血清アルブミン/ml中、最終容量25μlで転写反応を行った。予め官能化したヌクレオチド（43）および4種のリボヌクレオチド（CTP，GTP，ATPおよびUTP）をそれぞれ1.33Mmおよび各リボヌクレオチドについては4mMの濃度で加える。PCR鋳型は109コピー/μlの濃度で加え、ファージT7ＲＮＡポリメラーゼ（特許出願FR 97 04166）は1u/μlの濃度で加える。この反応物を37℃にて60分間インキュベートする。ＤＮＡ鋳型を破壊するために、O.5uのＤＮアーゼ1/μlを培地に加える。サンプルのインキュベーションを37℃にて15分間続ける。得られたＲＮＡはセファデックス（Sephadex）G50を通すことにより精製する。
平行して、T7ＲＮＡポリメラーゼを加えない反応により、第一の対照実験を行う。行われた転写のための対照として、いずれの活性化したヌクレオチドも用いずに第二の対照実験を行う。
精製した転写産物は実施例2に記載の実験方法を用いて標識し、アガロースゲルにおける電気詠動移動に続き、紫外線下で視認化する。
実施例２２：TMA増幅反応中の予め官能化したポリヌクレオチドの合成
TMA増幅産物を強力に標識するために、予め官能化したヌクレオチド27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）、27b（CTP-（N4）-C4-NH2）および32（CTP-（N4）-C6-ONH2）を増幅物に組み込む。増幅反応を平行して、フルオレセイン、すなわちフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）を有する標識ヌクレオチドの存在下で続ける。
予め官能化したヌクレオチド27a、27bおよび32、ならびに比較のためのBoerhingerの標識ヌクレオチドref. 1 427 857のTMA増幅反応産物への組み込みは、Genプローブ増幅TMMTD2（マイコバクテリウム・ツベルクロシス指示試験）キットを用いて試験する。この反応はマイコバクテリア16S ＲＮＡの136塩基断片を増幅する。それは４種の酵素活性（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼH）および２種の酵素、T7ＲＮＡポリメラーゼおよびAMV逆転写酵素を用いる。転写、逆転写およびＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんに含まれるＲＮＡの消化の工程（これらの工程はＲＮＡウイルス複製サイクルに類似）を含む循環反応により、この反応は２種のプライマー（単純プライマーおよびT7ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマー）によって認識される核酸配列を特異的に増幅させることが可能になる。増幅因子は極めて豊富であり（109）、感受性は極めて良好である（1ないし10コピー）。得られた産物の90%は一本鎖ＲＮＡからなり、10%は二本鎖ＤＮＡからなる。
増幅反応は106コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡを用いて行う。この標的ＲＮＡを予め得て、以下の方法により精製する：16S ＲＮＡ遺伝子をプロモーターの制御下でプラスミドにクローン化する。次いでin vitro転写により16S ＲＮＡを得る。このＲＮＡをフェノール／クロロホルムでの抽出、およびミクロコン30TM（Amicon）を通す濾過により精製する。それを260nmでの吸収により検定する。
標準的なTMA反応は各天然rNTP（ATP，CTP，GTPおよびUTP）を4mM含む。予め官能化したヌクレオチドを増幅産物へと組み込むためには、反応緩衝液中にこれら修飾されたヌクレオチドの１つが含まれている限り、この反応を行う。修飾されたものであろうと天然物であろうと、同じシリーズの各ヌクレオチドの総濃度が4mMであることを確かめると同時に、この反応は種々の濃度比率の修飾ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの存在下で検討される。検討された比率は0%、10%、30%、50%および70%（70%では試験できないフルオレセイン-UTPの場合は除く）である。陰性対照実験も行い、この陰性対照実験は、酵素は別として（凍結乾燥酵素を再溶解させるために使用する緩衝液により置換）、使用される最高比率の修飾ヌクレオチドを含有する、すべての試薬を含んでなる反応液からなる。
増幅反応は、変性ポリアクリルアミドゲル（6%アクリルアミド、7M尿素、1xTBE、bioRad電気泳動装置、170ボルト、45分）上で反応混合液5μlを電気泳動させ、次いで臭化エチジウムで染色することにより分析し；続いて、ノーザンブロッドを行う。核酸をメンブラン（ナイロンN、bioRad半乾燥転移装置、0.5xTBE、25V、15分）に転移させ、ペルオキシダーゼで標識したマイコバクテリウム・ツベルクロシスに特異的な核酸プローブ：
とハイブリダイズさせる（PEG中で37℃にて30分プレインキュベートし、次いで0.1ngのペルオキシダーゼプローブ/μlを含有するPEGの存在下で37℃にて１時間インキュベートする）。視認化は比色計による（基質、ジアミノベンジジン、Sigma）。
蛍光ヌクレオチド（フルオレセイン-12-UTP）を含有する反応の場合には、この増幅産物はまた、臭化エチジウムでの染色の前に紫外線テーブル上でのフルオレセインの励起により、ゲル上で視認化される。
臭化エチジウムでの染色に続き、予め官能化したヌクレオチドを使用するものを含めあらゆる反応の場合で、期待される増幅産物が大量に視認化される。ノーザンブロッティングの後、これらの産物を特異的プローブとハイブリダイズさせる。
実施例２３：TMA増幅産物における組み込み率の分析
標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）の存在する場合と比較することにより、予め官能化Ｌたヌクレオチド27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）および27b（CTP-（N4）-C4-NH2）の存在下で得られた増幅物の予めの官能化を評価するため、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドと類似体天然ヌクレオチドの間の比率を決定する。
実施例22の実施において得られた増幅産物をミクロコン30TM（Amicon製）を通す濾過により、反応物中に過剰に存在するヌクレオチドから分離し、50μlの水に溶解させる。フルオレセイン-12-UTPの存在下での増幅の場合は、増幅はセファデックス（Sephadex）G50上で行う（フルオレセインはミクロコンに吸着させる）。
次いで増幅産物の吸収を260nmにて測定する（酵素を含まない対照は極めて低濃度であるはずである）。
予め官能化したヌクレオチドを含む増幅反応（およびそれらの対照）の場合では、次いで、核酸を下位のヌクレオシド段階へと消化する工程を行う：
増幅産物5 1014コピー（およそ35μg）を最終容量86μlの水に希釈する（酵素を用いない対照の場合には、最大サンプル容量に等しい容量を用いる）。10μlの10xP1ヌクレアーゼ緩衝液（300mM CH3COONa緩衝液、pH5.3、1mM ZnSO4）および4μlのP1ヌクレアーゼ（Boerhinger, ref. 236225, 1μg/μl, 0.3u/μl）を加える。反応混合物を37℃にて30分間インキュベートする。次いで、12μLの10xアルカリ性ホスファターゼ緩衝液（Boerhinger, ref. 1246283）および1μlのアルカリ性ホスファターゼ（Boerhinger, ref. 713023, 1U/μl）を加え、37℃にて15分間インキュベーションを続ける。反応は氷で停止させる。
次いで、高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC, Beckman, Gold system）により、ヌクレオシド標準品と比較することによって、このヌクレオシド組成物を定める（各ヌクレオシド50ngのインジェクション）。20μLの消化物C18（Ultrasphere）カラムにインジェクトし、これを45℃で加熱する。分離は、メタノール勾配（10分後、95%メタノールの0%から30%を15分内に通す）を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液，pH7中で行う。ピークは254nmでの吸収により視認化し、ピーク面積を積分により算出する。
官能化したヌクレオチドのピーク面積と天然類似体のそれとの間の比率により、組み込み率、すなわち組み込まれている予め官能化したヌクレオチドの量と組み込まれている同シリーズのヌクレオチドの総量の間の比率を求めることができる。
酵素を用いない対照ではピークの立ち上がりは見られないはずである。この対照が過剰に存在するヌクレオチドを除去する工程が首尾よく効力を示したことを証明する。
フルオレセイン-UTPを含む増幅反応の場合では、組み込まれたフルオレセインヌクレオチドの量を蛍光強度により測定する：標準範囲のフルオレセインの蛍光強度はPerkin LS 50分光蛍光光度計で読みとる。種々の増幅反応の蛍光強度を測定する。組み込まれたフルオレセイン量は標準曲線と比較することにより求める。組み込み率は260nmでの吸収により測定される増幅物濃度に換算する。
HPLC分析により、８種の天然ヌクレオシド、ならびに試験された３種の予め官能化したヌクレオチドに対する類似体である３種のヌクレオシドを分離することができる。
下記表に示される結果は、検討されたすべての予め官能化したCTPヌクレオチドが、慣例的に用いられる標識ヌクレオチドであるフルオレセイン-12-UTPよりも優れた、TMA増幅産物における組み込み率を与えることを証明するものである。
これらの結果は、CTPヌクレオチドを予め官能化することがフルオレセインを用いて標識することにより達成されるものより優れた組み込みを可能にすることを証明するものである。増幅物を極めて良好に予め官能化することより、官能化後、フルオレセインヌクレオチドを用いて得られるものよりさらに強力な標識を得ることができる。
同様に、組み込み率の改良は、シチジンのN4位に組み込まれるヌクレオチド32のオキシアミノ基などの他の反応官能基を用いて達成することもできる。
実施例２４：TMA感受性における予め官能化したヌクレオチドの組み込みの影響に関する分析
予め官能化したヌクレオチドの組み込みを含むTMAの感受性を研究するため、種々の比率（100%，70%，50%，30%，10%および0%）の予め官能化したヌクレオチドとその天然類似体の存在下で、標的（実施例22に記載のマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡ）量を減少させながら（10000，1000，100，10および0コピー）TMAを行った。同様の予め官能化したヌクレオチド、すなわち27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）および27b（CTP-（N4）-C4-NH2）を試験した。
反応生成物を、特に実施例22に記載の方法により研究する。
また反応生成物をELOSA（PCT WO 92/19812）およびシグナル強度の標準範囲のそれとの比較による半定量的手法にて分析する。
反応は、予め官能化したヌクレオチドの存在下で行い、電気泳動および染色、ノーザンブロッティングおよびELOSAにより分析する。使用された種々の分析方法の代表的なELOSAにより得られた結果を図4および5に示す。いずれの予め官能化したヌクレオチドを使用しようとも（27aまたは27b）、最初の標的のコピー数が極めて少ない場合でさえ、TMA反応の感受性に有意な影響を及ぼさない予め官能化したヌクレオチド濃度を求めることが可能である。さらに特に、添付の図5から明らかなように、ヌクレオチド27bは天然ヌクレオチドと置き換えることが可能である。
実施例２５：予め官能化した増幅物の標識
予め官能化したヌクレオチド27b（CTP-（N4）-C4-NH2）の存在下で、実施例22を行ったときに用いた方法により得られた予め官能化した増幅物を、増幅により維持させ、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドにより供給する求核基と、予めフルオレセインと結合させた抗反応求電子基との間の化学結合反応により標識する。得られた標識は、標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）の存在下で得られたものと比較する。
106コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡ標的を用い、予め官能化したヌクレオチド27bの50%存在下で、実施例22に記載の方法により増幅物を得る。
得られた増幅物は、以下の方法：｛30μlのTMA増幅産物を30μlの0.2M炭酸塩、0.15M NaCl緩衝液、pH8.8および40μl（およそ200当量）のフルオレセインNHS（DMSO中3.5mg/ml）と混合｝を用いてフルオレセイン-NHS（Boerhinger 8370042128）と結合させる。周囲温度で１時間振盪の後、この標識を分析する。
実施例22に記載のゲル電気泳動によりこの標識増幅物（15μl）を分析し、次いで、臭化エチジウムでの染色の前後で、紫外線下で視認化する。このプロフィールを50%フルオレセイン-12-UTPの存在下で標識することにより得られたものと比較する。
染色なしで得られたシグナルは、フルオレセインで直接標識することにより得られたものよりさらに強力である。ヌクレオチド32が有するオキシアミノ基を用いることにより、フルオロフォール36と結合させた後も、同等の良好な結果を得ることができる。オキシアミノ／アルデヒド結合の反応性は、実施例20で示したように、達成される結合時間を短縮することが可能である。
文献：EP-A-0 285 057は、ヌクレオチドの構成要素、すなわち糖、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸エステル基の１つに種々の用途、特に標識の用途を持つ官能基を導入することからなる核酸処理方法を開示している。このように処理されて得られたヌクレオチドは、該文献によれば、ポリヌクレオチドに、特にこのヌクレオチドの存在により不安定になる二重らせんを有することなく二本鎖型へと組み込むことができた。
しかしながらこの場合、先行技術によれば、ヌクレオチドに結合している官能基は、立体障害、疎水性相互作用または複合現象などの種々の現象を示し、これらが、該処理ヌクレオチドを組み込んだポリヌクレオチドが、該処理ヌクレオチドが組み込まれていない相当するポリヌクレオチドを認識するであろう大部分の酵素によって認識されることを妨げるものである。
文献：WO−A−９２／００９８９は、標的核酸を増幅させることによって、特に標識されたプローブを得るために、核酸配列を標識するための蛋白質を使用する方法を提案している。該方法によれば、反応性官能基の存在によって天然のヌクレオチドとは異なる修飾ヌクレオチドが使用され、増幅は予め官能化されたプローブを得るために行われ、得られたプローブは蛋白質レベルと反応性官能基によって反応するものである。最後に、修飾ヌクレオチドの反応性官能基は、適当な箇所において保護されていてもよいチオール官能基およびアミノ官能基から選択された求核性官能基である。
該方法の欠点は、幾千のオーダーである分子量を有することによって、その大きさのために、該標識と該官能基との間の共有結合の収率および／または速度が実質的に制限されてしまうことにあり、該問題点は、プローブに組み込まれた修飾ヌクレオチドの数が増すにつれてより問題となるものである。さらに、該標識は、得られたプローブが含有されている反応、特にハイブリダイゼーションを減速してしまう可能性がある。
本発明は、前記の欠点を解消し、特にヌクレオチドの組み込みを妨害せず、その結果として標的とする増幅反応における収率および／または感受性に有意な影響を示さず、さらには標識の組み込みに従来付随していた標識の不安定現象を回避することにより、増幅産物の優れた標識を得ることを可能にする増幅方法を提供する。
かくして、本発明は、
−標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、１以上のヌクレオチド酵素活性とが少なくとも得られ、
−特に、単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的配列を増幅させる、
標的核酸配列の増幅方法であって、
少なくとも１つの予め官能化したヌクレオチドを含む予め官能化した増幅産物を得るために、少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも、保護されておらず、かつ、そのヌクレオチドの塩基の所定の部位の少なくとも１つに配置されている、少なくとも１つの共有反応官能の存在により、他のヌクレオチドとは異なる予め官能化したヌクレオチドであることを特徴とする方法に関する。
本発明の有利な方法によれば、この方法はさらに、
−予め官能化したヌクレオチドの反応性官能に特異的な共有結合性の抗反応官能と官能基を含んでなる試薬が得られ、
−官能化した増幅産物を得るために、予め官能化した増幅産物を該試薬と直接または間接的に反応させる行程を含んでなる。
本記載中で用いられるいくつかの用語を以下に定義し、その後、本発明を詳細に説明する。
本発明のヌクレオチドは以下に定義される天然または修飾ヌクレオチド単量体と理解される。
このように、該ヌクレオチド単量体は、その構成要素が糖と、リン酸エステル基と、窒素塩基である天然の核酸ヌクレオチド（その糖はＲＮＡにおいてはリボースであり、またＤＮＡにおいては2’-デオキシリボースであり；その核酸がＤＮＡかＲＮＡかによって、窒素塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択されている）であってもよいし；または、３つの構成要素のうち少なくとも１つで修飾されているヌクレオチドであってもよく（例示すれば、その修飾は、イノシン、メチル-5-デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ-5-デオキシウリジン、ジアミノ-2,6-プリンまたはブロモ-5-デオキシウリジンなどの修飾生成物、およびハイブリダイゼーションが可能な他の種々の修飾塩基が生じてもよい塩基のレベルで、糖のレベル、すなわち例えば少なくとも１つのデオキシリボースでの類似体による置換（例えば：P.E. Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500（1991））で、リン酸エステル基、例えばボロネート、アルカリホスホネートまたはホスホロチオエート誘導体のレベルで起こってもよい。
保護基は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの化学合成において従来より使用される基として理解される（例えば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Leroy B. Townsend編, Plenum Press, New York and LondonおよびProtocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Sudhir Agrawal編, Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照）。
本発明の標識官能基は検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じることができる分子である。この基は特に放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびb-ガラクトシダーゼから選択される酵素、ならびに発色団、発色、蛍光団、蛍光または発光化学化合物、発色、蛍光または発光基質を加水分解できる酵素から選択される酵素、ヌクレオチド塩基類似体およびビオチンなどのリガンドから選択される。
該標識が直接シグナルを生じることができない場合、例えば該標識が酵素である場合は、視認化物質、例えば検出可能な複合体、例えば発色化合物または発光化合物を生じる酵素／基質反応を伴う酵素に対応する基質を加える必要がある。例示すれば、該視認化試薬はオルト-フェニレンジアミンまたはリン酸4-メチルアンベリフェリルであってよい。
この予め官能化したヌクレオチドの共有結合性官能基とこの試薬の抗反応官能基は、それぞれ求電子性および求核性有機化学官能基であり、この逆であってもよい。
該求電子性有機化学官能基は、有利にはアルデヒド、活性化エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、ハロアシル誘導体および塩化スルフォニル官能基から選択される。
該求核性有機化学官能基は、有利にはアミノ、チオール、オキシアミノ、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され；好ましくはそれはアルコキシアミノ官能基である。
本発明の１つの変法によれば、修飾されたヌクレオチドの共有結合性官能基はカップリングアームにより塩基に結合されており、かつ／または該試薬の共有結合性の抗反応官能基はカップリングアームにより該官能基に結合している。
該カップリングアームは、特に飽和または不飽和ヒドロカーボン鎖から選択され、適切なところにアミノ、アミドおよびオキシ官能基が挿入されている。
好ましい方法によれば、該共有結合性官能基はオキシアミノ官能基であり、該試薬の共有結合性抗反応官能基はアルデヒド官能基であり、この後者は蛍光または発光官能基などの標識官能基に結合している。
アルデヒド官能基をカップリングアーム-NH-CS-NH-（CH2）3-により官能基に結合させることが有利であり、この試薬の官能基はフルオレセインである。
予め官能化したヌクレオチド産物は、１以上のヌクレオチドを組み込んだ１以上の同一または異なる共有結合性官能基を含んでなればよい。該共有結合性官能基は１以上の同一または異なる試薬と同時に、あるいは順次に反応させることができる。官能化された生成物の標識官能官能基は同時に、あるいは順次に検出することできる。
この標識方法は、特に異なる標的に由来する予め官能化した産物を識別するために、予め官能化した１以上のヌクレオチド産物に適用され得る。
標識された官能化増幅産物は、均一相または不均一相にて、定性的かつ／もしくは定量的に検出することができる。
均一相において、この試薬と予め官能化したヌクレオチド産物とは、同じ液体培地中で相互作用する。不均一相においては、この予め官能化した産物は、固体の支持体に取り込ませる前、または取り込ませた後に試薬と反応させることができ、すなわち直接的または間接的といわれる。固体支持体への取り込みは、吸着、共有結合など公知の手段を用いて、特に固体支持体の表面に用いることのできる共有結合性の抗反応官能基を用いて、またはポリヌクレオチド化合物を用いるハイブリダイゼーションにより達成できる。
管、円錐、くぼみ、マイクロ滴定プレート、シート、チップまたは可溶性ポリマーなどの適した形態の固体支持体はすべて、ポリスチレン、スチレン-ブタジエン共重合体、ポリスチレンを配合したスチレン-ブタジエン共重合体、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン-アクリロニトリル共重合体およびスチレン-メチル＝メチルメタクリレート共重合体から、合成繊維および天然繊維から、多糖類およびセルロース誘導体から、さらにはガラスおよび珪素およびそれらの誘導体から選択される。
本発明の方法の好ましい変法によれば、
標的核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、酵素活性はＲＮＡ依存性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含んでなり、
該酵素活性はさらに、一連の逆転写、転写および消化（digestion）反応に従い、標的核酸配列を増幅させるためのリボヌクレアーゼH活性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を含んでなる。
リボヌクレアーゼHおよびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、ある単一の酵素または互いに異なる酵素により提供されてもよい。
例示すれば、本発明の方法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）またはTMA（転写介在増幅（transcription-mediated amplification））、またはNASBA（核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification））法、もしくは他の酵素増幅法などの当業者に公知の技術に従い、サンプル中の標的核酸を増幅させるために使用することができる。
本発明はまた、予め官能化され、かつ、酵素処理を受けることが可能なヌクレオチド類似体または核酸に関する。
核酸類似体またはヌクレオチドの酵素処理は、その活性がヌクレオチドに結びつけられている少なくとも１つの酵素が関与する間のin vivoまたはin vitroのすべてを含む。このように、それは、ヌクレオチドが、酵素工程中、形質転換されていようといまいと、酵素に対する基質として働く少なくとも１種の酵素工程のあらゆる反応を含んでなり；例示すれば、このような工程は転写、連結反応、伸長および制限などの分子生物学技術で、さらに特には増幅技術（WINN-DEEN, Journal of Clinical Assay, 第19巻, 21-26頁（1996））で使用されるものから選択される。
このように、その活性がヌクレオチドに結びつけられている酵素は、網羅的ではないが特に以下のリストから選択される：大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Taqポリメラーゼ、T7、T4またはT5ＤＮＡポリメラーゼ、a、bおよびgウイルスまたは真核細胞ポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；AMV（トリ骨髄芽球症ウイルス）およびMMLV（モロニーマウス白血病ウイルス）ポリメラーゼなどのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；T7、T3、SP6、N4およびPBSIIＲＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ；制限エンドヌクレアーゼおよびＲＮアーゼ（ＲＮAse）Hなどのヌクレアーゼ活性を有する酵素；またはQ-ベータレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼまたはリガーゼなどのその他のポリAポリメラーゼ、レプリカーゼ。
好ましい具体例によれば、ここに参照して組み入れられる国際出願WO91/01384に記載されている、標的ＲＮＡ核酸配列を増幅させる、または逆転写工程の後に標的ＤＮＡ核酸配列を増幅させるTMA技術が本発明の方法を適用するために選択される。
本発明によって予め官能化した核酸類似体は式（I）
Bは核塩基を表し、
Zはカップリングアームを表し、
nは0または1に等しい整数であり、
Xは核塩基B中の少なくとも１つの部位に結合している共有結合性反応性官能基を表し、
R1はHまたはOHを表し、
R2はH、OH、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基、もしくはO-R基（ここでRは保護基を表す）を表し、
R3はH、保護基、または一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基を表す｝に相当する。
好ましくは、R1およびR2は各々互いに独立にHまたはOHを表し、かつ、R3は一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基を表す。
本発明の予め官能化したヌクレオチドは以下のヌクレオチドから選択される：
−その核塩基がシトシンから誘導され、ピリミジン環の4位の少なくともアミノ基において、保護されておらず、かつ、該ヌクレオチドの酵素処理に有意な影響を有さない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応性官能基を含み、該共有結合性反応性官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され、かつ、該共有結合性官能基が、（-CH2-）n1および（-O-CH2-）n1（ここで、n1は1から12までの間の整数である）；（-CH2-O-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2および（-CH2-O-CH2-CH2-）n2（ここで、n2は1から6までの間の整数である）；および-NH-CH2-O-CH2-CH2から選択されるカップリングアームによりピリミジン環の4位にある該アミノ基に結合している核酸。該共有結合性官能基は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-およびNH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利である。
−その塩基がウラシルから誘導され、少なくともピリミジン環の5位に、保護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴とし；該共有結合性反応官能基が、-C≡C-CH2-および-C≡C-CH2-NH-CO-CH2-、-CH=CH-CH2-NH-CO-CH2-および-CH2=CH-CH2から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利である核酸。
−その塩基がアデニンから誘導され、ピリミジン環の6位の少なくともアミノ基において、保護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基がNH2、O-NH2、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴とし；該共有結合性反応官能基が、（-CH2-）n1および（-O-CH2-）n1（ここで、n1は1から12までの間の整数を表す）；（-CH2-O-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2、（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2および（-CH2-CH2-O-CH2-CH2-）n2（ここで、n2は1から6までの間の整数を示す）；および（NH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームによって該アミノ基に結合しているヌクレオチド。該共有結合性反応官能基は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-およびNH-CH2-O-CH2-CH2-から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利であり；好ましくは該カップリングアームは-CH2-CH2-CH2-CH2-である。
本発明はまた、酵素的増幅処理における、前記定義に同じ予め官能化したヌクレオチドの使用に関する。
酵素処理に関しては、予め官能化したヌクレオチド類似体またはヌクレオチドの挙動は、これに対応するヌクレオチド類似体またはヌクレオチドのそれと多かれ少なかれ同じである。これは、酵素に関して生物学的、また化学的に不活性である結果、該類似体またはヌクレオチドの塩基中の部位に導入されている官能基が、その基質に関する酵素の親和性または特異性のいずれかを有意に修飾しないことによるものである。
最後に本発明は、すでに定義したようなヌクレオチドの特殊な使用に関する。好ましくは、それらは以下の文献：EP-0 721 988、WO-95/03426、US-5 409 818およびUS-5 399 491に記載されたものなどの増幅法に使用される。
以下、実施例および添付図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
図1は、4位にアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図2は、4位にアルキルオキシアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図3は、アミノ交換によるヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。
図4は、TMAの感受性におけるCTP-（N4）-C6O2-NH2（27a）の組み込みの効果を示す。
図5は、TMAの感受性におけるCTP-（N4）-C4-NH2（27b）の組み込みの効果を示す。
前記図4および5において、反応あたりの標的コピー数はx軸で示され、反応液（最終反応容量=100マイクロリットル）マイクロリットルあたりの得られた増幅数はy軸で示されている。凡例、例えば、■、□、▲、○、●およびパーセンテージは図4および5の曲線に与えられている。このパーセンテージはTMA増幅反応における天然ヌクレオチドと比較した場合の、予め官能化したヌクレオチドのパーセンテージに相当する。図4および5はそれぞれ、それら各々の天然ヌクレオチドと比較した場合の、種々の比率の27aおよび27bヌクレオチドの存在下で、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）16S ＲＮＡの標的領域から生じた増幅数の、ELOSA法（PCT特許出願WO92/19812に記載）による半定量化の結果を示す。
本発明のいくつかの利点を示す以下の実施例では標識のための官能基を含む試薬について言及するが、もちろん本発明の範囲はこのような特性を持つ官能基に限定されるものではないことが理解されよう。
標識および予め官能化されたヌクレオチドの合成
ヌクレオベースにおけるヌクレオチドを予め官能化するために一般的に使用されている方法は、保護されている反応性官能基を有する保護されたヌクレオシドを合成することからなる。５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修飾ヌクレオシドが遊離し、これは最終的にはLudwig−Eckstein法（J. Ludwig, F.Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）を用いて該部位においてトリホスホリル化される。
２’および３’ヒドロキシル官能基を保護し、しかもベースに導入された鎖の反応性官能基を保護している基の加水分解によって、予め官能化したヌクレオチドトリホスファートが得られる。
I−アデノシン系列
実施例１：アミノ鎖（４）を有するヌクレオシドの合成
合成法：
イソプロピリデン（１）：（Nucleic Acid Chemistry, part 2. Townsend, Tipson, p. ７６８, Wiley Interscience）
トリアゾロ（２）：（Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc., １９９４，１１６，９３３１−９３３２）
アミジンの合成：（Bartlett and Humphreg, J. Chem. Soc., １９６７，１６６４−１６６６）
トリアゾロのモノ保護ジアミノブタンでの置換
１，４−ジアミノブタンのモノ保護：（３）の合成（Hassen, Nielsen, Ehrbar, Buchardt, Synthesis, １９８２，４０４−４０５）
トリアゾロのジアミノブタン−モノbocでの置換：（４）の合成
アセトニトリルを蒸発後、残さを酢酸エチルに溶解し、該有機相を飽和食塩水で洗浄する。乾燥して、酢酸エチルを蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン、次いでCH2／MeOH、９８／２，９５／５（v／v））にかける。濃縮し、ヘキサン中で結晶化すると、生成物（４）が白色粉末の形態で、８０％の収率（５６３mg，１．１２mmol）で得られる。ヌクレオシド（４）は、質量分析およびプロトンNMRで同定した。
Eckstein法によるホスホリル化（Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl）で確認する。保持時間＝３５分。
該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。１９分の保持時間を有する新規な生成物の形成が観察される。
実施例２：オキシアミノ鎖を有するアデノシンヌクレオチドの合成
鎖の合成ルート
ヒドラジン分解：鎖（７）の調製
オキシアミンBocの形成における保護
２０mlのジオキサンに溶解したジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（１．２当量，０．０１９mol，４．１８g）を、次いでアルゴン雰囲気下、氷中で滴下する。該混合物を０℃で３時間反応させた後、ジオキサンを蒸発させ、pHを１NのHCl水溶液で３にする。該混合物を次いでエーテルで抽出（３X５０ml）する。有機相を次いで１NのHCl水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発後、生成物（８a）が黄色のオイル形態（２．５６g，０．０１３mol，８０％）で得られる。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。
LiAlH4を用いたニトリルの還元
オキシアミン鎖でのトリアゾロの置換
ヌクレオシド（９）のホスホリル化
実施例１に記載したプロトコール（ヌクレオチド５の調製）を用いて、ヌクレオシド（９）をホスホリル化すると、ヌクレオチド（１０）が得られる。
実施例３：アミン鎖（１５）を有するウリジンの合成
合成ルート：
該鎖のベースへの導入：Heckカップリング（Hobbs, J. Org. Chem., １９８９，５４，３４２０−３４２２）
イソプロピリデン形態の保護（Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part ２，p．７６５, Wiley−interscience）
Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig, Eckstein, J, Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl）で確認する。保持時間＝３６分。
該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。２０分の保持時間を有する新規な生成物（１５）が形成される。
実施例４：アルコキシアミン鎖２１を有するウリジンの合成
合成ルート：
ペプチドカップリングによる鎖の合成（Costa, Dominguez, Cutts, Williams, Bowen, J. Med. Chem., １９９４，３７，３１４−３２１）
Heckカップリング：Hobbs, J. Org. Chem., １９８９，５４，３４２０−３４２２
イソプロピリデン形態の保護（Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part ２, p. ７６５, Wiley−interscience）
Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）
該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨウ素の１％溶液（４ml，３１４mmol）を添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％のNaHSO3の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃縮し、残さを水／ジクロロメタン抽出する。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tris−HCl，pH７．６ ＋ ０．５M NaCl；Waters Protein−Pak ８HR １０X１００mm DEAEカラム）で確認する。保持時間＝３５分。
該混合物を濃縮後、残さを水（５ml）に溶解し、５mlの５０％TFAの水溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発させ、水で共蒸発させる。HPLCで観察され、３０分の保持時間を有する新規な生成物（２１）が形成される。該生成物を上記条件下でHPLCで精製し、脱塩する（isocratic milliQ 水, Macherey Nagel C１８ヌクレオシルカラム）。
III−シチジン系列
I−アルキルアミノ鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチドトリホスファートの合成
ベースの４位にアミン化アルキル鎖を導入するために、ベースをCzernecki et al.の方法（S. Czernecki, T. Lediguarher, J. M. Valery, Nucleosides ＆ Nucleotides, １９８９，５４，６３１−６３５）で、［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル］ウリジンから、トシル基を導入することによって、活性化した。
トシル基のジアミン化アルキル鎖との求核置換、次いで導入された鎖のフリーのアミノ官能基のエチル＝トリフルオロアセタートを用いた保護が１工程で行われる。
５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修飾ヌクレオシドが遊離され、これは、最終的には、前記の実施例に記載したLudwig−Eckstein法（J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５）を用いて該位置においてトリホスホリル化される。
４位に導入された鎖のアミノ官能基のおよび２’および３’ヒドロキシル基を保護している基の加水分解によって、所望のヌクレオチドトリホスファートが得られる（図１）。
トランスアミネーションによってヌクレオチドの４位に直接アミン化鎖を導入することからなる他の方法も、ヌクレオチド（３３）および（３４）の調製に使用された（図３）。
実施例５：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル］ウリジン（２２）の合成
２’，３’−O−イソプロピリデンウリジン（１mmol，シグマ，I−５１２７）のピリジン（５ml）溶液をアルゴン雰囲気下、常温で、t−ブチルジメチルシリルクロリドで一昼夜処理する。反応を無水エタノール（２ml）を添加することによって止め、混合物を濃縮し、トルエンで共蒸発させる。生成物（２２）をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v，Rf＝０．３）で精製する。
実施例６：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル−４−p−トルエンスルホニル］ウリジン（２３）の合成
アセトニトリル（１７ml）中の化合物（２２）（１mmol）を、炭酸カリウム（１．３mmol，１．３当量）およびp−トルエンスルホニルクロリド（１．２mmol，１．２当量）の存在下、３時間、還流させる。出発化合物が完全に無くなった後、反応混合物を常温で、水（２ml）を添加することによって加水分解し、次いで乾燥するまで蒸発させる。得られた残さを酢酸エチル及び水のパーティション化によって処理し、以下の工程に使用する。
TLC：Rf＝０．７（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v）。
ヌクレオシド（２３）は以下のように特徴づけられる。
プロトン
ジアミン化アルキル剤（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（５ml）中の化合物（２３）（１mmol）の溶液に添加する。５分間撹拌後、過剰量のエチル＝トリフルオロアセタート（１５mmol，１５当量）を反応媒体に添加し、撹拌を１５分間続ける。所望のヌクレオシド（２４）を、シリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：２，v：v，Rf＝０．２）で精製する。完全に保護された中間体のヌクレオシド（２４）の構造は、プロトンNMRで確認される。
ヌクレオシド（２４a）の例：
THF（５ml）に溶解した化合物（２４）（１mmol）を、THF中のテトラブチルアンモニウムフルオリド（１．２mmol，１．２当量）のモル溶液で処理する。常温でアルゴン雰囲気下、３又は４時間撹拌後、反応混合物を酢酸（１当量）で中性化し、次いで乾燥するまで蒸発させる。化合物（２５）はシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：１，v：v，Rf＝０．３）で精製する。
実施例９：［４−N−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（２６）の合成
化合物（２５）（０．２mmol）をピリジン（２X１ml）で共蒸発させ、４００mlのピリジン／ジオキサン（１：３，v：v）混合物に溶解する。ジオキサホスホリノンクロリド（２６０μｌ）を反応混合物に添加する。５から１０分後に白色沈殿が形成され、２０分撹拌後、DMF中のブチルアンモニウムピロホスファート（０．５M，６４０μl，１．６当量）を反応混合物に添加し、次いで、トリブチルアミン（２３０ml）を添加する。３０分撹拌後、反応混合物をピリジン／水（９８：２，v：v）混合物（４ml）中のヨウ素の１％溶液で酸化し、３０分間撹拌をつづける。過剰のヨウ素を５％の重亜硫酸ナトリウムの水溶液で処理し、反応媒体を乾燥するまで濃縮する。得られた残さを水（２０ml）に溶解し、該溶液をジクロロメタンで洗浄することによって処理する。水相を回収し、HPLCで分析する（ミリポア５X１００mm DEAE ８HRカラム，バッファA：２０mMトリス−HCl，pH７．６，バッファB：２０mMトリス−HCl，０．５M塩化ナトリウム，pH７．６，流速：０．５ml／分，勾配：０から３５％B４０分）。保持時間：２４から２９分。TLC：Rf＝０．５，溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（６：３：１，v：v：v）。
実施例１０：［４−N−アルキルアミノ−５’−O−トリホスファート］シチジン（２７）の合成
アンモニア水（１０ml）を、水（２０ml）中の化合物（２６）（０．２mmol）の溶液に添加し、該混合物を１時間撹拌する。反応媒体を乾燥するまで濃縮し、残さを水（２０ml）、次いで５０％トリフルオロ酢酸水溶液（１０ml）に溶解し、撹拌を３０分間続ける。反応媒体を再度濃縮し、次いで水を用いて乾燥するまで蒸発させる。所望の化合物は、HPLCで精製、脱塩する。分析HPLC：保持時間：１７から２０分。精製：プレパラティブ１０X１００mmプロテインパック８HR DEAEカラム、実施例９と同様のバッファおよび勾配が使用され、流速は２ml／分である。脱塩：RP１８カラム、バッファA：水、バッファB：メタノール。TLC：Rf＝０．２、溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（４：５：１，v：v：v）。
II−アルキルオキシアミン化鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチドトリホスファートの合成
末端がヒドロキシル化されたアルキル鎖をまず、シチジンの４位のトシル基の求核置換によって導入する。次いで、導入された鎖のヒドロキシル官能基とN−フタルアミドヒドロキシルアミンとのミツノブ反応を行った。
相当するアルキルオキシアミン化ヌクシオチドトリホスファートが、アルキルアミン化ヌクレオチドトリホスファート合成と同様の工程（図２）にしたがって、得られる。
実施例１１：［４−N−ヘキサニル−６−オール−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−t−ブチルジメチルシリルシチジン（２８）の合成
６−アミノヘキサノール（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（５ml）中の化合物（２３）（１mmol）の溶液に添加する。反応を３０分間進めた後、溶媒を乾燥するまで濃縮し、化合物（２８）はシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
実施例１２：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−t−ブチルジメチルシリル］シチジン（２９）の合成
ジエチル＝アゾジカルボキシラート（DEAD，３mmol，３当量）を常温でアルゴン雰囲気下、THF（１０ml）中の、トリフェニルホスフィン（３mmol，３当量）およびN−フタルアミドヒドロキシルアミン（３mmol，３当量）の存在下、化合物（２８）（１mmol）の溶液に添加する。１時間撹拌後、溶媒を乾燥するまで濃縮し、化合物（２９）をシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
実施例１３：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン］シチジン（３０）の合成
化合物（３０）は、実施例８に記載したプロトコールにしたがって合成された。
実施例１４：［４−N−ヘキサニル−６−N−フタルアミドオキシアミノ−２’，３’−O−イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（３１）の合成
化合物（３１）は、実施例９に記載したプロトコールにしたがって合成された。分析HPLC（実施例１０と同様の条件）：保持時間：４４分。TLC：Rf＝０．５、溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニウム（６：３：１，v：v：v）。
実施例１５：［４−N−ヘキサニル−６−オキシアミノ−５’−O−トリホスファート］シチジン（３２）の合成
全保護ヌクレオチド（３２）を、実施例１０に記載したプロトコールにしたがってトリフルオロ酢酸を用いて２’及び３’位を脱保護する。アルコキシアミノ官能基は、ヒドラジンの水溶液中、常温で一昼夜で脱保護される。ヌクレオチド（３２）は次いでHPLCで実施例１０と同様の条件下、精製される。
実施例１６：トランスアミン化による［４−N−（２，２−オキシ−ビス−エチルアミン）−５’−O−トリホスファート］シチジン（３３）の合成
シチジントリホスファート（０．１mmol）を、１０Mの水酸化ナトリウム溶液で予め７．０にpHを調節した、水（２．５ml）中の２，２’−オキシ−ビス−エチルアミン塩酸塩と重亜硫酸ナトリウム（１２mmol，１２０当量）からなる溶液に添加する。該混合物を次いで３７℃で３日間撹拌する。化合物（３３）をHPLCで精製して脱塩する（実施例１０のHPLC条件参照）。
実施例１７：トランスアミン化による［４−N−（アジピン酸ヒドラジド）−５’−O−トリホスファート］シチジン（３４）の合成
ヌクレオチド（３４）は、実施例１６に記載したプロトコールにしたがって、ヒドラジド官能基を導入するためにアジピン酸ジヒドラジド（８３mg，０．４４mmol）を用いて、トランスアミン化によって調製された。ヌクレオチド（３４）はまた、実施例１０に記載されたように精製し、脱塩し、その構造はプロトンNMRで確認された。
IV−官能化フルオロホル（fluorophore）：
実施例１８：フルオレセインアルデヒド（３６）の合成
合成ルート：
アルデヒドの脱保護：
実施例１９：予め官能化したポリヌクレオチドの化学合成
出発物質のヌクレオチド２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシン（３８）の合成
出発物質のヌクレオシドは、A. LAAYOUN, J. −L. DECOUT and J.LHOMME, Tetrahedron Lett, １９９４，３５，４９８９−４９９０に記載された方法を用いて得られた前駆体２’−デオキシ−８−メルカプトアデノシン（３７）を用いて合成した。
予め官能化されたポリヌクレオチドの化学合成：
予め合成されたヌクレオシドをまず、オリゴヌクレオチドに組み入れる。この最後に、保護された出発物質のヌクレオシドに相当するホスホラミジトシントン（３９）が、A. J. ROGERS ”Oligonucleotide synthesis”（１９８４）, pp. ２３−２４, M. J. GAIT Ed., IRL Press. Oxfordに記載された方法を用いて調製された。
Lが２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシンであるポリヌクレオチド５’CGCACLCACGC３’が、製造者によって示唆されたプロトコールを用いてMilligen／Biosearch８７００装置で、自動的にホスホラミジト法によって合成された。
合成されたポリヌクレオチドは逆相HPLC（セミプレパラティブMacherey Nagel１０mmX２５cmカラム；C１８；５μm孔度；溶出液：pH６の酢酸アンモニウムの０．１M水溶液と混合された０から３０％アセトニトリル２０分勾配）。ポリヌクレオチドを含むフラクションを集め、凍結乾燥する。
酢酸（水中８０％）で常温で１０分間オリゴヌクレオチドを処理した後、ポリヌクレオチドの５’位を脱トリチル化し、ポリヌクレオチドを次いで単離して、次いでエーテルで抽出する。
次いで、前の工程に組み入れられたヌクレオチドLを、ヌクレオチドジオール５’CGCACMCACGC３’を得るために活性化する。
最後に、ポリヌクレオチドアルデヒド５’CGCACNCACGC３’
実施例２０：実施例１９で得られた予め官能化したポリヌクレオチドの標識化：
標識化反応をダンシル核からなり、官能性蛍光基として、ジエチレングリコール鎖によってオキシアミノ（求核性）基に結合した薬剤（４０）を用いて行う。該薬剤はD. BOUTURYN et al., Tetrahedron, １９９７，５３，５４８５−５４９２に記載された方法を用いて調製した。
予め官能化されたヌクレオチド：２’−デオキシ−８−（ブタナール）−チオアデノシン−５’−トリホスファート（４３）の合成：
該合成は２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシン（３８）（実施例１９参照）を用いて行われる。出発物質のヌクレオチド（４２）は、J. LUDWIG and F. ECKSTEIN, J. Org. Chem., １９８９，５４，６３１−６３５に記載された方法を用いて得られる。
予め官能化したヌクレオチド（４３）の酵素的組み込み：
a）プロモーターを有するＤＮＡ鋳型の作製：
標準プライマーおよび標準プライマー配列の上流にファージT7RNAポリメラーゼに関するプロモーターのセンス配列を有するプライマーを用い、直鎖状pGEMプラスミドに含有される遺伝子HIVgagについてPCRを行った。
プライマー配列：
b）転写反応：
エッペンドルフ管内で、40mMトリス塩酸緩衝液、pH8.1、20mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、1mMスペルミジン、8%ポリエチレングリコール、0.01%トリトンX100、50μg/mlのウシ血清アルブミン/ml中、最終容量25μlで転写反応を行った。予め官能化したヌクレオチド（43）および4種のリボヌクレオチド（CTP，GTP，ATPおよびUTP）をそれぞれ1.33Mmおよび各リボヌクレオチドについては4mMの濃度で加える。PCR鋳型は109コピー/μlの濃度で加え、ファージT7ＲＮＡポリメラーゼ（特許出願FR 97 04166）は1u/μlの濃度で加える。この反応物を37℃にて60分間インキュベートする。ＤＮＡ鋳型を破壊するために、O.5uのＤＮアーゼ1/μlを培地に加える。サンプルのインキュベーションを37℃にて15分間続ける。得られたＲＮＡはセファデックス（Sephadex）G50を通すことにより精製する。
平行して、T7ＲＮＡポリメラーゼを加えない反応により、第一の対照実験を行う。行われた転写のための対照として、いずれの活性化したヌクレオチドも用いずに第二の対照実験を行う。
精製した転写産物は実施例2に記載の実験方法を用いて標識し、アガロースゲルにおける電気詠動移動に続き、紫外線下で視認化する。
実施例２２：TMA増幅反応中の予め官能化したポリヌクレオチドの合成
TMA増幅産物を強力に標識するために、予め官能化したヌクレオチド27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）、27b（CTP-（N4）-C4-NH2）および32（CTP-（N4）-C6-ONH2）を増幅物に組み込む。増幅反応を平行して、フルオレセイン、すなわちフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）を有する標識ヌクレオチドの存在下で続ける。
予め官能化したヌクレオチド27a、27bおよび32、ならびに比較のためのBoerhingerの標識ヌクレオチドref. 1 427 857のTMA増幅反応産物への組み込みは、Genプローブ増幅TMMTD2（マイコバクテリウム・ツベルクロシス指示試験）キットを用いて試験する。この反応はマイコバクテリア16S ＲＮＡの136塩基断片を増幅する。それは４種の酵素活性（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼH）および２種の酵素、T7ＲＮＡポリメラーゼおよびAMV逆転写酵素を用いる。転写、逆転写およびＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんに含まれるＲＮＡの消化の工程（これらの工程はＲＮＡウイルス複製サイクルに類似）を含む循環反応により、この反応は２種のプライマー（単純プライマーおよびT7ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマー）によって認識される核酸配列を特異的に増幅させることが可能になる。増幅因子は極めて豊富であり（109）、感受性は極めて良好である（1ないし10コピー）。得られた産物の90%は一本鎖ＲＮＡからなり、10%は二本鎖ＤＮＡからなる。
増幅反応は106コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡを用いて行う。この標的ＲＮＡを予め得て、以下の方法により精製する：16S ＲＮＡ遺伝子をプロモーターの制御下でプラスミドにクローン化する。次いでin vitro転写により16S ＲＮＡを得る。このＲＮＡをフェノール／クロロホルムでの抽出、およびミクロコン30TM（Amicon）を通す濾過により精製する。それを260nmでの吸収により検定する。
標準的なTMA反応は各天然rNTP（ATP，CTP，GTPおよびUTP）を4mM含む。予め官能化したヌクレオチドを増幅産物へと組み込むためには、反応緩衝液中にこれら修飾されたヌクレオチドの１つが含まれている限り、この反応を行う。修飾されたものであろうと天然物であろうと、同じシリーズの各ヌクレオチドの総濃度が4mMであることを確かめると同時に、この反応は種々の濃度比率の修飾ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの存在下で検討される。検討された比率は0%、10%、30%、50%および70%（70%では試験できないフルオレセイン-UTPの場合は除く）である。陰性対照実験も行い、この陰性対照実験は、酵素は別として（凍結乾燥酵素を再溶解させるために使用する緩衝液により置換）、使用される最高比率の修飾ヌクレオチドを含有する、すべての試薬を含んでなる反応液からなる。
増幅反応は、変性ポリアクリルアミドゲル（6%アクリルアミド、7M尿素、1xTBE、bioRad電気泳動装置、170ボルト、45分）上で反応混合液5μlを電気泳動させ、次いで臭化エチジウムで染色することにより分析し；続いて、ノーザンブロッドを行う。核酸をメンブラン（ナイロンN、bioRad半乾燥転移装置、0.5xTBE、25V、15分）に転移させ、ペルオキシダーゼで標識したマイコバクテリウム・ツベルクロシスに特異的な核酸プローブ：
蛍光ヌクレオチド（フルオレセイン-12-UTP）を含有する反応の場合には、この増幅産物はまた、臭化エチジウムでの染色の前に紫外線テーブル上でのフルオレセインの励起により、ゲル上で視認化される。
臭化エチジウムでの染色に続き、予め官能化したヌクレオチドを使用するものを含めあらゆる反応の場合で、期待される増幅産物が大量に視認化される。ノーザンブロッティングの後、これらの産物を特異的プローブとハイブリダイズさせる。
実施例２３：TMA増幅産物における組み込み率の分析
標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）の存在する場合と比較することにより、予め官能化Ｌたヌクレオチド27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）および27b（CTP-（N4）-C4-NH2）の存在下で得られた増幅物の予めの官能化を評価するため、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドと類似体天然ヌクレオチドの間の比率を決定する。
実施例22の実施において得られた増幅産物をミクロコン30TM（Amicon製）を通す濾過により、反応物中に過剰に存在するヌクレオチドから分離し、50μlの水に溶解させる。フルオレセイン-12-UTPの存在下での増幅の場合は、増幅はセファデックス（Sephadex）G50上で行う（フルオレセインはミクロコンに吸着させる）。
次いで増幅産物の吸収を260nmにて測定する（酵素を含まない対照は極めて低濃度であるはずである）。
予め官能化したヌクレオチドを含む増幅反応（およびそれらの対照）の場合では、次いで、核酸を下位のヌクレオシド段階へと消化する工程を行う：
増幅産物5 1014コピー（およそ35μg）を最終容量86μlの水に希釈する（酵素を用いない対照の場合には、最大サンプル容量に等しい容量を用いる）。10μlの10xP1ヌクレアーゼ緩衝液（300mM CH3COONa緩衝液、pH5.3、1mM ZnSO4）および4μlのP1ヌクレアーゼ（Boerhinger, ref. 236225, 1μg/μl, 0.3u/μl）を加える。反応混合物を37℃にて30分間インキュベートする。次いで、12μLの10xアルカリ性ホスファターゼ緩衝液（Boerhinger, ref. 1246283）および1μlのアルカリ性ホスファターゼ（Boerhinger, ref. 713023, 1U/μl）を加え、37℃にて15分間インキュベーションを続ける。反応は氷で停止させる。
次いで、高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC, Beckman, Gold system）により、ヌクレオシド標準品と比較することによって、このヌクレオシド組成物を定める（各ヌクレオシド50ngのインジェクション）。20μLの消化物C18（Ultrasphere）カラムにインジェクトし、これを45℃で加熱する。分離は、メタノール勾配（10分後、95%メタノールの0%から30%を15分内に通す）を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液，pH7中で行う。ピークは254nmでの吸収により視認化し、ピーク面積を積分により算出する。
官能化したヌクレオチドのピーク面積と天然類似体のそれとの間の比率により、組み込み率、すなわち組み込まれている予め官能化したヌクレオチドの量と組み込まれている同シリーズのヌクレオチドの総量の間の比率を求めることができる。
酵素を用いない対照ではピークの立ち上がりは見られないはずである。この対照が過剰に存在するヌクレオチドを除去する工程が首尾よく効力を示したことを証明する。
フルオレセイン-UTPを含む増幅反応の場合では、組み込まれたフルオレセインヌクレオチドの量を蛍光強度により測定する：標準範囲のフルオレセインの蛍光強度はPerkin LS 50分光蛍光光度計で読みとる。種々の増幅反応の蛍光強度を測定する。組み込まれたフルオレセイン量は標準曲線と比較することにより求める。組み込み率は260nmでの吸収により測定される増幅物濃度に換算する。
HPLC分析により、８種の天然ヌクレオシド、ならびに試験された３種の予め官能化したヌクレオチドに対する類似体である３種のヌクレオシドを分離することができる。
下記表に示される結果は、検討されたすべての予め官能化したCTPヌクレオチドが、慣例的に用いられる標識ヌクレオチドであるフルオレセイン-12-UTPよりも優れた、TMA増幅産物における組み込み率を与えることを証明するものである。
同様に、組み込み率の改良は、シチジンのN4位に組み込まれるヌクレオチド32のオキシアミノ基などの他の反応官能基を用いて達成することもできる。
実施例２４：TMA感受性における予め官能化したヌクレオチドの組み込みの影響に関する分析
予め官能化したヌクレオチドの組み込みを含むTMAの感受性を研究するため、種々の比率（100%，70%，50%，30%，10%および0%）の予め官能化したヌクレオチドとその天然類似体の存在下で、標的（実施例22に記載のマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡ）量を減少させながら（10000，1000，100，10および0コピー）TMAを行った。同様の予め官能化したヌクレオチド、すなわち27a（CTP-（N4）-C6O2-NH2）および27b（CTP-（N4）-C4-NH2）を試験した。
反応生成物を、特に実施例22に記載の方法により研究する。
また反応生成物をELOSA（PCT WO 92/19812）およびシグナル強度の標準範囲のそれとの比較による半定量的手法にて分析する。
反応は、予め官能化したヌクレオチドの存在下で行い、電気泳動および染色、ノーザンブロッティングおよびELOSAにより分析する。使用された種々の分析方法の代表的なELOSAにより得られた結果を図4および5に示す。いずれの予め官能化したヌクレオチドを使用しようとも（27aまたは27b）、最初の標的のコピー数が極めて少ない場合でさえ、TMA反応の感受性に有意な影響を及ぼさない予め官能化したヌクレオチド濃度を求めることが可能である。さらに特に、添付の図5から明らかなように、ヌクレオチド27bは天然ヌクレオチドと置き換えることが可能である。
実施例２５：予め官能化した増幅物の標識
予め官能化したヌクレオチド27b（CTP-（N4）-C4-NH2）の存在下で、実施例22を行ったときに用いた方法により得られた予め官能化した増幅物を、増幅により維持させ、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドにより供給する求核基と、予めフルオレセインと結合させた抗反応求電子基との間の化学結合反応により標識する。得られた標識は、標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP（Boerhinger, ref. 1 427 857）の存在下で得られたものと比較する。
106コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16S ＲＮＡ標的を用い、予め官能化したヌクレオチド27bの50%存在下で、実施例22に記載の方法により増幅物を得る。
得られた増幅物は、以下の方法：｛30μlのTMA増幅産物を30μlの0.2M炭酸塩、0.15M NaCl緩衝液、pH8.8および40μl（およそ200当量）のフルオレセインNHS（DMSO中3.5mg/ml）と混合｝を用いてフルオレセイン-NHS（Boerhinger 8370042128）と結合させる。周囲温度で１時間振盪の後、この標識を分析する。
実施例22に記載のゲル電気泳動によりこの標識増幅物（15μl）を分析し、次いで、臭化エチジウムでの染色の前後で、紫外線下で視認化する。このプロフィールを50%フルオレセイン-12-UTPの存在下で標識することにより得られたものと比較する。
染色なしで得られたシグナルは、フルオレセインで直接標識することにより得られたものよりさらに強力である。ヌクレオチド32が有するオキシアミノ基を用いることにより、フルオロフォール36と結合させた後も、同等の良好な結果を得ることができる。オキシアミノ／アルデヒド結合の反応性は、実施例20で示したように、達成される結合時間を短縮することが可能である。
Claims (11)
- −標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、少なくとも１つのポリメラーゼ活性と、ヌクレオチドとを少なくとも準備し、
−特に単一または複数の前記ポリメラーゼ活性に関して適切な条件下で、標的配列を増幅させる、サンプル中に存在する標的核酸配列の増幅方法であって、
−得られるヌクレオチド中、少なくとも１つのヌクレオチドが、前記ヌクレオチドのベースの少なくとも１つの予め定められた部位に結合手によって結合し、アミノおよびオキシアミノ官能基から選択された、少なくとも１つの保護されていない共有結合性反応性官能基が少なくとも存在することによって、他のヌクレオチドとは異なる予め官能化したヌクレオチドであり、前記結合手は、−（CH 2 ） 2 −O−（CH 2 ） 2 −O−（CH 2 ） 2 −、−（CH 2 ） 4 −、および−（CH 2 ） 6 −からなる群から選択され、さらに、
−得られた予め官能化した増幅産物が、官能化された増幅産物を得るために、蛍光性および発光性分子から選択された官能標識基と、アルデヒド官能基からなる共有結合性抗反応性官能基を含有する試薬と、直接的にまたは間接的に反応することを特徴とする方法。 - 該試薬の官能標識基が、蛍光化学分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 該試薬の官能標識基が、フルオレセインおよびダンシルから選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 試薬の抗反応性官能基が結合手によって官能標識基に結合することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか1項に記載の方法。
- 標的核酸配列が、DNAまたはRNA配列であり、前記ポリメラーゼ活性がRNA−依存および／またはDNA−依存DNAポリメラーゼ活性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ポリメラーゼ活性がさらに、リボヌクレアーゼＨ活性およびDNA-依存RNAポリマラーゼ活性を含有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
- リボヌクレアーゼHおよびDNAポリメラーゼ活性が、単一の酵素によって供給されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
- リボヌクレアーゼHおよびDNAポリメラーゼ活性が、異なる酵素によって各々供給されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
- 予め官能化されたヌクレオチドのベースがシトシンから誘導され、前記反応性官能基が、ピリミジン環の４位のアミノ官能基に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ポリメラーゼ処理に付すことができ、そのベースがシトシンから誘導され、少なくともピリミジンベースの環の４位のアミノ官能基に、−（CH2）6−からなる結合手によって結合したオキシアミノ官能基からなる少なくとも１つの反応性官能基を含有することを特徴とする予め官能化されたヌクレオチド。
- ポリメラーゼ処理に付すことができ、そのヌクレオベースがシトシンから誘導され、少なくともピリミジンベースの環の４位のアミノ官能基に、−（CH2）2−O−（CH2）2−O−（CH2）2−からなる結合手によって結合したアミノ官能基からなる少なくとも１つの反応性官能基を含有することを特徴とする予め官能化されたヌクレオチド。
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