JPH04503403A - 5′―結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシヌクレオチド - Google Patents
5′―結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシヌクレオチドInfo
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- JPH04503403A JPH04503403A JP1509892A JP50989289A JPH04503403A JP H04503403 A JPH04503403 A JP H04503403A JP 1509892 A JP1509892 A JP 1509892A JP 50989289 A JP50989289 A JP 50989289A JP H04503403 A JPH04503403 A JP H04503403A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
5′−結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシ
ヌクレオチド
技術分野
本発明はホスホルアミダイト(phoaphorawtdi te)ファミジド
結合アクリジンを用いる5′−アクリジン結合オリゴヌクレオチドの自動合成方
法に関する。これらの化合物は遺伝子発現の阻害のために有用であり、細胞への
取り込みの速度過程を螢光細胞選別を用いて測定することを可能にするものであ
る。
前景技術
オリゴデオキシヌクレオチドは特定の遺伝子メツセージまたはウィルス配列に対
して相補的であり、「アンチセンス」化合物と称される。これらの化合物はまた
、ラウス肉腫ウィルスおよびヒト免疫不全ウィルス、即ち[IIVに対する阻害
作用を有することが報告されている。
過去数年間に、抗−12NAとしてのオリゴデオキシヌクレオチドの使用は急速
に確立され拡大し、例えばHe1ene(Guschlbauer、 74.纒
DNA リガンド相互作用:薬剤から蛋白へ、 P1enus+ 1986)、
He1kkila等(Natures328:445−449(19B?)お
よび5tain等(Cancer Re5earch。
1988、新聞発表)により報告されている。 Matsukura等(Pro
c、 Natl、 Acad、Sci、、 USA 84ニア706−7710
(1987))はHIVウィルスの^TH8細胞に対する細胞毒性作用に対する
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの阻害作用を観察している。H
IV art/lrs遺伝子の5′−51域に対するアンチメツセージS−オリ
ゴヌクレオチド(28−s34)はp24の生産をほぼ完全に阻害できた。興味
深いことに、ホモポリマーS−dczmは1マイクロモルはどの低濃度でウィル
ス阻害の作用を示している。
Maju*darによる最近の研究は現在継続中であるが、この分子が低アフィ
ニティー結合部位および高アフィニティー結合部位でウィルス逆転写酵素に結合
できることを示している0通常のオリゴ種は、配列特異的なものもホモポリマー
も有効ではない。
これらの観察結果の1つの可能性のある説明として、Ecksterin(An
n、Rev、Bioche曽 54:367−402(1985)) の記載す
るようにホスホロチオエートジエステル結合のヌクレアーゼ安定性が考えられる
。しかしながら、通常のオリゴヌクレオチドとS−オリゴヌクレオチドの分解速
度を実際に比較した報告はなく、また通常のオリゴ−PS−オリゴニ重らせんの
熱安定性の測定も行なわれていない、単一のPS置換を有するオリゴヌクレオチ
ドの2つの立体異性体(SpおよびRp)の合成およびいくらかの性質がLaP
lanche等(Nucl、^cids Res、 14;9081−9093
(1986))により報告されているが、極めて広く用いられている自動合成
法は立体特異的なものではない。
実際、これらの化合物が臨床において現実に有用となる前には多くの障害が残っ
ている0例えば、現在の価格では28量体S−オリゴ1.Ogは50,000ド
ルを超える。
理論的により短いオリゴ体が低価格である。しかしながら、15量体より小さい
配列は特異性を有さす、S−オリゴ/RN^ハイブリッドは37℃のアッセイ温
度より低温の融点を有する。He1eneと共同研究者As5eline等(H
MBOjournal 3ニア95−800(1984)); As5elin
e等(Proc、 Natl。
Acad、Sci USA 81:3297−3301(1984)):He1
ene等(GuschIbauer、 op cit);およびToul+me
等(Proc、 Natl、 Acad。
Sci、 USA 83:1227−1231(1986))は3′末端で共有
結合し、一部は5′末端で結合した介在アクリジン部分含有する一連のオリゴマ
ーを提示している。これらの研究者達は、アクリジンの介在による結合安定性か
ら得られたとするより短いオリゴヌクレオチド(n<12)の融点の実質的な上
昇を記載している。
He1ene等は、欧州特許第0169787号、第0214908号および第
0117777号において、RNAおよびDNAの切断のため、ウィルスの複製
または発現の防止のため、または特定のDNAおよびRNAの配列の検出と生成
のための、介在基に結合した修飾オリゴヌクレオチドを開示している。これらの
オリゴヌクレオチドは共有結合により介在基を融合することにより調製される。
化合物は知られた方法、特にホスホトリエステル合成により調製される。開示さ
れた工程において、ヌクレオチドの鎖を先ず調製し、反応に関与しない基を反応
の間保護し、その後保護基を除去して最終生成物とする。
例えば3′−ホスホジエステルヌクレオチドを介在する試薬のヒドロキシル誘導
体と結合させる。残念なことに、この合成方法はかなり複雑であり、標準自動合
成工程には容易に適用できない。
その他の研究者はオリゴヌクレオチドに螢光標識を導入する試みを行なっている
。しかしながら、これらの方法は製品の大規模生産には適さなかった。
5proat等のPCT国際公開−087107611号は、螢光染料を用いた
オリゴヌクレオチドの標識方法を開示している。標識は、オリゴヌクレオチドを
その5’−(H3−(Y)z )−誘導体に変換し、これを螢光染料の誘導体と
反応させ、これが5−誘導体とともに螢光団オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレ
オチドを形成することにより行なっている。
Yamane等の欧州特許第0.251283号は、化合物の基本骨格の形成お
よび/またはそこへの置換基の導入のために用いた配列を用いることにより多標
識オリゴヌクレオチド誘導体を調製する方法を開示している。一方の方法は、ア
ミノアルキル化オリゴヌクレオチドを合成し、次に化合物にポリリジンを導入し
、そしてポリリジンを標識物質で標識することを包含している。
他方、アミノアルキル化オリゴヌクレオチドを、予め標識物質で標識したポリリ
ジンと結合させることもできる。
Inoue等の欧州特許第0235301号は、螢光物質でありグアニジンまた
はアデニンと塩基対を形成できるピリドピリミジンオリゴヌクレオチドの生成方
法を開示している。化合物は標準的な方法で合成できる。その化合物は全ては螢
光物質であり、天然のピリミジン塩基の共通の特性を示すとされている。
Cohen等は1988年2月22日出願の07/159.017号で、種々の
腫瘍およびレトロウィルスに対する処置のために用いることのできるオリゴデオ
キシヌクレオチドを開示している。この出願は参考のために本明細書に組み込ま
れる。
現在のところ、ポリヌクレオチド合成のための種々の方法がある。これらの方法
はいくつかの基準により特徴付けられる。第1に、合成は通常は固相支持体上ま
たは溶液中で行なわれる。固相合成法は支持体の一端に結合している成長中の鎖
に順次モノヌクレオチドを付加していく方法である。固相法は反応体の分離は容
易であるが、反応体の過剰な量が必要であり、通常、所望の配列は少量、即ち1
■未満しか得られない、溶液相合成法は高価な反応体の必要量が少なくより多く
の量の生成物配列が得られるが、各添加後に中間体生成物の単離および精製を必
要とする。実質的に全ての自動ポリヌクレオチド系は固相合成によるものである
。
オリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらの誘導体の
オリゴマーまたは重合体を調製するための反応系は、これらの化合物を比較的安
価に合成する簡便な方法になってきている。現在使用されている固相反応系は、
強床カラム、別法カラム、バッチ反応器または管状反応器の何れかを使用してい
る。このような系はl1rdea等の米国特許第4.483.964号に開示さ
れており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる。
発明の要旨
本発明の目的は上記した従来技術の欠点を克服することである。
本発明の別の目的は一連のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類縁
体の合成方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は遺伝子発現のアンチメツセージ阻害剤の自動調製方法を
提供することである。
本発明の更に別の目的はFIIV感染症の治療のための化合物の自動調製方法を
提供することである。
本発明の更に別の目的は螢光標識の付されたオリゴヌクレオチドまたはその化学
修!I頻緑体をall製するための合成方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、螢光アクリジン基の結合したホスホルアミダイトの合
成、および、それを合成オリゴヌクレオチドまたはその類縁体の5′末端へ自動
D口合成装置中で付加することを提供することである。
本発明はオリゴデオキシヌクレオチドの5′末端を螢光標識するための単純で、
自動化された高収率の方法を包含するホスホルアミダイト合成法を提供する0反
応過程を図1に示す、5′−アクリジン結合分子はPOおよびPSともに、逆相
クロマトグラフィーで容易に精製される。2つの主要ピークが観察され、各々は
アクリジンを含有しているが、IBおよび”P NMRによれば、所望の化合物
はより長い保持時間で一定に溶出することが解る。より早く溶出する成分の性質
はこの時点では明らかではない。
HL6G細胞は流動血球1夏分析により解るとおり、チミジンのホモオリゴデオ
キシヌクレオチドを取り込む。
即ち、オリゴデオキシヌクレオチドのエネルギー依存性輸送機構が存在すると考
えられる。即ちこれらの化合物は遺伝子発現のマーカーおよび阻害剤として有用
である。
図面の簡単な説明
図1は自動合成装置における結合ホスホルアミダイトを用いた5′−結合アクリ
ジンオリゴデオキシヌクレオチドの合成過程を示す。
図2は、5′−アクリジン−dT、の芳香族部分の400 MFIzおよび65
℃におけるプロトンNM費スペクトルである。
図3は種々のGC含有量のホスホロチオエート14−s34オリゴデオキシヌク
レオチドと通常のもの七の融点の差を示す。
図4は遊離アクリジンおよび5′−アクリジン−dT+を細胞への取り込みに対
する温度の影響を示すものである。
図5^および5Bは通常のdTおよび5−dTオリゴデオキシヌクレオチドの細
胞への取り込みを示すものである。
発明の詳細の記述
5′−結合オリゴデオキシヌクレオチドはホスホルアミダイトアクリジンを用い
て自動合成装置で合成できる。これらの化合物は、特定のホスホロチオエートオ
リゴデオキシヌクレオチド類縁体がその通常の同族体とは異り、Matsuku
ra等(Proc、Natl、Acad、Sci、 USA84ニア706−7
710(19B?)> (7)報告の通り、明らかな抗HIV活性を示すことか
ら重要である。
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのアクリジン−チミジン塩基対
の融点は通常のオリゴデオキシヌクレチドに比べて明らかに低下しているが、G
C含有ホスホロヂチオートオリゴデオキシヌクレオチドは更に低下した融点を示
す、ポリ−「^を有する5−dTオリゴマーの融点は通常のdAオリゴマーの二
重らせんより低温である。これらの結果は遺伝子発現のアンチメツセージ阻害剤
としてのS−d (CG)配列の理論的m拠を与えるものである。
ホスホルアミダイト結合アクリジンを用いた5′−アクリジン結合オリゴチミジ
レートの自動合成の間に、アクリジンの6−クロロ置換基がチオフェノールによ
り置き換えられることが解った。対応するdA、を有する二重重らせん型上の通
常およびホスホロチオエートのdTn (n・3−40)に結合した3つおよび
5つのメチレン基を有する化合物と比較して5−メチレン結合アクリジン誘導体
の融点は僅かに上昇していた。これらの螢光標識オリゴデオキシヌクレオチドは
より大きい化合物よりもより速く取り込まれ、通常のオリゴデオキシヌクレオチ
ドはS−オリゴデオキシヌクレオチドより速く取り込まれることが解った。この
細胞取り込みの温度依存性はエネルギー依存性過程およびオリゴデオキシヌクレ
オチドの膜受容体の存在の可能性を示唆するものである。
N−(6−クロロ−2−メトキシ−アクリジニル)−〇−メトキシージイソプロ
ピルアミノホスフィニル、3−アミノプロパン(1)オールおよび5−アミノペ
ンタン(1)オールの調製
3−アミノプロパツール、5−アミノペンタノールおよび6.9−ジクロロ−2
−メトキシアクリジンは^ldrlchChemical Co、より入手した
。6−クロロ−2−メトキシ(ヒドロキシアルキルアミノ)−9−アクリジンは
^5seline等の方法により!j[した(Proc、 Natl、 Aca
d、 Sci。
us^、 op、c口)、ホスホルアミダイトはConnallyの方法の変法
により!M製した。6−クロロ−2〜メトキシ〜9−(3−ヒドロキシプロピル
)アミノアクリジン(318mg、 l■−〇暑)または5−ヒドロキシペンチ
ルアミノ誘導体(346B、 1ssol)を塩化メチレン(CHxc j!
z )2mlに溶解した0次いで、N−エチル−ジイソプロピルアミン(380
m1cro L、2+w+gtol)N、N−ジイソプロピル−メチル−ホスホ
ナミドクロリドC194m1cro L、 l5sol)を約5分間かけて添加
した。更に30分後、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸
エチル:トリエチニルアミン、10:10:1)によれば、反応が終了していた
(出発物質のRfは0.1.生成物のRfは0.8(■=3)および0.75(
−5))、塩化メチレン5ml を添加し、混合物を5%重炭酸ナトリウム(2
X5■l)および飽和塩化ナトリウム5mlで抽出した。有機層を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、蒸発させて黄色油状物を得た。これを少量の9:1ヘキサン/ト
リメチルアミンに溶解し、この混合溶媒を用いながらシリカゲルカラム(10x
2 cm)上のクロマトグラフィーで精製した。生成物は上記薄層クロマトグ
ラフィー系では単一のスポットとして溶離し、正しいプロトンNMRスペクトル
を有していた。更に、”IP NMRスペクトルによれば、単一のピーク147
.331(m讃3)および147.171(−・5)がみとめられた、約65%
の収率であった。
オリゴデオキシリボヌクレオチドの調製5−メチルシチジンローシアノエチルホ
スホルアミダイトをGlen Re5earch(Herndon、 VA)よ
り入手した0通常のオリゴデオキシヌクレオチドは全て、APpltedBio
systems 380B DNA合成装置で合成し、HPLC逆相り1 ロマ
トグラフィー(PRP−1) カラムで精製した。アセトニトリル中アクリジニ
ルホスホルアミダイトの100mM溶液を用いて合成を1同素分に実施した。こ
の最終カップリングの後、メチルホスフェート保護基をチオフェノールで除去し
く、!曝露時間30分)、樹脂からの分離は濃アンモニア水を用いて行なった。
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの自動合成は、5tein等(
Nucl、 Ac1ds research+ 198L新聞発表)の報告のと
おり、5tecの方法の変化法により実施した。
即ち、標準ヨウ素酸化をC5t/ピリジン/ トリエチルアミン(45:45:
10)中の元素イオウの10%溶液を用いたイオウ化段階と置き換えた。酸化段
階の前後、カラムを二硫化炭素およびピリジンの1:1溶液で繰り返し洗浄して
残存イオウを除去した。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを上記
した逆相HPLCで精製したが、その際の%有機層(アセトニトリル)は高値で
ある。試料を3%酢酸中室温でトリチル除去し、酢酸エチルで抽出し、凍結乾燥
した。
融点
ポリ−rAおよびポリ−r1 をPhar腸aciaより入手した。
全光学測定は、CPSコントローラーサーモスタットに連結したShiwadz
u−LIV−160記録分光光度計で行なった。
吸光度は10−Mナトリウムカコジレートハ405M塩化ナトリウム緩衝液、
PH7,0中、260nmで記録した。全ての二重らせんは、1本鎖とその相補
鎖との1:l混合物として形成した。全試料を75〜98℃で予gII溶融して
二次構造を破壊し、次に熱的に平衡とした。各溶融曲線は最低20の独立した点
よりなる。
NM[?測定
NMRスペクトルは22℃で、′Hでは400MHz、 ”Pでは162MHz
でVarian XL−400分光型で測定記録した。化学シフトは内部TMS
および外部T?IPに対してそれぞれ測定した。リサイクル時間は2〜3秒とし
、スキャン回数はI)で64〜200回、llpで3000回までとした。積分
はVarianプログラムにより行なった。
酸素の速度過程
S1ヌクレアーゼおよびPIヌクレアーゼをBI?Lより入手した。ウシ肺臓ホ
スホジェステラーゼおよびヘビ毒ホスホジェステラーゼをPhar*acfaよ
り入手した。反応は全て37℃で総容積1111で行なった。WJjL光度値は
λwaxで測定した。 Slヌクレアーゼ(100(lsicrons/ml)
を30mM酢酸ナトリウム(pH4,6)、 505M塩化ナトリウム、1■H
酢酸亜鉛および5χ(v/v)グリセロールを含有する官能緩衝液中1:10に
希釈した。酵素の最終濃度は100u/−1であった。 piヌクレアーゼ(4
011/−1)を50−M酢酸ナトリウム(pt15.3)を含有する反応緩衝
液中1:10に希釈した。酵素の最終濃度は4u/mlであった。ウシ肺臓ホス
ホジェステラーゼを水に溶解しく0.04u/ p L)、125mMスクシネ
ート−塩酸を含有する溶液pf16.5に添加(1u/−1)シた。ヘビ毒ホス
ホジェステラーゼ(46閤g 5olid)/層I)を500 a L の水に
溶解した。この溶液のうちIIILを、1005M )リス塩酸、 pH8,9
,100mM塩化ナトリウムおよび14wM塩化マグネシウムを含有する反応混
合物に添加した。
データ分析
全データをNIHコンビエータ−センターのDHCPDPIOコンピューター上
のMLABプログラムを用いて分析した。
単純指数をヌクレアーゼ分解データに通用しく吸光度対時間)、そして、下記式
:
%式%(1)
〔式中00(T) は時間Tにおける光学密度であり、ε。
およびε、は最小および最大の吸光度値であり、Kmexp(H(T−Tm)R
Ta+”) )であり、Hはファントホヮフのエンルビーである〕のシグモイド
曲線を溶融曲線に適用した(規格化吸光度対温度)。
アクリジンII識オリゴデオキシヌクレオチドの細胞蓄積の流動血球計数分析
5′−アクリジンを有する種々の長さのオリゴデオキシヌクレオチド(dτy、
dT+z、 dTtoおよびdTto)を10%ウシ胎児血清および抗生物質
を含有するRP11640培地中、0.2〜0.5マイクロモルの最終濃度で、
HL60細胞とともにインキュベートした。所定の時間の培養液から細胞100
,000を採取し、リン酸塩緩衝食塩水で3回洗浄し、Becton Dick
inson Facstar装置を用いて流動血球計数分析により分析した。細
胞内アクリジンを300− に設定したアルゴンレーザーの488nm線で励起
し、個々の細胞の発光螢光を記録した。集団の対数増幅螢光が単峰型であったた
め、データをFacstarによるCon5ort 30ソフトウエアを用いて
計算された集団の螢光中央値として表わした。
アクリジン含有オリゴマーの特性化
アクリジン結合オリゴデオキシヌクレオチドの合成に用いた反応工程を図1に示
す、生成物はHPLC,UV。
Iおよび”P NMR分析で特性化した。全生成物は単一の主要ピークを”P
NMRスペクトル上で示した。 UVおよび’HNMRスペクトルは単一のアク
リジン結合化合物とは合致しなかった。観察されたピークはAs5eline等
(op、cit、、 1984a) の報告した6−クロロ化合物には相当しな
い、芳香族プロトン共鳴の相対領域は一貫して、図2に示すように、生成物中に
存在する余分の芳香族部分を示していた。ヌクレオチドの結合しないアクリジン
前駆体を合成装置の条件下でチオフェノールで処理したところ、やはり余分の芳
香族基を有する生成物が得られた。従ってこれは、図1に示すようにアクリジン
の6−クロロ置換基とチオフェノールとの置換反応であると考えられた。このチ
オフェノール置換に関わらず、得られた生成物は以下に述べる溶融試験および細
胞取り込み試験で使用するのに適していることが解った。
融点温度
全てのPSおよび通常の種々の長さくn・12.15.20)のオリゴdTのポ
リ−r^との二重らせんの融点を表■に示すように措定した。オリゴdC(15
および28量体)をおよび5−メチル−オリゴ−dC(28量体)のPSおよび
通常のものとポリ−rl の二重らせんの融点も測定した。
表1
ボ’)−rAを伴った5′−アクリジンオリゴ−dTの融点PO−オ 1 ゴ
a+T−ΔHΔTm PS−オ 1 ゴ mT−ΔHΔ丁−〇−dT12 32
42 5−dT12 < 120−dT12−Acr3 37 37 5 5
−dT12−Acr3 <125 39 43 7 5<12
0−dT15 39 54 5−dT15 22 380−dT15−Acr3
43 41 4 5−dT15−Acr3 20 40 −2O−dT20
45 65 5−dT20 29 490−dT20−Acr3 49 60
4 5−dT20−Acr3 30 24 −1表Hに示す通り、S−オリゴは
相当するPO?J合体より約10〜12℃低い融点を有している。意外にも、5
−メチル5−dc、、、 42℃、ΔH・80の融点は未メチル化通常同族体と
ほぼ等しい、全psおよび通常の15量体の融点をGC含を量の関数としてその
相補的なオリゴ体と比較したところ、図3に示すように、約50%含有量におい
て最も小さい差が観察された。
表■
ポリ−rl を伴ったオリゴ−dCの融点PO−オリゴ T−ΔHPS−オリゴ
Tm ΔH61階0−dc15 29 833−dc15 20 85 9O
−dC28411075−dC2831921OS−5Me10S−54280
5′結合アクリジン誘導体を有する覆々の長さのポリ−rA とオリゴdTとの
二重らせん(通常およびPS)の融点を、表■に示すように、同じ長さの未修飾
のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドと比較した。
各々の場合において、As5eline等(op、 ci t、 、 1984
b)の報告のとおり、介在部分とオリゴ部分との間の結合には3または5つのメ
チレン基が含まれていた* n <12のS−オリゴとポリ−rA との二重ら
せんの融点はそれらが極めて低温であったため測定できなかった。dT、□。
dTizおよびsT、。の試験の場合は、平均で、−・3の5′結合修飾アクリ
ジンの融点は4℃、―・5の場合は7 ’Cの上昇が認められた。デルタHの値
は通常のオリゴのものと大きく変化しなかった。しかしながら、全23191体
(dTiz、dTz。)について、未修飾のPSオリゴ体と比較して、−・3お
よび欄・5の何れの場合も、本質的な融点の変化はみとめられなかった。5−d
Tポリ−rA二重らせんについては、顕著なΔHの減少が認められた(49kc
al/5io1から29kcal/+*ol)。
ヌクレアーゼ感受性
通常−・3の5′−アクリジン−dTizのデオキシリボヌクレアーゼ(DNa
se)感受性について表■に示すように検討した。使用したDNaseは大部分
がエンドヌクレアーゼSl、エキソ−およびエンドヌクレアーゼP1.ヘビ毒ホ
スホジェステラーゼ(SVP)およびウシ肺臓ホスホジェステラーゼ(BSP)
であり、遊離の5’−OH基を要するものであった。ヌクレアーゼ分解は、未修
飾およびアクリジン結合オリゴ体で実質的に等しい速度で進行したが(Sl、
Pi、 5VP) 、BSPを使用した場合ニハアクリジンオリゴ体では約20
倍遅かった(tl/2=855秒に対してacrT15の場合は1.95 x
10量秒)。
表■
オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレアーゼ分解(t 1/2秒)
オリゴマー DNaseSI 5NasePI 5VPa BSPadT+s
21 124 18 8555’−Acr−dTiz 23 85 23 19
500略号: 5vp=ヘビ毒ホスホジエステラーゼ;BSP・ウシ膵臓ホスホ
ロジェステラーゼJL60細胞による5′−アクリジン標識オリゴ体の蓄積遊離
のアクリジンと比較した場合の、5′−アクリジン−dTiz(PO,−一3)
の蓄積による細胞内螢光物質の増加を図4に示す。オリゴ体は数時間に渡り細胞
内に蓄積し、この過程は37°Cでは生じるが4℃では生じないことが明らかで
ある。遊離のアクリジンアミノブロバノ−ルは拡散により細胞に侵入し、37゛
cおよび4℃の何れの場合も同様に蓄積する。異る長さの通常のオリゴ体の蓄積
を調べたところ、図5aに示すとおり、5′−アクリジン−dT、は6丁1.お
よびdTz。より急速に取り込まれることが解った。5′−アクリジン−5dT
y は図5Aと5Bを比較することにより解るとおり、通常のdT、よりかなり
遅く取り込まれた。
図1に示されるとおり、本発明のホスホルアミダイト合成ハ簡便で、自動化され
た高収率のオリゴデオキシヌクレオチド5′末端螢光標識法を提供するものであ
る0分子を塩基性脱ブロツク条件下、例えば水性アンモニア60″CIO時間の
条件下に付した場合にアクリジンはオリゴデオキシヌクレオチドから切断除去さ
れる。
従って、この方法は基本的にチミジンのホモオリゴ体に適する。穏やかな条件下
での6位でのチオフェノールによる環塩素基の置換は新規なものであり、混合物
中のチミジンの存在により可能になると考えられる。
POおよびPSともに、5′−アクリジン結合分子は逆相クロマトグラフィーに
より迅速に精製される。2つの主要ピークが観察され、各々はアクリジンを含有
するが、′llおよび”P NMRによれば、所望の化合物はより長い保持時間
に一定に溶離することが解る。
ポリ−rA二重らせんの一連の融点測定をPOおよびPS両方のチミジンのアク
リジン結合ホモオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施した。260n−にお
ける吸光度の変化を使用したが、これはオリゴ体およびアクリジンの発色団の両
方の吸収よりなる複合吸収帯である。
n〉12では、この吸収帯は実質的にオリゴ体の性質のものであった。オリゴ体
が幾分異るアクリジン誘導体で3′および5′末端を標識された過去の観察結果
とは対照的に(Asseline等、 ops、ci ts ) 、今回みとめ
られた結果では融点の上昇は小さかった。例えば、n・12の場合は、As5e
line等は融点上昇的14°C,ep=5を報告しているが、表■によれば、
異る修飾アクリジンを使用したところ上昇は僅か7℃であった。さらに、通常の
5′アクリジン−dTyを使用した同様の実験においては、融点の上昇は認めら
れても極僅かなものであったのに対し、As5eline等は、3′〜アクリジ
ン−dTsの融点が23℃上昇したことを報告している。本発明の系においては
、融点の上昇はn・20でもなお観察された(7℃、m・5)。
さらに、同様の実験でaiiへたps化合物(S−dT+s、 5−dTzo)
の全てについて融点上昇が観察されなかった。これらの結果は、本発明で合成し
た種類の5′−結合アクリジンが寛際に極めて弱い介在物質であることを示して
いると考えられる。これはアクリジンに結合しているより大きい置換基の厳密な
性質を反映しているものと考えられる。またさらに、−一5は、この特定のアク
リジン部分による最大介在のためには不十分なメチレン基数である可能性もある
。介在が生じていないことが示されたものの、S−オリゴポリ−rA二重らせん
が5′結合アクリジンによる安定化を示さない理由は明らかではない。イオウは
酸素と比較した場合、より大きいファンデルワールス半径を有するため、既に弱
い介在部分がその結合部位に近付くのが妨害されたと考えられる。
通常およびS−オリゴ体の融点の差は、GC含有量が増大するほど減少し、図3
に示すとおり、約50%のGC含有量で最小値を示した。さらに、現在得られて
いる最も活性の高い抗HIV S−オリゴ体は、高いGC含有量を有する(Ma
tsukura等、po、cit)。
本発明の合成方法は4つの塩基全てに適用できる。
チオホスフェート側鎖反応は、別の置換アクリジンを用いることにより回避でき
る。
細胞系において通常のオリゴデオキシヌクレオチドを使用する際の主要な問題の
1つは、ヌクレアーゼ感受性である。しかしながら、S−オリゴデオキシヌクレ
オチドは極めて高いヌクレアーゼ耐性を示す、修飾アクリジンでオリゴデオキシ
ヌクレオチドの5′末端をキャンピングすることにより、5′エキソヌクレアー
ゼウシ膵臓ホスホジエステラーゼに対する感受性は大きく変化するが、Slおよ
びPIヌクレアーゼ、またはヘビ毒ホスホジェステラーゼに対する感受性は変化
しない。
チミジンのホモオリゴ体は流動血球計数分析により示されるとおり、HL60細
胞により取り込まれる。死亡細胞には細胞内螢光物質はみとめられず、これらの
化合物の蓄積がエネルギー依存性の過程であることを示している。この仮説を裏
付けるものとして、図4に示されるとおり、遊離のアクリジンの細胞内への侵入
は温度独立性(4゛c対37’C)であるのに対し、5′アクリジン−dT+z
は4°Cでは侵入しないことが解っている。
5′アクリジン−5−aT?の細胞取り込みは通常のアクリジン−dT、。より
も緩やかであり、恐らく約48時間、検知限界未満であることが図5により示さ
れている。この時点以降、オリゴデオキシヌクレオチドの分解および遊離アクリ
ジンの形成が顕著になる。S−オリゴ体はまた、螢光標識通常オリゴ体の取り込
みを抑制することも解っている。
オリゴデオキシヌクレオチドの螢光基を用いることにより螢光細胞選択を用いた
細胞取り込み速度過程の測定が可能になる。さらに、この螢光基を用いることに
より、細胞取り込み、代謝作用およびオリゴ体および関連ヌクレオチド誘導体、
例えばプラスミドおよび未被Jll l?NA分子の放出に対するその他の物質
の阻害作用を観察することができる。
特定の実施amに関する上記記載は本発明の一般的性質を充分説明するものであ
るから、現在の知識を提供することにより、本発明に一貫する概念から外れるこ
となく、特定の実施M様を種々の用途の為に容易に変形および/または応用する
ことができるが、そのような応用や変形は開示した実施態様と等しい意味および
領域に含まれるものである。本発明で用いた用語、および表現は、それに限定す
る意図のものではなく、本発明を説明するためのものである。
FIG、 1
time oず 1ncubation (hours)インキエーベーシッン
時間 (時間)
−1ハ A
国際調査報告
Claims (8)
- 1.下記段階: ホスホルアミダイトを6−置換アクリジンに結合させること、および、ホスホル アミダイトーアクリジンをオリゴデオキシヌクレオチドと反応させて螢光標識オ リゴデオキシヌクレオチドを形成すること、を包含するオリゴデオキシヌクレオ チドまたはその修飾類縁体の5′末端を螢光標識するための方法。
- 2.アクリジン上の6−置換基が塩素である請求項1記載の方法。
- 3.アクリジン上の6−置換基がチオフェノールである請求項1記載の方法。
- 4.自動ヌクレオチド合成反応器で工程を行なう請求項1記載の方法。
- 5.オリゴデオキシヌクレオチドがGC含有ホスホロチオエートオリゴデオキシ ヌクレオチドである請求項1記載の方法。
- 6.オリゴデオキシヌクレオチドがS−オリゴデオキシヌクレオチドである請求 項1記載の方法。
- 7.オリゴデオキシヌクレオチドが10〜30の単量体を含有する請求項1記載 の方法。
- 8.オリゴデオキシヌクレオチドがチミジンのホモオリゴマーである請求項1記 載の方法。
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