JPS62294622A - 癌性胸・腹水貯留抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 この発明は、癌性胸・腹水貯留抑制剤及び炎症性浮腫亢
進抑制剤並びに制癌作用増強剤に関するものである。

〔従来の技術〕

従来から植物由来のプロテアーゼインヒビターが種々報
告されている。これらインヒビターには特異性があり、
例えば、トウモロコシトリプシンインヒビターやカポチ
ャトリプシンインヒビターは、トリプシンと活性型ハー
ゲマン因子に抑制活性を示しくＴｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ
、　　２０，１４９．１９８０等）、ダイズトリプシン
インヒビターのうちクニッツ（Ｍｕｎｉｔｚ）型トリプ
シンインヒビターは、トリプシン。

血景カリクレイン、活性型第Ｘ因子等に抑制効果を有す
ることが知られている。また炎症性浮腫亢進の際には、
ブラジキニンの活性が発現し、疼痛や血管透過性が増大
するが、プラジキニンの活性発現にはハーゲマン因子や
カリクレインが関与するスキームが提案されている。

しかし、プロテアーゼインヒビターと炎症の関係は、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでの研究の段階にとどまっているのが現
状で、ｉｎ　ｖｉｖｏでの効果を実証した報告例は極め
て少ない。

一方、胃癌、腎癌、卵巣癌、肝癌等の患者には腹水が、
肺癌の患者の場合には胸水が、屡々貯留し、これら固形
＋＋１瘍の術後播種によって高い確率で腹腔或いは胸腔
内に腫瘍が転移し、その結果同様の貯留が認められる。

腹水の貯留が生じると、血漿タンパクの低下を来じ、患
者の体力低下その他の増悪を来すので、治療効果の低下
、多量輸血シタの必要性が生じ又、胸水の貯留が生じる
と呼吸不全をもたらし、ひいては患者の悪疫質の導入を
速める等、癌の治療上重大な結末をもたらす。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者は、炎症抑制とプロテアーゼインヒビターの関
連について種々検討した結果、大豆クニツク（Ｋｕｎｉ
ｔｚ）　型トリプシンインヒビター、とりわけその誘導
体が、ｉｎνｉｖｏにおいて炎症性ｉ７）！腫の抑制に
著しい効果があることを見出した。また、炎症における
血管透過性増大と固形腫瘍における血管透過性増大の機
構が類似していること（固形腫瘍及び炎症部位における
血管透過性亢進と血漿成分の漏出が類似）に着目して種
々検討する中で、該インヒビター及びその誘導体が癌性
胸・腹水貯留抑制にも効果を有すること、即ち、該イン
ヒビターが癌組織における血管透過性を強く阻害し、腹
水癌（Ｍｅｔｈ　Ａ、　Ｓａｒｃｏｍａ　１８０　）の
系に於いて上記阻害物質の連続投与によって、腹水の貯
留を顕著に抑えて、担癌マウスに延命効果をもたらすこ
と等を見いだし、癌治療上にも有益な薬剤になるとの知
見を得、この発明を完成したものである。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち、この発明は、一つは、大豆クニツク（Ｋｕｎｉｔ
ｚ）型トリプシンインヒビターまたはその誘導体を活性
成分とする癌性胸・腹水貯留抑制剤及び炎症性浮腫亢進
抑制剤であり、他の一つは、大豆クニツク（Ｋｕｎｉｔ
ｚ）型トリプシンインヒビターまたはその誘導体を活性
成分とする制癌作用増強剤である。

大豆トリプシンインヒビターは、分子量約２万ノクニツ
ツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型トリプシンインヒビターと分子量
約６千〜８千のボウマン−パーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉ
ｒｋ）型トリプシンインヒビターに二大別される。それ
らの基本的性質はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ肥、８５３　（１９７０）　、及び、「タン白
質研究の新しい視点（化学的研究を中心として）」第１
７３８頁（１９８２）　　（共面出版）等によって明ら
かにされており、その内代表的なりニフッ（Ｋｕｎｉｔ
ｚ）　　）リプシンインヒビターやボウマン−パーク（
Ｂｏｗ＋＋＋ａｎ−Ｂｉｒｋ）インヒビターの構造は既
に決定されており（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３
２，４１７　　（１９７３）　、Ｊ、Ｂｉｏｃｈ’ｅｍ
。

、７４，６９７　　（１９７３）　）　、従って、それ
らの化学的、生物学的方法（細胞培養、遺伝子組替等）
による合成も今日可能である。

この発明の剤は、大豆クニツク（Ｋｕｎｉｔｚ）型トリ
プシンインヒビター（以下ＫＴＩ　という）を活性成分
とするが、ＫＴＩは大豆由来のもの、及びこれを限定分
解して尚ＫＴＩ固有の活性を保持するもの、並びにこれ
らを上記化学的、生物学的方法により合成して１Ｍたち
のを包含する。

大豆由来のＫＴＩ、の調製方法は、すでにいくつかの具
体的方法が提案されていて、いずれの方法を採用しても
よいが、一般的には大豆、脱脂大豆。

大豆ホエーなどを原料にし、これらから、水性媒体また
は極性有機溶剤（例えばエタノール、アセトンなど）に
よる抽出、膜分離１等電点沈澱、塩析等による濃縮１分
画によって粗精製物を得、これをさらに、ゲル濾過、イ
オン交換、物理的若しくは化学的吸着手段などによりさ
らに精製された標品を得ることができ、その活性や純度
も、公知の方法例えば、クニッツ（Ｘｕｎｉｔｚ）のカ
ゼイン消化法〔本明細書での表記は、この方法で測定し
、Ｓｉｇｍａ社製トリプシン「タイプ−ＸＩ　ｊ　　（
７５００〜９０００　ＢＡＥＥ　Ｕｎｉｔ／ｍｇの活性
蛋白）　１　ｍｇを阻害する量をｌ　Ｕｎｉｔとした〕
やＳＯ３含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等によ
り測定することができる。

活性成分としての量は、精製度、投与方法、残存活性に
より多少相違するが、１．５〜２．５　Ｕｎｉｔ／ｍｇ
の活性を有するＫＴＩ蛋白質重量に換算して、概ね腹腔
内投与の場合１〜３０００＋ｎｇ／６０ｋｇ体重の範囲
、静脈注射の場合１〜３００ｍｇ　／６０ｋｇ体重の範
囲を目安として定めた含量が適当である。

誘導体は、蛋白質であるＫＴＩの抗原性を低下させ、ま
た分解物質（ＳＨ−プロテアーゼなど）に対する安定性
を増しく生体内半減期の改善）、或いは疎水性を賦与す
ることにより両親媒性を増すといった一または二辺上の
目的のために使用することができる。このような誘導体
は、ＫＴＩ　と、種々の修飾体、例えばスチレンマレイ
ン酸無水物共重合体（ＳＭＡ　）及びその部分エステル
化物、ポリエチレングライコール、ビニールエーテル共
重合体。

ピラン、***公開特許第３１５５４１号に例示のもの等
、との結合物、その他低分子の修飾体との結合物等が挙
げられ、これらとの結合方法は既知に属するが、上記一
または二辺上の目的が達成されるものであればどのよう
な方法によってもよい。例えば修飾体がＳＭＡまたはそ
の部分エステル化物の場合は、ＫＴＩのＮ−末端アミノ
基乃至リジン残基のε−アミノ基に対して中性乃至アル
カリ性溶液中で直接反応させ、ペプチド結合を形成する
方法が本発明者である前出らにより報告されている（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　２８．４５５−４６１．　（１９８５））
。

本物質及びその誘導体は、局所的、経静脈的、経動脈的
、経粘膜的、経皮的、経口的な投与及び腹腔内投与する
ことが可能である。

即ち、例えば静脈注射用の水溶性薬剤として、ＫＴＩそ
のまま、又は生理食塩水、５％グルコース溶液、若しく
はその他の水溶性注射剤に溶解しての使用をすることが
でき、動脈注射用の油剤としてリビオドール化した製剤
としても使用することができ、その他、ＫＴＩを溶解し
た水溶液を乳化剤を用いオリーブ油、中鎖脂肪酸エステ
ル、リノール酸エステル、大豆油、桐油等の油脂と乳化
しての使用、リポゾームの形態での使用も可能である。

ＫＴＩまたはその誘導体は、自体制癌作用を有する剤と
併用することが出来る。

自体制癌作用を有する剤としては、ネオカルチノスタチ
ン（ＮＣ３’）　、スマンクス（ＳＭＡＮＣ３：スチレ
ンマレイン酸（ＳＭＡ）共重合体と、ネオカルチノスタ
チン（ＮＣＳ　’）のアミノ基を介して結合させたもの
〕、マイトマイシン（商品名）等の抗癌性抗生物質、５
−Ｆｕ（商品名）等の代謝拮抗剤、ピシバニール（商品
名）等の免疫賦活剤、又はその他の抗癌性薬剤を使用す
ることができ、にＴＩ　との併用の態様としては、−製
剤に加工して、若しくは単味体を各々個別に投与する方
法があげられる。

〔作用〕

ＫＴＩは炎症性浮腫亢進抑制効果、及び癌性腹水。

胸水貯留抑制効果を有し、結果として、延命効果を示す
。ＫＴＩは、さらに、自体制癌作用を有する剤と併用す
ることにより、核剤の有する抗癌作用を増強する。これ
らの効果の生じる理由は完全には明らかでないが、炎症
性浮腫の場合に関与すると考えられるカリクレイン−プ
ラジキニン系を１ｎｖｉｖｏにおいてＫＴＩが効果的に
阻止し、ブラジキニンの発現による疼痛発生と血管透過
性の光道を抑制すること、及び、癌組織の血管透過性増
大に同様の系が存在して血管透過性を抑制、即ち、該組
織への血漿蛋白質などの漏出が抑制され胸水。

腹水の貯留を抑制すること、並びに、該組織への血漿成
分−栄養供給が遮断され、抗癌剤の直接の作用力を高め
るのではないかと推定される。又プロテアーゼによる癌
細胞増殖促進作用を一部には抑制している可能性がある
。さらに、ＫＴＩの分子量は約２万（誘導体はこれ以上
）であるため、血管透過性の光道していない正常組織へ
の漏出は殆どなく、ある程度血管透過性の光道した組織
への選択的な透過・作用に寄与し、浮腫や癌組織の成長
を抑制することも推定される。また、炎症局所の浸出液
（漏出液）はリンパから回収されるが、腫瘍組織におい
てはリンパ系がないので浸出した高分子は回収されずに
長期間そこに留まると考えられ、この性質も患部への選
択的作用に有用であると考えられる。

尚、癌組織への栄養供給の遮断は、物理的塞栓療法によ
る栄養供給抑制の考え方と類似するが、物理的塞栓は屡
々正常な組織までも壊す弊害があるのに比べ、本発明剤
ではこのような副作用は生じない。

〔実施例〕

以下この発明を実施例で説明するが、例示は説明用のも
のであって発明精神の限定を意図したものではない。

実施例１　　（ＫＴＩの鋼製例） 低変性脱脂大豆から分離大豆蛋白を製造する過程で得ら
れる大豆ホエーを濃縮し、この濃縮物（粗蛋白質含量５
．５％）１容に対し０．５容のアセトンを加えて約１時
間攪拌し、遠心分離により得られた上清に対し、さらに
１．５容のアセトンを加えて約１時間攪拌し、遠心分離
して得られた沈澱画分を、水に対して透析した。この透
析液に１）５０量の０．５ト燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）を加え、ｐＨを７．０に調節し、ＤＥＡＥ−
セルロースイオン交換カラムに通して、該樹脂に吸着さ
せ、次いで０〜０．４Ｍの直線食塩濃度勾配を有する溶
出液を、フラクションコレクターにより分画し、ＢＢＩ
型トジトリプシンインヒビターＫＴＩに富む両分をさら
に各々塩析濃縮し、（さらにＢＢＩ型トジトリプシンイ
ンヒビターいてはＣＭセルロースイオン交換樹脂でさら
に精製し）、各濃縮精製物を等電点沈澱後、凍結乾燥し
てＫＴＩ標品及びＢＢＩ型トジトリプシンインヒビター
標品た。各標品の純度は、ＳＯＳ含有ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で、蛋白質中９５％以上であった。又、
比活性は前者が１．９７１ｎｉｔ／ｍｇ蛋白、後者が３
．３７　Ｕｎｉｔ／ｍｇ蛋白であった。

実施例２（腹水貯留抑制及び延命効果）生後８週目の♀
の　ｄｄＹ−マウス（１群７匹）の腹腔内にＳａｒｃｏ
ｍａ　１８０　ｅ濁液を５０万ｃｅｌｌ　／匹になるよ
う移植し、その日から生理食塩水１　ｃｃに対して上記
調製例で得たＫＴＩ若しくはＢＢＩ型トジトリプシンイ
ンヒビターｍｇ溶解した水溶性薬剤又は溶解しない生理
食塩水を１日、１匹あたりｌｃｃづつ４日又は１４日連
続して腹腔内に投与し、その間自由摂食・自由爪木させ
た。Ｓａｒｃｏｍａ　１８０を全く移植しない無処置例
も並行して実施した。

この間の体重測定を行った結果を第１図（１４日間投与
）及び第２図（４日間投与）に示した。両図に示された
結果及び肉眼的観察により、ＫＴＩによる体重増加の抑
制効果（腹水貯留の抑制効果）、が明らかに認められ、
無処置群との差異が殆ど無かったのに対して、ＢＢＩ型
トジトリプシンインヒビターる該抑制効果は殆ど認めら
れなかった。

さらに上記投与例での平均生存日数等は次表の通りで、
延命効果が認められた。

表−１ 実施例３　（部分ブチル化ＳＭＡと結合した誘導体の調
製例） 実施例１の方法で調製したにＴＩ　３００　ｍｇを、３
０ｃｃの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム液に溶解し、部分
ブチル化ＳＭＡ　　（平均分子量約２０００＞を１５０
ｍｇ加えて２５℃で９０分間攪拌した後、グリシン溶液
を加えて反応を停止した。このものの残存活性は３６．
３％であり、ＴＮＢＳ法（蛋白質、核酸、酵素、　１８
　（１３）　、１）５３−１）５９．　　（１９７３）
　）にて測定した修飾されたアミノ基の個数は１．９４
個／分子であった。さらに炭酸水素アンモニウム溶液に
透析し、凍結乾燥してＫＴＩのＳＭＡで修飾された誘導
体（ＫＴＩ−ＳＭＡ　）を得た。

実施例４（炎症性浮腫昂進抑制効果） 実施例３で得た修飾したＫＴＴ−ＳＭＡを生理食塩水に
溶解したものを被験薬とし、該被験薬又は生理食塩水と
混合して調製した１％カラゲニン溶液（ＫＴＩ−ＳＭＡ
の含量は各々５ｍｇ／ｃｃ、又は１５ｍｇ／ｃｃ）をＳ
Ｄ系♂ラット（平均体重１５０ｇ±５ｇ、１群５匹）に
対して、０．１ｃｃ／部位投与して炎症を惹起し、経時
的に定容積を測定することにより、カラゲニン誘発足浮
腫に対する抑制効果を調べた結果は第３図の通りであっ
た。

同図に示されるように、炎症惹起後３時間の時点におい
て、ＫＴＩ−ＳＭＡ　１５ｍｇ／ｃｃ投与群に顕著な炎
症性足浮腫抑制効果が認められた。

尚、ＫＴＩ−ＳＭＡにかえて実施例１で得た無（Ｂ飾の
ＫＴＩ　２０ｍｇ／ＣＣ使用したものの抑制効果はＫＴ
Ｉ−ＳＭＡ５ｍｇ／ｃｃ投与群と同程度の効果にとどま
った。

実施例５（制癌剤増強作用の効果） 生後８週目の♀の　ｄｄＹ−マウス（１群１０匹）の腹
腔内にＳａｒｃｏｍａ　１８０　：’ｆ！、濁液を５０
万ｃｅｌｌ　／匹になるよう移植し、その日から生理食
塩水に対して前記調製例で得たＫＴＩ　、ネオカルチノ
スタチン（ＮＣ３）又は両者の混合物を１日、１回７日
間連続投与し、生理食塩水のみを投与した群をコントロ
ールとした。実験期間中は自由摂食・自由爪木させた。

投与量及び、生存率（％）の推移を次表に示した。

表−２ 上表の結果が示すように、にＴｌは自ら延命効果を有す
るのみならず、制癌剤（ＮＣＳ　”）の効果を高める相
乗作用を有することが認められた。

〔効果〕

以上説明したように、ＫＴＩ及びその誘導体を有効成分
とする剤は、炎症性浮腫の抑制及び癌性胸水腹水の貯留
抑制効果並びに制癌作用増強効果を有する。炎症性浮腫
の抑制は浮腫による疼痛の発生または元通を未然に抑制
し、胸水腹水の貯留抑制により、該貯留による弊害例え
ば、患者の体力低下、治療効果の低下、多量の輸血類、
呼吸不全、悪疫質の導入等を未然に防止乃至抑制し、治
療効果を高める等、延命させる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１及び２図は、実施例２における投与薬剤と体重増加
（＃腹水貯留量）の関係を示すグラフである。第１図中
（１）（△＞　、、、、生理食塩水投与群、（２）（◇
”）　、、、、ＢＢＩ　　）リプシンインヒビター投与
群、（３）（ロ）　、、、、ＫＴＩ投与群、（４）（○
＞　、、、、無処置群。 （８）、、、、癌細胞移植日、（↓）、、、、薬剤投与
口。 第２図中＋１）　（０）　、、−０生理食塩水投与群、
（２）（△）　１００．ＢＢＩ　　）リプシンインヒビ
ター投与群、（３）（ロ）　９．、、ＫＴＩ投与群、（
折破線＞　、、、、無処置群。 （８）、、、、癌細胞移植日、（↓）　、、、、薬剤投
与口。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）大豆クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型トリプシンイン
   ヒビターまたはその誘導体を活性成分とすることを特徴
   とする癌性胸・腹水貯留抑制剤及び炎症性浮腫亢進抑制
   剤
2. （２）大豆クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型トリプシンイン
   ヒビターまたはその誘導体を活性成分とすることを特徴
   とする制癌作用増強剤。