JPS62285787A - ヒ−トシヨツクたんぱく質遺伝子ｈｓｐ８３を含む発現ベクタ−及びこれを用いる誘導的発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 日の〜野　び関゛技術の脱Ｂ この発明はドロソフィラ・メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ　　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のヒー
トショックたんばく質遺伝子（」８３）を用いて生理活
性物質を生産する技術に係る。

本発明の関連する技術としては、ドロソフィラ・メラノ
ガスター由来のヒートショックたんばくｒ退ｆム子であ
って分子量が約７０キロダルトンのヒートショックたん
ばく賞遺伝子（ｈｓｐ７０）　ヒートショック発現制御
ＤＮＡ塩基配列を使用して動物細胞で異種遺伝子の制御
的発現がある。

２１９１昨久艷旦叉 本発明の目的は、外来の生理活性物質構造遺伝子を真核
生物細胞、特に動物細胞で誘導的に発現させ、目的とす
る生理活性物質を生産させるについて、従来の技術に比
較して強い発現量で確実に反復実施できる技術を提供す
ることにある。

本発明は前記の目的を達成するだめの手段として、発現
制御ＤＮＡ塩基配列としてドロソフィラ・メラノガスタ
ーのヒートショックたんばく賞遺伝子」ニー３ヒートシ
ヨンク発現制（ｉｌＤＮＡ塩基配列又はそのＦｉ配列を
用いることに特徴があり、この配列により転写制御を受
けるように外来の構造遺伝子を結合し、転写に必要な他
の因子も有効に結合してベクターなどを構築し、真核生
物細胞で得た形質転換細胞で望みの時にヒートショック
処理して遺伝子の殿能を誘導的に発現させて目的を達す
ることが出来る。

明の態様の　に詳細な脱Ｂ 本発明の方法によれば外来の生理活性物質構造遺伝子を
真核生物細胞、特に動物細胞で誘導的に、望みの時に強
い発現量で確実に発現させ、その生理活性物質を得るこ
とができる。

本発明の方法によれば外来の生理活性物質の遺転子発現
を通常は停止させておき、必要な時にそれを進行させる
ことができるので産業上の有用性が極めて大きい。

ｔ　　　　　　　また、本発明によると宿主として用い
る動物細胞の生長に有害な生理活性物質あるいは有害な
量の生理活性物質を産生ずる能力を存する形質転換細胞
を得ることもできるので自然には行われていない生理活
性物質の生産を行うことも出来る。

本発明の方法とは、ドロソフィラ・メラノガスターの約
８３キロダルトンのヒートショックたんばく質（」８３
　）遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列あ
るいはその誘導配列を用いて外来の生理活性物質構造遺
伝子の発現ベクターを作成し、その発現ベクターを真核
生物細胞に導入し、形質転換細胞を得、その形質転換細
胞でヒートショックにより誘導的にその生理活性物質を
産生させ、その産物を取得する方法である。

本発明の云う「ドロソフィラ・メラノガスターの約８３
キロダルトンのヒートショックたんばく賃（」８３　）
遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列」とは
次のことを意味する。

ドロソフィラ・メラノガスターの約８３キロダルトンの
ヒートショックたんばく質（」８３）　ａ転子のヒート
ショック発現制御ＤＮＡ塩基配列とは〕８３遺伝子中の
ヒートショ・ツクによる発現を可能とするのに必要なり
ＮＡ塩基配列のことであり、ホルムグレン等により示さ
れたＴＡＴＡボックス配列及びその上流の制御要素を含
み、あるいはその他の未知の制御配列を含むものである
。

約８３キロダルトンのドロソフィラ・メラノガスターの
ヒートショックたんばく譬については以前」８０．８１
．８２あるいは８３と報告されてきたが、全ＤＮＡ塩基
配列の決定することにより正確な分子量が算定され、以
前の箪８３は最近は−■上８２であったとされている場
合があるが、本発明に言う皿８３はその」８２と同一の
ものである。

本発明に言う誘導配列とは、元の配列に対し、本発明に
おいて目的としているヒートショック発現制御の能力を
損なうことなく、あるいは能力の向上を伴って塩基置換
、削除、挿入、転位されたＤＮＡ塩基配列のことを云う
。

ヒートショックたんばく賞（以下皿と略記することがあ
る）は真核生物の進化において富農に保存的（ｃｏｎｓ
ｅｒｖａｔｉｖｅ）であったことが知られており、ドロ
ソフィラ」鉦８３が分類される、分子量８０キロダルト
ンから９０キロダルトンの「第一のクラス」の並はマウ
ス細胞、ヒト細胞等いくつかの真核生物で見つかってい
る。

従ってドロソフイラ以外の真核生物のドロソフィラ」８
３遺伝子に相当する「第１のクラス」の皿遺転子にはド
ロソフイラ」且８３遺伝子のヒートショック発現制御Ｄ
ＮＡ塩基配列と同一か極めて類似の配列で本発明に利用
できるものが当然に存在していると考えられるがこれも
誘導配列に含める。

ヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を使用して外来
遺伝子を誘導的に発現させることは、すでにドロソフィ
ラ」７０遺伝子で試みられていたことではある。

然し、知られているそれらの発現実験の結果は発現量が
低いものでしかないし、我々の追試によっても例えば皿
７０遺伝子のヒートショック発現制？ＩＩＩＤＮ＾塩基
配列を使用し、ヒト正常細胞由来組織プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−ＰＡ）の発現を試みたが発現は甚だ微
弱であり、活性で測定した場合産生されたｔ−ＰＡの検
出はほとんど不可能であった。

またドロソフィラ」７０のヒートショック発現量？１１
　ＤＮＡ塩基配列を用いてインフルエンザウィルスへマ
グルチニンたんばく質遺転子の発現実験（特開昭５９−
１９２０９１）も行われているがその場合にはヒートシ
ョックで誘導しなくても目的のたんばく譬の産生がみら
れておりヒートショックによる誘導の発現制御の効果か
否かが明確ではない。

このようなヒートショックによる発現制御ＤＮＡ塩基配
列を利用する固有の効果が明瞭でない従来技術に就いて
、我々は前記の目的を実現する為に研究を重ねた結果、
特許請求の範囲に特定した構成によってはじめて、明確
に誘導を実現し得たものである。

即ち本発明ではドロソフィラ」７０遺伝子とは異なる」
８３遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を
用い、形質転換された動物細胞で外来遺伝子の制御のき
いた発現と十分な発現量を得ているのである。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

［ドロソフィラ・メラノガスター〇」８３遺伝子のヒー
トショック発現剤′４１１　Ｉ）ＮＡ塩基配列」を得る
にはクローン化された」８３遺伝子より酵素を用いる方
法で、または他の物理的方法等でヒートショック発現制
御ＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片として取り出す方法
あるいはＤＮＡ合成法も用いることができる。

本発明者等は簡便な方法としてクローン化された」８３
遺伝子より制限酵素で切断する方法を用い、目的のＤＮ
Ａ塩基配列を含む約１９０塩基対ＤＮＡ断片を取り出し
た。

「ドロソフィラ・メラノガスターの」狂８３遺伝子のヒ
ートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列の誘導配列」を得
る為には既知のヒートショック発現側？１１１ＤＮＡ塩
基配列に対して塩基置換、削除、挿入、転位等を行うこ
とになるが、その為には合成りＮＡを用いる方法が過当
であると考えられる。

またドロソフィラ皿８３遺伝子に相当する真核生物の「
第１のタイプ」の皿遺転子から酵素法あるいは物理的方
法で「誘導配列」を取り出しても良い。

本発明で云う「発現ベクター」とは、ある遺伝子を発現
するべく構築されたベクターであり、その本体はＤＮＡ
である。一般にこの種のＤＮＡは環状二重鎖の形態すな
わちプラスミドと普通言われているものである。

目的の外来遺伝子の０４へ塩基配列に対しいくつかのＤ
ＮＡ塩基配列を連結することによりその遺伝子を有効に
発現させる工夫は既に幾つもなされている。　本発明で
はドロソフィラ皿８３遺伝子のヒートショック発現制御
ＤＮＡ塩基配列あるいはその誘導配列を用いて誘導的発
現を可能にする工夫がなされている。

すなわち、本発明では「発現ベクター」を構築する際、
ヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断
片を少なくとも１つを、目的の生理活性物質の構造遺伝
子がそのヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列の発現
制御下となる様に結合する。

そして外来の生理活性物質の構造遺伝子の下流にはその
構造遺伝子自体のものでも良いが、少なくとも１つの任
意の他の適当な転写終了及びポリＡ付加の指令を内在す
るＤＮＡ塩基配列が存在する様にし、１つの転写可能な
ユニットをなすようにする。

この転写可能なユニットを作成するにあたって目的の構
造遺伝子のコード領域の他に５゛及び３゛フランキング
領域のある部分を含んでいてもかまわないし、あるいは
構造遺伝子がイントロンを含んでいてもかまわないし、
またヒートシシック発現制′４ＩＤＮＡ塩基配列のある
いは転写終了及びポリＡ付加の指令を内在するＤＮＡ塩
基配列の前後に転写の邪魔にならない長さのＤＮＡある
いは邪魔にならない性質のＤＮＡ塩基配列をリンカ−Ｄ
ＮＡ含めて挿入してもかまわない。

「発現ベクター」は宿主細胞中でエピゾームとして、又
は染色体ＤＮＡに組み込まれた部分として複製可能でな
ければならない。エピゾームとして複製可能にする為に
は、宿主細胞中で有効に働く複製起点を「発現ベクター
」中に含ませる。

真核生物細胞を宿主細胞として用いる場合、その真核生
物細胞内で働く染色体外複製起点を「発現ベクター」中
に含ませることによりその「発現ベクター」をエピゾー
ムとして核外で増殖させることが可能となり高いコピー
数が実現できる。

ここに用いられる染色体外複製起点には、例えば５１ｍ
１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０（ＳＶ４０）やウシ乳頭腫ウ
ィルスの複製起点等がある。

一方染色体内に組み込む方法は、形質転換細胞者たりの
導入された遺伝子のコピー数は、通常高くはないが、宿
主の染色体複製に従って組み込まれた遺伝子複製される
ので安定で、細胞の増殖につれ細胞光たりの導入された
遺伝子の変動が起こる可能性はエピゾームのような染色
体外複製系に比べて低い。

以下「宿主細胞」の説明のところでも述べる様に「発現
ベクター」に遺伝子選択マーカーを挿入することが「発
現ベクター」を導入して得られる形質転換体を選択する
目的でしばしばなされる。

真核生物細胞を宿主として用いる場合でも、「発現ベク
ター」に原核生物で有効な複製起点、遺伝的選択マーカ
ーを含ませて原核生物細胞中でプラスミドＤＮＡの形態
で増殖させる工夫がしばしばなされる。

例えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点ま
たはアンピシリン耐性遺伝子を発現ベクターに含ませる
ことにより、そのベクターを大腸菌に導入して増殖させ
、プラスミドｐＮＡとして大工に回収することができる
。

「宿主細胞」とは、上記の発現ベクターをその細胞に導
入して形質転換細胞を得る目的で用いる細胞である。宿
主細胞は発現ベクターに合わせて有効に機能する様に選
ばれる。すなわち宿主に用いる細胞には発現ベクターに
含まれる目的の遺伝子の転写ユニットが働き目的の物質
の遺伝子が転写され、続いてその物質の生産がなされる
性質が要求される。

発現ベクターであるプラスミドＤＮＡをその宿主細胞で
ある原核生物細胞に導入する方法には例えばカルシウム
処理法が、またセキライ動物細胞に導入する方法として
は、例えばリン酸カルシウム法等がありこれらのいずれ
も本発明に用いられる。

また宿主細胞が哺乳動物細胞である場合には、選択マー
カー遺伝子として例えばネオマイシン耐性（Ｎｅｏ″）
遺伝子、細菌キサンチン・グアニン・ホスホリボシル・
トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子を「発現ベク
ター」に導入して用いると野性型の細胞を使用しても形
質転換体の選択が可能である。

また例えば選択マーカー遺伝子としてチミジンキナーゼ
（ＴＫ）遺伝子あるいはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）遺伝子を使用する場合には、それぞれの遺伝子を含
む発現ベクターが導入されて得られた形質転換体の選択
の為に、それぞれの遺伝子が欠損している捕乳動物細胞
の変異株を宿主細胞として用いる必要がある。

Ｄ）ＩＦＩ？阻害剤であるメトトレキセー）　（ＭＴＸ
）を含む培地で哺乳動物細胞を培養すると、ＤＨＦＲ遺
伝子は染色体内で増殖する性質があり、そのＤＨＰＲ遺
伝子と大腸菌ＸＧＰＲＴ遺伝子の両方を含む発現ベクタ
ーで形質転換したチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞で
有効濃度のＭＴＸ存在下では両方の遺伝子が連動して増
幅する。

染色体内で目的の遺伝子のコピー数を増大させる方法と
しては、ＤＨＦＩ？遺伝子を用いる方法は確実かつ有用
である。

本発明に云う「生理活性物質」には例えば酵素、ホルモ
ン、リンフ才力イン類、ウィルス抗原または免疫原並び
に他の種々なポリペプチドあるいはいくつかのポリペプ
チド集合体がある。

このような物質のうちある種のポリペプチド、特に真核
生物由来のある種のポリペプチドは、細胞内の諸酵素に
より切断、プロセシング、糖鎖の付加やその他の修飾に
より変形を受け、あるいはＳ−Ｓ結合等により複雑な高
次構造が形成されるが、この様な変形は原核生物細胞中
で起こりに（いと考えられる。

例えばその生理活性物質がヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）である場合、それはフィブリン溶
解の活性を有する生理活性物質であるが、その遺伝子が
転写され翻訳された後、得られるポリペプチドはそのＮ
端のリーダー配列が切断され、糖鎖の修飾を受け、Ｓ−
Ｓ結合により高次構造が形成され、そして細胞外に分泌
される。

ヒトｔ−ＰＡは上述のように単純なポリペプチドでなく
、また細胞外に分泌される性質があるので生産されたｔ
−ＰＡの検出が容易であること等の特徴がある為、本発
明のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を用いた誘
導的発現の実験に使用した。

しかし本発明はもちろんこれに制限されるわけではない
。

ヒｌ−ｔ−ＰＡ遺伝子は、実際的にはヒト染色体ＤＮＡ
よりクローン化されたゲノムＤＮＡクローンあるいはメ
ラノーマ培養細胞ｍＲＮＡよりクローン化されたｃＤＮ
Ａであり、またヒト正常細胞（１列えばごＴＣ０１７株
）よりクローン化されたｃＤＮＡクローンあるいはゲノ
ムＤＮＡクローンであり、フ゛ラスミド中にクローン化
された形態であって、いずれも本発明に用いうる。

ここでは、外来の生理活性構造遺伝子の例としてヒト正
常細胞由来ｔ−ＰＡ遺伝子を選んで発明の効果を示す。

ドロソフィラ皿８３遺伝子のヒートショック発現制御Ｄ
ＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片は皿８３遺伝子のクロー
ンより分離した。

そのＤＮＡ断片を、外来遺伝子の例として用いるヒト正
常細胞由来ｔ−ＰＡ構造遺伝子が組み込まれているプラ
スミドＤＮＡ中の正しい位置に正しい方向で挿入した。

この連結にはヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列と
ｔ−ＰＡ構造遺伝子が前者が後者を制御するのに不都合
がないように注意を払った。

このプラスミドには、大腸菌で増殖するのに必要な複製
開始部位、大腸菌で働く選択マーカー及びｔ−ＰＡ構造
遺伝子を有効に働かせる為に必要な池のＤＮＡ断片を導
入した。

宿主として用いる細胞には、この分野の実験によく使用
されている哺乳動物培養細胞を使用した。

発現ベクターには例えばｔｋ遺伝子の様な選択マーカー
遺伝子を導入し、形質転換された細胞の選択を容易にし
た。

得られた形質転換細胞については、ヒートショック有り
、無しの両方の条件下についてｔ−ＰＡ生産を調べた。

この点は培養液中に蓄積されたｔ−ＰＡの活性を調べる
ことにより目的の達成を確かめることができる。

またドロソフィラ皿７０遺伝子のヒートショック発現制
御ＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片を、ｈｓｐ７０遺伝
子のクローン（サブクローン８８）より制限屏素を用い
て分離し、上述の皿８３遺伝子を用いる場合と同一な方
法と手順でＬ−ＰＡ産生能をその活性で調べた。

その結果ヒートショックによる誘導がない場合は、」７
０遺伝子も四８３遺伝子もそのヒートショック発現制御
ＤＮＡ塩基配列を用いたｔ−ＰＡ発現は見られなかった
。

しかし、ヒートショックによる誘導を行った場合、」且
７０遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を
用いた場合はんのわずか（ｔｒａｃｅ）の活性が認めら
れただけであったが、」８３遺伝子のヒートショック発
現制御ＤＮＡ塩基配列を用いた場合、十分の発現量すな
わちＳＶ４０初朋プ初子プロモーターた通常の発現と同
程度の発現量を得た。

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、
これは本発明のほんの一例示にすぎないものである。

実施例 沢且工食Ｕ」並ｂｐ　ＤＮＡ瓶片。

ドロソフィラ・メラノガスター」８３遺伝子の５゛−フ
ランク領域を含むＢａｍＨｒ’　　Ｓａｔ　Ｉサブクロ
ーンａＤＭ４．４６を制限酵素ＥｃｏＲＩ　（Ｂｅむｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５−ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　ＩＮＣ，以下ＢＲＬと略す）及びＸｈｏ　Ｔ　（
ＢＲＬ）で消化し、アガロース電気永動で分画し電気溶
出で７６０塩基対（ｂｐ）　Ｅ臼Ｒｒ−ＸｈムＩ断片を
得た。

ＤＮＡ断片の長さは塩基対（ｂｐ）の数で示すが、この
明細書で示す値は全てこの技術分野の常識に従っておよ
その値であるとして読まれるべきものである。

得られた断片の３°−粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ■
クレノフ断片（ＢＲＬ）で常法に従ってうめて平滑末端
とした。

両端が平滑末端となった７６０ｂｐ　ＤＮＡ断片を制限
酵素Ｒｓａ　ｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ、以下ＮＥＢと略す）で消化し、アガロースゲル
電気泳動で分画して１９０ｂｐ立Ｒ１／Ｆｉｌｌ−Ｒ匣
■断片を電気溶出で得た。

次に市販の」旦ｄ［リンカ−ＤＮＡ　（ｄ５’−ＧＣＡ
ＡＧＣＴＴＧＣ−３’　、　ＢＲＬ）の５゛端のリン酸
化をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）を用い常
法に従って行った。

このリンカ−ＤＮＡの塩基配列は対称であるので適当な
条件下で、例えば下記のりガーゼ反応の条件下で、アニ
ールすると２本鎖ＤＮＡになる。

５′端がリン酸化されたＨｉｎｄＩ［ｌリンカ−０，４
５４と１９０ｂｐ　Ｅ図Ｒ１／Ｆｉｌｌ−Ｒ旦■断片ｏ
、６３Ｐｇを供給者が示す反応緩衝液３７μに溶解し、
Ｔ、、　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）　６ユニツトを加え
１２°Ｃで５時間インキュベートした。

反応生成物を制限酵素」圏ｄ　Ｉ［Ｉ　（ＢＲＬ）で消
化しアガロース電気泳動で分画し両端が」圏ｄｌｌＩの
粘着端である２００ｂｐ　ＤＮＡ断片を電気溶出で得た
（図１）。その２００ｂｐ　Ｈｉｎ　ｄ　［Ｕｒ片には
ヒートショック発現制？ｌｏｏ塩基配列が含まれている
。

ｉ　Ｂ）ヒト正常細胞由来ｔ−ＰＡ遺伝子及び同遺伝子
のプラスミドｐＳＶＭ−ｄｈｆｒ　（Ｌｅｅ、Ｆ、旦　
ａｌ、、１９８１゜Ｎａｔｕｅｒ　２９４：２２Ｂに従
って得られたもの）を制限酵素ｌＩ［（ＢＲＬ）で消化
し直鎖状とした。

その直鎖状プラスミドＤＮＡの粘着末端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■クレノフ断片を用いてうめて平滑末端とした。

そのＤＮＡ断片をＨｉｎｄ［Ｉで消化し、細菌アルカリ
性ホスファターゼ（ＲＡＰ：ＢＲＬ）を用いて５゛一端
のリン酸を常法に従って除き、アガロースゲルで分画し
長さが約４．４キロ塩基対（ｋｂｐ）”であるＤＮＡ断
片を電気溶出により得た。

そのＤＮＡ断片には、ＳＶ４０初期プロモーター、原核
生物で働く複製開始点、アンピシリン耐性（ＡｍρＩＩ
）遺伝子またＳＶ４０初朋トランスクリプト読取終止及
びポリＡシグナル、ＳＶ４０由来のエンハンサ−及び復
製開始起点が含まれていた（図２−ａ）。

いくつかのヒト正常細胞（染色体２ｎ＝４６）のうちｔ
−ＰＡ生産能の高い一株（１’ｌＴｃ　０１７）を選び
大量に培養し、その培養細胞から全ｍＲＮＡを抽出しオ
リゴｄｔセルロースを使用してポリ　（Ａ）”　ｍＲＮ
Ａを分離回収した。

そのｍＲＮＡを用いてＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの
方法でｃＯＮＡ遺伝子バンクを作成した。

ヒ１−ｔ−ＰＡのアミノ酸配列を反映した合成オリゴヌ
クレオチドプローブを用いてｔ−ＰＡをコードするｃＤ
ＮＡをクローン化した。ｔ−ＰＡ遺伝子の全塩基配列は
マクサム−ギルバート法で確かめた。

プラスミドＰＴ４（ヒト正常細胞ＭＴＣ−０１７株由来
でｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡを含むもの）から以下に述べる方
法で、ｔ−ＰＡのコード領域がそれら断片を連結するこ
とにより得られる２本のＤＮＡ断片を調製した。

プラスミドＩＩＩＴ−！を制限醇素工■及びＢａ１ｌ（
ＮＥＯ）で切断しアガロース電気泳動で分画し１８６０
ｂｐ　ＤＮＡ断片を電気溶出で得た（図２−ｃ）。その
ＤＮＡはｔ−ＰＡのほとんどのアミノ酸配列の暗号と３
′フランク領域を含んでいた。

次に９Ｔ−Ｌを制限酵素」憇旧（Ｂｌｌい及び」■■（
ＮＥＢ）で切断しアガロース電気永動で分画し９７０ｂ
ｐ　ＤＮＡ断片を電気溶出で得た。そのＤＮＡ断片には
Ｌ−ＰＡのＮ−末端ｆ寸近のアミノ酸配列の暗号、また
５゛−フランク領域が含まれていた。

そのＤＮＡ断片を制限酵素」■Ｉ　（ＮＥＢ）で消化し
、アガロース電気泳動で分画し５１５ｂｐ　ＤＮＡ断片
を電気溶出で得た。

得られたＤＮＡ断片にはｔ−ＰＡのＮ末端付近のアミノ
酸配列の暗号と７ｂρの５゛−フランク領域の情報が含
まれていた ｔ−ＰＡ遺伝子の５°−フランク領域を上述の４．４ｋ
ｂｐＤＮＡ断片のＨｉｎｄｌＩ［末端に連結する為に必
要である２本に合成リンカ−ＤＮＡを作成した。

このリンカ−ＤＮＡのうち１つは塩基配列が５’　−Ａ
ＧＣＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＡ−３’であるリンカ−ＨＨ
Ｉで、他の１つは塩基配列が５’　−ＴＴＧＣＴＴＣＡ
ＣＡＧＣＧＴＡ−３’　であるリンカ−ＨＨ２であった
。

これらリンカ−ＤＮＡを例えば下記のりガーゼ反応の条
件下でアニールさせると２本鎖ＤＮＡが得られるが、そ
のＤＮＡはＳＶ４０初期プロモーターを含む４．４ｋｂ
ｐ　ＤＮＡ断片のＨｉｎ　ｄＩ［Ｉ粘着末端につながる
Ｈｉｎｄ［末端、またＬ−ＰＡの５゛−フランク領域を
含む・５１５ｂｐ　ＤＮＡ断片の」ｌｌ粘着末端につな
がる末端を有していた。

またこれらのリンカ−ＤＮＡをアニールさせて得られる
２本鎖ＤＮＡはＨｉｎｄｌＩＩ粘着末端を除いて、その
塩基配列がプラスミドｐＴ−１のｔ−ＰＡの５゛−フラ
ンク領域の配列と同一にした。

これらリンカ−ＤＮＡは固相法−ホスホトリエステル法
で合成し、常法により精製した。

リンカ−ＨＨ２の５゛−末端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化した。５゛−末端がリン酸化さ
れていないリンカ−ＨＨ１０，４ｐ４．５゛−末端がリ
ン酸化されているリンカ−ＨＨ２０，４Ｎ及び５１５ｂ
ｐ　ＤＮＡ断片０．６４を供給者が示す反応緩衝液２０
ｐｉに溶解し、Ｔ４．　ＤＮＡリガーゼ０．１５ユニツ
トを加えて１５℃で１時間インキュベートした。

反応終了後６５℃で５分間インキュベートし、０℃に冷
却した。反応生成物を■■及び」旦ｄＩ［Ｉで消化し、
６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、１２５
ｂｐ　ＤＮＡ断片を電気溶出で単離した。

その１２５ｂｐ　ＤＮＡ断片には２本のリンカ−由来の
塩基配列が含まれており、一端がＨｉｎｄｌＩ端、他端
が」紅■端であった（図２−ｂ） 一端がＨｉｎｄｌｌ［粘着端で他端が平滑端である４、
４ｋｂｐ　ＤＮＡ断片（図２−ａ）、一端が５゛一端に
リン酸を欠（ＨｉｎｄＩ［［粘着端で他端が」紅■粘着
端である１２５ｂｐ　ＤＮＡ断片（図２−ｂ）、一端が
」紅■粘着端で他方が平滑端であるｔｓｓｏｂｐ　ＤＮ
Ａ断片（図２−ｃ）を材料として下記の様にしてライゲ
ーションを行いプラスミドｐｓｖ　ｔＰＡ　（図２）を
得た。

すなわち４．４ｋｂｐ　ＤＮＡ断片１５０ｎｇ　、　１
２５ｂｐ　ＤＮＡ断片１２ｎｇ及び１８６０ｂｐ　ＤＮ
Ａ断片２００ｎｇを供給者の示す反応液１５ＪＬｉ！に
溶解し、Ｔｈ　ＤＮＡリガーゼ０．０２ユニツトを加え
、まず１５℃で１時間インキュベートし、そしてＴ４　
ＤＮＡリガーゼ２ユニ・ノドを加え、１５℃で１時間イ
ンキュベートし、次に６５℃で５分間インキュベートし
０℃に冷却した。

その反応で得られたＤＮＡ溶液で大腸菌ＤＨ−１株（Ｌ
ｏｗ、Ｂ、、１９６８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、　旦１６０に従って得られたもの）を塩化カ
ルシウム法で形質転換した。

得られたアンピシリン耐性株について〔γ３２Ｐ）　Ａ
ＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで標識ラベルしたＨＨＩリンカ−ＤＮＡ　（プロー
ブ１）とｔ−ＰＡ遺伝子のコード領域より得られる４７
０ｂｐ　Ｅｃ。

Ｒ１断片を（α”Ｐ　）　ＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
を用いて二フクトランスレーシヲンして標識ラベルした
ＤＮＡ　（プローブ２）をそれぞれプローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーション法で図２に示した目的のプ
ラスミドｐｓｖ　ｔＰＡを含む形質転換株をスクリーニ
ングした。

４６個の形質転換株を２系列のニトロセルロースフィル
ター（ｌＩ５９１　；Ｗｈａ　ｔｍａｎ）上に成育させ
た。そのフィルターをアルカリで処理し、中和し、洗浄
しそして風乾した。

次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液（１８
０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）　、６ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．５χＮｏ１ｄｅｔ
−Ｒ４０（ＢＲＬ）、５Ｘデンハート溶液（水１００１
００Ｏにフィコール１ｇ、ポリビニルピロリドンＩｇ、
８ＳＡ１ｇを含む）、１００ＰＩｌｂの煮沸した超音波
処理サケ***ＤＮＡを含む）１０−中でフィルターを５
５℃で２時間インキュベートした。

プレハイブリダイゼーションの後一方のフィルターに、
標識品プローブＬ（ＩＸＩＯ’カウント湊）を含むプレ
ハイブリダイゼーションと同一組成の？ｌ　１０　ｔｈ
ｉｌを加え３０°Ｃで２時間インキュベートしハイブリ
ダイゼーションを行った。

他のフィルターに標識品プローブ１（ＬＸＩＯ７カラン
トＡ）を含むプレハイブリダイゼーション液と同一組織
の液１０ｍ１！を加え４５℃で２時間インキエベートし
ハイブリダイゼーションを行った。

次にフィルターを６χＳＳＣ溶液（０，９Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０９　Ｍクエン酸ナトリウム）で３０℃で３
０分３回洗浄し風乾した。

そのフィルターを増悪スクリーンを使用し、Ｘ線フィル
ムに一７０℃で１２時間露光した。

アンピシリン耐性の４７クローンのうち４２クローンが
プローブ１及びプローブ２の両方にポジティブな反応を
示した。

ポジティブクローンのうち１つからアルカリ法でプラス
ミドＤＮＡを調製した。

得られたプラスミド及び前記のプラスミドｐＴ−ｔを」
印ｄＩＩＩ、」れＩＦ、Ｓ匣Ｉ、勿Ｈ１でそれぞれある
いは組み合わせて用い消化し、アガロース電気泳動で分
画し、そのパターンを比較した結果得られたプラスミド
は正しく構築されたｐＳＶｔＰＡであることが確認でき
た。

また合成りＮＡリンカ−を使用して連結した」立ｄｌ１
１部位とその上流、またそのＨｉｎ　ｄＩ［１部位から
」旦■部位までのＤＮＡ塩基配列をマキサムギルバート
法で決定した。

その結果プラスミドｐｓｖ　ｔＰＡが正しく構築された
ことが塩基配列レベルでも確認出来た。

プラスミドｐｓｖ　ＬＰＡの塩基配列のうちＳＶ４０初
朋プロモーターが含まれるＰｖｕ　１１部位から」しｆ
ｆ部位の配列を図３に示した。

１−Ｃ）ドロソフィラｈＳ８３′　　云　のヒートショ
ックすることによるプラスミドｐＨ３ｔＰＡｆｉ。

実施例１−Ａ）で示した２００ｂｐ　Ｈｉｎ　ｄ０１断
片にはドロソフィ与・メラノガスターの一助２８３遺伝
子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列が含まれて
いた。

その断片を以下に述べる方法で実施例１−Ｂ）で示した
プラスミドρＳＶ　ｔＰＡのＨｉｎｄ０１切断部位に挿
入した。

まずｐｓＶｊ−ＰＡをＨ４ｎｄＩ［［で消化し、ＲＡＰ
処理を行い５°一端のリン酸を除去した。２００ｂｐ　
Ｈ圏ｄｌ［Ｉ断片Ｏ，Ｏ３，（と」江ｄｌＩ［て消化し
、ＢＡＰ処理した直鎖状プラスミドｐＳＶｔＰＡ　ｏ、
ｔｐｇを供給者が示す反応溶液１９．５ｐｉに融解させ
、Ｔ４．　ＤＮＡリガーゼ０．０５ユニツトを加え１５
℃で３時間インキエベートした。

反応で得られたＤＮＡ溶液で大腸菌ＤＨ−１株を塩化カ
ルシウムを用い形質転換した。

出現したアンピシリン耐性のクローンのうち６クローン
についてそれぞれ急速法でプラスミドＤＮＡを調製した
。

得られたそれぞれのプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ
　ＩＩ及びＸｂａ　Ｉ　（ＢＲＬ）で消化し、６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した。

その結果４クローンがｐｓｖ　ｔＰＡの」凰ｄｌｌ［部
位に２００ｂｐ　　Ｈｉｎ　ｄｌ断片を目的とする方向
に含むプラスミドＤＮＡを含んでいた。

その４クローンのうち１クローンからアルカリ法でプラ
スミドＤＮＡを調整した。

得られたプラスミド及びプラスミドｐｓｖ　ｔＰＡをＨ
ｉｎｄｌｌ［，８ｇｌ　ＩＩ　、Ｓｃａ　ｒ　、　　Ｂ
ａｍＨｒ　Ｔ：それぞれあるいは組み合わせて用いて消
化し、それぞれのプラスミドＤＮＡの制限酵素消化パタ
ーンをアガロース電気泳動で調べ、目的のプラスミドｐ
ＨＳ　ｔＰＡ　（図４）が正しく構築されたことを確認
した。

プラスミドｐｉ（Ｓ　ｔＰＡのＸｂａ　［部位から」紅
［部位までの２１０ｂｐ　ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列
をマキサム・ギルバート法で決定し、得られたプラスミ
ドｐＨＳｔＰＡが正しく構築されたことを塩基配列レベ
ルで確認した。

ｐＨＳｔＰＡの２つのＨｉｎｄｆ［Ｉ部位及び工１１部
位を含むＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を図５に示した。

１−〇）ヘルペスシンプレックスウィルス−１Ωｔｋ１
広王至皇％　ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳｔＰＡ及！
八工玉ことによ′プラスミドｐＨＳｔＰＡ−ｔｋの構築
。

ヘルペスシンプレックスウィルス−１（ＨＳＶ−１）の
ｔｋ遺伝子を含む３．４ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ断片を、プ
ラスミドρｔｋ５から調製し以下の方法で実施例１−Ｃ
）で示したプラスミドｐＨ５ｔ−ＰＡのＢａｍＨ［部位
に挿入した。

まずｐＨＳｔＰＡを」憇）ＩＩで消化しＢＡＰ処理を行
い５゛一端のリン酸を除去した。

３．４ｋｂｐハｍ　ＨＩ断片０．０５可と」憇Ｈ１で消
化しＢＡＰ処理した直鎖状プラスミドｐＨＳｔＰＡ　０
．２屑を供給者が示す反応／８液１９．５ｄに融解せし
め、Ｔ、、　ＤＮＡリガーゼ０．０５ユニツトを加え１
５°Ｃで３時間インキュベートした。

反応で得られたＤＮＡ溶液で大腸菌ＤＨ−１株を塩化カ
ルシウムを用い形質転換した。

出現したアンピシリン耐性のクローンのうち７クローン
についてそれぞれ急速法でプラスミドＤＮＡを調整した
。

得られたそれぞれのプラスミドＤＮＡを」憇旧で消化し
、アガロースゲル電気泳動で分析した。

その結果６クローンが３．４ｋｂｐ　Ｒａｍ旧断片を含
むプラスミドを保有していることがわかった。

その６クローンより得られたプラスミドＤＮＡを制限酵
素ユ■及びＳａｃ　Ｉ　（ＮＥＢ）で消化し、アガロー
ス電気永動で分析した。その結果１つのプラスミドでは
ｔｋ遺伝子がｔ−ＰＡｉｔｆｉ子に対し同一方向となる
ように挿入されていたのでこのプラスミドをＡ型とし、
他の５つのプラスミドではｔｋ遺伝子がｔ−ＰＡ遺伝子
に対し逆方法になるように挿入されていたのでこれらの
プラスミドをＢ型とした。Ａ型プラスミドｐ）ＩＳｔＰ
４４ｋを保有するクローンよりアルカリ法でプラスミド
ＤＮＡを調製した（図６）。

ｐＨＳｔＰＡ−ｊｋの構築と同一の方法でＨＳＶ−１ｅ
ｋ遺伝子を含む３．４ｋｂｐ　Ｂａｍ旧断片を実施例１
−Ｂ）で示したプラスミドｐｓｖ　ｔＰＡのＢａｍＨＩ
部位に挿入しｐｓｖ　ＬＰＡ−ｔｋを得た。

ｐＳＶｔＰＡ−ｔｋ　ニはＳＶ４０初期プロモーターに
連結したｊ−ＰＡ遺伝子が含まれるのでこのプラスミド
では以下に述べる」８３遺伝子のヒートショック発現側
ｊＢ　ＤＮＡ塩基配列を含むｐＨＳｔＰＡ−ｔｋを用い
た発現実験に対する対照実験で使用した。

２、プラスミドｐＨＳｔＰＡ−ｔｋによるマウスＬｔｋ
−員マウスＬｔｋ−細胞（Ｋｉｔ、Ｓ＋旦　ａｌ、、１
９６３．Ｅｘｐｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、３１：２９７に記載の方法で得ら
れちもの）は１０％牛脂児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭ
ｒ−１６４０（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂ、）培地中で５χＣＯ
２を含む空気中で３７℃で培養した。

増殖した細胞を直径１０ｃｍのシャーレにそれぞれＩ　
Ｘｌ０ｂ細胞ずつスプレッドし１６時間培養した。

得られた細胞につき、シャーレ１枚に対しＡ型のｐＨＳ
ｔＰＡ−ｔｋ　ＤＮＡ　５　Ｈをリン酸カルシウム法で
導入し、形質転換実験を行った。

細胞は１０％ＦＣＳ及びＨＡＴ（ハイポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を含むＨＥＭ培地（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂ、）で５χＣｏｔを含む空気中、３７°Ｃで１２
日間培養しＬｋ”　となった細胞を選択した。

この結果約１００個のコロニーがＨＡＴ培地で増殖して
１０枚のシャーレ中に出現した。そのコロニーのうち９
６コロニーをクローニングリングで分離し２４ウエルデ
イシユに移し、ＨＡＴ培地で更に増殖させた。

ディシエのウェル中で細胞がコンフルエントになるまで
増殖すると、培地をＦＣＳを含まないＲＰＭ　ｌ−１６
４０培地に交換し５χＣＯ□を含む空気中で３７℃で２
４時間インキユヘートした。

得られた培養上清２０ハを取り出し、フィブリンプレー
ト法で既知のウロキナーゼ（ＵＫ）活性に比較しながら
培地中に蓄積されたｔ−ＰＡのフィブリンクロット溶解
活性を測定した。

その結果全てのクローンの培養上清のｔ−ＰＡ活性は陰
性であった。

次ニソの９６クローンについて、それがヒートショック
処理することによりｔ−ＰＡを産生するかどうか調べた
。

ま子細胞を２４ウエルデイシユでコンフルエントになる
まで増殖させた。培地をあらかじめ４３℃に暖めたＲＰ
門１４６４０に交換し、細胞を４３°Ｃで１時間空気中
でインキュベートし、さらに５Ｘ　Ｃｏ□を含む空気中
で３７℃でインキュベートした。

２４時間後に２０ハの培地を取り出しフィブリンプレー
ト法でｔ−ＰＡ活性を測定した結果４クローンが陽性で
あった。

ｔ−ＰＡ活性を与える培養液上清に抗ｔ−ＰＡ血清を混
合するとフィブリンクロット溶解活性は消失したが、同
培養液上清に抗ＵＫ血清を混合しても活性は消失しなか
った。

それら４クローンめうちｔ−ＰＡ産生能の高かったクロ
ーン＃Ｐ４８の産生能は５．２ユニツト、−ンであった
。そしてこのクローン＃Ｐ４８を２ケ月にわたって重代
培養したがｔ−ＰＡを生産する能力の低下はみられなか
った。

プラスミドｐＳＶｔＰＡ−ｊｋをマウスＬｔｋ−細胞に
リン酸カルシウム法で導入してｔｋ”　となった形質転
換体を得た。

得られた６６クローンについて前記同様の方法で３７℃
でインキュベートし、培地中に蓄積したｔ−ＰＡ活性を
調べたところ７クローンが陽性であった。

ｔ−ＰＡ産生能の高かったクローン１ＩＰ６のｔ−ＰＡ
産生能は４．２ユニツトＭ／ａであうた。

この値に比較してクローン＃Ｐ４８は少し良いｔ−ＰＡ
産生能（５，２ユニツト＆Ａ）を示したが、このことは
動物細胞での発現実験でよく用いられるＳＶ初期プロモ
ーターに比較してドロソフィラ」８３のプロモーターは
プロモーター活性が同程度に強いことを示したものであ
った。

クローン＃Ｐ４８についてヒートショックによるしＰＡ
遺伝子の発現を更に詳細に調べた。

まずヒートショック前あるいは後で形質転換細胞より全
ＲＮＡを調製し、ｔ−ＰＡ遺伝子の発現量をｍＲＮＡレ
ベルで解析した。

ヒートショック処理前、また４３℃で１時間ヒートショ
ック処理した後のそれぞれの細胞を集め全ＲＮＡをグア
ニジウム・セシウムクロライド法で調製した。

ヒートショック処理後細胞を５χＣＯ□を含む空気中で
３７°Ｃでインキュベートし０時間、１時間、８時間あ
るいは２４時間後にそれぞれ全ＲＮＡを調製した。

ｉｋ遺伝子を含むｐ　ｊｋ５でＬｔｋ−細胞を形質転換
し得られたｔｋ’のクローン＃　ｊｋ２についても＃Ｐ
４８と同一条件でヒートショック前あるいは後で全ＲＮ
Ａを調製した。

それぞれの条件で直径Ｌｏａｍのディ９１８枚より細胞
を集め全ＲＮＡを調製したが、得られたＲＮＡ量は２５
０可から３８０にであった。

それぞれの全ＲＮＡ　１０　ｇをフォルムアミドを含む
アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースフィルター
にトランスファーし、そのフィルターを真空オープンで
８０°Ｃで２時間焼いた。フィルターは２シリーズ準備
した。

２枚のフィルターを５０％のホルムアミドを含むプレハ
イブリダイゼーション夜５０　＋ｎｉ！中で４２°Ｃで
４時間インキュベートしプレハイブリダイゼーションを
行った。

ＳＶ４０初朋プロモーターを含む３２５ｂｐ　Ｐｖｕ　
ＩＩ　−Ｂｉｎｄ［［［断片を二・ツクトランスレート
して得た標識プローブ（２，６Ｘ　１０’カウント湊）
をプレハイブリダイゼーション液と同一組成の液２５−
に加えてハイフ゛リタ゛イゼーションン佼をイ乍成し、
またＥ−ＰＡをコードする領域の４７０ｂｐ　ＥｃｏＲ
Ｉ断片を二、クトランスレートして得た標識プローブ（
２，６Ｘ１０７カウント廃）を含む２５ｉのハイブリダ
イゼーション液を作成した。それぞれのフィルターのハ
イブリダイゼーションを４２℃で１９時間行った。

フィルターを２ＸＳＳＣで２０°Ｃで３０分３回、次に
ｌＸ５ｓｃで２０°Ｃで３０分３回洗浄し風乾した。そ
れらフィルターを増悪スクリーンを使用し一７０℃でＸ
線フィルムを１２時間露光した（図７）。

その結果＃４８クローンではヒートショックをしない場
合ｊ−ＰＡ　ｍＲＮＡ合成はみられず、ヒートショック
後１時間後には大量のｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡが合成されて
いることが判明した。ヒートショック後８時間あるいは
２４時間後にはｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡ量は徐々に減少して
いた。

１１４８クローンでは、使用したプラスミトｐＨＳｔＰ
Ａ４ｋ　（Ｄ構成からＳｔ／４Ｑ初期ブロモ−クーが働
　−きｔ−ＰＡｍＲＮＡが合成される可能性あったが、
ＥｃｏＲＩ４７０ｂｐ断片をプローブとして調べるとヒ
ートショック前にｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡを合成していない
こと、ＳＶ４０初朋プロモーターを含む３２５ｂｐム■
−一旧工ｄＩ［［断片をプローブとして調べるとその断
片にハイブリダイズするｍＲＮＡバンドは極く微量であ
るか検出されないかであったことによりその可能性は否
定された。

口に２クローンを用いて行った対照実験では、ヒートシ
ョック前、と−トショック後１時間目、８時間目または
２４時間目では共にｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡが検出されなか
った。

＃Ｐ４８クローンについて、ヒートショック後に培地中
に蓄積されたｔ−ＰＡの活性の時間的変動をフィブリン
プレート法で測定して調べた。

その結果４３℃１時間のヒートショック後細胞を５χＣ
（ｈを含む空気中３７°Ｃでインキニヘートすると培養
液中に８時間目に弱いｔ−ＰＡ活性が検出され、１６時
間目に最大の活性が検出され、２４時間目または４８時
間目には徐々に活性が低下していくことがわかった。

次にヒートショック前または後に培地中に蓄積したｔ−
ＰＡの分子種について、フィブリン−アガーゲル法で３
周べた。

得られた培養上清２０ｐｉを７．５’ＸＳ［ｌＳ−ポリ
アクリルアミドゲルで分画しフィブリンアガーゲルでｔ
−ＰＡ活性を示す分子種を調べた（図８）。

その結果分子量約７０キロダルトンの位置にｔ−ｐ＾の
明瞭なフィブリンクロット溶解活性が認められ、分子量
約１００キロダルトンの位置にマイナーな活性が認めら
れた。

分子量約１００キロダルトンの位置に認められるマイナ
ーな分子種は、分子量約７０キロダルトンの位置に認め
られるＬ−ＰＡに関連した副産物であると予想された。

例えばｊ−ＰＡ　−ｔ−ＰＡインヒビター結合体が生じ
ると分子量約１００キロダルトンの位置にｔ−ＰＡ活性
が生じることが報告されているが、図８で認められたマ
イナーな分子種はそのようなものと考えられる。

以上特定の具体例によって本発明を説明したが、本発明
が当業者の技術常識に従って均等の範囲に１　　　　　
　おいて種々の変更および置換を行って実施できること
は言うまでもないことである。

【図面の簡単な説明】

図１は両端がＨｉｎｄＩ帖着末端に変更されたドロソフ
ィラ・メラノガスター」旦８３遺伝子のヒートショック
発現制御ＤＮＡ塩基配列を含む長さが約２００ｂｐであ
る［ｌＮＡ断片を得る手順を示す図である。 図２はプラスミドｐｓｖ　ｔＰＡの構築手順を示す図で
ある。 図３はｐＳＶｔＰＡのＰｖｕＩ［−」紅ＩＩ断片（７）
　［］ＮＡ塩基配列を示す図である。 図４はプラスミドｐＨＳｔＰＡの構築手順を示す図であ
る。 図５はｐＨＳｔＰＡの２つの血ｄｎＩ部位及びｌｆｆ部
位を含むＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を示す図である。 図６はプラスミドｐＨ５ｊＰＡ−ｔｋの構築を示す図で
ある。 図７はＮｏｒｔｈｅｒｎ法によるクローン＃Ｐ４８が生
成するｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡの検出を示す図面代用写真で
あり、０はヒートショック処理前の時を、他の数字はヒ
ートショック処理後の時間を示す。 図８はフィブリン−アガー法によるクローンオＰ４８が
産生ずるｔ−ＰＡの検出を示す図面代用写真であり、０
はヒートショック処理後の時を、他の数字はヒートショ
ック処理後の時間を示す。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社 図面 図面の浄書（円各二変更なし） 第１図 第３図 第４図 ｐｃａ　ｒ 第５図 第　６　図 ｊ（工 手　　続　　補　　正　　書 昭和６１年０り月／７日 特許庁長官　　　　　　　　　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２７１７２号 ２、発明の名称 ヒートショックたんばく譬遺転子」８３を含む発現ヘク
ター及びこれを用いる誘導的発現３、補正をする者 名称三井東圧化学株式会社 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄及び図面の簡単な説明の
欄 ５、補正の内容 （１１明細書第２５頁第１２行の「ｄ【」の記載をｒｄ
ＴＪに補正する。、／””　′、’＝゛＼（２）　　明
細書第３０頁第４行のｒ　５９１Ｊの記載をｒ　５４１
Ｊに補正する。 （３）明細書第３０頁第２０行の「プローブｌ」の記載
を「プローブ２」に補正する。 （４）　　明細書第３１頁第２行の「同一組織」の記載
を「同一組成」に補正する。 （５）明細書第３７頁第９行の「得られちもの」の記載
を「得られたもの」に補正する。 （６）　　明細書第４２頁第１４行のｒ　＃４８Ｊの記
載をｒ　１ｌＰ４８　Ｊに補正する。 （７）　　明細書第４２頁第１３行の「（図７）」の記
載を削除する。 （８）　　明細書第４２頁第１９行の記載を、［してい
た（図７）、」に補正する。 （９）　　明細書第４２頁第２０行のｒ　＃４８Ｊの記
載をｒ　＃Ｐ４８　Ｊに補正する。 α〔明細＠第４６頁第３行の「処理前の時」の記載を「
を欠くこと」に補正する。 Ｇυ　明細書第４６頁第７行の「処理前の時」の記載を
「を欠くこと」に補正する。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 手続補正書（方式） ％式％ ■、事件の表示 昭和６１年特許願第１２７１７２号 ２、発明の名称 ヒートションクたんばく賞遺転子」８３を含む発現ベク
ター及びこれを用いる誘導°的発現３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、補正命令の日付（発送日） 昭和６１年０８月２６日 ５、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面６、補正の内容
　　　　　　　　　　　Ｉ′ブー図面第７図および第８
図を削除する。 ２）図面 別紙のとおりに補正する。 ４、図面の簡単な説明 図１は両端が血ｄ■粘着末端に変更されたドロソフィラ
・メラノガスター皿８３遺伝子のヒートショック発現制
御ＤＮＡ塩基配列を含む長さが約２００ｂｐであるＤＮ
Ａ断片を得る手順を示す図である４図２はプラスミドｐ
ｓｖ　ｔＰＡの構築手順を示す図である。 図３はｐｓＶｔＰＡ（７）　Ｐｖｕ　ＩＩ　−８ｇｌ　
ＩＩ断片のＤＮＡ塩基配列を示す図である。 図４はプラスミドｐＨＳｔＰＡの構築手順を示す図であ
る。 図５はｐＨＳｔＰＡの２つの一達ユｄｌｌ［部位及び」
Ｃｒ１部位を含むＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を示す図
である。 図６はプラスミドｐＨＳｔＰＡ−ｔｋの構築を示す図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ドロソフィラ・メラノガスター（￥Ｄｒｏｓｏｐｈ
   −ｉｌａ￥￥ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ￥）の約８３キ
   ロダルトンのヒートショックたんぱく質遺伝子（￥ｈｓ
   ｐ￥８３）のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列あ
   るいはその誘導配列を少なくとも１つ含み、かつその塩
   基配列によって転写制御を受けるように外来の生理活性
   物質の構造遺伝子を結合し、転写に必要な他の因子を有
   効に結合し、形質転換された宿主細胞内でその構造遺伝
   子の誘導的発現を可能とする発現ベクター。 ２、ドロソフィラ・メラノガスターの￥ｈｓｐ￥８３遺
   伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列が、ドロ
   ソフィラ・メラノガスターの￥ｈｓｐ￥８３遺伝子のヒ
   ートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列を含む約１９０塩
   基対長のＤＮＡ断片の配列、あるいはその誘導配列であ
   る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ３、外来の生理活性物質の構造遺伝子が、真核生物より
   導かれたものである特許請求の範囲第１項記載の発現ベ
   クター。 ４、外来の生理活性物質の構造遺伝子が、ヒト組織プラ
   スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）遺伝子である特許
   請求の範囲第３項記載の発現ベクター。 ５、外来の生理活性物質の構造遺伝子が、ヒト正常細胞
   株より分離されたヒトｔ−ＰＡ遺伝子である特許請求の
   範囲第４項記載の発現ベクター。 ６、外来の生理活性物質の構造遺伝子が、ヒト正常細胞
   株より分離されたヒトｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡである、ある
   いはその誘導配列を有するＤＮＡである特許請求の範囲
   第５項記載の発現ベクター。 ７、原核生物宿主中で増殖を可能にする原核生物の複製
   系を含む特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ８、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする少なく
   とも１つの遺伝的選択マーカーを含む特許請求の範囲第
   １項記載の発現ベクター。 ９、遺伝的選択マーカーがアンピシリン耐性及びチミジ
   ンキナーゼ遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の発
   現ベクター。 １０、プラスミドｐＨＳｔＰＡ。 １１、プラスミドｐＨＳｔＰＡ−ｔｋ。 １２、真核生物細胞に、ドロソフィラ・メラノガスター
   の￥ｈｓｐ￥８３遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮ
   Ａ塩基配列あるいはその誘導配列を用いて、外来の生理
   活性物質の構造遺伝子の発現を可能としたベクタープラ
   スミドＤＮＡをトランスフェクト法で導入し、導入され
   た外来ＤＮＡが染色体中に組み込まれて、あるいは染色
   体外で増殖して保持されている形質転換細胞を得、その
   形質転換細胞を増殖させ、目的の構造遺伝子を誘導的に
   発現させ、その産物を得ることからなる生理活性物質の
   製造方法。 １３、ドロソフィラ・メラノガスターの￥ｈｓｐ￥８３
   遺伝子のヒートショック発現制御ＤＮＡ塩基配列がその
   細胞内で効果的に働き、外来の生理活性物質がその細胞
   で生産可能である宿主細胞を用いた特許請求の範囲第１
   ２項記載の方法。 １４、形質転換された宿主の選択を可能にする少なくと
   も１つの選択可能な因子が存在する宿主細胞を用いる特
   許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、選択可能な因子がチミジンキナーゼ欠損（ｔｋ＾
   −）である宿主細胞を用いる特許請求の範囲第１４項記
   載の方法。 １６、宿主細胞としてマウスｔｋ＾−株を用いる特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １７、プラスミドがｐＨＳｔＰＡ又はｐＨＳｔＰＡ−ｔ
   ｋのいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １８、特許請求の範囲第１項記載のベクターによって形
   質転換された細胞。 １９、特許請求の範囲第１０項記載のベクターによって
   形質転換された細胞。 ２０、特許請求の範囲第１１項記載のベクターによって
   形質転換された細胞。 ２１、特許請求の範囲第１０項記載のベクターによって
   形質転換された真核生物細胞でかつヒトｔ−ＰＡを産生
   する細胞。 ２２、特許請求の範囲第１１項記載のベクターによって
   形質転換された真核生物細胞でかつヒトｔ−ＰＡを産生
   する細胞。