DE3783515T2

DE3783515T2 - Expressionsvektoren, die die hitzeschock-regulator-dna-sequenzen eines hitzeschock-protein-83-(hsp 83)-gens enthalten und induzierbare expression unter verwendung der vektoren.

Info

Publication number: DE3783515T2
Application number: DE19873783515
Authority: DE
Inventors: Tomoko Ishii; Eriko Mine; Fumio Mitsui Toatsu Kosug Omae; Noboru Tomioka
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-06-03
Filing date: 1987-06-03
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2007-06-04
Also published as: JP2515299B2; DK285587D0; DK285587A; FI872465A0; JPS62285787A; DE3783515D1; EP0248647B1; CA1312028C; EP0248647A1; FI872465A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Technologien, um gewünschte Produkte von Fremdgenen, wie zum Beispiel physiologisch aktiven Substanzen, usw., durch Verwendung von Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen eines Hitzeschock-Protein 83 (hsp83)-Gens von Drosophila melanogaster zu produzieren.
Eine verwandte Technologie unter Verwendung von Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen des Hitzeschock-Protein (hsp70)-Gens von Drosophila melanogaster ist bereits entwickelt worden. Mehrere Fremdgene sind bereits unter der Kontrolle der hsp70-Regulatorsequenzen exprimiert worden (Corces, V. et al., 1982, in Heat Shock from Bacteria to Man, Eds., Schlesinger, M.J., et al., Cold Spring Harbor Laboratory, p27; Pelham, H.R.B., 1982, Cell, 30:517; Pelham, H.R.B. und Bienz, M., 1982, EMBO Journal, 1:1473; Bromley, P. and Voellmy, R., 1984, European Patent Publication No. 011839A2; Kingston, R.E. et al., 1984, Nature, 312:280), aber die Ausbeute an reifen Genprodukten war ziemlich beschränkt.
Beispielsweise wurde ein Influenza-Haemagglutinin- Protein-Gen mit Hilfe der hsp70 Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen exprimiert und die Expressionsdaten zeigten eine unklare Art und Weise der Expression in Affen-COS-Zellen oder Xenopusoocyten nach Bromley und Voellmy (Bromley, P. und Voellmy, R., 1984, European Patent Publication No. 0118393A2). In den meisten ihrer Expressionsexperimente wurde Haemagglutinin bei normaler Temperatur ohne Hitzeschockbehandlung gefunden. In einigen ihrer Experimente hatte die Hitzeschocktemperatur (43ºC) einen inhibitorischen Effekt auf die Haemagglutininprodution zu Folge. Die Menge des produzierten Haemagglutinins wurde durch Immunpraezipitation und nachfolgender Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt. Im allgemeinen wird die Methode der Immunpraezipitation angewendet, um ein Genprodukt, dessen Gehalt sehr gering ist, nachzuweisen, deshalb wird erwartet, daß der Gehalt an Haemagglutinin, das unter der Kontrolle der hsp70-Hitzeschock-Regulator-Sequenzen exprimiert wird, in deren Experimenten nicht hoch ist.
Durch die Verwendung von hsp70-Hitzeschock-Regulator- Sequenzen wurde ein Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV- tk)-Gen und ein humanes Wachstumshormongen in Maus-L-Zellen (Corces, V. et al., 1982. in Heat Shock from Bacteria to Man, Eds., Schlesinger, M.J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, p27) und das HSV-tk-Gen in Affen-COS-Zellen (Pelham, H.R.B. und Bienz, H., 1982, EMBO Journal, 1:1473) exprimiert. In diesen Expressionsexperimenten wurde das Ausmaß dieser Fremdgenexpression durch die Messung der mRNA- Gehalte ermittelt, wahrscheinlich weil die Niveaus nicht hoch genug waren, um Translationsprodukte nachzuweisen. Vermutlich liegt einer der Gründe für diese niedrige Expression darin, das der hsp70-Promotor ein extrem schwacher Promotor ist (Kingston, R.E. et al., 1984, Nature, 312:280).
Die Erfinder haben außerdem, wie später erläutert wird, versucht, ein Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA)-Gen, das aus normalen menschlichen Zellen stammt, durch Verwendung der Hitzeschock-Regulator-Sequenzen des Drosophila-hsp70-Gens zu exprimieren, aber das Expressionsexperiment führte nur zu einer beinahe vernachlässigbaren Höhe der tPA-Produktion.
Andere Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen von Drosophila melanogaster-hsp83 analysiert (Holmgren, R. et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3775; Wu, C., 1984, Nature, 309:229; Wu, C., 1984, Nature, 311:81) und es ist bekannt, daß ein Teil der Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenz eine beinahe perfekte dyadische Symmetriestruktur besitzt und daß diese Regulator-DNA-Sequenz mit einem mutmaßlichen Hitzeschock-Aktivator-Protein bindet.
Expressionen von Fremdgenen durch Gebrauch der hsp83- Regulator-DNA-Sequenzen wurden versucht, aber bisher sind noch keine gewünschten Resultate erzielt worden.
Obwohl, zum Beispiel, das Drosophila-hsp83-Gen selbst in Hefezellen exprimiert worden ist (Lis, J. et al., 1982, in Heat Shock from Bacteria to Man, Eds., Schlesinger, M.J. et al., p57), wurden Transkriptionsaktivitäten der Drosophila- hsp83-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenz en in transformierten Tierzellen bisher noch nicht erfolgreich untersucht, soweit es den Erfindern der vorliegenden Erfindung bekannt ist.
Die Analyse der Drosophila-hsp83-Hitzeschock-Regulator- Region wurde durchgeführt (Wu, C., 1984, Nature, 309:229: Wu, C., 1984, Nature, 311:81). Eine vermeintliche Bindungsstelle des Hitzeschock-Aktivator-Proteins (HAP) des hsp83-Gens wurde durch die Analyse Exonuclease-resistenter Stellen nachgewiesen. Es ist gezeigt worden, daß die DNA-Sequenz der HAP-Bindungsstelle eine Sequenz mit 28 Basen mit einer beinahe perfekten dyadischen Symmetrie enthält. Die Sequenz mit der dyadischen Symmetrie mag eine Stammstruktur bewirken, wie unten gezeigt wird. Die Erfinder finden keine DNA-Sequenz mit guter dyadischer Symmetrie um die hsp70-Hitzeschock- Consensus-Sequenz herum, was von Pelham vorhergesagt wurde (Pelham, H.R.B., 1982, Cell, 30:517). Ein Beispiel für die mögliche Stammstruktur für die hsp70-Sequenz ist unten gezeigt. Die Sternchen zeigen die Lage der Consensus-Sequenz an.
Obwohl Wu berichtet hat, daß das hsp83-Gen mit dem vermeintlichen HAP stärker als das hsp70-Gen bindet (Wu, C., 1984, Nature, 311:81), weisen andere Berichte darauf hin, daß die Höhe der hsp83-Genexpression bei Hitzeschock-Temperatur niedriger als diejenige der hsp70-Genexpression ist und daß das hsp83-Gen bei normalen Wachstumstemperaturen in manchen Drosophila-Zellen langsam exprimiert wird. (Hackett, R.W. und Lis, J.T., 1983, Nucl. Acids Res., 11:7011; Ashburner, M. and Bonner, J.J., 1979, Cell, 17:241).
Obwohl hsp83-Hitzeschock-Regulator-DNASequenzen in den Gebieten der gentechnologischen Produktion von Fremdgenen nutzbar sein können, ist ein effektiver Gebrauch von ihnen noch nicht erwiesen.
Die Erfinder haben vermutet, daß Probleme in den hsp70- Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen enthalten sein können, wenn jemand beabsichtigt, die hsp70-Sequenzen zu verwenden, um Fremdgene in eukaryotischen Zellen nach Induktion zu exprimieren. Um diese Schwierigkeit zu beheben, haben die Erfinder die Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen aus dem Drosophila-hsp83-Gen in Fremdgen-Expressionsvektoren in Tierzellen eingebracht und erhielten Transformanten durch den Gebrauch der Vektoren. Die resultierenden Transformanten produzierten bestimmte Mengen des Genprodukts nur nach Hitzeschockinduktion und somit wurde die Erfindung vervollständigt.
Obwohl in der Konstruktion der vorliegenden Erfindung die starke und regulatorische Expression vom Stand der Technik her nicht erwartet worden war, wie oben erwähnt wurde, haben die Erfinder jedoch unerwarteterweise die starke und regulatorische Expression eines Fremdgens in Tierzellen festgestellt, indem sie die Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen aus dem Drosophila-hsp83-Gen in die Konstruktion wie unten beschrieben eingeführt haben. Die Ergebnisse der Erfinder zeigten, daß das Fremdgen in den transformierten Zellen nur nach Hitzeschockinduktion stark exprimiert werden konnte.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, reproduzierbare Technologien zur Verfügung zu stellen, um eine stärkere Expression des Fremdgens zu erhalten, das für eine physiologisch aktive Substanz und dergleichen in eukaryotischen Zellen, besonders in Tierzellen, codiert.
Die vorliegende Erfindung ist durch die Verwendung der Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen eines Hitzeschock- Protein-83 (hsp83)-Gens aus Drosophila melanogaster charakterisiert, um die oben erwähnte Aufgabe durchzuführen. Die modifizierten Sequenzen der Regulator-Sequenzen können anstelle der hsp83-Sequenzen verwendet werden. Die hsp83- Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen und andere für die Translation notwendige DNA-Sequenzen sind funktionell mit den Fremdstrukturgenen verbunden, die für physiologisch aktive Substanzen, usw., codieren, und daher wurden Expressionsvektoren konstruiert
Eukaryotische Zellen können mit den Expressionsvektoren transformiert werden. Die transformierten Zellen werden gezüchtet und die Produktion der erwünschten Fremdgenprodukte wird durch die Hitzeschockbehandlung induziert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Fremdgene, die für physiologisch aktive Substanzen etc. codieren, nach Induktion in eukaryotischen Zellen, besonders in Tierzellen, exprimiert werden und die physiologisch aktiven Substanzen, etc., können leicht aus den Zellen oder dem Kulturmedium gewonnen werden. Gemäß der in dieser Erfindung beschriebenen induzierbaren Expression wird die Expression eines Fremdgens normalerweise unterdrückt und die Expression kann, wenn erforderlich, durch Hitzeschockbehandlung eingeschaltet werden. Die vorliegende Erfindung versetzt einen ebenfalls in die Lage, transformierte Zellen zu erhalten, die die potentielle Fähigkeit besitzen, eine physiologisch aktive Substanz in für die Wirtszellen toxischer Menge zu produzieren.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung des verwendeten Verfahrens, um das annähernd 200 bp HindIII- Fragment zu erhalten, das die hsp83-Hitzeschock-Regulator- DNA-Sequenzen enthält.
Figuren 2A & 2B zeigen das Konstruktionsverfahren des Plasmids pSVtPA.
Figur 3 zeigt die Nukleotidsequenz eines Strangs des PvuII-BglII-Fragments in dem Plasmid pHStPA.
Figur 4 zeigt das Konstruktionsverfahren des Plasmids pHStPA.
Figur 5 zeigt die Nukleotidsequenz eines Strangs des DNA-Fragments, das zwei HindIII-Stellen und eine BglII-Stelle im Plasmid pHStPA enthält
Figur 6 zeigt das Konstruktionsverfahren des Plasmids pHStPA-tk.
Figur 7 zeigt die Northern-Blot-Analyse, um die Mengen von tPA-mRNA sichtbar zu machen, die von dem Klon #P48 vor und nach Hitzeschockinduktion produziert wurden.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse des Fibrin-Agar-Tests nach Trennung der tPA-Moleküle durch Polyacrylamidgel. Die tPA- Moleküle, die durch #P48-Klone hergestellt wurden, wurden vor und nach der Hitzeschockbehandlung analysiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Konstruktion des Expressionsvektors durch Verwendung der Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen des annähernd 83 kd großen Hitzeschock-Protein (hsp83)-Gens aus Drosophila melanogaster oder der modifizierten Sequenzen dieser Regulator-Sequenzen, sowie Verfahren, um Transformanten durch Verwendung dieser Expressionsvektoren zu erhalten, sowie Verfahren zur induzierbaren Expression der erwünschten Fremdgene und Verfahren, um deren Genprodukte zu gewinnen.
Der hier verwendete Ausdruck "Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen des annähernd 83 kd großen Hitzeschock-Protein (hsp83)-Gens aus Drosophila melanogaster" bezeichnet die DNA- Sequenzen, die für die hsp83-Genexpression verantwortlich sind. Diese DNA-Sequenzen umfassen die TATA-Box-Sequenz, die DNA-aufwärts der hsp83-Strukturregion gelegen ist, wie von Holmgren et al. gezeigt wurde (Holmgren, R. et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3775), die Regulator-DNA-Sequenz, die in DNA-abwärts der TATA-Box-Sequenz gelegen ist, wie von Wu gezeigt wurde (Wu, C., 1984, Nature 309:229), und (eine) andere nicht-identifizierte Regulator-DNA-Sequenze (n), die an der transkriptionalen und/ oder der translationalen Regulation des hsp83-Gens beteiligt sein können (kann).
hsp83 aus Drosophila melanogaster ist verschiedene Male als hsp80, -81, -82 und -83 beschrieben worden. Vor kurzem wurde hsp83 auf hsp82 bezogen, weil das Molekulargewicht von hsp83 mit 81,853 aus den kompletten Nukleotidsequenzdaten des Gens berechnet wurde (Wu, C., 1984, Nature, 311: 81).
"Modifizierte Sequenzen" bezieht sich auf die Sequenzen, die aus den Originalsequenzen durch Basensubstitution, -deletion, -insertion und -austausch ohne Abnahme oder mit Zunahme der Effizienz der Hitzeschock-Regulator-Expression verändert wurden, welche das Ziel der vorliegenden Erfindung ist.
Hitzeschockproteine (hsp) sind bekanntermaßen hochkonserviert innerhalb der Eukaryoten. Die hsp mit höherem Molekulargewicht, deren Molekulargewichte sich von 80 kd bis 90 kd erstrecken, sind nicht nur in Drosophila, sondern auch in Maus-, humanen und anderen eukaryotischen Zellen nachgewiesen worden (siehe Heat Shock from Bacteria to Man, 1982, Eds., Schlesinger, M.J. Je al.; Lai, B.-T., et al., 1984, Mol. Cell. Biol., 4:2802). Deshalb müssten, falls die Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen in den eukaryotischen hsp-Genen mit hohem Molekulargewicht gefunden würden und diese Sequenzen identisch oder ähnlich denen des hsp83-Gens aus Drosophila melanogaster wären, diese Sequenzen in die "modifizierten Sequenzen" mit eingeschlossen werden.
Die Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen des hsp83-Gens aus Drosophila können mittels enzymatischer oder physikalischer Verfahren aus dem hsp83-Gen isoliert werden, das bereits von Holmgren et al. (Holmgren, R. et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3775) kloniert worden ist. Die DNA-Sequenzen können durch das DNA-Synthese-Verfahren hergestellt werden (Itakura, K. et al., 1984, Ann. Rev. Biochem., 53:323), weil die teilweise und sogar die gesamte DNA-Sequenz des hsp83-Gens veröffentlicht worden ist (Holmgren, R. et Ja., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3775; Hackett, R.W. and Lis, J.T., 1983, Nucl. Acids Res., 11:7011).
Die Erfinder erhielten zweckmäßigerweise das annähernd 190 Basenpaare große DNA-Fragment, das die Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen von Drosophila-hsp83 enthält, mittels Restriktionsenzymen.
"Modifizierte Sequenzen" der Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen von Drosophila-hsp83 können durch das DNA-Synthese- Verfahren hergestellt werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens kann man auf einfache Art und Weise die modifizierten Sequenzen entwerfen und dann durch Basenaustausch, -deletion, -insertion, -transposition und so weiter erhalten. Andere Wege, um die modifizierten Sequenzen zu erhalten, sind enzymatische oder physikalische Isolierung der Sequenzen aus eukaryotischen höhermolekularen hsp-Genen, die zum Drosophila-hsp83-Gen in Bezug stehen. Punktmutation oder andere Mutationsverfahren, einschließlich der in vitro- Mutagenese, liefern das Verfahren, um modifizierte Sequenzen des hsp83-Gens herzugeben.
"Expressionsvektor" bedeutet Vektoren, die zur Expression bestimmter darin enthaltener Gene fähig sind, und deren eigentliche Form die DNA ist im allgemeinen liegen Expressionsvektoren in der Form von "Plasmiden" vor, die sich auf kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleifen beziehen. Die DNA-Konstrukte des Expressionsvektors schließen zumindest ein DNA-Fragment, das die Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen enthält, ein fremdes Strukturgen, das für die gewünschte Substanz, wie zum Beispiel physiologisch aktive Substanzen, codiert und zumindest ein DNA-Fragment, das einen Terminator und ein Polyadenylierungssignal enthält, mit ein. Alle DNA- Fragmente werden im Vektor miteinander verbunden, um die transkriptionale und/ oder translationale Kontrolle für das Strukturgen zu erreichen. Die funktionelle Einheit, die die transkriptionale und/ oder translationale Kontrolle für das Strukturgen enthält, könnte als "Expressionseinheit" bezeichnet werden. Das DNA-Fragment, das den Terminator und das Polyadenylierungssignal enthält, kann von dem Fremdgen selbst oder von einem anderen geeigneten Gen erhalten werden Die "Expressionseinheit" enthält untranslatierte 5'- flankierende und/ oder untranslatierte 3'-flankierende DNA- Sequenzen des gewünschte Fremdgens und in einigen Fällen intervenierende Sequenzen des Fremdgens. Die "Expressionseinheit" darf ebenfalls DNA-Sequenzen enthalten, die die Genexpression DNA-aufwärts oder -abwärts der Kontrollsequenzen nicht inhibieren. Flankierende DNA- Sequenzen der Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen, die Terminator-Sequenz und Linker-DNAs dürfen nämlich in der Expressionseinheit vorhanden sein. Die "Expressionseinheit" wird in die Expressionsvektoren eingebracht.
"Expressionsvektoren" müssen in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als ein Bestandteil der chromosomalen DNA replizierbar sein. Autonom replizierende Sequenzen, die vom Simian Virus 40 (SV40), vom Rinder- Papillom-Virus, etc., hergeleitet sind, machen Expressionsvektoren in Wirtszellen als Episomen replizierbar. Episomen bewirken eine höhere aber schwankende Anzahl von Kopien des gewünschten Fremdgens in Wirtszellen.
Integration des Expressionsvektors in die chromosomale DNA der Wirtszellen resultiert in einer gewöhnlich niedrigen aber stabilen Anzahl von Kopien, weil die integrierten Gene in Übereinstimmung mit der Replikation der Wirtschromosomen replizierbar sind. Das Integrationsverfahren ist vorzuziehen, wenn eine stabile Expression erwünscht ist.
In der vorliegenden Erfindung werden die Selektionsmarker für die "Expressionsvektoren" angewendet, um Transformanten auszuwählen. Die für Tierzellen nutzbaren Selektionsmarker werden später bei der Erklärung der Wirtszellen beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung ist es von Vorteil, ein prokaryotisches Replikationssystem und einen prokaryotischen Selektionsmarker bereitzustellen, um die Klonierung des Expressionsvektors in einer Bakterienwirtszelle zu ermöglichen. Der prokaryotische Replikationsursprung, wie der Plasmid-pBR322-Ursprung und der prokaryotische Selektionsmarker, wie das Ampicillin-Resistenz-Gen, werden in den Expressionsvektor eingebracht und das ermöglicht es, die transformierten Bakterienzellen mit großen Mengen der Vektor- Plasmid-DNA zu gewinnen.
"Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die zur Transformation durch die Einbringung des Expressionsvektors benutzt werden. Die Wirtszellen werden nach ihrer Brauchbarkeit für die Funktion des Expressionsvektors ausgewählt. Die Wirtszellen müssen die Fähigkeit besitzen, die Expressionseinheit für das gewünschte Fremdgen zu transkribieren und zu translatieren.
In einigen Fällen brauchen die Wirtszellen die Fähigkeit, für die Genprodukte Modifikationen bereitzustellen. In anderen Fällen brauchen die Wirtszellen die Fähigkeit, die Genprodukte zu translozieren und/ oder zu sezernieren.
Jedes Verfahren, durch das DNA in die Wirtszellen inkorporiert wird, kann zur Einbringung der Expressionsvektor-Plasmid-DNA in die Wirtszellen verwendet werden. Das Calciumchlorid-Verfahren (Mandel, M. and Higa, A., 1970, J. Mol Biol., 53:154) wird allgemein für prokaryotische Wirtszellen und das Calciumphosphat-Verfahren (Wigler, M. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., 76:1373) für Tierzellen benutzt. Beide Verfahren sind für die vorliegende Erfindung geeignet.
Dominante Funktionsmarker, wie das Neomycin-Resistenz (Neo )-Gen (Colbere-Garapin, F. et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1), ein Bakterien-Xanthinguaninphosphoribosiltransferase (XGPRT)-Gen (Mulligan, R.C. and Berg, P., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 2072) sind für die Selektion von transformierten Tierzellen brauchbar. Ein Thymidinkinase (tk)-Gen (Wigler, H. et al., 1977, Cell, 11:223) oder ein Dihydrofolatreductase (DHFR)-Gen (Subramani, S. et al., 1981, Mol. Cell. Biol., 1:854) können ebenfalls für die Selektion von transformierten Tierzellen benutzt werden. Die für das tk- oder das DHFR-Gen defizienten Zellen sind für Transformationsexperimente vorzuziehen.
Das von Ringold et al. (Ringold, G. et al., 1981, J. Mol. Appl. Genet., 1:165) berichtete Co- Amplifikationsverfahren versetzt einen in die Lage, das gewünschte Fremdgen gemeinsam mit dem DHFR-Gen zu amplifizieren. Das Verfahren ist in vorliegender Erfindung einsetzbar und kann einfach angewendet werden, um die Anzahl der Kopien des gewünschten Gens zu erhöhen. Eine hohe Anzahl der Kopien kann eine stärkere Expression des gewünschten Gens in vorliegender Erfindung zur Folge haben.
Der hier verwendete Ausdruck "physiologisch aktive Substanzen" meint eine Anzahl von Polypeptiden oder eine assoziierte Form dieser Polypeptide wie Enzyme, Hormone, Gerinnungsfaktoren, Lymphokine, virale Antigene, andere Antigene und so weiter. Besonders wenn Polypeptide aus eukaryotischen Zellen stammen, werden viele Polypeptide durch proteolytische Spaltung, Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Reifungsprozesse usw. mit besonderen Enzymen, die sich in den eukaryotischen Zellen befinden, modifiziert. Einige Polypeptide werden zu komplizierten höheren Strukturen mit Hilfe der S-S-Bindungen oder anderer molekularer Wechselwirkungen gefalten. Die post- translationalen Modifikationen und höheren Strukturen finden in prokaryotischen Zellen möglicherweise nicht korrekt statt.
Ist die physiologisch aktive Substanz ein humaner Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), dessen physiologische Aufgabe in der Lösung von Fibrin-Gerinnseln besteht, wird das translatierte Produkt des tPA-Gens am Ende der N-terminalen Leader-Aminosäurensequenz gespalten und einer Glycolysierung unterzogen, das entstehende reife tPA wird durch die Hilfe von S-S-Bindugen in der Zelle in eine höhere Struktur gefalten und schließlich wird das reife Produkt aus der Zelle herausgeschleust (Rijken, D.C. and Collen, D., 1981, J. Biol. Chem., 256:7035; Pennica, D. et al., 1983, Nature, 301:214).
Humanes tPA wurde als ein Beispiel für eine physiologisch aktive Substanz in der vorliegenden Erfindung wegen seiner Beschaffenheit ausgewählt. Die vorliegende Erfindung ist selbstverständlich durch dieses Beispiel nicht eingeschränkt.
Humane tPA-Gene sind als genomische Klone aus humaner chromosomaler DNA (Ny, T. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:5355; Browne, M.J. et al., 1985, Gene, 33:279; Fisher, R. et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:11223) oder als cDNA Klone aus Melanom-mRNA (Pennica, D. et al., 1983, Nature, 301:214; Goeddel, D.V. et al., 1983, UK Patent Application No. GB2119804A) und als normale zelluläre mRNA (European Patent Application No. 86309250.8) verfügbar.
Bei Verwendung eines der humanen tPA-Gene als ein Beispiel für das Gen einer fremden physiologisch aktiven Substanz wird eine allgemeine Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hier und in dem nachstehenden experimentellen Abschnitt präsentiert, um die Vorteile und den Nutzen der vorliegen Erfindung zu demonstrieren.
Das DNA-Fragment, das die Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen von Drosophila-hsp83 enthält, wurde aus einem Drosophila-hsp83-Klon isoliert. Das Fragment wurde funktionell mit dem tPA-Struktur-Gen verbunden, das aus normalen menschlichen Zellen erhalten und in dem Expressionsvektor plaziert wurde. Das DNA-Fragment, das die für die Termination und die Polyadenylierung verantwortlichen Sequenzen enthält, wurde eingefügt, um eine zufriedenstellende Expression des tPA-Gens in dem Expressionsvektor zu erreichen.
Der für die Replikation in E. coli-Zellen notwendige Replikationsursprung, der in E. coli wirksame Selektionsmarker und andere für die tPA-Gen-Expression notwendige DNA-Sequenzen wurden in den Expressionsvektor eingebracht.
Für Fremdgenexpressionsexperimente im allgemeinen benutzte kultivierte Säugerzellen wurden als Wirtszellen verwendet.
Das Selektionsmarker-Gen, wie zum Beispiel ein tk-Gen, wurde in den Expressionsvektor eingebracht und die Einfügung des Marker-Gens hatte eine geeignete Selektion der Transformanten zu Folge. Tk-defiziente Zellen wurden im Falle einer tk-Selektion als Wirtszellen verwendet.
Die Wirtszellen wurden mit der Expressionsvektor-DNA transformiert und die sich ergebenden Transformanten wurden für eine Bestimmung der tPA-Produktion unter den Bedingungen einer Hitzeschockinduktion hergenommen. Die Menge des sich im Kulturmedium anreichernden tPA wurde mit dem Fibrin- Gerinnsel-Lyse-Test gemessen. Wurde die Hitzeschockinduktion vor der Bestimmung des tPA durchgeführt, wurden bestimmte Mengen von tPA unter der Kontrolle der hsp83-Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen festgestellt, obwohl eine meßbare Menge von tPA bei nicht vorliegender Hitzeschockinduktion nicht produziert wurde.
In einem vergleichbaren Experiment wurde das DNA- Fragment einschließlich der Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen aus Drosophila-hsp70 (siehe Pelham, H.R.B., 1982, Cell, 30:517) aus dem Subklon B8 (Craig, E.A. et al., 1979, Cell, 16:575; Ingolia, T.D. et al., 1980, Cell, 21:669) mit Restriktionsenzymen isoliert. Das DNA-Fragment, das die hsp70-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen enthält, wurde in die passende Stelle des tPA-Expressionsvektors in der richtigen Orientierung eingesetzt. Die Konstruktion des Expressionsvektors und die anderen Verfahren und Vorgehensweisen, um eine tPA-Gen-Expression zu erzielen, wurden nach den in dem Beispielabschnitt erwähnten hsp83- Experimenten durchgeführt.
Nur Spuren von tPA wurden unter der Kontrolle der hsp70-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenz gemessen, wenn die Hitzeschockinduktion vor der Messung des tPA durchgeführt wurde und keine tPA-Aktivität wurde ohne Hitzeschockinduktion gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß die hsp83-Regulator-DNA- Sequenz für die induzierbare Expression von Fremdgenen vorzuziehen ist.
Die Produktion von tPA unter der Kontrolle der hsp83- Regulator-DNA-Sequenz wurde als relativ hoch interpretiert, weil die von den hsp83-Regulator-Sequenzen produzierten Mengen mit denjenigen der grundlegenden Expression unter der Kontrolle des frühen Promoters aus SV40 vergleichbar sind.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern aber nicht einschränken.
Überdies sollte selbstverständlich sein, daß, wo in den folgenden Beispielen keine besonderen Verfahren und Arbeitsvorschriften angezeigt sind, übliche Verfahren und Arbeitsvorschriften, die jedem mit der Materie vertrauten einleuchtend sind, in geeigneter Weise ausgewählt und angewendet wurden.

Beispiel 1

(Isolierung des DNA-Fragments enthaltend die Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen aus Drosophila-hsp83 und Konstruktion des Expressionsvektors unter Verwendung dieses Fragments)

1-A Herstellung des 200 bp HindIII-Fragments enthaltend die Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen aus Drosophila-hsp83

Ein BamHI-SalI-Subklon aDm4.46 (Hackett, R.W. und Lis, J.T., 1983, Nucl. Acids Res., 11:7011), der die 5'- flankierende Region eines hsp83-Gens aus Drosophila melanogaster enthält, wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI (Bethesda Research Laboratories ING; als BRL abgekürzt) und XhoI (BRL) verdaut und die sich ergebenden DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Das 769 Basenpaare (bp) große EcoRI-XhoI-Fragment wurde durch Elektroelution gewonnen (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Eds., Maniatis, T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, p150). Die Einheit "Basenpaare (bp)" ist ein Maß für die Länge der DNA und der in den nachstehenden Beispielen gezeigte numerische Wert kann nur eine angenäherte Information geben.
Die 3'-kohäsiven Enden des 760 bp-Fragments wurden durch Einfügen mit der Klenow DNA-Polymerase I zu glatten Enden aufgefüllt. Das 769 bp-Fragment mit glatten Enden wurde mit der Restriktionsendonuklease RsaI (New England Biolabs; abgekürzt als NEB) verdaut und das sich ergebende Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Ein 190 bp EcoRI/fill-RsaI-Fragment wurde durch Elektroelution gewonnen. Eine kommerziell verfügbare HindIII-Linker-DNA (d5'- GCAAGCTTGC-3', BRL) wurde an ihren 5'-Enden durch T4 Polynukleotidkinase (BRL) phosphoryliert, wie in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Eds., Maniatis T. et al., p125 beschrieben. 450 ng der phosphorylierten HindIII-Linker- DNA und 630 ng des 190 bp EcoRI/fill-RsaI-Fragments wurden in 37 ul Ligationspuffer gelöst, wie es vom Lieferanten vorgeschlagen wurde, durch Hinzufügen von 6 Einheiten T4 DNA- Ligase (BRL) ligiert und nachfolgend bei 12ºC über 5 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 65ºC für 5 Minuten beendet und dann wurde sehr schnell bei 0ºC abgekühlt. Die resultierenden Fragmente wurden mit HindII (BRL) verdaut, der Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 200 bp HindIII-Fragment (siehe Figur 1) wurde elektroeluiert. Das 200 bp HindIII-Fragment beinhaltet die hsp83-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen.

1-B Konstruktion des Plasmids pSVtPA

Das Plasmid pSVM-dhfr (Lee, F. et al., 1981, Nature, 294:228) wurde mit der Restriktionsendonuklease BglII verdaut und durch Klenow DNA-Polymerase I (BRL), wie beschrieben wurde (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Eds., Maniatis, T. et al., p113) aufgefüllt. Im besonderen wurden die 5'-kohäsiven Enden der resultierenden linearen DNA durch Einfügen mit der Klenow DNA-Polymerase I zu glatten Enden aufgefüllt. Das so erhaltene lineare DNA-Fragment mit glatten 5'-Enden wurde mit HindIII verdaut, an seinen 5'- Enden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP, BRL) dephosphoryliert, wie beschrieben wurde ( Ullrich, A. et al., 1977, Science, 196:1313) und der Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das 4,4 kilo Basenpaare (kb) große DNA-Fragment wurde elektroeluiert. Ein Ende des Fragments war ein HindIII- kohäsives Ende und das andere war ein glattes Ende.
Das 4,4 kb-Fragment enthält einen frühen Promotor aus SV40, einen SV40-Verstärker, einen SV40-Replikationsursprung, einen prokaryotischen Replikationsursprung, ein Ampicillin-Resistenz-Gen (Amp ), SV40-frühe-Transkript-Termination und Polyadenylierungssignale und andere nicht-translatierende DNA-Fragmente (Figur 2B-a).
Das Plasmid pT-1 (European Patent Application No. 86309250.8) beinhaltet eine aus normalen Zellen (MTC-017) gewonnene humane tPA-cDNA. Die gesamte tPA-codierende Region wurde aus dem Plasmid wie folgt isoliert.
Die Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen BglII und BalI (NEB) verdaut und die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese separiert. Ein 1860 bp großes DNA-Fragment, das die C-terminale Aminosäuren- codierende Region und die 3'-flankierende Region trägt (siehe Fig. 2B-c), wurde durch Elektroelution isoliert. Ein Ende des Fragments war BglII-kohäsiv und das andere Ende war glatt.
Getrennt davon wurde pT-1 mit den Restriktionsendonukleasen BamHI (BRL) und ScaI (NEB) verdaut und der Agarosegelelektrophorese unterzogen und danach wurde ein 970 bp-DNA-Fragment elektroeluiert. Das Fragment trug die N-terminale Aminosäuren-codierende Region und auch die 5'- flankierende Region. Das Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease HgaI (NEB) verdaut und die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Das 515 bp-DNA-Fragment, das die N-terminale Aminosäuren-codierende Region und auch die 7 bp 5'- flankierende Region trug, wurde durch Elektroelution gewonnen.
Zwei verschiedene Oligodeoxynukleotide wurde mit dem Festphasen-Phosphotriester-Verfahren synthetisiert (Itakura, K. et al., 1984, Ann. Rev. Biochem., 53:323). Eines der Oligonukleotide (5'-AGCTTACGCTGTGA-3') wurde als HH-1 und das andere (5'-TTGCTTCACAGCGTA-3') wurde als HH-2 bezeichnet. Die nach dem Abkühlen der synthetischen DNAs erhaltene doppelsträngige DNA umfaßte ein HindIII-kohäsives Ende und (ein) anderes kohäsives Ende, dessen Sequenz komplementär zu dem HgaI-Ende des oben erwähnten 515 bp-DNA-Fragment war. Außer für die HindIII-Sequenz stellte sich die DNA-Sequenz der sich ergebenden doppelsträngigen DNA als identisch zu der DNA-aufwärts der HgaI-Stelle in der 5'-flankierenden Region des tPA-Gens liegenden Sequenz heraus.
400 ng der HH-1 DNA, 400 ng der HH-2 DNA, deren 5'-Enden durch die T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert wurden, und 600 ng des 515 bp-DNA-Fragments wurden in 20 ul Ligationspuffer gelöst und durch Hinzufügen von 0,15 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und danach bei 15ºC über 1 Stunde inkubiert. Die ligierten DNAs wurden mit BglII und HindIII verdaut und die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese fraktioniert (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Eds., Maniatis, T. et al., p174). Das 125 bp-HindIII-BglII-Fragment, das die DNA- Sequenz aus dem synthetischen Oligonukleotid (Fig. 2B-b) enthält, wurde elektroeluiert. Dem 125 bp-Fragment fehlte Phosphat an seinem HindIII-5'-Ende.
Das Plasmid pSVtPA wurde durch Ligation des 4,4 kb-DNA- Fragments (Fig. 2B-a), des 125 bp-DNA-Fragments (Fig. 2B-b) und des 1860 bp-DNA-Fragments (Fig. 2B-c) wie folgt konstruiert:
150 ng des 4,4 bp-DNA-Fragments, 12 ng des 125 bp-DNA- Fragments und 200 ng des 1860 bp-DNA-Fragments wurden in 15 ul Ligationspuffer gelöst und durch Hinzufügen von 0,02 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und danach bei 15ºC für 1 Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde weiterhin bei 15ºC für 1 Stunde nach der Hinzugabe von 2 weiteren Einheiten der Ligase inkubiert und die Reaktion wurde dann durch Inkubation bei 65ºC über 5 Minuten und Abkühlen auf 0ºC vervollständigt.
Die ligierten cDNAs wurden in den E. coli-Stamm DH-1 (Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166:557) mittels des Calciumchloridverfahrens eingebracht (Mandel, M. und Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53:154). Transformanten wurden nach der Ampicillin-Resistenz selektiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden durch das Kolonie-Hybridisierungsverfahren gescreent (Grunstein, M. und Hogness, D.S., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci., 72:3961). Eine der für das Screening benutzten Proben war die HH-1 DNA, die mit [τ³²P]ATP (Amersham) und T4 Polynukleotidkinase markiert war (Probe 1). Das 470 bp-EcoRI- Fragment, das für die tPA-Gen-Sequenz codierte, wurde einer Nick-Translation mit [α³²P]CTP und einem Nick-Translations- Kit (BRL) unterzogen (Probe 2).
46 Transformanten wurden auf zwei Serien von Nitrozellulose-Filtern gezüchtet (#541; Whatman). Die die Transformanten beinhaltenden Filter wurden mit Alkali behandelt und danach neutralisiert, gewaschen und luftgetrocknet. Die Filter wurden bei 55ºC über 2 Stunden vorhybridisiert. Die für die Vorhybridisierung benutzte Lösung war 180 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6 mH EDTA, 0,9 M NaCl, 0,5% Nonidet-NP40 (NP-40; BRL), 5x Denhart's (Ficoll 1 g, Polyvinylpyrrolidon 1 g und BSA 1 g in 1000 ml Lösung), 100 ug/ml beschallte Lachsspermien-DNA.
Einer der Filter wurde mit der Probe 1 (1x10&sup7; cpm) in 10 ml frischer Hybridisierungslösung bei 30ºC über 2 Stunden hybridisiert. Ein anderer Filter wurde mit der Probe 2 (1x10&sup7; cpm) in 10 ml frischer Hybridisierungslösung bei 45ºC über 2 Stunden hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter dreimal bei 30ºC in 6xSSC (0,9 H NaCl, 0,09 M Na-Citrat) für 30 Minuten gewaschen, luftgetrocknet und dann auf Röntgenfilme (XAR-5, Kodak) mit Verstärkerfolien (intensifying screens) (Kodak) gelegt bei -70ºC über 12 Stunden. 42 Kolonien zeigten eine positive Reaktion mit beiden radioaktive Proben.
Plasmid DNA wurde mittels des Alkaliverfahrens (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Eds., Maniatis, T. et al., p90) aus einer der positiven Kolonien isoliert. Die Plasmid DNA wurde mit HindIII, BglII, ScaI, BamHI oder Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Enzyme verdaut und dann mit der Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Gelmuster der verdauten DNAs wurden mit den Gelmustern von pT-1 verglichen und der Vergleich zeigte, daß das analysierte Plasmid das gewünschte war (pVStPA, Fig. 2B).
DNA-Sequenzen zwischen HindIII und BglII und DNA- aufwärts der HindIII-Stelle wurden mit der chemischen Methode ermittelt (Maxam, A.M. and Gilbert, W., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:560). Die Sequenzdaten zeigten, daß das Plasmid pSVtPA korrekt konstruiert wurde. Figur 3 zeigt die DNA-Sequenzen zwischen PvuII und BglII des Plasmids pSVtPA. Eine SV40-frühe-TATA-Box-Sequenz ist in der Figur angezeigt.

1-C Konstruktion des Plasmids pHStPA

Das in Abschnitt 1-A erhaltene 200 bp-HindIII-Fragment enthält die hsp83-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen. Das HindIII-Fragment wurde in die HindIII-Stelle des Plasmids pSVtPA, das im Abschnitt 1-B erhalten wurde, eingesetzt, um das Plasmid pHStPA wie unten beschrieben zu konstruieren.
pSVtPA wurde mit HindIII verdaut und mit BAP behandelt. 100 ng der resultierenden linearen pSVtPA-DNA, deren 5'-Enden phosphoryliert waren, und 30 ng des 200 bp-HindIII-Fragments aus Abschnitt 1-A wurden in 19,5 Hul Ligationspuffer gelöst und durch Hinzufügen von 0,05 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und danach bei 15ºC über 3 Stunden inkubiert. Der E. coli- Stamm DH-1 wurde mit der ligierten DNA-Probe transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien wurden erhalten.
Plasmid DNAs wurden aus 6 Kolonien mittels des schnellen Verfahrens (Birnboim, H.G. und Doly, J., 1979, Nucl. Acids Res., 7:1513) isoliert, mit den Restriktionsnukleasen BglII und XbaI (BRL) verdaut und durch Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Gelmuster zeigte, daß 4 der Plasmide das 200 bp-HindIII-Fragment in der richtigen Orientierung enthielten. Die Plasmid DNA wurde durch das Alkaliverfahren aus einem der 4 Klone gereinigt. Die Plasmid DNA wurde mit HindIII, BglII, ScaI, BamHI oder einer Kombination von zwei oder mehreren dieser Enzyme verdaut und dann durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Gelmuster der verdauten DNAs zeigten, daß das analysierte Plasmid das gewünschte war (pHStPA, Figur 4).
Die DNA-Sequenz zwischen XbaI und BglII des erhaltenen Plasmids wurde durch das chemische Verfahren ermittelt und die Sequenzdaten zeigten, daß das Plasmid pHStPA korrekt konstruiert wurde. Figur 5 zeigt die DNA-Sequenzen des pHStPA DNA-Fragments, das zwei HindIII- und eine BdlII-Stellen beinhaltet. Die hsp83-Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen sind inder Figur angezeigt.

1-D Konstruktion des Plasmids pHStPA-tk

Ein 3,4 kb-BamHI-Fragment, das ein Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1)-tk-Gen (Wigler, M. et al., 1978, Cell, 14:725) enthält, wurde aus dem Plasmid ptk5 (Goodenow, R.S. et al., 1982, Science, 215:677) isoliert. Das 3,4 kb-BamHI-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Plasmids pHStPA (Abschnitt 1-C) eingesetzt, um das Plasmid pHStPA-tk wie unten beschrieben zu konstruieren.
Das Plasmid pHStPA wurde mit BamHI verdaut und mit BAP behandelt. 200 ng des resultierenden linearen pHStPA und 50 ng des 3,4 kb-BamHI-Fragments wurden in 19,5 ul Ligationspuffer gelöst und durch Hinzufügen von 0,05 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und danach bei 15ºC über 3 Stunden inkubiert. Der E. coli-Stamm DH-1 wurde mit der ligieren DNA-Probe transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien wurden erhalten. Plasmid DNAs wurden aus 7 Kolonien mittels des schnellen Verfahrens isoliert. Die DNAs wurden mit BamHI verdaut und mit dem Agarose-Gel analysiert. Das Gelmuster zeigte, daß 6 Plasmide das 3,4 kb-BamHI-Fragment enthielten. Diese Plasmide wurden als pHStPA-tk bezeichnet.
pHStPA-tk wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und SacI (NEB) verdaut. Die Orientierung der eingefügten DNA wurde unter Verwendung der verdauten DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Das Plasmid, das das tPA-Gen und das tk-Gen in der gleiche Richtung enthielten, wurde als Typ A bezeichnet. Ein anderes Plasmid, das die zwei Gene in der entgegengesetzten Richtung enthielt, wurde als Typ B bezeichnet. Das Plasmid vom Typ A (Figur 6) wurde mit dem Alkaliverfahren hergestellt.
Das 3,4 kb-BamHI-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Plasmids pSVtPA, das in Abschnitt 1-B erhalten wurde, eingefügt. Das resultierende Plasmid pSVtPA-tk (Typ A) wurde in den Kontrollexperimenten benutzt, die in den nachstehenden Expressionsexperimenten des Beispiels 2 beschrieben sind, weil dieses Plasmid den SV40-frühen-Promotor enthielt, der funktionell mit dem tPA-Strukturgen verbunden war.

Beispiel 2

(Transformation von Maus-L-Zellen mit pHStPA-tk und Regulator-Expression des tPA-Gens in der transformierten Zelle.)

Die in der Thymidinkinase (tk)-Aktivität defiziente Haus-L-Zellinie wurde präpariert und weiter gezüchtet wie von Kit et al. (Kit, S. et al., 1963, Expl. Cell Res., 31:297) beschrieben. Die Zellen wurden mit 1x10&sup6; Zellen pro 10 cm- Schale ausgesät und in RPMI-1640 (Flow Laboratories)-Medium, das mit 10% foetalen Kälberserum (FGS) ergänzt war, bei 37ºC in einer 5%-CO&sub2;-Atmosphäre über 16 Stunden inkubiert.
Die Zellen wurden mit pHStPA (Typ A) transfiziert (5 ug DNA pro Schale), das in Beispiel 1 durch das Calciumphosphat- Verfahren erhalten wurde (Graham, F.L. und Van der Eb, A.J., 1973, Virology, 52:456), und die Zellen wurden dann in MEM (Flow Laboratories)-Medium, das mit 10% FCS, 5 ug/ ml Hypoxanthin, 1 ug/ ml Aminopterin und 5 ug/ ml Thymidin ergänzt war (HAT-Medium), über 12 Tage kultiviert. Nahezu 100 tk-positive Kolonien wurde aus 10 Schalen nach der Kultivierung im HAT-Medium erhalten. 96 Kolonien wurden mittels Klonringen (cloning rings) isoliert und in Platten mit 24 Vertiefungen in HAT-Medium weiterkultiviert. Als die Zellen nahezu konfluent gewachsen waren, wurde das Medium abgesaugt und RPMI-1640-Medium ohne FCS (0% FCS) auf die Zellschicht hinzugegeben. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37ºC in 5% CO&sub2; wurde ein Aliquot (20 ul) von jedem Kulturmedium entnommen und den Messungen der Fibringerinnsel- Lyse-Aktivität (Rijken, D.G. et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta, 580:140) zugeführt. Keine Aktivität wurde in den 96 Proben gemessen, wenn diese bei normaler Temperatur (37ºC) kultiviert worden waren.
Dann wurde die Expression nach Hitzeschockinduktion ermittelt und Klone, die ein Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Enzym produzierten, wurden in den 96 Klonen gefunden. Alle diese Klone wurde in Platten mit 24 Vertiefungen weiterkultiviert. Als die Zellen nahezu konfluent gewachsen waren, wurde das HAT-Medium abgesaugt und das auf 43ºC vorgewärmte RPMI-1640 (0% FCS) wurde hinzugegeben. Die Zellen wurden bei 43ºC in Luft über 1 Stunde und dann bei 37ºC in 5% CO&sub2; über 24 Stunden inkubiert. Nach der 24-stündigen Inkubation wurde ein Aliquot (20 ul) des Kulturmediums der Fibrin-Gerinnsel-Lyse- Aktivitäts-Messung zugeführt. Die Messung ergab, daß 4 Klone ein bestimmtes Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Enzym sezernierten.
Eine anti-Urokinase unterdrückte diese Aktivität nicht, aber ein anti-humanes tPA tat dies. Die Ergebnisse zeigten, daß das Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Enzym humanes tPA war. Die Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Aktivität des sezernierten tPA wurde bestimmt durch Vergleich mit derjenigen der Urokinase. Einer der 4 Klone, der als #P48 bezeichnet wurde, produzierte tPA mit 5,2 Einheiten/ ml/ Tag. Die Zellen (#P48) wurden innerhalb von 2 Monaten mehrere Male umgesetzt, aber die Mengen des sezernierten tPA änderen sich während der Umsetzungen nicht.
In einem Kontrollexperiment wurden Maus-L-tk&supmin;-Zellen mit pSVtPA mit dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert und tk&spplus;-Transformanten wurden im HAT-Medium ausgewählt. 66 einzelne Kolonien wurden isoliert und die tPA-Produktion durch die Transformanten wurde wie oben beschrieben gemessen. 7 Klone zeigten eine wesentliche tPA-Produktion unter der Kontrolle des SV40-frühen-Promotors. Der am stärksten tPA- produzierende Klon wurde als #P6 bezeichnet und dieser Klon produzierte tPA mit 4,2 Einheiten/ ml/ Tag.
Da der Klon #P48 nur wenig mehr tPA (5,2 Einheiten/ ml/ Tag) als der Klon #P6 (4,2 Einheiten/ ml/ Tag) produzierte, wurde die Stärke des Drosophila-hsp83-Hitzeschock-Promotors als vergleichbar mit derjenigen des SV40-frühen-Promotors angesehen, der im allgemeinen für Expressionsexperimente in Säugerzellen verwendet wird.
Hitzeschock-Expression durch die Drosophila-hsp83- Hitzeschock-Regulator-Sequenzen wurde im weiteren durch Verwendung des Klons #P48 untersucht.
Die Menge der tPA-mRNA der #P48-Zellen wurde vor und nach Hitzeschockinduktion wie folgt gemessen.
Die #P48-Zellen wurden gezüchtet und der Hitzeschockbehandlung (43ºC, 1 Stunde) wie oben erwähnt unterzogen. Nach der Hitzeschockbehandlung wurden die Zellen bei 37ºC in 5% CO&sub2; für 1, 8 oder 24 Stunden inkubiert und dann geerntet. Zellen, die nicht mit 43ºC behandelt wurden, wurden ebenfalls geerntet und für Kontrollexperimente verwendet. Die Gesamt-RNAs wurden aus den geernteten Zellen mittels des Guanidinium-CsCL-Verfahrens (Glisin, V. et al., 1974, Biochemistry, 13:2622) gewonnen. 250-380 ug der Gesamt- RNAs wurden aus acht 10 cm-Schalen in jeder Präparation gewonnen.
Die Gesamt-RNAs wurden durch Formamid enthaltendes Agarosegel, wie berichtet wurde (Lehrach, H. et al., 1977, Biochemistry, 16:4743), fraktioniert, auf Nitrozellulosefilter (BA85, Schleicher und Schuell) mit der Southern-Methode (Southern, E.H., 1975, J. Mol. Biol., 98:503) übertragen und bei 80ºC über 3 Stunden in einem Vakuumofen gebacken. Zwei Serien von Filtern wurden präpariert und für Hybridisierungsexperimente verwendet.
Die Filter wurden in 50 ml der Vorhybridisierungslösung bei 42ºC über 4 Stunden vorhybridisiert und jeder Filter wurde mit zwei verschiedenen Proben bei 42ºC über 19 Stunden in 25 ml der Hybridisierungslösung, die 50% Formamid enthielt, hybridisiert. Eine der Proben war das nicktranslatierte 325 bp-PvuII-HindIII-Fragment (2,6x10&sup7; cpm), das den SV40-frühen-Promotor enthielt (siehe pHStPA in Fig. 4 und 6), und die andere war das 480 bp-EcoRI-Fragment (2,6x10&sup7; cpm), das die tPA-codierende Sequenz enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter dreimal bei 20ºC in 2xSSC über 30 Minuten und weiterhin dreimal bei 20ºC in 1xSSC über 30 Minuten gewaschen und dann luftgetrocknet. Die getrockneten Filter wurden auf Röntgenfilme mit einer Verstärkerfolie (intensifying screen) bei -70ºC über 12 Stunden gebracht.
Figur 7 zeigt die induzierbare Expression (mRNA-Stufe) von tPA in den #P48-Zellen. Das nick-translatierte 470 bp- EcoRI-Fragment hybridisierte stark mit der bestimmten Fraktion der Gesamt-RNAs, die von den hitzeschockbehandelten Zellen erhalten wurden. Die Nummern 1, 8 oder 24 zeigen die Inkubationsdauer nach dem Hitzeschockexperiment. Die Nummer 0 zeigt die Spur für die Gesamt-RNAs der Kontrollzellen, die nicht hitzebehandelt waren. Figur 7 zeigt, daß die tPA-mRNA, die vor der Hitzeschockbehandlung nicht gemessen werden kann, in großen Mengen 1 Stunde nach der Hitzeschockbehandlung synthetisiert wird. Die Mengen der tPA-mRNAs nehmen während der 37ºC-Znkubation ab.
In den #P48-Zellen könnte der SV40-frühe-Promotor (siehe pHStPA in Fig. 4 und 6) anstelle des hsp83-Hitzeschock- Promotors in Betracht gezogen werden, um die Transkription des tPA-Gens zu steuern, aber die folgenden Beobachtungen unterstützen diesen Gedanken nicht. Erstens zeigt die Spur 0 in Figur 7, daß die tPA-mRNA unter der Kontrolle des SV40- Promotors nicht wesentlich transkribiert wurde. Zweitens hybridisierte die nick-translatierte 325 bp-PvuII-HindIII- Probe nicht zu irgendeiner Fraktion der Gesamt-RNAs aus den #P48-Zellen.
Maus-L-tk&spplus;-Zellen wurden durch Transfektion von Maus-L- tk&supmin;-Zellen mit ptk5 erhalten und die Gesamt-RNAs der transformierten Zellen wurden für die gleichen Hybridisierungsexperimente wie oben benutzt. Die Experimente bestätigten das Fehlen von tPA-mRNA in den Maus-L-tk&spplus;-Zellen vor oder nach Hitzeschockinduktion.
Der zeitliche Verlauf der tPA-Anreicherung im Kulturmedium wurde untersucht. Dei #P48-Zellen wurden mit 43ºC über 1 Stunde behandelt und dann bei 37ºC in 5% CO&sub2; über 8, 16, 24 oder 48 Stunden kultiviert. Messungen der Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Aktivität zeigten, daß die maximale Aktivität nach der 16-stündigen Inkubation auftrat. Die Proteine in 20 ul des Kulturmediums, das vor oder nach Hitzeschockbehandlung gewonnen wurde, wurden durch eine 7,5%- SDS-Polyacrylamidgelelektrophoese (Laemmli, U.K., 1970, Nature, 227:680) getrennt und das (die) tPA-Molekül(e) wurden durch das Fibrin-Agar-Gel-Verfahren (Granelli-Piperno, A. und Reich, E., 1978, J. Exp. Med., 148:223) nachgewiesen. Das Molekulargewicht des tPA wurde mit ungefähr 70 kd berechnet, wie in Figur 8 gezeigt wird. Die Nummern 0, 8, 16, 24 oder 48 zeigen die Inkubationsdauer nach der Hitzeschoxkbehandlung. Die kleinere Bande (ungefähr 100 kd) in Fig. 8 wurde als der tPA-tPA-Hemmkomplex angesehen, wie von Levin (Levin, E.G., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:6804) beschrieben.
Während die Erfindung durch eine detaillierte Beschreibung von bestimmten spezifischen Ausführungsformen erklärt wurde, ist es selbstverständlich, daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen in ihnen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche, die Äquivalente solcher Ausführungsformen mit einschließen sollen, vorgenommen werden können.

Claims

1. Expressionsvektor, der zu einer induzierbaren Expression eines fremden Strukturgens fähig ist, das in genanntem Expressionsvektor in Säugetier-Wirtszellen vorhanden ist, der umfaßt;

a) eine oder mehrere Hitzeschock-Regulator-DNA- Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen eines annähernd 83 kd großen Heat Shock-Protein-(hsp83)-Gens aus Drosophila melanogaster oder aus modifizierten DNA-Sequenzen, die aus genannten Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen von besagtem hsp83-Gen durch Basensubstitution, -deletion, -insertion oder -austausch erhalten wurden, wobei die modifizierte DNA- Sequenz einen oder mehrere kleinere Unterschiede in der Nukleotidsequenz zu den genannten Hitzeschock-Regulator- Sequenzen aus besagtem hsp83-Gen aufweist und zumindest die Effizienz der Hitzeschock-Regulator-Expression, die von den Hitzeschock-Regulator-Sequenzen des hsp83-Gens gezeigt wird, behalten hat,

b) ein erwünschtes fremdes Strukturgen, das an eines oder mehrere der besagten Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen gebunden ist, um die Expression des besagten gewünschten fremden Strukturgens in Wirtszellen durch eine oder mehrere der besagten Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen zu kontrollieren und

c) ein oder mehrere DNA-Fragmente, die einen Terminator und ein Polyadenylierungssignal besitzen.

2. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, bei dem eine oder mehrere besagte Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen ausgewählt wird (werden) aus der Gruppe, bestehend aus einem DNA-Fragment von annähernd 190 Basenpaaren, das Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen des hsp83-Gens aus Drosophila melanogaster oder modifizierte DNA-Sequenzen beinhaltet, die aus besagten DNA-Fragmenten mit annähernd 190 Basenpaaren durch Basensubstitution, -deletion, -insertion oder -austausch erhalten wurden, wobei die modifizierte DNA-Sequenz einen oder mehrere kleinere Unterschiede in der Nukleotidsequnz zu den genannten DNA-Fragmenten mit annähernd 190 Basenpaaren aufweist und zumindest die Effizienz der Hitzeschock-Regulator-Expression, die von den DNA-Fragmenten mit annähernd 190 Basenpaaren gezeigt wird, behalten hat.

3. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, bei dem das gewünschte fremde Strukturgen seinen Ursprung in eukaryotischen Zellen hat, und zum Beispiel das humane Gewebs-Plasminogenaktivator (tPA)-Gen ist, das z. Bsp. in normalen menschlichen Zellen vorhanden ist.

4. Expressionsvektor gemäß Anspruch 3, in dem das tPA- Gen, das aus normalen menschlichen Zellen stammt, humane tPA cDNA ist.

5. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, der weiterhin einen prokaryotischen Replikationsstartpunkt für die Replikation des besagten Expressionsvektors in prokaryotischen Wirtszellen enthält.

6. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, der weiterhin einen oder mehrere Selektionsmarker enthält, um transformierte Zellen durch besagten Expressionsvektor zu selektionieren, wobei der Selektionsmarker zum Beispiel das Ampicillin-Resistenzgen oder das Thymidinkinasegen ist.

7. Expressionsvektor, wie in Anspruch 4 beansprucht, der das Plasmid pHStPA mit der Struktur ist, die in Figur 4 gezeigt wird, oder das Plasmid pHStPA-tk mit der Struktur ist, die in Figur 6 gezeigt wird.

8. Verfahren, um gewünschte Genprodukte herzustellen, das folgende Schritte umfaßt;

a) einen Expressionsvektor in Säugetier-Wirtszellen einzuführen, der aus einer oder mehreren Hitzeschock- Regulator-DNA-Sequenzen besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen aus dem annähernd 83 kd großen Hitzeschock-Protein-(hsp83)-Gen aus Drosophila melanogaster oder modifizierten DNA-Sequenzen, die von besagten Hitzeschock-Regulator-DNA-Sequenzen aus besagtem hsp83-Gen durch Basensubstitution, -dletion, -insertion oder austausch erhalten wurden, wobei die modifizierte DNA-Sequenz eine oder mehrere kleinere Unterschiede in der Nukleotidsequenz zu den besagten Hitzeschock-Regulator- Sequenzen aus besagtem hsp83-Gen besitzt und zumindest die Effizienz der Hitzeschock-Regulator-Expression, die von den Hitzeschock-Regulator-Sequenzen des hsp83-Gens gezeigt werden, behalten hat, eine gewünschte Fremdgenexpression, die durch eine oder mehrere der besagten Hitzeschock-Regulator- DNA-Sequenzen kontrolliert wird und ein oder mehrere DNA- Fragmente, die einen Terminator und ein Polyadenylierungssignal enthalten, um transformierte Zellen zu erhalten, die den eingeführten Expressionsvektor, der entweder in ein Chromosome integriert ist oder der außerhalb des Chromosoms repliziert, beibehalten,

b) die transformierten Zellen in Kultur zu halten und

c) die Expression des gewünschten fremden Strukturgens, das in den transformierten Zellen vorliegt, zu induzieren.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Wirtszellen eine Eigenschaft besitzen, durch die die transformierten Zellen von den Wirtszellen selektiert werden können, in die der Expressionsvektor eingeführt wurde;

und wobei die besagte Eigenschaft zum Beispiel die Defizienz des Thymidinkinasegens ist und der Expressionsvektor weiterhin das Thymidinkinasegen enthält.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, in der die Expressionsvektoren weiterhin das Thymidinkinasegen enthalten und die Wirtszellen Mäusezellstämme sind, denen das Thymidinkinasegen fehlt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem der Expressionsvektor das Plasmid pHStPA mit der Struktur ist, die in Figur 4 gezeigt wird, oder pHStPA-tk mit der Struktur ist, die in Figur 6 gezeigt wird.

12. (a) Eine Zelle, die durch einen Expressionsvektor aus Anspruch 1 transformiert ist; oder

(b) eine eukaryotische Zelle, die durch einen Expressionsvektor aus Anspruch 7 transformiert ist; oder

(c) eine tierische Zelle, die durch einen Expressionsvektor aus Anspruch 7 transformiert ist.

13. Verwendung der Zellen gemäß Anspruch 12 für die Herstellung eines Medikaments.