JP3456992B2 - 変異型ｄｈｆｒ遺伝子を使用した発現誘導方法 - Google Patents
変異型ｄｈｆｒ遺伝子を使用した発現誘導方法Info
- Publication number
- JP3456992B2 JP3456992B2 JP50134990A JP50134990A JP3456992B2 JP 3456992 B2 JP3456992 B2 JP 3456992B2 JP 50134990 A JP50134990 A JP 50134990A JP 50134990 A JP50134990 A JP 50134990A JP 3456992 B2 JP3456992 B2 JP 3456992B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mtx
- protein
- dhfr
- interest
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、タンパク質製造法、特にタンパク質製造を
増大する組み換え法に関する。
増大する組み換え法に関する。
真核細胞カルチャーは、真核細胞が多くのタンパク質
の活性に必要とされる転写後の修飾（たとえば、グリコ
シル化）をすることができるので、大きなそして複雑な
哺乳動物タンパク質を製造するために好ましい系であ
る。しかし、真核細胞系は通常、多くの原核細胞には可
能であるタンパク質発現レベルを表さない。それゆえ
に、異種タンパク質の高いレベルを発現する、操作させ
た真核細胞系を作成するための方法が開発されて来た。
の活性に必要とされる転写後の修飾（たとえば、グリコ
シル化）をすることができるので、大きなそして複雑な
哺乳動物タンパク質を製造するために好ましい系であ
る。しかし、真核細胞系は通常、多くの原核細胞には可
能であるタンパク質発現レベルを表さない。それゆえ
に、異種タンパク質の高いレベルを発現する、操作させ
た真核細胞系を作成するための方法が開発されて来た。
１つの既知の系では、マーカー遺伝子をコードする目
的DNAおよび目的タンパク質をコードする遺伝子のコピ
ー数を共増幅する細胞の能力を利用する。この系は、マ
ーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofol
ate reductase）（DHFR）遺伝子、およびDHFRの活性を
阻害する葉酸アナログとしてメトトレキセート（methot
rexate（MTX）（例えば、米国特許第4,656,134号および
米国特許第4,399,216号を参照）の利用を含む。
的DNAおよび目的タンパク質をコードする遺伝子のコピ
ー数を共増幅する細胞の能力を利用する。この系は、マ
ーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofol
ate reductase）（DHFR）遺伝子、およびDHFRの活性を
阻害する葉酸アナログとしてメトトレキセート（methot
rexate（MTX）（例えば、米国特許第4,656,134号および
米国特許第4,399,216号を参照）の利用を含む。
DHFRは、葉酸がテトラヒドロ葉酸へ転換する反応を触
媒する酵素であり、生体内の多くの生合成経路における
必須基質である。DHFRが欠損している細胞（DHFR
（−））は，生存および成長のためにその培地に代謝産
物の補給を必要とする。択一的に、DHFR遺伝子はDHFR
（−）宿主にトランスフェクトされることが可能であ
る。DHFRの野生型細胞は、MTXが極めて低濃度で存在し
ている中で培養されても死亡率は高い。MTXは、化学量
論的にDHFRに結合し、阻害することにより細胞を死に至
らしめる。しかしわずかな割合の細胞は、阻害剤の存在
下でも生存する（シムケ等;Schimke et al.（1978）Sci
ence 202:1051−1055）。これらの細胞は、増幅されたD
HFR遺伝子のコピー数を含有し、均等物が細胞内DHFRの
レベルで増加したすることが発見された。漸次的により
高濃度のMTXに繰り返し晒すことにより、初めは50nMのM
TXで死んだ１つの細胞カルチャーが 最終的に500mMのM
TXで生存できる。これらの細胞は、同様に上昇した細胞
内DHFRのレベルを伴い、高いコピー数の統合されたDHFR
遺伝子を含有するであろう（例えば数千コピー）。
媒する酵素であり、生体内の多くの生合成経路における
必須基質である。DHFRが欠損している細胞（DHFR
（−））は，生存および成長のためにその培地に代謝産
物の補給を必要とする。択一的に、DHFR遺伝子はDHFR
（−）宿主にトランスフェクトされることが可能であ
る。DHFRの野生型細胞は、MTXが極めて低濃度で存在し
ている中で培養されても死亡率は高い。MTXは、化学量
論的にDHFRに結合し、阻害することにより細胞を死に至
らしめる。しかしわずかな割合の細胞は、阻害剤の存在
下でも生存する（シムケ等;Schimke et al.（1978）Sci
ence 202:1051−1055）。これらの細胞は、増幅されたD
HFR遺伝子のコピー数を含有し、均等物が細胞内DHFRの
レベルで増加したすることが発見された。漸次的により
高濃度のMTXに繰り返し晒すことにより、初めは50nMのM
TXで死んだ１つの細胞カルチャーが 最終的に500mMのM
TXで生存できる。これらの細胞は、同様に上昇した細胞
内DHFRのレベルを伴い、高いコピー数の統合されたDHFR
遺伝子を含有するであろう（例えば数千コピー）。
発現ベクター内でのDHFR遺伝子の側面の領域も共トラ
ンスフェクションおよび共増幅されることが発見された
（カウフマン等;Kaufman et al.,（1985）Molec Cell B
iol.５:1750−1759）。この側面領域に目的タンパク質
ををコードする遺伝子を含む場合の共増幅も、細胞内レ
ベルで目的タンパク質のさらなる上昇をもたらすであろ
う（アルト:Alt et al.（1978）J.Biol.Chem.253:1357
−1370;米国特許第4,656,134号；および米国特許第4,39
9,216号）。
ンスフェクションおよび共増幅されることが発見された
（カウフマン等;Kaufman et al.,（1985）Molec Cell B
iol.５:1750−1759）。この側面領域に目的タンパク質
ををコードする遺伝子を含む場合の共増幅も、細胞内レ
ベルで目的タンパク質のさらなる上昇をもたらすであろ
う（アルト:Alt et al.（1978）J.Biol.Chem.253:1357
−1370;米国特許第4,656,134号；および米国特許第4,39
9,216号）。
一般的に遺伝子増幅は、耐性細胞を増大した薬剤濃度
中で段階的に選択してのみ達成できる。加えて遺伝子増
幅はまれな出来事である。通常は、生存細胞がコロニー
を形成し、２から５倍に増大したMTXの濃度に適応する
までは数週間かかる。細胞系が50nMから500mMのMTXの濃
度に適応することを含む完全な増幅過程には、数カ月を
要し、それは時間のかかる、退屈な工程である。
中で段階的に選択してのみ達成できる。加えて遺伝子増
幅はまれな出来事である。通常は、生存細胞がコロニー
を形成し、２から５倍に増大したMTXの濃度に適応する
までは数週間かかる。細胞系が50nMから500mMのMTXの濃
度に適応することを含む完全な増幅過程には、数カ月を
要し、それは時間のかかる、退屈な工程である。
加えて増幅遺伝子は、曖昧には維持されないであろ
う。一定の選択により維持された細胞内では、増幅DNA
配列または遺伝子に連続的な変化が進行しており、安定
または不安定に分類できる。不安定な増幅遺伝子は、し
ばしば小さく、double minute染色体と呼ばれる自己複
製染色体外因子である（カウフマン等;Kaufman et al.
（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）76:5669−567
3）。なぜならdouble minute染色体はセントロメアを欠
いているので、それらは有糸***の際に娘細胞に等しく
分離しない。それゆえに、選択をしないと細胞数は増幅
遺伝子の半分を失い、20細胞倍少ない（シムケ:Schimk
e,（1988）J.Biol.Chem.263:5989−5992）。安定な増幅
遺伝子は、しばしば均一染色領域（homogeneouly stain
ing region）と呼ばれる染色体領域を伴う（ヌンベルグ
等;Numberg et al.（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）75:5553−5556）。しかし、連続的な選択無しでは、
安定な統合されたの増幅配列でもさまざまに不安定であ
る。例えば安定な細胞系がMTXの非存在中で成長した
時、それらは増幅遺伝子を６から12カ月に渡って失う。
う。一定の選択により維持された細胞内では、増幅DNA
配列または遺伝子に連続的な変化が進行しており、安定
または不安定に分類できる。不安定な増幅遺伝子は、し
ばしば小さく、double minute染色体と呼ばれる自己複
製染色体外因子である（カウフマン等;Kaufman et al.
（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）76:5669−567
3）。なぜならdouble minute染色体はセントロメアを欠
いているので、それらは有糸***の際に娘細胞に等しく
分離しない。それゆえに、選択をしないと細胞数は増幅
遺伝子の半分を失い、20細胞倍少ない（シムケ:Schimk
e,（1988）J.Biol.Chem.263:5989−5992）。安定な増幅
遺伝子は、しばしば均一染色領域（homogeneouly stain
ing region）と呼ばれる染色体領域を伴う（ヌンベルグ
等;Numberg et al.（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）75:5553−5556）。しかし、連続的な選択無しでは、
安定な統合されたの増幅配列でもさまざまに不安定であ
る。例えば安定な細胞系がMTXの非存在中で成長した
時、それらは増幅遺伝子を６から12カ月に渡って失う。
本発明の目的は生物工学的に操作された培養細胞中で
目的タンパク質の発現を増大させる方法を提供すること
である。もう１つの目的は、時間経過にも失われず、遺
伝子増幅に関与しない哺乳動物細胞中におけるタンパク
質発現を増強させる方法を提供することである。さらに
増幅よりもより速く達成できる細胞培養におけるタンパ
ク質発現の誘導方法を提供することを目的とする（例え
ば数カ月のかわりに数週間）。
目的タンパク質の発現を増大させる方法を提供すること
である。もう１つの目的は、時間経過にも失われず、遺
伝子増幅に関与しない哺乳動物細胞中におけるタンパク
質発現を増強させる方法を提供することである。さらに
増幅よりもより速く達成できる細胞培養におけるタンパ
ク質発現の誘導方法を提供することを目的とする（例え
ば数カ月のかわりに数週間）。
発明の概要
本発明は、哺乳動物細胞内において増加した量の目的
タンパク質を製造する方法を提供する。該方法は、 （ａ） 多数のコピーの発現ベクターで細胞をトランス
フェクションし、前記ベクターの各々のコピーは、酵素
的に機能性のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードす
る発現可能な遺伝子および目的タンパク質をコードする
発現可能な遺伝子を含み、 （ｂ） 前記細胞をメトトレキセート（MTX）の存在下
で培養し、多数のクローンを生成させ、 （ｃ） DHFRおよび前記目的タンパク質を共発現する少
なくとも10コピーのDNAを含有するクローンを選択し、 （ｄ） 前記選択クローンを培養し、そして （ｅ） 培養した前記クローンを、約0.1から100μＭの
範囲で連続的に増加させた濃度のMTXで処理する、 ことからなり、 前記遺伝子によってコードされたDHFRは野生型DHFRと比
較して減少したMTX−結合親和性を有する変異タンパク
質であり、かつ前記細胞は野生型DHFR遺伝子を含有する
ことを特徴とする。
タンパク質を製造する方法を提供する。該方法は、 （ａ） 多数のコピーの発現ベクターで細胞をトランス
フェクションし、前記ベクターの各々のコピーは、酵素
的に機能性のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードす
る発現可能な遺伝子および目的タンパク質をコードする
発現可能な遺伝子を含み、 （ｂ） 前記細胞をメトトレキセート（MTX）の存在下
で培養し、多数のクローンを生成させ、 （ｃ） DHFRおよび前記目的タンパク質を共発現する少
なくとも10コピーのDNAを含有するクローンを選択し、 （ｄ） 前記選択クローンを培養し、そして （ｅ） 培養した前記クローンを、約0.1から100μＭの
範囲で連続的に増加させた濃度のMTXで処理する、 ことからなり、 前記遺伝子によってコードされたDHFRは野生型DHFRと比
較して減少したMTX−結合親和性を有する変異タンパク
質であり、かつ前記細胞は野生型DHFR遺伝子を含有する
ことを特徴とする。
本発明は、真核細胞中で目的タンパク質の生産の増大
方法を提供する。より詳細には、遺伝子増幅をせずに、
種々の遺伝子工学、トランスフェクション、培養および
誘導法を利用してタンパク質発現を増大する方法に関す
るものである。
方法を提供する。より詳細には、遺伝子増幅をせずに、
種々の遺伝子工学、トランスフェクション、培養および
誘導法を利用してタンパク質発現を増大する方法に関す
るものである。
ここで使用する“誘導”と言う用語は、実質的（約２
−または３−倍以上の）な遺伝子増幅なしに、転写の割
合、それに続いて翻訳の速度を増加させることを言う。
“DHFR変異タンパク質”と言う用語は、野生型DHFRの酵
素活性を有するが、メトトレキセートへの減少した（MT
X）−結合親和性を有するジヒドロ葉酸還元酵素の変異
体または構造類似体を言う。“目的のタンパク質”とい
う用語は、タンパク質またはそれらの断片であり、トラ
ンスフェクションされた野生型宿主細胞により発現さ
れ、後の使用のために収穫されたものを言う。
−または３−倍以上の）な遺伝子増幅なしに、転写の割
合、それに続いて翻訳の速度を増加させることを言う。
“DHFR変異タンパク質”と言う用語は、野生型DHFRの酵
素活性を有するが、メトトレキセートへの減少した（MT
X）−結合親和性を有するジヒドロ葉酸還元酵素の変異
体または構造類似体を言う。“目的のタンパク質”とい
う用語は、タンパク質またはそれらの断片であり、トラ
ンスフェクションされた野生型宿主細胞により発現さ
れ、後の使用のために収穫されたものを言う。
ミエローマ細胞を、目的プラスミドまたは発現ベクタ
ーと大変高いコピー数を含有するようにトランスフェク
ションすることができる。もしこれらのベクターが生物
工学的にDHFRの変異タンパク質をコードするマーカー遺
伝子を含有するようにした後、初期の高コピー数のクロ
ーンをMTXにさらすと、その結果マーカー遺伝子ととも
に共トランスフェクションされた大変高レベルの目的遺
伝子の発現が誘導されることが発見された。
ーと大変高いコピー数を含有するようにトランスフェク
ションすることができる。もしこれらのベクターが生物
工学的にDHFRの変異タンパク質をコードするマーカー遺
伝子を含有するようにした後、初期の高コピー数のクロ
ーンをMTXにさらすと、その結果マーカー遺伝子ととも
に共トランスフェクションされた大変高レベルの目的遺
伝子の発現が誘導されることが発見された。
さらに、これらの初期クローンは目的遺伝子の発現期
間である２〜３週間中に段階的に100から1000倍に増大
したMTX濃度に適応するが，それらのコピー数は数倍に
増大する。加えて、MTXの高濃度（例えば5mM）に適応す
る細胞は、低濃度のMTXまたはMTXを含まない培地中でさ
えも成長できる。このような培地では、成長速度および
生存率は実質的に向上するが、この反応は同時に発現レ
ベルの低下をもたらす。このような培地中で培養された
細胞集団は、MTXを培地に加え戻すことで本来の高レベ
ル発現に戻すことができる。
間である２〜３週間中に段階的に100から1000倍に増大
したMTX濃度に適応するが，それらのコピー数は数倍に
増大する。加えて、MTXの高濃度（例えば5mM）に適応す
る細胞は、低濃度のMTXまたはMTXを含まない培地中でさ
えも成長できる。このような培地では、成長速度および
生存率は実質的に向上するが、この反応は同時に発現レ
ベルの低下をもたらす。このような培地中で培養された
細胞集団は、MTXを培地に加え戻すことで本来の高レベ
ル発現に戻すことができる。
本発明は、これらの知見を利用して目的タンパク質の
増大量の生産に関する工程およびそのような物質を生産
するために誘導することのできるトランスフェクトマー
（transfectmas）を提供する。本発明によれば細胞は発
現ベクターの多数のコピーによってトランスフェクショ
ンされ、そのコピーの各々は酵素的に機能的なDHFRをコ
ードする発現可能な遺伝子及び目的タンパク質をコード
する発現可能な遺伝子の双方を含む。トランスフェクト
された細胞はMTX存在下で培養され、多数のクローンを
生産する。その後、DHFR及び目的タンパク質を共発現す
るトランスフェクションベクタの多くーのコピー数を含
有するクローンを選択する。このクローンはその後、MT
Xを少量または含まない培地中で大規模成長のために培
養される。細胞の所望容量および最適細胞密度の時にMT
Xで処理し、目的タンパク質およびDHFRをコードする遺
伝子の実質的な増幅なしに、転写の増大を誘導すること
により、目的タンパク質の発現を増強させる。
増大量の生産に関する工程およびそのような物質を生産
するために誘導することのできるトランスフェクトマー
（transfectmas）を提供する。本発明によれば細胞は発
現ベクターの多数のコピーによってトランスフェクショ
ンされ、そのコピーの各々は酵素的に機能的なDHFRをコ
ードする発現可能な遺伝子及び目的タンパク質をコード
する発現可能な遺伝子の双方を含む。トランスフェクト
された細胞はMTX存在下で培養され、多数のクローンを
生産する。その後、DHFR及び目的タンパク質を共発現す
るトランスフェクションベクタの多くーのコピー数を含
有するクローンを選択する。このクローンはその後、MT
Xを少量または含まない培地中で大規模成長のために培
養される。細胞の所望容量および最適細胞密度の時にMT
Xで処理し、目的タンパク質およびDHFRをコードする遺
伝子の実質的な増幅なしに、転写の増大を誘導すること
により、目的タンパク質の発現を増強させる。
好ましくは、このDHFRは、野生型DHFRに比較して減少
したMTX−結合親和力を有し、トランスフェクションさ
れる細胞は、ミエローマのような野生型DHFR遺伝子を含
有する、例えばSp2/0系の１つのようなネズミ起源の細
胞である。
したMTX−結合親和力を有し、トランスフェクションさ
れる細胞は、ミエローマのような野生型DHFR遺伝子を含
有する、例えばSp2/0系の１つのようなネズミ起源の細
胞である。
好ましいトランスフェクションの方法は、原形質また
はスフェロプラスト融合であり、これは統合された発現
ベクターの高コピー数を生じる。
はスフェロプラスト融合であり、これは統合された発現
ベクターの高コピー数を生じる。
本発明の実験に有用なベクターは、マーカー遺伝子及
び目的タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれを含有
する第一及び第二転写単位を有する。マーカー遺伝子
は、好ましくは野生型酵素活性を示し、しかし野生型DH
FRに比較して減少したMTX−結合親和性を示す（例え
ば、3T6−R400;シモンセンおよびレビンソン;Simonsen
and Levinson（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）80:2
495−2499）。この遺伝子は、例えば、SV40初期領域の
ような、転写制御下であろう。
び目的タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれを含有
する第一及び第二転写単位を有する。マーカー遺伝子
は、好ましくは野生型酵素活性を示し、しかし野生型DH
FRに比較して減少したMTX−結合親和性を示す（例え
ば、3T6−R400;シモンセンおよびレビンソン;Simonsen
and Levinson（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）80:2
495−2499）。この遺伝子は、例えば、SV40初期領域の
ような、転写制御下であろう。
第二転写単位上の遺伝子にコードされる目的タンパク
質は、真核細胞中で発現可能な任意のタンパク質であ
る。このようなタンパク質は、条件または欠損を訂正す
るのに有効であり、ペプチドホルモン、インターロイキ
ン、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA），プロー
ウロキナーゼ（pro−UK），ヒトまたはネズミ免疫グロ
ブリンの重鎖または軽鎖、マウス−ヒトキメラ免疫グロ
ブリン、またはそれらの活性構造類似体、誘導体、断片
または融合生成物である。第二転写単位はまた、好まし
くは免疫グロブリンの重鎖由来（ギリス等;Gillis et a
l.（1983）Cell 33:717−728;米国特許第4,663,281号）
のエンハンサー要素およびプロモーターを含みうる。第
二転写単位に有用なプロモーターは、メタロチオネイン
プロモーター、カッパー軽鎖プロモーターまたはSV−40
プロモーターのような強いプロモーターである。プロモ
ーターは、単位時間あたりに開始されるmRNAの数に依存
して強いまたは弱いといわれる。
質は、真核細胞中で発現可能な任意のタンパク質であ
る。このようなタンパク質は、条件または欠損を訂正す
るのに有効であり、ペプチドホルモン、インターロイキ
ン、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA），プロー
ウロキナーゼ（pro−UK），ヒトまたはネズミ免疫グロ
ブリンの重鎖または軽鎖、マウス−ヒトキメラ免疫グロ
ブリン、またはそれらの活性構造類似体、誘導体、断片
または融合生成物である。第二転写単位はまた、好まし
くは免疫グロブリンの重鎖由来（ギリス等;Gillis et a
l.（1983）Cell 33:717−728;米国特許第4,663,281号）
のエンハンサー要素およびプロモーターを含みうる。第
二転写単位に有用なプロモーターは、メタロチオネイン
プロモーター、カッパー軽鎖プロモーターまたはSV−40
プロモーターのような強いプロモーターである。プロモ
ーターは、単位時間あたりに開始されるmRNAの数に依存
して強いまたは弱いといわれる。
DHFR遺伝子および目的タンパク質遺伝子を含むこの２
つの転写単位は、ブロッキング要素として提供される１
片のDNAによって分離される（ギリス等;Gillis et al.
出願中の米国特許出願第837,595号、1986年３月７日
付）、すなわちDHFR変異タンパク質転写単位のエンハン
サーの活性をブロックする効果を持つプロモーターであ
る。ｇ軽鎖プロモーターがこの目的に特に有用である。
つの転写単位は、ブロッキング要素として提供される１
片のDNAによって分離される（ギリス等;Gillis et al.
出願中の米国特許出願第837,595号、1986年３月７日
付）、すなわちDHFR変異タンパク質転写単位のエンハン
サーの活性をブロックする効果を持つプロモーターであ
る。ｇ軽鎖プロモーターがこの目的に特に有用である。
本発明の好ましい観点においては、選択されたクロー
ンをMTXの濃度を連続的に、例えば約0.1から100mMの範
囲で増加させて処理する。しかし細胞***10周期以下に
おいて目的タンパク質の発現を約４から８倍に増強させ
るものであればどのような濃度範囲のMTXであっても有
効である。
ンをMTXの濃度を連続的に、例えば約0.1から100mMの範
囲で増加させて処理する。しかし細胞***10周期以下に
おいて目的タンパク質の発現を約４から８倍に増強させ
るものであればどのような濃度範囲のMTXであっても有
効である。
図面の簡単な説明
本発明自体に加えて、本発明のすでに述べた、および
その他の目的、様々な特徴は、以下の説明および図面を
同時に読むことによりより完全に理解されるであろう。
その他の目的、様々な特徴は、以下の説明および図面を
同時に読むことによりより完全に理解されるであろう。
第１図は、本発明の方法の図解的に表したものであ
り； 第２図は、トランスフェクションのために使用する、
ネズミSp2/0 ハイブリドーマ細胞のベクター構築を図
式的に表したものであり；目的cDNAはベクターのXho I
部位に挿入されており； 第３図は、3T6−R400変異タンパク質DHFRの塩基配列
および対応するアミノ酸配列、本発明の使用に好ましい
変異タンパク質を図式的に表したものであり； 第４図は、ウロキナーゼcDNAをプローブとしたサザン
ブロッティングのオートラジオグラムの写真を表し； 第５図は、DHFR cDNAをプローブとしたサザンブロッ
ティングのオートラジオグラムの写真を表し； 第６図は、tPAのコード領域Glu254からIle317に対応
する合成２本鎖DNAをプローブとしたサザンブロッティ
ングのオートラジオグラムの写真を表し； 第７図は、カッパー軽鎖遺伝子のオリゴラベルした1K
b断片をプローブとして使用したノーザンブロッティン
グのオートラジオグラムの写真を表し；そして 第８図は、オリゴラベルしたDHFR cDNAをプローブと
して使用したノーザンブロッティングのオートラジオグ
ラムの写真を表したものである。
り； 第２図は、トランスフェクションのために使用する、
ネズミSp2/0 ハイブリドーマ細胞のベクター構築を図
式的に表したものであり；目的cDNAはベクターのXho I
部位に挿入されており； 第３図は、3T6−R400変異タンパク質DHFRの塩基配列
および対応するアミノ酸配列、本発明の使用に好ましい
変異タンパク質を図式的に表したものであり； 第４図は、ウロキナーゼcDNAをプローブとしたサザン
ブロッティングのオートラジオグラムの写真を表し； 第５図は、DHFR cDNAをプローブとしたサザンブロッ
ティングのオートラジオグラムの写真を表し； 第６図は、tPAのコード領域Glu254からIle317に対応
する合成２本鎖DNAをプローブとしたサザンブロッティ
ングのオートラジオグラムの写真を表し； 第７図は、カッパー軽鎖遺伝子のオリゴラベルした1K
b断片をプローブとして使用したノーザンブロッティン
グのオートラジオグラムの写真を表し；そして 第８図は、オリゴラベルしたDHFR cDNAをプローブと
して使用したノーザンブロッティングのオートラジオグ
ラムの写真を表したものである。
発明の詳細な説明
本発明は、安定で有糸***的に可能な真核細胞カルチ
ャー内で実質的に遺伝子の増幅無く、高レベルの遺伝子
発現を誘導する方法に関するものである。変異DHFR遺伝
子および目的タンパク質をコードする遺伝子からなるベ
クターの多くのコピーによってトランスフェクションさ
れた細胞から培養された初期クローンは、100nM MTXの
存在下で選択されれば、目的タンパク質を高レベルで生
産し（１−5mg/106細胞／日）、そのようなクローン
は、100から1000倍に増加したMTX濃度に素早く適応（数
週間）し、その間、目的遺伝子の発現は数倍に増加する
ことがわかった。
ャー内で実質的に遺伝子の増幅無く、高レベルの遺伝子
発現を誘導する方法に関するものである。変異DHFR遺伝
子および目的タンパク質をコードする遺伝子からなるベ
クターの多くのコピーによってトランスフェクションさ
れた細胞から培養された初期クローンは、100nM MTXの
存在下で選択されれば、目的タンパク質を高レベルで生
産し（１−5mg/106細胞／日）、そのようなクローン
は、100から1000倍に増加したMTX濃度に素早く適応（数
週間）し、その間、目的遺伝子の発現は数倍に増加する
ことがわかった。
さらに、高濃度MTX（例えば5mM）に適応する細胞は、
低濃度MTXまたはMTXが存在しない培地でも成長できる。
そのような培地中では成長速度および生存率は実質的に
向上するが、この反応は発現レベルの低下を伴う。この
培地からの細胞集団は、MTXをその培地に加え戻すこと
で本来の高レベル発現を再び誘導できる。
低濃度MTXまたはMTXが存在しない培地でも成長できる。
そのような培地中では成長速度および生存率は実質的に
向上するが、この反応は発現レベルの低下を伴う。この
培地からの細胞集団は、MTXをその培地に加え戻すこと
で本来の高レベル発現を再び誘導できる。
これまでの知見は、従来の組み換えDNA技術を使用し
て所望する任意のタンパク質の優れた発見レベルを有す
る形質転換体のカルチャーを生産するために利用できる
であろう。第１図に描いた様に、この工程は既知の方法
を使用して、２つの転写単位をコードするタイプの発現
ベクターの製造を含む。
て所望する任意のタンパク質の優れた発見レベルを有す
る形質転換体のカルチャーを生産するために利用できる
であろう。第１図に描いた様に、この工程は既知の方法
を使用して、２つの転写単位をコードするタイプの発現
ベクターの製造を含む。
“マーカー”遺伝子転写単位は、少なくとも１つのプロ
モーターおよびDHFR遺伝子をコードする遺伝子から成
り、このDHFR遺伝子は、野生型DHFRの酵素活性特性およ
び減少したMTXへの結合を有する。他の転写単位は、目
的タンパク質をコードし、これは意図する宿主細胞によ
って任意のタンパク質を発現可能である。このベクター
は次に動物細胞宿主中にトランスフェクションされる。
優れた結果は、ネズミノエローマ細胞を宿主として使用
したときに達成されるが、任意の連続動物細胞も使用さ
れ得る（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）。
トランスフェクションは、宿主の個々の細胞に統合され
たベクターの数多くのコピーが生じる条件で行われる。
最後に既知の原形質またはセファロプラスト融合技術が
好ましい。
モーターおよびDHFR遺伝子をコードする遺伝子から成
り、このDHFR遺伝子は、野生型DHFRの酵素活性特性およ
び減少したMTXへの結合を有する。他の転写単位は、目
的タンパク質をコードし、これは意図する宿主細胞によ
って任意のタンパク質を発現可能である。このベクター
は次に動物細胞宿主中にトランスフェクションされる。
優れた結果は、ネズミノエローマ細胞を宿主として使用
したときに達成されるが、任意の連続動物細胞も使用さ
れ得る（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）。
トランスフェクションは、宿主の個々の細胞に統合され
たベクターの数多くのコピーが生じる条件で行われる。
最後に既知の原形質またはセファロプラスト融合技術が
好ましい。
次に、細胞をMTX存在下で培養し、高レベルの目的タ
ンパク質を発現しているクローンをスクリーニングす
る。選択したクローンを、タンパク質生産に適した密度
にまで培養する。所望すればこれらの細胞は再びMTXに
晒され、目的タンパク質の発現は繰り返し誘導され得
る。
ンパク質を発現しているクローンをスクリーニングす
る。選択したクローンを、タンパク質生産に適した密度
にまで培養する。所望すればこれらの細胞は再びMTXに
晒され、目的タンパク質の発現は繰り返し誘導され得
る。
上述の手順の特別な態様の詳細および本発明の最適な
実施態様の開示は、以下に示される。
実施態様の開示は、以下に示される。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに理
解されるであろう。
解されるであろう。
実施例1.tPAおよびUKをコードする完全鎖長cDNAの単離
TPA−poly［A+］mRNAおよびUK−poly［A+］mRNAはそ
れぞれ、ボウズ（Bowes）ミエローマ細胞系および上皮
細胞系A431から確立された方法により単離される（例え
ば、マニアチス等：モレキュラークローニング、アクロ
ーニングマニュアル;Maniatis et al.,（1982）Molecul
ar Cloning,A Cloning Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,pp.197−198参照）。２本鎖cDNAの合成は、ギ
ブラーおよびホフマン（Gubler and Hoffman）（1983）
Gene 25:263−269,により本質的に達成され、この文献
は参照のためここに編入される。リンカーのライゲーシ
ョンに続いてcDNAは、ggt 10中にクローンされる。この
ファージライブラリーは、その後オリゴヌクレオチドプ
ローブでスクリーンされる。シークエンシングによって
決定された完全鎖長cDNAが発現ベクターのXho I部位に
クローンされる。
れぞれ、ボウズ（Bowes）ミエローマ細胞系および上皮
細胞系A431から確立された方法により単離される（例え
ば、マニアチス等：モレキュラークローニング、アクロ
ーニングマニュアル;Maniatis et al.,（1982）Molecul
ar Cloning,A Cloning Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,pp.197−198参照）。２本鎖cDNAの合成は、ギ
ブラーおよびホフマン（Gubler and Hoffman）（1983）
Gene 25:263−269,により本質的に達成され、この文献
は参照のためここに編入される。リンカーのライゲーシ
ョンに続いてcDNAは、ggt 10中にクローンされる。この
ファージライブラリーは、その後オリゴヌクレオチドプ
ローブでスクリーンされる。シークエンシングによって
決定された完全鎖長cDNAが発現ベクターのXho I部位に
クローンされる。
2.発現ベクターの構築
発現ベクターpDEMp1.0（第２図）は発現ベクターpDEM
p1.0由来である。pEMp1.0の構築は、本質的にギリスの1
987年６月25日付け出願中の特許出願第066,727号に掲載
ように達成され、これは参照により編入される。キサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XG
TPRT）遺伝子は、pDEMP1.0中のマーカー遺伝子としてDH
FR cDNAに置き換えられる。このDHFRマーカー遺伝子
は、MTXに対する減少した結合親和性を持つ改変マウスD
HFRをコードする。この完全なDNA配列（および対応する
アミノ酸配列）を第３図に示す。マウスDHFR cDNAの−
９の位置にあるFnu4H1部位は、リンカーライゲーション
を通してHind III部位に転換される。このHind III部位
は、SV−40エンハンサーおよびプロモーターの制御下に
DHFR遺伝子を配置するために使用される（第２図）。SV
−40初期領域のポリアデニレーションシグナルが使用さ
れる。これは、SV−40のBcl I−Bam H1制限断片をDHFR
cDNAの3'非翻訳部位にあるBgl II部位に連結して達成さ
れる。BamH I部位は、代わりにEcoR I部位にリンカーラ
イゲーションを通じて転換される。このpDEMp1.0ベクタ
ーは、pEMp1.0のHind III−Pst Iベクター断片、pBR322
のPst1−EcoR I断片（アンピシリン耐性遺伝子の部分を
含む）、およびHind III−EcoR I断片（DHFR cDNAおよ
び初期SV−40ポリアデニレーションシグナルを含む）を
含む。
p1.0由来である。pEMp1.0の構築は、本質的にギリスの1
987年６月25日付け出願中の特許出願第066,727号に掲載
ように達成され、これは参照により編入される。キサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XG
TPRT）遺伝子は、pDEMP1.0中のマーカー遺伝子としてDH
FR cDNAに置き換えられる。このDHFRマーカー遺伝子
は、MTXに対する減少した結合親和性を持つ改変マウスD
HFRをコードする。この完全なDNA配列（および対応する
アミノ酸配列）を第３図に示す。マウスDHFR cDNAの−
９の位置にあるFnu4H1部位は、リンカーライゲーション
を通してHind III部位に転換される。このHind III部位
は、SV−40エンハンサーおよびプロモーターの制御下に
DHFR遺伝子を配置するために使用される（第２図）。SV
−40初期領域のポリアデニレーションシグナルが使用さ
れる。これは、SV−40のBcl I−Bam H1制限断片をDHFR
cDNAの3'非翻訳部位にあるBgl II部位に連結して達成さ
れる。BamH I部位は、代わりにEcoR I部位にリンカーラ
イゲーションを通じて転換される。このpDEMp1.0ベクタ
ーは、pEMp1.0のHind III−Pst Iベクター断片、pBR322
のPst1−EcoR I断片（アンピシリン耐性遺伝子の部分を
含む）、およびHind III−EcoR I断片（DHFR cDNAおよ
び初期SV−40ポリアデニレーションシグナルを含む）を
含む。
発現ベクターpDEKp1.0は合成カッパープロモーターを
含有し、これはpDEMp1.0中のメタロチオネインプロモー
ターと交換する。合成カッパープロモーターは、Afl II
−Xho I断片として、免疫グロブリン遺伝子のカッパー
プロモーターの両鎖をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドを連結することにより構築される。
含有し、これはpDEMp1.0中のメタロチオネインプロモー
ターと交換する。合成カッパープロモーターは、Afl II
−Xho I断片として、免疫グロブリン遺伝子のカッパー
プロモーターの両鎖をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドを連結することにより構築される。
目的遺伝子は、発現ベクターのXho I部位にクローン
される。転写単位は、免疫グロブリンの重鎖エンハンサ
ー、メタロチオネイン／カッパープロモーターおよび免
疫グロブリンのカッパー鎖のポリアデニレーションシグ
ナルから成る。目的遺伝子の転写方向は、DHFRマーカー
遺伝子の方向とは反対であり、２つの転写単位は、ｇプ
ロモーターによってブロッキング要素として分離されて
いる。このブロッキング要素に関してさらに詳細には、
ここに参照として編入される出願中の1987年６月25日付
特許出願第066,727号を参照にされたい。
される。転写単位は、免疫グロブリンの重鎖エンハンサ
ー、メタロチオネイン／カッパープロモーターおよび免
疫グロブリンのカッパー鎖のポリアデニレーションシグ
ナルから成る。目的遺伝子の転写方向は、DHFRマーカー
遺伝子の方向とは反対であり、２つの転写単位は、ｇプ
ロモーターによってブロッキング要素として分離されて
いる。このブロッキング要素に関してさらに詳細には、
ここに参照として編入される出願中の1987年６月25日付
特許出願第066,727号を参照にされたい。
3.DNA転写および細胞培養
ネズミハイブリドーマ系Sp2/0を、10％ウシ胎児血清
（FCS）を含有するダルベッコの改良イーグル培地中で
成長させる。プラスミドを、プロトプラストを作成する
ために使用するE.Coli C600R-中で増殖させる。Sp2/0細
胞を、ギリス等（Gillis et al.（1983）Cell 33:717−
728）によって述べられたようなサンドリーゴルディン
（Sandri−Goldein:（1983）Mol.Cell Biol.１:743−75
2）のプロトプラスト融合法の改良法によってトランス
フェクションする。トランスフェクションの後、細胞を
104細胞／ウェルで96−ウェルのマイクロタイタープレ
ートに撒く。選択培地（100nM MTX含有）を24時間後に
加える。細胞に選択培地を３日の間隔で２回以上与え
る。トランスフェクションの10−14日後にコロニーが現
れる。それらは、ELISAまたはアッセイにより96−ウェ
ル上でスクリーンされ、増殖したクローンが選択され
る。
（FCS）を含有するダルベッコの改良イーグル培地中で
成長させる。プラスミドを、プロトプラストを作成する
ために使用するE.Coli C600R-中で増殖させる。Sp2/0細
胞を、ギリス等（Gillis et al.（1983）Cell 33:717−
728）によって述べられたようなサンドリーゴルディン
（Sandri−Goldein:（1983）Mol.Cell Biol.１:743−75
2）のプロトプラスト融合法の改良法によってトランス
フェクションする。トランスフェクションの後、細胞を
104細胞／ウェルで96−ウェルのマイクロタイタープレ
ートに撒く。選択培地（100nM MTX含有）を24時間後に
加える。細胞に選択培地を３日の間隔で２回以上与え
る。トランスフェクションの10−14日後にコロニーが現
れる。それらは、ELISAまたはアッセイにより96−ウェ
ル上でスクリーンされ、増殖したクローンが選択され
る。
3.タンパク質アッセイ
（ａ）ELISA:
10％FCSを含有する上清を96−ウェルから採取し、こ
こに参照として編入される出願中の1987年６月25日付特
許出願第066,727号に記載されているtPA ELISAによって
直接アッセイする。
こに参照として編入される出願中の1987年６月25日付特
許出願第066,727号に記載されているtPA ELISAによって
直接アッセイする。
（ｂ）活性測定
活性測定用に試料を収穫するために、106細胞を１％
のウシ胎児血清を含有する1mLの培地中、24−ウェルプ
レート内でインキュベートする。24時間後、培地を活性
測定のために採取する。活性はIu/106細胞／日（Iu/m
L）で表す。
のウシ胎児血清を含有する1mLの培地中、24−ウェルプ
レート内でインキュベートする。24時間後、培地を活性
測定のために採取する。活性はIu/106細胞／日（Iu/m
L）で表す。
tPA活性を、ここで参照として編入する出願中の関連
米国特許出願第151,707号に記載された間接アッセイで
監視（monitore）する。この過程中で、フィブリンの存
在下でtPAによりプラスミノーゲンはプラスミンに触媒
的に転換される。プラスミンによる染色体遺伝子基質S2
251（ヘレナ ラボ、ビューモント テキサス;Helena L
abs Beaumont Texas）の開裂を測定する。
米国特許出願第151,707号に記載された間接アッセイで
監視（monitore）する。この過程中で、フィブリンの存
在下でtPAによりプラスミノーゲンはプラスミンに触媒
的に転換される。プラスミンによる染色体遺伝子基質S2
251（ヘレナ ラボ、ビューモント テキサス;Helena L
abs Beaumont Texas）の開裂を測定する。
UK活性を、ここで参照として編入する出願中の関連米
国特許出願第205,437号に記載された直接Ｓ−2444アッ
セイで活性測定する。このアッセイで、プラスミンによ
りプロ−UKは定量的にUKに転換される。UKのアミドリテ
ィック（amidolytic）活性を染色体遺伝子基質Ｓ−2444
（ヘレナ＃5281:Helena）の開裂により間接的に監視（m
onitore）する。精製UK（カルビオケム．＃672081:Calb
iochem）を標準として使用する。
国特許出願第205,437号に記載された直接Ｓ−2444アッ
セイで活性測定する。このアッセイで、プラスミンによ
りプロ−UKは定量的にUKに転換される。UKのアミドリテ
ィック（amidolytic）活性を染色体遺伝子基質Ｓ−2444
（ヘレナ＃5281:Helena）の開裂により間接的に監視（m
onitore）する。精製UK（カルビオケム．＃672081:Calb
iochem）を標準として使用する。
5.ゲノムDNA分析
高分子量DNAをマニアチス等（Maniatis et al.同上、
pp280−281）に記載されたように調製する。5mgのDNAを
各々の制限酵素で完全に消化し、TANバッファー（50mM
Tris、20mM酢酸ナトリウム、2mM Na2EDTA、pH8.2）中
で、１％アガロースゲル電気泳動を行う。サザンブロッ
トトランスファーをサザン（Southern:（1975）J.Mol.B
iol.98:503）に記載されたように行う。第４図に示され
たそれぞれのクローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電
気泳動、ブロッティングし、その後UK cDNAを含むオリ
ゴラベルしたXho I断片とハイブリダイズした。第５図
に示されたそれぞれのクローンからのDNAを、EcoR Iお
よびSal Iで消化し、電気泳動、ブロッティングし、そ
の後DHFR cDNAを含むオリゴラベルしたEcoR I−Sal I断
片とハイブリダイズした。第６図に示されたそれぞれの
クローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電気泳動、ブロ
ッティングし、その後オリゴラベルした合成２本鎖のtP
A cDNAとハイブリダイズした。親のSp2/0ミエローマ由
来のDNAを対照として使用する。それぞれのサザンブロ
ッティングにおいて、消化したプラスミドDNAを、20,5
0,100および200コピー相当量泳動し、コピー数マーカー
とした。分子量標準は、キロベース（Kb）で示す。
pp280−281）に記載されたように調製する。5mgのDNAを
各々の制限酵素で完全に消化し、TANバッファー（50mM
Tris、20mM酢酸ナトリウム、2mM Na2EDTA、pH8.2）中
で、１％アガロースゲル電気泳動を行う。サザンブロッ
トトランスファーをサザン（Southern:（1975）J.Mol.B
iol.98:503）に記載されたように行う。第４図に示され
たそれぞれのクローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電
気泳動、ブロッティングし、その後UK cDNAを含むオリ
ゴラベルしたXho I断片とハイブリダイズした。第５図
に示されたそれぞれのクローンからのDNAを、EcoR Iお
よびSal Iで消化し、電気泳動、ブロッティングし、そ
の後DHFR cDNAを含むオリゴラベルしたEcoR I−Sal I断
片とハイブリダイズした。第６図に示されたそれぞれの
クローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電気泳動、ブロ
ッティングし、その後オリゴラベルした合成２本鎖のtP
A cDNAとハイブリダイズした。親のSp2/0ミエローマ由
来のDNAを対照として使用する。それぞれのサザンブロ
ッティングにおいて、消化したプラスミドDNAを、20,5
0,100および200コピー相当量泳動し、コピー数マーカー
とした。分子量標準は、キロベース（Kb）で示す。
6.RNA分析
細胞内および核内RNAを、ギリス等（Gillis et al:19
88提出）によって記載されたように調製する。RNAをホ
ルムアミドで変性し、ホルムアルデヒドバッファー中で
1.2％アガロースゲル電気泳動、ニトロセルロース膜へ
のトランスファー、（トーマス（Tomas）（1980）Proc.
Natil.Acad.Sci.77:5201）を行う。第７および８図にお
いて、約0.5mgのRNAをノーザンブロッティングの１レー
ン当たりに添加する。示したように核内RNAを含む２つ
のレーンを除き、残りのレーンすべては、細胞性RNAで
ある。第７図において、各々のレーンに添加した細胞性
RNAの量は、同量のカッパーメッセージ（message）（太
矢印）を含有するように標準化されており、これは親Sp
2/0が作る。UKメッセージ（細矢印）およびtPAメッセー
ジ（破線矢印）は両方ともカッパー軽鎖の3'−非翻訳領
域を含有しており、故にプローブとハイブリダイズす
る。このプローブは、3'−非翻訳領域を含有するオリゴ
ラベルされたカッパー軽鎖の1Kb断片である。第８図に
おいては、ノーザンブロッティングをオリゴラベルした
DHFR cDNAでプローブする。
88提出）によって記載されたように調製する。RNAをホ
ルムアミドで変性し、ホルムアルデヒドバッファー中で
1.2％アガロースゲル電気泳動、ニトロセルロース膜へ
のトランスファー、（トーマス（Tomas）（1980）Proc.
Natil.Acad.Sci.77:5201）を行う。第７および８図にお
いて、約0.5mgのRNAをノーザンブロッティングの１レー
ン当たりに添加する。示したように核内RNAを含む２つ
のレーンを除き、残りのレーンすべては、細胞性RNAで
ある。第７図において、各々のレーンに添加した細胞性
RNAの量は、同量のカッパーメッセージ（message）（太
矢印）を含有するように標準化されており、これは親Sp
2/0が作る。UKメッセージ（細矢印）およびtPAメッセー
ジ（破線矢印）は両方ともカッパー軽鎖の3'−非翻訳領
域を含有しており、故にプローブとハイブリダイズす
る。このプローブは、3'−非翻訳領域を含有するオリゴ
ラベルされたカッパー軽鎖の1Kb断片である。第８図に
おいては、ノーザンブロッティングをオリゴラベルした
DHFR cDNAでプローブする。
サブクローニングにおいて、メトトレキセート−無し
（MF）のサブクローンのRNA（および第４−６図のDNA）
をサブクローンがコロニーを確立した後６−７週間後に
調製した。RNAを調製した時の、SDU 4.1−5MFの活性は
それぞれ、MTX−無しの培地において100Iu/mL、5mM MTX
では2300Iu/mL、SDTK 5.16MFの活性はそれぞれ、MTX−
無しの培地において450Iu/mL、10mM MTXで6000Iu/mLで
あった。
（MF）のサブクローンのRNA（および第４−６図のDNA）
をサブクローンがコロニーを確立した後６−７週間後に
調製した。RNAを調製した時の、SDU 4.1−5MFの活性は
それぞれ、MTX−無しの培地において100Iu/mL、5mM MTX
では2300Iu/mL、SDTK 5.16MFの活性はそれぞれ、MTX−
無しの培地において450Iu/mL、10mM MTXで6000Iu/mLで
あった。
7.pDEMp1.0を使用した遺伝子伝達
Sp2/0細胞への原形質融合による伝達効率を、発現ベ
クターpDEMp1.0−tPAを使用して研究する。選択に100nM
MTXを使用する時、トランスフェクション頻度は、約１
−２×10-5細胞：コロニー中のtPA生産細胞系の割合は9
0％に近かった。マイクロタイター中のクローンの上清
は、200−900Iu/mLの活性を有する。同様な結果がpDEMp
1.0−UKで得られる。表１（下記）は、pDEMp1.0−tPAお
よび1.0−UKベクターを使用した原形質融合由来クロー
ンの第１組の初期発現レベルを表す。
クターpDEMp1.0−tPAを使用して研究する。選択に100nM
MTXを使用する時、トランスフェクション頻度は、約１
−２×10-5細胞：コロニー中のtPA生産細胞系の割合は9
0％に近かった。マイクロタイター中のクローンの上清
は、200−900Iu/mLの活性を有する。同様な結果がpDEMp
1.0−UKで得られる。表１（下記）は、pDEMp1.0−tPAお
よび1.0−UKベクターを使用した原形質融合由来クロー
ンの第１組の初期発現レベルを表す。
8.より高濃度のMTX存在下における成長およびタンパク
質発現 MTX−耐性のトランスフェクトマー（transfectomas）
を、段階的にMTXの濃度を増加させた培養培地中で成長
させる。初めに、100nM MTXで選択した細胞を0.5mM MT
X,それから1mM MTXへと供した時、細胞は生存率に有意
な低下はなく、１週間の内に高濃度の薬剤に適応する。
MTXの濃度を1.0mMから2.5mM,そして5mM,10mM,20mM等の
段階的に上昇させた時、細胞の生存率は、40−70％低下
する。一般的に、細胞が５倍のMTX濃度増加に適応する
のに２週間はかからない。さまざまなMTX濃度での細胞
のtPAまたはUK生産量をアッセイする。一般的に大量生
産系では、培地中のMTX濃度が10倍増加すると、発現レ
ベルは２倍増加する。しかし、MTXの濃度が20mM以上に
なると、発現レベルが弱まる傾向にある（下記第１図参
照）。
質発現 MTX−耐性のトランスフェクトマー（transfectomas）
を、段階的にMTXの濃度を増加させた培養培地中で成長
させる。初めに、100nM MTXで選択した細胞を0.5mM MT
X,それから1mM MTXへと供した時、細胞は生存率に有意
な低下はなく、１週間の内に高濃度の薬剤に適応する。
MTXの濃度を1.0mMから2.5mM,そして5mM,10mM,20mM等の
段階的に上昇させた時、細胞の生存率は、40−70％低下
する。一般的に、細胞が５倍のMTX濃度増加に適応する
のに２週間はかからない。さまざまなMTX濃度での細胞
のtPAまたはUK生産量をアッセイする。一般的に大量生
産系では、培地中のMTX濃度が10倍増加すると、発現レ
ベルは２倍増加する。しかし、MTXの濃度が20mM以上に
なると、発現レベルが弱まる傾向にある（下記第１図参
照）。
9.pDEKp1.0を使用したトランスフェクションからのクロ
ーン 発現ベクターpDEK1.0−tPAおよびpDEKp1.0−UKを使用
したトランスフェクションの頻度は、pDEM1.0−tPAおよ
びpDEMp1.0−UKを使用した場合の約10から20％にすぎな
いが、tPAおよびUK生産クローンは、高いままである
（すなわち約80％）。pDEKp1.0ベクターは、pDEKp1.0で
得られるよりも有意に高レベルのtPA/UKを生産するトラ
ンスフェクタント（transfectant）の上昇を与える。カ
ッパークローンをMYXの濃度が上昇した中で増殖させる
時、tPAおよびUKの高い発現レベルをもたらす。
ーン 発現ベクターpDEK1.0−tPAおよびpDEKp1.0−UKを使用
したトランスフェクションの頻度は、pDEM1.0−tPAおよ
びpDEMp1.0−UKを使用した場合の約10から20％にすぎな
いが、tPAおよびUK生産クローンは、高いままである
（すなわち約80％）。pDEKp1.0ベクターは、pDEKp1.0で
得られるよりも有意に高レベルのtPA/UKを生産するトラ
ンスフェクタント（transfectant）の上昇を与える。カ
ッパークローンをMYXの濃度が上昇した中で増殖させる
時、tPAおよびUKの高い発現レベルをもたらす。
表１は、tPA−生産（SDT）およびUK−生産（SDU）細
胞系の活性結果を表す。pDEKp1.0発現ベクターで得られ
たクローンには、クローン番号の前に“K"を付し、残り
はpDEKp1.0で得られたクローンである。
胞系の活性結果を表す。pDEKp1.0発現ベクターで得られ
たクローンには、クローン番号の前に“K"を付し、残り
はpDEKp1.0で得られたクローンである。
10.遺伝子コピー数およびRNAレベルの分析
プラスミドDNAのコピー数をサザン分析（同上）で試
験して発現レベルの上昇が増幅によるものか、誘導によ
るものかを決定する。
験して発現レベルの上昇が増幅によるものか、誘導によ
るものかを決定する。
最初のクローンは、（例えばSDU−４およびSDT−１）
100nM MTXですでに約100コピーのプラスミドDNAを含有
していた。しかし、SDU−４は、0.1μＭから100μM MTX
（第４および第５図）からの挿入DHFR遺伝子およびUK遺
伝子のいずれの増幅も示さないが、活性測定で決定され
たようにUKの発現において８倍の上昇がある。核及び細
胞性RNA（UKおよびDHFR）の両方のレベルの上昇は、第
7,8図に示すノーザンブロットから明らかである。tPAの
発現が４倍に増強するにもかかわらず、同様に遺伝子増
幅の無いことが、100nMから10mM MTXからのSDT−１クロ
ーンにも見らる。
100nM MTXですでに約100コピーのプラスミドDNAを含有
していた。しかし、SDU−４は、0.1μＭから100μM MTX
（第４および第５図）からの挿入DHFR遺伝子およびUK遺
伝子のいずれの増幅も示さないが、活性測定で決定され
たようにUKの発現において８倍の上昇がある。核及び細
胞性RNA（UKおよびDHFR）の両方のレベルの上昇は、第
7,8図に示すノーザンブロットから明らかである。tPAの
発現が４倍に増強するにもかかわらず、同様に遺伝子増
幅の無いことが、100nMから10mM MTXからのSDT−１クロ
ーンにも見らる。
11.MTX−無しでのサブクローンおよびMTXによる誘導
培地からMTXを除去すると、ほとんどのクローンの発
現レベルは第１週目に、本来のレベルの50％以下に落ち
る。この生存サブクローン中の目的遺伝子が失われたの
かどうかを決定するために、1mM MTXで生育するSDTK−
５および5mM MTXで生育するSDU4.1（UKを3,000Iu/mLで
発現するSDU4のサブクローン）をMTX無しの培地でサブ
クローニングする。MTX−無しのいくつかのサブクロー
ンをスクリーニングし、最高のもの:SDTK−16MF（MF＝M
TX−無しサブクローン）;SDU4.1−5MF;およびSDU4.1−1
8MF、を選択する。それらの発現レベルは、表２に表す
ように親クローンの発現より極めて低い。
現レベルは第１週目に、本来のレベルの50％以下に落ち
る。この生存サブクローン中の目的遺伝子が失われたの
かどうかを決定するために、1mM MTXで生育するSDTK−
５および5mM MTXで生育するSDU4.1（UKを3,000Iu/mLで
発現するSDU4のサブクローン）をMTX無しの培地でサブ
クローニングする。MTX−無しのいくつかのサブクロー
ンをスクリーニングし、最高のもの:SDTK−16MF（MF＝M
TX−無しサブクローン）;SDU4.1−5MF;およびSDU4.1−1
8MF、を選択する。それらの発現レベルは、表２に表す
ように親クローンの発現より極めて低い。
MTXを再びサブクローンの培地に誘導した。MTX−無し
の培地で約1,000Iu/mlで発現するSDTK5−16MFを1mM MTX
中で約２週間増殖させる。発現レベルは、1mM MTX中で3
060Iu/ml,および10mM MTX中で6480Iu/mlである。
の培地で約1,000Iu/mlで発現するSDTK5−16MFを1mM MTX
中で約２週間増殖させる。発現レベルは、1mM MTX中で3
060Iu/ml,および10mM MTX中で6480Iu/mlである。
これらのMTX−無しでのサブクローンのより高い発現
レベルを短期間の内に誘導できるかどうかを決定するた
めに、SDU 4.1−5MFおよびSDU 4.1−18MFを1mMおよび5m
M MTXを含有する成長培地で14時間、24時間および10日
間培養する。誘導期間の最後に、106細胞を取り出し、
遠心沈降させ、１％ウシ胎児血清（FCS）を含有する1ml
の正常成長培地中に加える。24時間後の上清をアッセイ
のために収穫する。表２に示すように、少なくとも14時
間において、細胞は再び誘導され、発現レベルを数倍増
加でき、これは細胞の倍加時間より短い。
レベルを短期間の内に誘導できるかどうかを決定するた
めに、SDU 4.1−5MFおよびSDU 4.1−18MFを1mMおよび5m
M MTXを含有する成長培地で14時間、24時間および10日
間培養する。誘導期間の最後に、106細胞を取り出し、
遠心沈降させ、１％ウシ胎児血清（FCS）を含有する1ml
の正常成長培地中に加える。24時間後の上清をアッセイ
のために収穫する。表２に示すように、少なくとも14時
間において、細胞は再び誘導され、発現レベルを数倍増
加でき、これは細胞の倍加時間より短い。
14時間という誘導時間は、有意な遺伝子増幅が起こる
には、短かすぎる。それゆえ、発現レベルにおける増加
が誘導現象であることを確認するために、これらMTX−
無しでのサブクローンのプラスミドDNAのコピー数をサ
ザン分析で試験した。約６週間、MTX−無し培地および5
mM MTX中で成長したSDU 4.1−5MFの間には、有意な遺伝
子増幅を欠いている（第４図）。ノーザンブロット分析
（第７及び８図）で決定したUKおよびDHFRのRNAのレベ
ルは、関連する遺伝子コピー数では説明できない5mM MT
Xでの細胞成長の劇的な増加を表す。同様に、MTX−無し
の培地におけるSDT K5−16MFおよび10mM MTX中で成長す
るSDT K5−16MFは約同数のプラスミドDNA（第６図）を
持つが、細胞は10mM MTX中で成長する時、tPAのmRNAレ
ベルにおいては、10倍以上の増加がある。
には、短かすぎる。それゆえ、発現レベルにおける増加
が誘導現象であることを確認するために、これらMTX−
無しでのサブクローンのプラスミドDNAのコピー数をサ
ザン分析で試験した。約６週間、MTX−無し培地および5
mM MTX中で成長したSDU 4.1−5MFの間には、有意な遺伝
子増幅を欠いている（第４図）。ノーザンブロット分析
（第７及び８図）で決定したUKおよびDHFRのRNAのレベ
ルは、関連する遺伝子コピー数では説明できない5mM MT
Xでの細胞成長の劇的な増加を表す。同様に、MTX−無し
の培地におけるSDT K5−16MFおよび10mM MTX中で成長す
るSDT K5−16MFは約同数のプラスミドDNA（第６図）を
持つが、細胞は10mM MTX中で成長する時、tPAのmRNAレ
ベルにおいては、10倍以上の増加がある。
活性測定は、SDU 4.1−5MFおよびSDU 4.18MFがサブク
ローニングの過程でコロニーを確立した後、約４週間後
に行われた。MTX−無し培地のこれらのサブクローンに
ついては、選択圧が無いのでそれらはクローンの均一性
を失う傾向にあり、ゆえにそれらの発現レベルは、時間
の延長期間以上である。
ローニングの過程でコロニーを確立した後、約４週間後
に行われた。MTX−無し培地のこれらのサブクローンに
ついては、選択圧が無いのでそれらはクローンの均一性
を失う傾向にあり、ゆえにそれらの発現レベルは、時間
の延長期間以上である。
本発明の精神および本質的な特徴から逸脱する事な
く、他の特定の形で具体化されるであろう。ゆえに本発
明の実施例は、すべて説明であり限定的なものではな
く、本発明の観点は前述の記載よりも添付の請求の範囲
に示されると考えられ、ゆえに請求の範囲と均等な意味
および範囲にあるすべての変更は、これらに内包される
ことを意図する。
く、他の特定の形で具体化されるであろう。ゆえに本発
明の実施例は、すべて説明であり限定的なものではな
く、本発明の観点は前述の記載よりも添付の請求の範囲
に示されると考えられ、ゆえに請求の範囲と均等な意味
および範囲にあるすべての変更は、これらに内包される
ことを意図する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ロ，キン―ミン
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
02181，ウェルズリー，エルウッド・ロ
ード 39
(72)発明者 ギリィズ，スティーヴン・ディー
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
02043，ヒンガム，リービット・ストリ
ート 245
(56)参考文献 米国特許4766075（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】哺乳類細胞内において増加した量の目的タ
ンパク質を生産する方法であって、工程： ａ）酵素として機能するジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）
をコードする発現可能な遺伝子及び目的タンパク質をコ
ードする発現可能な遺伝子を含む、少なくとも100コピ
ーのベクターで、哺乳類細胞をトランスフェクトするこ
とにより、上記哺乳類細胞のトランスフェクト体を生産
し； ｂ）選択剤として少なくとも約100nMのメトトレキセー
ト（MTX）の存在下で上記トランスフェクト体を選択培
地に供することにより、トランスフェクトされなかった
哺乳類細胞を本質的に含まない単離されたトランスフェ
クト体のクローンを生産し； ｃ）MTX不在下で上記クローンを培養し；そして ｄ）培養されたクローンを100nMから100μＭの範囲にお
いて連続的に増加する濃度のMTXで処理することによ
り、培養クローンの細胞倍加時間より短い時間で上記目
的タンパク質及び上記DHFRをコードする遺伝子の実質上
の増幅なしにDHFRをコードする遺伝子及び目的タンパク
質をコードする遺伝子の同時転写の増加を誘導すること からなる、上記方法。 - 【請求項２】前記の酵素として機能するDHFRが3T6−R40
0 DHFRである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記細胞がミエローマからなる、請求項１
記載の方法。 - 【請求項４】目的タンパク質をコードする遺伝子が、ペ
プチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノー
ゲン活性化因子、プロウロキナーゼ、および、ヒト軽
鎖、ヒト重鎖、ネズミ軽鎖、ネズミ重鎖、ネズミ−ヒト
キメラ軽鎖およびネズミ−ヒトキメラ重鎖からなる群よ
り選択される免疫グロブリン、ならびにそれらの活性ア
ナログ、断片、誘導体および融合生成物からなる群より
選択されるタンパク質をコードする、請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】連続的に濃度を増加させたMTXの存在下に
おいて工程（ｂ）の選択培地にトランスフェクト体を供
する、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】MTX濃度を２週間未満の間隔で５倍増加さ
せる、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】MTX濃度を約100nMから少なくとも１μＭま
で連続的に増加させる、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】MTX濃度を少なくとも５μＭまで連続的に
増加させる、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】MTX濃度を少なくとも20μＭに連続的に増
加させる、請求項８記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28183388A | 1988-12-08 | 1988-12-08 | |
| US281,833 | 1988-12-08 | ||
| PCT/US1989/005412 WO1990006363A1 (en) | 1988-12-08 | 1989-11-30 | Expression induction method employing mutant dhfr gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04502254A JPH04502254A (ja) | 1992-04-23 |
| JP3456992B2 true JP3456992B2 (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=23078969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50134990A Expired - Lifetime JP3456992B2 (ja) | 1988-12-08 | 1989-11-30 | 変異型ｄｈｆｒ遺伝子を使用した発現誘導方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5741682A (ja) |
| EP (1) | EP0555203B1 (ja) |
| JP (1) | JP3456992B2 (ja) |
| AT (1) | ATE129289T1 (ja) |
| AU (2) | AU4741090A (ja) |
| CA (1) | CA2004632C (ja) |
| DE (1) | DE68924605T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990006363A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2045175C (en) * | 1989-11-06 | 2003-03-18 | Arthur I. Skoultchi | Production of proteins using homologous recombination |
| US5714345A (en) * | 1990-12-24 | 1998-02-03 | Pharmaceutical Proteins Limited | Increased expression of a gene by a second transferred mammary gland specific sequence transgenic |
| GB9028062D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Agricultural & Food Res | Production of transgenic animals |
| US6156514A (en) | 1998-12-03 | 2000-12-05 | Sunol Molecular Corporation | Methods for making recombinant cells |
| IL148785A0 (en) * | 1999-10-13 | 2002-09-12 | Immunex Corp | Vectors and methods for recombinant protein expression |
| FR2818539B1 (fr) † | 2000-12-22 | 2004-04-30 | Oreal | Composition pour la teinture d'oxydation des fibres keratiniques comprenant au moins 4,5 ou 3,4 diamino pyrazole ou triamino pyrazole et au moins un compose cellulosique particulier, et procede de teinture |
| CN1304411C (zh) * | 2002-02-21 | 2007-03-14 | 本元正阳基因技术股份有限公司 | 一种突变型二氢叶酸还原酶基因及其在哺乳动物细胞基因表达中的应用 |
| CA2709894C (en) | 2007-12-21 | 2017-10-24 | Novartis Ag | Mammalian expression vector |
| US20100330572A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-12-30 | Assaraf Yehuda G | Organic compounds |
| KR101030978B1 (ko) * | 2008-07-10 | 2011-04-28 | (주) 에이프로젠 | 동물세포용 재조합 발현벡터 |
| JP7214962B2 (ja) * | 2018-01-17 | 2023-01-31 | 東ソー株式会社 | アルカリホスファターゼ高発現動物細胞 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4399216A (en) * | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US4442203A (en) * | 1981-06-30 | 1984-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene amplification assay for detecting tumor promoters |
| US4656134A (en) * | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4965196A (en) * | 1983-01-19 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
| AU572108B2 (en) * | 1983-01-19 | 1988-05-05 | Genentech Inc. | Human tpa production using vectors coding for dhfr protein |
| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| JPS62502662A (ja) * | 1985-05-01 | 1987-10-15 | ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド | 外来性ｄｎａの高レベル増幅および発現 |
| GB8601597D0 (en) * | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| JP2585532B2 (ja) * | 1986-05-10 | 1997-02-26 | 三井東圧化学株式会社 | 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法 |
-
1989
- 1989-11-30 AU AU47410/90A patent/AU4741090A/en active Granted
- 1989-11-30 EP EP90901297A patent/EP0555203B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-30 JP JP50134990A patent/JP3456992B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-30 AU AU47410/90A patent/AU644352B2/en not_active Ceased
- 1989-11-30 DE DE68924605T patent/DE68924605T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-30 AT AT90901297T patent/ATE129289T1/de active
- 1989-11-30 WO PCT/US1989/005412 patent/WO1990006363A1/en active IP Right Grant
- 1989-12-05 CA CA002004632A patent/CA2004632C/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-20 US US08/376,073 patent/US5741682A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2004632A1 (en) | 1990-06-08 |
| DE68924605D1 (de) | 1995-11-23 |
| WO1990006363A1 (en) | 1990-06-14 |
| US5741682A (en) | 1998-04-21 |
| CA2004632C (en) | 1999-01-19 |
| AU4741090A (en) | 1990-06-26 |
| DE68924605T2 (de) | 1996-05-15 |
| EP0555203A4 (en) | 1992-03-31 |
| ATE129289T1 (de) | 1995-11-15 |
| AU644352B2 (en) | 1993-12-09 |
| EP0555203A1 (en) | 1993-08-18 |
| JPH04502254A (ja) | 1992-04-23 |
| EP0555203B1 (en) | 1995-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kaufman et al. | Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells | |
| US4656134A (en) | Gene amplification in eukaryotic cells | |
| US5827739A (en) | Recombinant DNA sequences, vectors containing them and method for the use thereof | |
| JP3073009B2 (ja) | 組換えｄｎａ法及びそこに使用するベクター | |
| CS248705B2 (en) | Production method of the activator of the human tissue plasminogen | |
| JPH09103296A (ja) | 安定化配列を有するベクターおよび真核宿主細胞 | |
| HU200615B (en) | Methods of preparing tissue plasiminogen activator derivative composition | |
| JP3456992B2 (ja) | 変異型ｄｈｆｒ遺伝子を使用した発現誘導方法 | |
| JP2535000B2 (ja) | 真核細胞の高レベル発現を達成するためのベクタ−およびその製法 | |
| JP2693361B2 (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 | |
| US5747308A (en) | Recombinant DNA method | |
| USH2181H1 (en) | Human tPA production using vectors coding for DHFR protein | |
| US5268291A (en) | Human t-PA production using vectors coding for DHFR protein | |
| JP3449418B2 (ja) | 内因性レトロウイルス様配列内への遺伝子標的化による発現の増大 | |
| Hussain et al. | Coupled expression of Ca2+ transport ATPase and a dihydrofolate reductase selectable marker in a mammalian cell system | |
| JP2798659B2 (ja) | ヒトアンチトロンビンｉｉｉ（ａｔｉｉｉ）の製造 | |
| AU602664B2 (en) | DNA sequence containing the DNA sequence coding for human tissue plasminogen activator originating from human normal cells, recombinant DNA incorporating the DNA sequence, host cells transformed with the recombinant DNA, and process for producing human tissue plasminogen activator by use of the host cells | |
| JPS63304982A (ja) | ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 | |
| Weidle et al. | Establishment of a temperature-inducible cell line for human plasminogen activator (tissue-type) by transfection of monkey cells with expression constructs | |
| JP3265587B2 (ja) | 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 | |
| JPH022338A (ja) | 真核細肪中での同時発現 | |
| NO845186L (no) | Vektorsystem for innfoering av heterolog dna i eykaryotiske celler. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070801 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080801 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080801 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090801 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100801 Year of fee payment: 7 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100801 Year of fee payment: 7 |